CN104130949B - 一种富铁蛹虫草的液体深层发酵培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种富铁蛹虫草的液体深层发酵培养基和培养方法，其培养基组分及含量为：大豆粉10‑45g/L、蔗糖10‑45g/L、KH₂PO₄ 0‑1.5g/L、MgSO₄ 0‑1.5g/L、硫胺素50×10^‑6g/L、Fe²⁺溶液 0.04‑0.06 g/L，其ph值为6.0。其培养方法包括菌种活化、耐铁蛹虫草菌株驯化、种子扩大培养、富铁蛹虫草发酵、干燥分离。其操作简单，培养周期短，使得蛹虫草产品除了发挥蛹虫草本身的药理作用之外，还能起到补充微量元素铁的作用。

Description

一种富铁蛹虫草的液体深层发酵培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及一种蛹虫草的液体深层发酵培养方法，特别是一种富铁蛹虫草的液体深层发酵培养方法。

背景技术

蛹虫草又名北冬虫夏草、北虫草等。研究证实，蛹虫草的主要药效成分为核苷类化合物、糖醇类、虫草多糖类、氨基酸类、酶类以及矿物元素等，与冬虫夏草的药效成分类同。所以，蛹虫草具有与冬虫夏草相似的功效。蛹虫草的生理功能归纳起来包括：提高免疫、抗病毒及抑菌作用、抗疲劳、抗肿瘤、镇静及抗惊厥作用、抗辐射、降血糖、降血脂、延缓衰老等。随着社会的进步和科技的发展，人们对健康饮食愈加重视，诸如蛹虫草类的健康食品市场需求量日益增加，然而，蛹虫草的天然资源分布数量很少。北虫草的人工培养方法大大提高了其产量。目前，蛹虫草的人工培养方法主要包括固体培养和液体发酵培养等常见方法。

铁作为人体最重要的微量元素，具有非常重要的生物学功能。人体缺铁或铁摄入量过多都会导致疾病。人体获取铁元素主要通过两种途径，一种是通过摄入含铁食物自然获得，比如苔菜、晋中红蘑、香杏片口蘑、发菜、木耳等菌类食物和动物内脏；另一种，人体通过摄入富铁的保健品来获取铁元素。

本领域对蛹虫草附加功能产品的开发具有很大需求，而富铁蛹虫草至今未有报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出一种富铁蛹虫草的液体深层发酵培养基，包括：大豆粉10-45g/L、蔗糖10-45g/L、KH₂PO₄0-1.5g/L、MgSO₄0-1.5g/L和硫胺素50×10^-6g/L,还包括Fe²⁺浓度0.01-1.8g/L。

本发明又进一步提供了上述发酵培养基的优选技术方案。

作为优选，所述大豆粉为35g/L，所述蔗糖为30g/L，所述KH₂PO₄为1.5g/L、所述MgSO₄为1.5g/L或所述Fe²⁺浓度为0.04-0.06g/L。

作为优选，所述Fe²⁺为七水合硫酸亚铁的水溶液中的铁离子。

本发明还提供了一种富铁蛹虫草的液体深层发酵培养方法，包括如下步骤：

a菌种活化

将菌种接种于PDA培养基中，在PH值为6、温度为26℃条件下培养5-7天，得到活化菌种；

b耐铁蛹虫草菌株驯化

将步骤a得到的活化菌种接种于PDA优化培养基中，在PH值为6、温度为26℃条件下，培养5-7天，得到驯化铁蛹虫草菌株；

c种子扩大培养

将步骤b得到的驯化铁蛹虫草菌株置于装有PDA培养基的三角瓶中，三角瓶的装液量为100ml/250ml，放置于26℃、150r/m环境下的摇床中摇瓶培养48小时或至菌液清亮，即得种子培养液；

d富铁蛹虫草发酵培养

将步骤c得到的种子培养液以3-5％的接种量接种于装有权利要求1-3任一项所述培养基的三角瓶中，三角瓶的装液量为60-150ml/250ml，培养72小时，即得富铁蛹虫草；

e干燥分离

将步骤d得到的富铁蛹虫草与发酵液分离，烘干至恒重，得到富铁蛹虫草干品。

本发明又进一步提供了上述发酵培养方法的优选技术方案。

作为优选，所述步骤d的三角瓶的装液量为100ml/250ml。

作为优选，所述PDA优化培养基包括，土豆200g/L、葡萄糖10-45g/L、蛋白胨10-45g/L、KH₂PO₄0-1.5g/L、MgSO₄0-1.5g/L、硫胺素50×10^-6g/L和Fe²⁺浓度0.01-1.8g/L。

作为优选，所述葡萄糖为20g/L、所述蛋白胨为20g/L、所述KH₂PO₄为1.5g/L、所述MgSO₄为1.5g/L或所述Fe²⁺浓度0.04-0.06g/L。

本发明所提供的蛹虫草的液体深层发酵培养基及培养方法，通过将无机铁盐添加到蛹虫草的培养基中，经过生物转化使得无机的铁变成蛹虫草中有机的铁，从而增加蛹虫草的营养价值。

本发明同已有技术相比可产生如下积极效果和显著的进步

首先，通过耐铁实验得出最佳Fe²⁺添加量浓度范围：

在培养基为土豆200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、琼脂粉20g/L、KH₂PO₄1.5g/L、MgSO₄·7H₂O1.5g/L、硫胺素50×10^-6g/L、琼脂25g/L，分别添加Fe²⁺(7H₂O·FeSO₄)0.01-0.18mg/ml，得出Fe²⁺与生物量和富集铁的曲线。最佳Fe²⁺添加量为0.04～0.06mg/L时，蛹虫草菌丝体粉的生物量达到最大值。又考虑到人体每天正常摄入18mg铁最为合适，选择富铁蛹虫草的最佳添加的Fe²⁺浓度为0.06mg/ml，富集铁量为13.521mg/g。

其次，通过实验确定出富铁蛹虫草的最佳发酵条件，使得蛹虫草在培养过程中加入的无机铁，通过蛹虫草在生长过程中对铁元素的吸收和转化，变为了有机铁，使铁能够更高效、更安全地被人体吸收；在此权利要求所述的工艺条件下，进行富铁蛹虫草的摇瓶发酵实验，测得富铁蛹虫草生物量18.930g/L，富集铁16.011mg/g，此时，每克蛹虫草已经可以提供人体每日所需铁元素的89％之多。

最后，在富铁蛹虫草的培养过程中，采用本发明的培养基不仅原料易得，培养周期短，而且富铁蛹虫草产率高，在富铁的同时，其余有益成分的含量更高。如表1所述，与未添加铁离子的培养基培养的蛹虫草相比，其有效成分腺苷、虫草素、虫草多糖、虫草酸含量均有大幅提高。

表1

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 富铁蛹虫草的液体深层发酵培养

(1)菌种活化：

配制PDA培养基：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂粉20g/L、KH₂PO₄1.5g/L、MgSO₄·7H₂O1.5g/L、硫胺素50×10^-6g/L；其pH值为6，121℃下灭菌20min。

将蛹虫草菌种在无菌条件下接种于试管斜面，26℃的培养箱中培养5至7天。

(2)耐铁蛹虫草菌株驯化：

配制PDA优化培养基：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、琼脂粉20g/L、KH₂PO₄1.5g/L、MgSO₄·7H₂O1.5g/L、不同浓度的Fe²⁺(7H₂O·FeSO₄)溶液，硫胺素50×10^-6g/L、琼脂25g/L；其Ph值为6，121℃下灭菌20min。将斜面菌种接种于平板培养基中驯化培养，放置于26℃的培养箱中培养5至7天。

(3)种子扩大培养：

配制PDA培养基：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、KH₂PO₄1.5g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5g/L、硫胺素50×10^-6g/L；其Ph值为6，121℃下灭菌20min。

在无菌操作台中切取步骤(2)中铁驯化培养后的平板蛹虫草菌两小块(约0.8cm²)，置于装液量100ml/250ml的三角瓶，放置于26℃、150r/m环境下的摇床中大约培养48h，直至摇瓶培养置菌液清亮(出现稠密且大小均匀的菌丝球)。

(4)富铁蛹虫草发酵

配制发酵培养基：大豆粉10-45g/L、蔗糖10-45g/L、KH₂PO₄0-1.5g/L、MgSO₄0-1.5g/L、硫胺素50×10^-6g/L、不同浓度的Fe²⁺(7H₂O·FeSO4)；其Ph值为6。

培养温度26℃，种龄48h，接种量(3-5)mL/100mL，装液量每250mL三角瓶60-150mL，培养时间72h。

(5)干燥分离：

蛹虫草富铁发酵72h后，在转速为10000r/min的环境下，将发酵液离心5min，去上清液，加去离子水少许，再次离心，如此反复3次，将其置于鼓风恒温干燥箱中经40℃烘干24小时左右，烘干至恒重。经粉碎机粉碎后过60目筛，得到富铁蛹虫草菌丝体干粉。

表2为不同铁离子浓度条件下与富集铁量的变化情况。表2可以清楚表明本发明提供的富铁蛹虫草的液体深层发酵培养基及培养方法极大地丰富了铁蛹虫草中铁元素的含量。

名词解释：

生物量：某一时间单位面积或体积栖息地内所含一个或一个以上生物种，或所含一个生物群落中所有生物种的总个数或总干重(包括生物体内所存食物的重量)。本发明指单位体积培养基中蛹虫草细胞的总干重。

生物量测定：采用干重法，将发酵液10000r/min离心5min，倾出上清液用于铁含量的测定，菌丝体泥40℃烘干至恒重，称重。

富集铁：每克干菌丝体粉吸附的铁量(mg/g)。

蛹虫草菌丝体粉中富集的铁(富集铁)含量测定：邻二氮菲比色法测定。

表2

实施例2 0.06mg/ml铁离子浓度条件下富铁蛹虫草的液体深层发酵培养

根据实施例1中富铁蛹虫草的液体深层发酵培养方法，Fe²⁺采用0.06mg/ml的FeSO₄·7H₂O溶液，发酵培养时间采用84小时，得到富铁蛹虫草。

测得上述富铁蛹虫草的生物量为18.930g/L，富集铁含量为16.011mg/g，腺苷的含量为2314.6μg/g、虫草素为900.21μg/g、虫草多糖为52.37mg/g、虫草酸的含量为35.84mg/g。

另外，测得实施例1中实验1得到的普通蛹虫草的腺苷、虫草素、虫草多糖、虫草酸的含量分别为：385.1μg/g、51.05μg/g、32.51mg/g、34.31mg/g。

虫草多糖含量测定采用按苯酚-硫酸法；腺苷含量测定采用高效液相色谱法；虫草素含量测定采用高效液相色谱法；虫草酸含量测定采用比色法。

本实施例中得到的富铁蛹虫草中的有效成分含量均高于普通蛹虫草。

以上所述，仅为本发明专利较佳的具体实施方式，但本发明专利的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明专利揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖。上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种富铁蛹虫草的液体深层发酵培养方法，包括如下步骤：

a菌种活化

将菌种接种于PDA培养基中，在PH值为6、温度为26℃条件下培养5-7天，得到活化菌种；

b耐铁蛹虫草菌株驯化

将步骤a得到的活化菌种接种于PDA优化培养基中，在PH值为6、温度为26℃条件下，培养5-7天，得到驯化铁蛹虫草菌株；所述PDA优化培养基包括，土豆200g/L、葡萄糖10-45g/L、蛋白胨10-45g/L、KH₂PO₄ 0-1.5g/L、MgSO₄ 0-1.5g/L、硫胺素50×10^-6g/L和0.04-0.06g/LFe²⁺浓度；

c种子扩大培养

将步骤b得到的驯化铁蛹虫草菌株置于装有PDA培养基的三角瓶中，三角瓶的装液量为100ml/250ml，放置于26℃、150r/m环境下的摇床中摇瓶培养48小时或至菌液清亮，即得种子培养液；

d富铁蛹虫草发酵培养

将步骤c得到的种子培养液以3-5％的接种量接种于装有液体深层发酵培养基的三角瓶中，三角瓶的装液量为60-150ml/250ml，培养72小时，即得富铁蛹虫草；所述液体深层发酵培养基包括大豆粉10-45g/L、蔗糖10-45g/L、KH₂PO₄ 0-1.5g/L、MgSO₄ 0-1.5g/L、硫胺素50×10^-6g/L和0.04-0.06g/LFe²⁺浓度；

e干燥分离

将步骤d得到的富铁蛹虫草与发酵液分离，烘干至恒重，得到富铁蛹虫草干品。

2.根据权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述步骤d的三角瓶的装液量为100ml/250ml。

3.根据权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述葡萄糖为20g/L、所述蛋白胨为20g/L、所述KH₂PO₄为1.5g/L、所述MgSO₄为1.5g/L、所述Fe²⁺浓度为0.04-0.06g/L。