CN110218688A - 海内氏芽孢杆菌ly-23、菌剂及其应用和应用其的产品 - Google Patents

海内氏芽孢杆菌ly-23、菌剂及其应用和应用其的产品 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种海内氏芽孢杆菌LY‑23、菌剂及其应用和应用其的产品，涉及微生物领域。该海内氏芽孢杆菌LY‑23分离自健康成年黑毛驴的大肠内容物，可以利用多种糖类物质，具有良好的酶活性，其中蛋白酶活性、淀粉酶活性和纤维素酶活性均较佳，尤其是具有极强的纤维素酶活性；还具有改善动物对饲料中的营养物质消化率，提高动物血清免疫球蛋白IgG含量。基于海内氏芽孢杆菌LY‑23的功能，其可以应用于发酵、制备饲料添加剂、饲料、改善马属动物肠道环境的产品和改善马属动物免疫力的产品。

Description

海内氏芽孢杆菌LY-23、菌剂及其应用和应用其的产品
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一种海内氏芽孢杆菌LY-23、菌剂及其应用和应用其的产品。
背景技术
驴属奇蹄目、马科、马属，草食动物。我国驴驯养历史悠久，形成了很多优良的地方品种。
随产业发展，驴饲养业已成为我国特种动物养殖业的重要组成部分，形成完善的产业链条，在促进农民增收、带动脱贫致富等方面起到了重要的作用。但我国对于家养驴的研究起步晚，基础研究较少，多集中于常见疾病防控、饲养管理技术以及育肥性能研究等方面。对与驴肠道微生物组成以及功能微生物的研究方面国内鲜有报道。
为了满足市场需求，产业逐渐向规模化、标准化方向发展。但受国内家养驴产业起步晚、技术落后的制约，在传统动物饲养中普遍应用的一些饲养管理技术以及一些优质的饲料产品在驴养殖中还未得到充分应用。如，在猪、禽、牛、羊等家畜饲养中，益生菌制剂具有提高生产性能、改善体况、降低营养物质排泄、调节免疫力等诸多优良作用，不仅提高生产的效率，而且改善了畜产品品质，获得显著的经济和社会效益。
目前，驴的传统养殖多以农作物秸秆、青干草、糠麸及饼粕类为主，辅以少量精料，存在饲料成分简单、营养配比不合理的情况较多。在育成期补饲大量精料，粗饲料多以豆秸、玉米秸秆等劣质粗饲料为主，饲料品质差，精粗比严重不合理，造成驴只易产生消化系统疾病，产业生产潜力未得到充分发挥。目前市场上益生菌类产品品类多，剂型广泛，但很多产品核心菌种来源不清，导致应用结果参差不齐。因此，一种适用于驴的益生菌制剂是目前市场需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23，于2018年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018942。
本发明的第二目的在于提供一种菌剂，该菌剂包含上述海内氏芽孢杆菌LY-23。
本发明的第三目的在于提供上述海内氏芽孢杆菌LY-23或上述菌剂的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一株海内氏芽孢杆菌(Bacillushaynesii)LY-23，于2018年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M 2018942。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种菌剂，该菌剂包含上述海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种发酵方法，包括使用上述海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23或上述菌剂发酵底物；
优选地，所述底物包括糖类底物；
优选地，所述糖类底物包括葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖、L-阿拉伯糖、半乳糖、山梨醇、七叶苷、蕈糖、果糖、纤维二糖和苦杏仁苷中的至少一种。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了采用上述发酵方法制备得到的发酵产物。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述海内氏芽孢杆菌LY-23、上述菌剂、上述发酵方法或上述发酵产物在制备饲料添加剂或饲料中的应用。
优选地，使用所述海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23或所述菌剂发酵植物类的饲料原料，以制备所述饲料添加剂或所述饲料。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种饲料添加剂，该饲料添加剂包含上述海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23、上述菌剂和上述发酵产物中的一种或多种。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种饲料，所述饲料包含上述海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23、上述菌剂、上述发酵产物和上述饲料添加剂中的一种或多种；
优选地，所述饲料包括发酵饲料。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于改善马属动物肠道环境的产品，该产品包含上述海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23、上述菌剂、上述发酵产物、上述饲料添加剂和上述饲料中的一种或多种；所述马属动物优选包括驴。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于改善马属动物免疫力的产品，该产品包含上述海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23、上述菌剂、上述发酵产物、上述饲料添加剂和上述饲料中的一种或多种；所述马属动物优选包括驴。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的海内氏芽孢杆菌LY-23分离自健康成年黑毛驴的大肠内容物，可以利用多种糖类物质，具有良好的酶活性，其中蛋白酶活性、淀粉酶活性和纤维素酶活性均较佳，尤其是具有极强的纤维素酶活性。基于海内氏芽孢杆菌LY-23的优良性能，本发明还提供了包含其的菌剂，该菌剂具有海内氏芽孢杆菌LY-23的所有有益效果，不再赘述。
本发明提供的海内氏芽孢杆菌LY-23或菌剂的应用，包括用于发酵，用于制备饲料添加剂、饲料、改善马属动物肠道环境的产品和改善马属动物免疫力的产品。将海内氏芽孢杆菌LY-23或菌剂用于发酵，适用于糖类、蛋白质类和纤维素类等多种底物的发酵，发酵效率高；该方法得到的发酵产物，发酵充分，容易消化吸收的物质含量高。本发明提供得到饲料添加剂以及饲料能够促进动物对营养物质的吸收，并提高动物的免疫力。
本发明提供的改善马属动物肠道环境的产品能够补充马属动物肠道中的有益微生物，并提高马属动物对粗饲料的消化能力，降低马属动物患消化系统疾病的几率。本发明提供的用于改善马属动物免疫力的产品，能够提高马属动物血清免疫球蛋白IgG含量，有利于增强动物机体免疫力，提高对疾病等抵抗能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的驴源海内氏芽孢杆菌LY-23菌落形态；
图2为本发明提供的驴源海内氏芽孢杆菌LY-23显微镜检形态；
图3为本发明提供的驴源海内氏芽孢杆菌LY-23基于16S rRNA基因序列比对结果以E.coli ATCC 11775T(X80725.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一株海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23，本发明的菌株的保藏日期为2018年12月28日，保藏编号为：CCTCC NO：M2018942。分类命名为：海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；邮编：430072。
本发明提供的海内氏芽孢杆菌LY-23分离自健康成年黑毛驴的大肠内容物，菌落形态为中间有褶皱凸起，边缘不整齐，菌落表面粗糙无光泽；经鉴定该菌株为兼性厌氧，革兰氏阳性，细胞呈杆状，内生孢子。该菌株在pH值5-6条件下生长并耐受高达8％的NaCl(w/v)，具有β-半乳糖苷酶活性，经16S rRNA测序比对，鉴定为海内氏芽孢杆菌。
本发明经试验发现，海内氏芽孢杆菌LY-23可以利用多种糖类物质，包括但不限于葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖、L-阿拉伯糖、半乳糖、山梨醇、七叶苷、蕈糖、果糖、纤维二糖和苦杏仁苷中的一种或者多种；海内氏芽孢杆菌LY-23还具有良好的酶活性，其中蛋白酶活性、淀粉酶活性和纤维素酶活性均较佳，尤其是具有极强的纤维素酶活性。
本发明经小鼠急性经口毒性试验发现，海内氏芽孢杆菌LY-23无毒性，且无抗原抗体反应；将该菌株施于黑毛驴能够改善黑毛驴对饲料中的营养物质消化率，并且还提高了黑毛驴血清免疫球蛋白IgG含量。
综上，本发明筛选到的海内氏芽孢杆菌LY-23具有良好的发酵性能，能够发酵多种糖类物质，还具有良好的酶活性，尤其是具有较强的纤维素酶活性；将该株海内氏芽孢杆菌LY-23施于动物，能够提高动物对饲料中的营养物质消化率，并提高动物血清免疫球蛋白IgG含量，有利于增强动物机体免疫力，提高对疾病等抵抗能力。
基于本发明筛选到的海内氏芽孢杆菌LY-23的性能，本发明还提供了包含上述海内氏芽孢杆菌LY-23的菌剂，以及海内氏芽孢杆菌LY-23和包含其的菌剂的应用。
可以理解的是，由于本发明提供的菌剂包含海内氏芽孢杆菌LY-23，因此该菌剂具有海内氏芽孢杆菌LY-23的所有性能以及有益效果。所述菌剂优选以海内氏芽孢杆菌LY-23作为主要的活性成分；可选地，所述菌剂还可以包含一种或多种用于和海内氏芽孢杆菌LY-23配合使用的其他种属的微生物。
在一些可选的实施方式中，所述菌剂还可以包括任意的可接受的辅料，所述可接受的辅料指的是不影响菌剂中的活性成分的生理功能，同时对菌剂起辅助作用的成分，包括但不限于pH调节剂、乳化剂、崩解剂、填充剂、溶剂、润湿剂、稳定剂、分散剂和保湿剂中的一种或者多种；可选地，辅料也可以包括用于维持菌剂中菌株活性的营养物质，包括但不限于为糖类物质、盐类、酵母提取物和牛肉膏等；可选地，所述辅料还可以包括用于吸附微生物的载体，包括但不限于蒙脱石、高岭土、白碳、海泡石、稻壳、淀粉、聚乙烯醇和聚乙二醇和轻质碳酸钙中的一种或者多种。
在一些可选的实施方式中，由于海内氏芽孢杆菌LY-23具有发酵糖类，和良好的酶活性的性能，所述菌剂可以作为发酵剂，以用于发酵含有糖类、蛋白质类、淀粉类和纤维素类中的一种或多种的底物。
在一些可选的实施方式中，由于海内氏芽孢杆菌LY-23具有良好的酶活性，所述菌剂可以作为酶制剂，所述酶制剂可选的包括海内氏芽孢杆菌LY-23，也可以以海内氏芽孢杆菌LY-23作为酶制剂的原料，从菌株中提取出蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶中的一种或几种，作为酶制剂的活性成分。
基于海内氏芽孢杆菌LY-23能够发酵多种糖类物质，并且具有良好的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的活性，本发明还提供了一种发酵方法，该发酵方法包括使用海内氏芽孢杆菌LY-23或使用上述包含海内氏芽孢杆菌LY-23的菌剂发酵底物。其中底物指的是发酵反应的原料。本发明提供的发酵方法由于利用了海内氏芽孢杆菌LY-23较佳的酶活性和能够发酵糖类物质的性能，因此适用于多种底物的发酵，包括但不限于含有糖类、蛋白质类和纤维素类中的一种或多种的底物的发酵。本发明提供的发酵方法适用范围广，发酵效率高。
由于海内氏芽孢杆菌LY-23能够发酵多种糖类物质，因此在一些优选的实施方式中，底物为包含糖类物质的底物，其中糖类物质包括但不限于葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖、L-阿拉伯糖、半乳糖、山梨醇、七叶苷、蕈糖、果糖、纤维二糖和苦杏仁苷中的一种或多种。
本发明还提供了采用上述发酵方法得到的发酵产物，经上述发酵方法得到的发酵产物中的蛋白质、淀粉和纤维素发酵充分，经酶解作用使发酵产物中的小分子物质含量高，所述小分子物质指的是由发酵作用将大分子物质，例如蛋白质、多糖和纤维素等，分解代谢得到的产物；同时，发酵产物中含有的海内氏芽孢杆菌LY-23还具有促进动物消化饲料中的营养物质和提高动物血清免疫球蛋白IgG含量的作用，因此该发酵产物具有富含更容易吸收的小分子物质和改善动物健康的有益效果，尤其适合用于制备饲料添加剂和饲料。所述发酵产物包括采用上述发酵方法直接得到的产物，也可以包括将发酵产物经本领域常规的处理，比如灭菌、除杂、分离、提纯和造粒等常规工艺处理过的发酵产物，本发明对此不做限制。
基于上述海内氏芽孢杆菌LY-23及包含其的菌剂，和上述发酵方法以及采用该发酵方法得到的发酵产物的有益效果，本发明还提供了上述海内氏芽孢杆菌LY-23，上述菌剂，上述发酵方法或上述发酵产物在制备饲料添加剂或饲料中的应用。所述在制备饲料添加剂或饲料中的应用可选的包括将上述海内氏芽孢杆菌LY-23及包含其的菌剂，或上述发酵产物直接和饲料添加剂或饲料的其他成分混合；也可选的包括以海内氏芽孢杆菌LY-23，或包含其的组合物作为发酵剂发酵底物，发酵后经灭菌处理的发酵产物作为饲料添加剂或饲料等方式。
在一些优选的实施方式中，以植物类的饲料原料作为发酵底物，通过海内氏芽孢杆菌LY-23对植物类的饲料原料的发酵，以制备饲料添加剂或饲料。海内氏芽孢杆菌LY-23可利用多种糖类，并且淀粉酶和纤维素酶活性佳，尤其是纤维素酶活性较强，相比于传统的发酵菌种，更能够充分的发酵植物性原料，分解其中的纤维素成分，提高植物类的饲料原料的利用率，同时发酵后的植物类饲料原料更容易被动物消化和吸收，提高饲料中的营养成分。所述植物类的饲料原料包括但不限于秸秆、青干草、糠麸和饼粕等饲料原料。
本发明还提供了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂可以直接含有上述海内氏芽孢杆菌LY-23，也可以包含所述菌剂或者所述发酵产物；所述饲料添加剂还可以包含海内氏芽孢杆菌LY-23、包含其的菌剂和所述发酵产物中的多种，例如将所述发酵产物作为饲料添加剂中的一种活性成分，根据实际生产需要再在饲料添加剂中再添加可接受量的包含海内氏芽孢杆菌LY-23的菌剂，以增加饲料添加剂中的活菌数量，以补充牲畜肠道中的益生菌。所述饲料添加剂还可以包含任选的辅料，包括但不限于酸化剂、微量元素、促生长剂、氨基酸、微量元素、抗生素、驱虫剂、防霉剂、调味剂和激素中的一种或者多种，该饲料添加剂含有海内氏芽孢杆菌LY-23，能够促进动物对营养物质的吸收，并提高动物的免疫力。所述饲料添加剂可以混合至饲料内施与动物，也可以不和饲料混合单独施与动物。
本发明还提供了一种饲料，所述饲料可以直接将所述海内氏芽孢杆菌LY-23混合至饲料中，也可以将所述菌剂、所述发酵产物或所述饲料添加剂和组成饲料的其他组分混合，所述饲料还可以包含海内氏芽孢杆菌LY-23、包含其的菌剂、所述发酵产物和所述饲料添加剂中的多种，例如将所述发酵产物或所述饲料添加剂作为饲料中的一种活性成分，根据实际生产需要再在饲料中添加可接受量的包含海内氏芽孢杆菌LY-23的菌剂，以增加饲料添加剂中的活菌数量，以补充牲畜肠道中的益生菌。所述组成饲料的其他组分包括饲料领域中的常规组分，包括但不限于干草、秸秆、麸皮、青贮、米糠、豆饼、鱼粉、骨粉和油脂等，本发明对此不做限制。所述饲料还可以包括上述饲料添加剂，以便于随时调控饲料中海内氏芽孢杆菌LY-23的含量。
添加了海内氏芽孢杆菌LY-23的饲料能够促进动物的干物质消化率、粗蛋白质消化率、中性洗涤纤维消化率、酸性洗涤纤维消化率和粗脂肪消化。因此添加海内氏芽孢杆菌LY-23可提高饲料中营养物质消化率，节约饲料投入，降低饲养成本，尤其提高脂类营养物质的利用。
在一些优选的实施方式中，所述饲料包括发酵饲料，所述发酵饲料是粗饲料经过微生物发酵而制成的饲料，本发明所述的发酵饲料，指的是经过含有海内氏芽孢杆菌LY-23的微生物发酵制得的发酵饲料。本实施方式中提供的发酵饲料主要由海内氏芽孢杆菌LY-23发酵粗饲料得到，能将粗饲料中的纤维素和半纤维素分解成更容易吸收的小分子物质，以减轻动物的肠道负担和提高饲料的利用率。
本发明在实验中发现海内氏芽孢杆菌LY-23无毒性，且无抗原抗体反应；并且能够改善黑毛驴对饲料中的营养物质消化率，同时提高了黑毛驴血清免疫球蛋白IgG含量。基于此，本发明还提供了一种用于改善马属动物肠道环境的产品和一种用于改善马属动物免疫力的产品，上述两种产品可以是包含海内氏芽孢杆菌LY-23的菌剂、经海内氏芽孢杆菌LY-23发酵的发酵产物、上述饲料添加剂或上述饲料；也可以是以海内氏芽孢杆菌LY-23、包含其的菌剂、经海内氏芽孢杆菌LY-23发酵的发酵产物、上述饲料添加剂或上述饲料中的一种或多种作为主要活性成分，配合其他组分组成的产品；在一些可选的实施方式中，所述改善马属动物肠道环境的产品和用于改善马属动物免疫力的产品，可选地是包含所述饲料添加剂的营养补充剂；可选地是包含所述饲料添加剂和海内氏芽孢杆菌LY-23的组合物，以便于随时调整施与马属动物的海内氏芽孢杆菌LY-23的量。所述马属动物例如可以为但不限于为家马、野马、非洲野驴、家驴、骡、普通斑马或细纹斑马。由于所述海内氏芽孢杆菌LY-23是从健康成年黑毛驴的大肠内容物中分离出的，因此本发明提供的产品更适用于毛驴，以改善毛驴的肠道环境和免疫力。本发明提供的用于改善马属动物肠道环境的产品主要以海内氏芽孢杆菌LY-23作为活性成分，能够补充马属动物肠道中的有益微生物，并提高马属动物对粗饲料的消化能力，降低马属动物患消化系统疾病的几率。
本发明提供的用于改善马属动物免疫力的产品，能够提高马属动物血清免疫球蛋白IgG含量，有利于增强动物机体免疫力，提高对疾病等抵抗能力。
下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1
驴源海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)的分离纯化及生化特性:
(Ⅰ)分离用培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，培养基成分如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，121℃灭菌30min。
(Ⅱ)分离方法：
(1)样品的采集与微生物分离：选择东阿县黑毛驴饲养基地的健康成年黑毛驴，采取大肠内容物，迅速放入装有液体培养基的灭菌螺口具盖试管中，带回实验室后立即进行梯度稀释，每梯度三个平板，倾注法分离培养，于37℃倒置培养。
(2)分离纯化：取以上长有各种细菌的平板，选取芽孢杆菌单菌落，采用连续划线法进行分离纯化。将有不同菌落形态的单菌落均进行纯化。重复3-4次，镜检，直至获得纯种。
(3)观察菌落特征，利用革兰氏染色、镜检，观察细菌形态。
(4)DNA提取按照大连宝生物公司DNA提取试剂盒(akaRa 2.0)说明书方法提取细菌DNA，利用芽孢杆菌的通用引物：gyrA-F：5′-ATTCACGCTATCACTGACTTATTC-3′(如SEQ IDNO.2所示)和gyrA-R：5′-ATGGGAGACAAAGTAGAACCGAG-3′(如SEQ ID NO.3所示)对所获得芽孢杆菌保守序列进行扩增并测序，引物合成及测序送检上海生工生物工程技术服务有限公司完成，对16S rRNA序列进行同源性比较。16S rDNA的扩增体系如下，扩增体系的总体积为50μl：
PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min 30s，25个循环，72℃延伸8-10min，4℃保存。
(Ⅲ)海内氏芽孢杆菌的分离筛选鉴定：
经形态学观察，显微镜检，酶学分析以及碳水化合物利用实验，结合16S rRNA测序比对，鉴定为海内氏芽孢杆菌，命名为LY-23，16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。菌株培养24h后，菌落中间有褶皱凸起，边缘不整齐，菌落表面粗糙无光泽；兼性厌氧，革兰氏阳性，细胞呈杆状，内生孢子。LY-23的菌落形态如图1所示，显微镜检形态如图2所示。
对海内氏芽孢杆菌LY-23的16S rRNA基因进行系统发育分析，确定它们与地衣芽孢杆菌的亲缘关系密切。海内氏芽孢杆菌LY-23基于16S rRNA基因序列比对结果以E.coliATCC 11775T(X80725.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树如图3所示。
在表型分析中，发现海内氏芽孢杆菌LY-23在pH值5-6条件下生长并耐受高达8％的NaCl(w/v)，具有β-半乳糖苷酶活性，具有独特的碳利用模式，区别于其系统发育关系最近的菌株，根据系统发育和表型分析的共识，这菌株属于海内氏芽孢杆菌LY-23，在马属动物中属首次发现。
实施例2
海内氏芽孢杆菌LY-23碳水化合物发酵实验：利用普通细菌生化鉴定管(广东环凯生物技术有限公司)，进行糖发酵实验。结果表明该菌可利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖等自然界中广泛存在的多种碳水化合物，结果如表1所示，具有可在富含植物性成分的环境中广泛生长的良好基础，也可作为发酵植物性饲料的备选菌株。
表1海内氏芽孢杆菌LY-23碳水化合物发酵
实施例3
海内氏芽孢杆菌LY-23产酶实验。
基础培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；奶粉培养基(蛋白酶)：A：3.2g脱脂奶粉加蒸馏水定容至120mL，121℃灭菌1min；B：3.2g琼脂加蒸馏水定容至120mL，121℃灭菌20min；将A、B分别灭菌后冷却至60℃混匀后倒平板，用于蛋白酶活性检测。
在凝固冷却的培养基平板上，用牛津杯法接种目的菌株，测量奶粉培养基平板水解圈的大小，以判断是否具可分泌蛋白酶。
淀粉酶检测：在定性培养基固体平板点样孔中加入待测菌液，设置3个重复，37℃培养20-24h，向淀粉酶定性培养基中加入0.1mL的碘液，将碘液均匀涂布覆盖平板，静置10min，记录碘液染色的蓝紫色平板上出现显色圈的大小，以判断是否分泌淀粉酶。
纤维素酶：在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)筛选培养基平板，放置直径为4-5mm的滤纸小圆片。将供试菌株置于LB液体培养基中，37℃、200r/min过夜培养12h后，取待测菌液5μL点在滤纸中央，每个处理3个重复，37℃，培养36-48h，将革兰氏碘液注入并淹没平板表面，静置4min，观测并记录滤纸片周围透明圈直径，以判断是否分泌纤维素酶。
实验结果如表2所示，该海内氏芽孢杆菌LY-23具有蛋白酶，淀粉酶活性，并具有极强的纤维素酶活性，进一步证实该菌株可作为发酵饲料的候选菌株。
表2.海内氏芽孢杆菌LY-23产酶实验结果
实施例4
海内氏芽孢杆菌LY-23的安全性评价。
试验菌株：取复苏的海内氏芽孢杆菌LY-23接种到LB液体培养基中，37℃培养48h。
试验动物：健康ICR小鼠，体重17～21g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，动物质量合格证号：SCXK-(吉)2016-0003。
小鼠急性经口毒性试验：按照GB 15193.3-2014《食品安全国家标准急性经口毒性试验》和《保健食品检验与评价技术规范2003版》要求进行实验。随机选取雄性小鼠28只，分为2组，每组14只，设置空白对照组和实验组，各组每天定时经口灌胃1次，分别灌服0.2m L/只生理盐水，以及109CFU/只菌液，连续灌胃7d。观察并记录各组小鼠的行为、死亡情况、中毒表现和腹泻情况。
菌株易位实验：饲喂28天后，无菌操作下每组取三只小鼠的肝脏、脾脏、肾脏，分别加入适量的无菌生理盐水后制成组织匀浆液，分别涂布于LB固体培养基平板，37℃培养48h，观察菌落生成情况。
试验结果：灌服不同梯度海内氏芽孢杆菌LY-23菌液后，对小鼠一般体征、行为、活动、毛发、色泽、饮食、粪便的影响，均无不良反应和死亡现象；体重持续增长；肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数无异常。海内氏芽孢杆菌LY-23在小鼠肝脏、肾脏、脾脏均无细菌易位发生；高剂量的海内氏芽孢杆菌LY-23测得的血液指标和对照组无区别。
通过小鼠安全性试验判定该海内氏芽孢杆菌LY-23无毒性，且无抗原抗体反应，结合碳水合物实验以及酶学实验，此菌株可作为饲用添加剂的候选菌株。
实施例5
海内氏芽孢杆菌LY-23对黑毛驴生长性能及肠道菌群多样性的影响:
实验动物及分组：选取4月龄～7月龄的雌性驴驹10头，平均体重111.80±15.69kg，随机分为2组，每组5头，预饲期7天，正式期60天。试验根据添加剂不同分为两组：I)对照组(基础日粮)；II)试验组(添加海内氏芽孢杆菌LY-23 1012cfu/kg的精饲料)。每头每天10：00和16：30两次饲喂精饲料，精料添加量固定为初始体重1.3％，粗料自由采食，全天自由饮水。动物日粮组成及营养水平见表3。
表3基础饲粮组成及营养水平(风干基础)％
项目 基础日粮 营养水平 基础日粮 粗料
玉米 46 干物质DM％ 92.57 15.55
豆粕 10 有机物OM％ 83.84 90.03
棉籽粕 10 粗蛋白质CP％ 21.54 8.75
花生仁粕 11 粗脂肪EE％ 1.72 1.17
玉米胚芽 4 中性洗涤纤维NDF％ 45.98 72.75
DDGS 10 酸性洗涤纤维ADF％ 8.28 54.63
石粉 4 钙Ca 1.12 1.26
预混料<sup>1</sup> 5 总磷TP 0.67 0.17
合计Total 100 代谢能<sup>2</sup>ME/(MJ/kg) 13.28 12.87
1每千克预混料含有:MgO 0.076g，ZnSO4·H2O 0.036g，MnSO4·H2O0.043g，FeSO4·H2O 0.053g，NaSeO3 0.031g，VA 484IU，VD3 496.8IU，VE 0.828IU，VK3 0.23mg，VB10.092mg，VB2 0.69mg，VB12 0.00138mg，叶酸0.023mg，烟酸1.62mg，泛酸1.15mg，CaHPO45.17g，CaCO3 4.57g。
2代谢能为计算值，其余为实测值。
(1)添加海内氏芽孢杆菌LY-23对黑毛驴生长性能影响:
生长性能的测定：试验正式期的第1、15、30、45、60d晨饲前称量动物体重。每隔3d对每头驴精饲料和粗饲料投食量和剩食量进行记录，计算每头驴采食量(ADFI)和料重比(F/G)。
添加海内氏芽孢杆菌LY-23对黑毛驴生长性能影响如表4所示，对照组和添加组在驴驹初始体重相差3.2kg，但差异不显著(p＝0.76)，45d实验结束时末重上并无显著差异(P＞0.05)，但添加组与对照组体重差异变为1.9kg，生长速度高于对照组，平均日增重和料重比无显著差异(P＞0.05)，但与对照组相比分别有增加和降低的趋势。这表明添加海内氏芽孢杆菌具有增加动物生长速度，提高日增重、降低料重比的潜力。
表4添加海内氏芽孢杆菌LY-23对黑毛驴生长性能影响
项目 对照组 添加组 s.e.m P value
初始体重kg 113.40 110.20 10.46 0.76
末重kg 130.20 128.30 12.82 0.65
总增重kg 16.80 18.10 4.36 0.55
平均日增重g 280.00 301.67 70.35 0.55
平均日采食量kg 3.02 2.97 0.14 0.12
料重比F/G 10.79 9.85 2.86 0.38
(2)添加海内氏芽孢杆菌LY-23对黑毛驴消化代谢影响:
消化代谢指标测定：营养物质消化率采用2N盐酸不溶性灰份法测定，饲料及粪样的干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(ADF)和酸性洗涤纤维(NDF)参照《饲料分析及饲料质量检测技术(第4版)》。
添加海内氏芽孢杆菌对黑毛驴营养物质消化代谢如表5所示，添加组和对照组在干物质消化率、粗蛋白质消化率、中性洗涤纤维消化率、酸性洗涤纤维消化率和粗脂肪消化率均有增加的趋势，与对照组相比分别提高0.65％，0.94％，2.37％，2.98％和11.94％。这表明，添加海内氏芽孢杆菌可提高营养物质消化率，节约饲料投入，降低饲养成本，尤其提高脂类营养物质的利用。按此阶段每头驴每日采食量3kg，其中精粗比5:5计算，每头驴每天可节约4.27g蛋白质，1000头驴的饲养场，每天可节约蛋白质4.27kg，一年则可以节约蛋白质1.6吨，假设蛋白质均由豆粕提供，优质豆粕蛋白质含量按42％计算，可节约豆粕3.71吨，降低饲养成本1.3万多元。因此添加海内氏芽孢杆菌LY-23作为驴用益生菌制剂的核心菌种在提高营养物质消化率和降低饲养成本方面具有较好应用潜力。
表5添加海内氏芽孢杆菌LY-23对黑毛驴消化代谢影响％
项目 对照组 添加组 s.e.m P value
干物质消化率 94.70 95.32 0.57 0.30
粗蛋白质消化率 89.07 89.91 1.82 0.65
中性洗涤纤维消化率 83.71 85.69 1.93 0.33
酸性洗涤纤维消化率 74.77 76.66 2.67 0.49
粗脂肪消化率 52.25 58.49 5.69 0.30
(3)添加海内氏芽孢杆菌LY-23对黑毛驴血清免疫球蛋白的影响：
血清免疫指标测定：总蛋白(total proteins，TP)，白蛋白(albumin，ALB)检测使用Beckman AU 480全自动生化分析仪测定。试剂盒采购于中生北控生物科技有限公司，球蛋白(globulin，GLOB)采用总蛋白与白蛋白的差值表示。血清免疫球蛋白A、G、M(Immunoglobulin A、G、M，IgA、IgG、IgM)采用Elisa试剂盒测定。
添加海内氏芽孢杆菌LY-23对黑毛驴血清免疫指标影响如表6所示，添加组血清免疫球蛋白IgG含量显著高于对照组组(P＜0.05)，IgA和IgM也有增加的趋势，但差异不显著(P＞0.05)。免疫球蛋白在机体内广泛参与体液免疫反应，其中IgA、IgM和IgG是参与体液免疫的主要免疫球蛋白，这3种免疫球蛋白在血清中的含量与机体体液免疫水平呈正相关。IgA和IgG具有抑菌、抗病毒等免疫活性，IgM在机体发生初期免疫应答时起重要作用，具有激活补体等生物学功能，添加海内氏芽孢杆菌可显著提高血清IgG的含量，有利于增强动物机体免疫力，提高对疾病等抵抗能力。
表6添加海内氏芽孢杆菌LY-23对黑毛驴血清生化指标影响
项目 对照组 添加组 s.e.m P value
球蛋白GLOB(g/L) 35.05 34.05 3.15 0.75
免疫球蛋白A，IgA(mg/ml) 5.24 6.06 2.05 0.70
免疫球蛋白G，IgG(mg/ml) 7.78b 11.08a 0.52 0.01
免疫球蛋白M，IgM(mg/ml) 0.71 0.96 0.29 0.42
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院特产研究所
<120> 海内氏芽孢杆菌LY-23、菌剂及其应用和应用其的产品
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1405
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌（Bacillus haynesii）
<400> 1
tgcaagtcga gcggaccgac gggagcttgc tcccttaggt cagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120
atgcttgatt gaaccgcatg gttcaatcat aaaaggtggc ttttagctac cacttgcaga 180
tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta 240
gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360
tgatgaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgttaggga agaacaagta ccgttcgaat 420
agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 480
cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg 540
gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactggg 600
gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat 660
gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct gaggcgcgaa 720
agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct 780
aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgcagcaaac gcattaagca ctccgcctgg 840
ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca 960
accctagaga tagggcttcc ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt 1080
gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1140
atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatgggcaga 1200
acaaagggca gcgaagccgc gaggctaagc caatcccaca aatctgttct cagttcggat 1260
cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1320
gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac 1380
acccgaagtc ggtgaggtaa ccttt 1405
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
attcacgcta tcactgactt attc 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgggagaca aagtagaacc gag 23

Claims (10)

1.一株海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23，于2018年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018942。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌(Bacillushaynesii)LY-23。
3.发酵方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌(Bacillushaynesii)LY-23或权利要求2所述的菌剂发酵底物；
优选地，所述底物包括糖类底物；
优选地，所述糖类底物包括葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖、L-阿拉伯糖、半乳糖、山梨醇、七叶苷、蕈糖、果糖、纤维二糖和苦杏仁苷中的至少一种。
4.权利要求3所述的发酵方法得到的发酵产物。
5.权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23，权利要求2所述的菌剂、权利要求3所述的发酵方法或权利要求4所述的发酵产物在制备饲料添加剂或饲料中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，使用所述海内氏芽孢杆菌(Bacillushaynesii)LY-23或所述菌剂发酵植物类的饲料原料，以制备所述饲料添加剂或所述饲料。
7.饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂包含权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23、权利要求2所述的菌剂和权利要求4所述的发酵产物中的一种或多种。
8.饲料，其特征在于，所述饲料包含权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌(Bacillushaynesii)LY-23、权利要求2所述的菌剂、权利要求4所述的发酵产物和权利要求7所述的饲料添加剂中的一种或多种；
优选地，所述饲料包括发酵饲料。
9.一种用于改善马属动物肠道环境的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23、权利要求2所述的菌剂、权利要求5所述的发酵产物、权利要求7所述的饲料添加剂和权利要求8所述的饲料中的一种或多种；所述马属动物优选包括驴。
10.一种用于改善马属动物免疫力的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)LY-23、权利要求2所述的菌剂、权利要求5所述的发酵产物、权利要求7所述的饲料添加剂和权利要求8所述的饲料中的一种或多种；所述马属动物优选包括驴。
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