CN107022511A - 一种驴用促生长复合活菌制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种驴用促生长复合活菌制剂及其制备方法；属于生物制剂领域。本发明驴用促生长复合活菌制剂是将干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别依次经过活化，扩大培养，液态发酵培养，离心浓缩和喷雾干燥处理后复配。本发明驴用促生长复合活菌制剂具有活菌数高、绿色安全、无毒副作用等优点。驴用促生长复合活菌制剂在提高断奶仔驴头均日增重，降低料重比的同时，降低腹泻发病率。适于在规模化驴养殖场，实现健康、生态养驴，满足人们对绿色、保健驴产品的需求。可大幅度推动我国驴养殖业的发展，提高驴产业的综合效益，对于我国驴养殖业的健康、循环、可持续发展具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂领域；具体涉及一种驴用促生长复合活菌制剂及其制备方法。
背景技术
随着生活水平的提高和消费观念的转变，人们对自身健康和生态环境日益关注。众所周知，驴产品具有极高的的药用、保健和营养价值，驴肉、驴皮、驴乳、驴脂等产品的需求量日益增加。驴产品市场呈现供不应求的局面，这也对驴养殖业提出了更高的要求。现代养殖业已经向高效、绿色、无公害、环保的生态养殖模式转变。
复合活菌制剂做为微生态制剂的一种，具有绿色、安全、无抗等特点，已被广泛应用于畜牧业养殖。其主要由两种或两种以上的不同益生菌菌属组成，将具有不同生物功能的益生菌组合，研制的复合活菌制剂通过生物拮抗作用、生物夺氧用及及增强免疫等作用以维持胃肠道内环境平衡，且益生菌可在动物机体内生长代谢，产生的各种消化酶能提高驴对饲料中各种营养成分的消化吸收，提高饲料效率和生长性能。驴用促生长复合活菌制剂可提高驴养殖业的综合效益，具有广阔的推广前景，同时为发展驴规模化生态养殖，生产绿色、有机、无公害驴产品提供技术支撑，对于我国驴养殖业的健康、循环、可持续发展具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种活菌数高、抗逆性强、绿色安全、无毒副作用的驴用促生长复合活菌制剂。
本发明的一种驴用促生长复合活菌制剂是将干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，分别依次经过活化，一级种子、二级种子培养，发酵培养，离心浓缩和喷雾干燥处理后复配制成，其中干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的有效活菌数比例为：0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2。
所述的一种驴用促生长复合活菌制剂，其中所述干酪乳杆菌为干酪乳杆菌SY3，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌SSYB，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌SY6。
一种所述驴用促生长复合活菌制剂的制备方法，其特征在于该促生长生物制剂的工艺是按下述步骤进行：
步骤a、将干酪乳杆菌活化，液体培养基扩大培养至活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，收集发酵液，再经离心浓缩、喷雾干燥，得到粉状制剂a；
步骤b、将解淀粉芽孢杆菌活化，液体培养基扩大培养至活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，收集发酵液，再经离心浓缩、喷雾干燥，得到粉状制剂b；
步骤c、将枯草芽孢杆菌活化，液体培养基扩大培养至活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，收集发酵液，再经离心浓缩、喷雾干燥，得到粉状制剂c；
步骤d、然后将粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c复配，得到驴用促生长复合活菌制剂。
其中，步骤a中的干酪乳杆菌、步骤b中的解淀粉芽孢杆菌、步骤c中的枯草芽孢杆菌一级、二级液体培养用种子液制备方法为：将菌种接种于5mL液体培养基中，置于35-37℃培养一段时间，完成活化，然后划线接种，选取5个以上典型菌落，接种于5-10mL液体培养基，置于35-37℃培养，作为一级种子，取一级种子接种于50-100mL液体培养基中，置于35-37℃培养，即为二级种子。
优选地，其特征在于干酪乳杆菌的菌种及一级种子均接种于MRS液体培养基中，解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的菌种及一级种子分别接种于营养肉汤中；干酪乳杆菌的菌种划线接种于MRSA平板上，解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌种分别划线接种于营养琼脂平板上；干酪乳杆菌的菌种及一级种子的培养条件为微需氧，培养时间为36-48h，解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌种及一级种子的培养条件为振荡培养，培养时间为24-36h。
其中，步骤a中的干酪乳杆菌的二级种子于液态发酵罐中的液态深层培养方法为：发酵培养基为MRS液态培养基，接种量为2％-5％，装液量为70％-80％，35-37℃和pH值6.0-7.0条件下微需氧发酵培养36-48h；步骤b中的解淀粉芽孢杆菌、步骤c中的枯草芽孢杆菌的二级种子于液态发酵罐中的液态深层培养方法为：发酵培养基为营养肉汤，接种量为1％-3％，装液量为60％-80％，在120-190rpm、33-35℃和pH值6.0-7.0条件下发酵培养24-36h。
其中，步骤a中的干酪乳杆菌的二级种子发酵液、步骤b中的解淀粉芽孢杆菌的二级种子发酵液、步骤c中的枯草芽孢杆菌的二级种子发酵液离心浓缩方法为：将发酵培养液1000mL，以5000-8000rpm的转速离心10-15min，加入100mL无菌生理盐水重悬菌泥，加入脱脂乳保护剂，制备成离心浓缩料液。
优选地，步骤a中的干酪乳杆菌的发酵液离心浓缩时脱脂乳保护剂添加量为15-18％w/v；步骤b中的解淀粉芽孢杆菌的二级种子发酵液、步骤c中的枯草芽孢杆菌的二级种子发酵液离心浓缩时脱脂乳保护剂添加量为17-20％w/v。
其中，步骤a中的干酪乳杆菌发酵液喷雾干燥过程中，设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数为：出口温度70-80℃、入口温度120-140℃、入料速度1000-1200mL/h；步骤b中的解淀粉芽孢杆菌发酵液、步骤c中枯草芽孢杆菌发酵液喷雾干燥过程中，设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数为：出口温度80-85℃、入口温度140-150℃、入料速度1300-1500mL/h。
优选地，所述驴用促生长复合活菌制剂的制作方法中步骤d中将粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c、按质量比1:1:1复配。
本发明的驴用促生长复合活菌制剂具有活菌数高、抗逆性强、绿色安全、无毒副作用等优点。临床应用证实，驴用促生长复合活菌制剂在提高驴头均日增重，降低料重比的同时，降低仔驴腹泻发病率，减少腹泻治疗用抗生素使用量，适于在规模化驴养殖场推广应用，实现健康养殖，满足人们对绿色驴产品的需求。
具体实施方式
下述使用的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)SY3公开自2011年第28卷第7期《猪业科学》94-95页的《齐齐哈尔周边地区仔猪肠道乳酸杆菌的分离与鉴定》。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SSYB公开自2017年第38卷第4期《家畜生态学报》58-62页的《一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其酶促反应适宜条件初步研究》。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SY6公开自2013年第26卷第1期《中国生物制品学杂志》122-128页的《猪源枯草芽孢杆菌喷雾干燥工艺的优化》。
上述三株微生物馈赠获得！
具体实施方式一
本实施方式中一种驴用促生长复合活菌制剂是将干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，分别依次经过活化，一级种子、二级种子培养，发酵培养，离心浓缩和喷雾干燥处理后复配制成，其中干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的有效活菌数比例为：0.8:1.2:1.0。
本实施方式中一种驴用促生长复合活菌制剂的制备方法，其特征在于该驴用促生长复合活菌制剂是按下述步骤进行的：
步骤a、将干酪乳杆菌SY3菌种接种5mL MRS液体培养基中，置于37℃微需氧培养36h，完成活化，然后划线接种于MRSA平板上，选取5个以上典型菌落，接种于10mL MRS液体培养基若干支，置于37℃微需氧培养48h，作为一级种子，取一级种子接种于100mL MRS液体培养基中，置于37℃微需氧培养48h，即为二级种子。将干酪乳杆菌二级种子接种到液态发酵罐中，进行液态深层培养，发酵培养基为MRS液态培养基，接种量为5％，装液量80％，于37℃和pH值7.0条件下微需氧培养48h，待活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，取干酪乳杆菌培养液体1000mL，以5000rpm的转速离心15min，加入100mL无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量18％w/v，制备成离心浓缩料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度70℃、入口温度120℃、入料速度1000mL/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂a；
步骤b、将解淀粉芽孢杆菌SSYB菌种接种5mL营养肉汤中，置于37℃振荡培养36h，完成活化，然后划线接种于营养琼脂平板上，选取5个以上典型菌落，接种于10mL营养肉汤若干支，置于37℃振荡培养36h，作为一级种子，取一级种子接种于100mL营养肉汤中，置于37℃振荡培养36h，即为二级种子。将解淀粉芽孢杆菌二级种子接种到液态发酵罐中，进行液态深层培养，发酵培养基为营养肉汤，接种量为3％，装液量80％，在190rpm/min、35℃和pH值7.0条件下培养36h，待活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，取解淀粉芽孢杆菌培养液体1000mL，以5000rpm的转速离心15min，加入100mL无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量为20％w/v，制备成离心浓缩料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度85℃、入口温度150℃、入料速度1500mL/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂b；
步骤c、将枯草芽孢杆菌SY6菌种接种5mL营养肉汤中，置于37℃振荡培养36h，完成活化，然后划线接种于营养琼脂平板上，选取5个以上典型菌落，接种于10mL营养肉汤若干支，置于37℃振荡培养36h，作为一级种子，取一级种子接种于100mL营养肉汤中，置于37℃振荡培养36h，即为二级种子。将枯草芽孢杆菌二级种子接种到液态发酵罐中，进行液态深层培养，发酵培养基为营养肉汤，接种量为3％，装液量80％，在188rpm、35℃和pH值7.0条件下培养36h，待活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，取枯草芽孢杆菌培养液体1000mL，以5000rpm的转速离心15min，加入100mL无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量为20％w/v，制备成离心浓缩料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度85℃、入口温度150℃、入料速度1500mL/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂c；
步骤d、然后将粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c按质量比0.8:1.2:1.0复配；即得到驴用促生长复合活菌制剂。
微需氧条件为O2浓度为5％、N2浓度为85％、CO2浓度为10％。
具体实施方式二
本实施方式中一种驴用促生长复合活菌制剂是将干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，分别依次经过活化，一级种子、二级种子培养，发酵培养，离心浓缩和喷雾干燥处理后复配制成，其中干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的有效活菌数比例为：1.0:0.8:1.2。
本实施方式中一种驴用促生长复合活菌制剂的制备方法，其特征在于该驴用促生长复合活菌制剂是按下述步骤进行的：
步骤a、将干酪乳杆菌SY3菌种接种5mL MRS液体培养基中，置于35℃微需氧培养48h，完成活化，然后划线接种于MRSA平板上，选取5个以上典型菌落，接种于5mL MRS液体培养基若干支，置于35℃微需氧培养36h，作为一级种子，取一级种子接种于50mL MRS液体培养基中，置于35℃微需氧培养36h，即为二级种子。将干酪乳杆菌二级种子接种到液态发酵罐中，进行液态深层培养，发酵培养基为MRS液态培养基，接种量为2％，装液量70％，于35℃和pH值6.0条件下微需氧培养36h，待活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，取干酪乳杆菌培养液体1000mL，以8000rpm的转速离心10min，加入100mL无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量15％w/v，制备成离心浓缩料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度80℃、入口温度140℃、入料速度1200mL/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂a；
步骤b、将解淀粉芽孢杆菌SSYB菌种接种5mL营养肉汤中，置于35℃振荡培养24h，完成活化，然后划线接种于营养琼脂平板上，选取5个以上典型菌落，接种于5mL营养肉汤若干支，置于35℃振荡培养24h，作为一级种子，取一级种子接种于50mL营养肉汤中，置于35℃振荡培养24h，即为二级种子。将解淀粉芽孢杆菌二级种子接种到液态发酵罐中，进行液态深层培养，发酵培养基为营养肉汤，接种量为1％，装液量60％，在187rpm、33℃和pH值6.0条件下培养24h，待活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，取解淀粉芽孢杆菌培养液体1000mL，以8000rpm的转速离心10min，加入100mL无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量为17％w/v，制备成离心浓缩料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度80℃、入口温度140℃、入料速度1300mL/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂b；
步骤c、将枯草芽孢杆菌SY6菌种接种5mL营养肉汤中，置于35℃振荡培养24h，完成活化，然后划线接种于营养琼脂平板上，选取5个以上典型菌落，接种于5mL营养肉汤若干支，置于35℃振荡培养24h，作为一级种子，取一级种子接种于50mL营养肉汤中，置于35℃振荡培养24h，即为二级种子。将枯草芽孢杆菌二级种子接种到液态发酵罐中，进行液态深层培养，发酵培养基为营养肉汤，接种量为1％，装液量60％，在122rpm、33.5℃和pH值6.1条件下培养25h，待活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，取枯草芽孢杆菌培养液体1000mL，以5000以7990rpm的转速离心10min，加入100mL无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量为17.3％w/v，制备成离心浓缩料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度80℃、入口温度141℃、入料速度1300mL/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂c；
步骤d、然后将粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c按质量比1.0:0.8:1.2复配；即得到驴用促生长复合活菌制剂。
具体实施方式三
本实施方式中一种驴用促生长复合活菌制剂是将干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，分别依次经过活化，一级种子、二级种子培养，发酵培养，离心浓缩和喷雾干燥处理后复配制成，其中干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的有效活菌数比例为：1.0:1.0:1.0。
本实施方式中一种驴用促生长复合活菌制剂的制备方法，其特征在于该驴用促生长复合活菌制剂是按下述步骤进行的：
步骤a、将干酪乳杆菌SY3菌种接种5mL MRS液体培养基中，置于36℃微需氧培养42h，完成活化，然后划线接种于MRSA平板上，选取5个以上典型菌落，接种于8mL MRS液体培养基若干支，置于36℃微需氧培养43h，作为一级种子，取一级种子接种于78mL MRS液体培养基中，置于36℃微需氧培养42.5h，即为二级种子。将干酪乳杆菌二级种子接种到液态发酵罐中，进行液态深层培养，发酵培养基为MRS液态培养基，接种量为3.6％，装液量76％，于36℃和pH值6.5条件下微需氧培养42h，待活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，取干酪乳杆菌培养液体1000mL，以6500rpm的转速离心12min，加入100mL无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量16.5％w/v，制备成离心浓缩料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度75℃、入口温度132℃、入料速度1150mL/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂a；
步骤b、将解淀粉芽孢杆菌SSYB菌种接种5mL营养肉汤中，置于35.8℃振荡培养28.2h，完成活化，然后划线接种于营养琼脂平板上，选取5个以上典型菌落，接种于7mL营养肉汤若干支，置于36℃振荡培养28h，作为一级种子，取一级种子接种于75mL营养肉汤中，置于36℃振荡培养27.9h，即为二级种子。将解淀粉芽孢杆菌二级种子接种到液态发酵罐中，进行液态深层培养，发酵培养基为营养肉汤，接种量为2％，装液量70％，在155rpm/min、34℃和pH值6.5条件下培养27h，待活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，取解淀粉芽孢杆菌培养液体1000mL，以6490rpm的转速离心13min，加入100mL无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量为18.5％w/v，制备成离心浓缩料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度83℃、入口温度145℃、入料速度1400mL/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂b；
步骤c、将枯草芽孢杆菌SY6菌种接种5mL营养肉汤中，置于36℃振荡培养29h，完成活化，然后划线接种于营养琼脂平板上，选取5个以上典型菌落，接种于7.5mL营养肉汤若干支，置于35.7℃振荡培养28h，作为一级种子，取一级种子接种于75mL营养肉汤中，置于36℃振荡培养27.7h，即为二级种子。将枯草芽孢杆菌二级种子接种到液态发酵罐中，进行液态深层培养，发酵培养基为营养肉汤，接种量为1.8％，装液量69％，在156rpm、33.8℃和pH值6.6条件下培养，待活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，取枯草芽孢杆菌培养液体1000mL，以6510rpm的转速离心12.5min，加入100mL无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量为18.6％w/v，制备成离心浓缩料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度82℃、入口温度144℃、入料速度1400mL/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂c；
步骤d、然后将粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c按质量比1.0:1.0:1.0复配；即得到驴用促生长复合活菌制剂。
针对上述实施例，检测驴用促生长符合活菌制剂对驴的各项生长指标、排泄的影响，以及探索干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的在不同温度下保存对菌群活力的影响，以及满足最大生产性能的三种菌配比情况。
1.驴用促生长复合活菌制剂对驴仔生长性能及腹泻影响
在黑龙江省三头驴农业科技有限公司和齐齐哈尔康和牧业有限责任公司驴场进行驴用促生长复合活菌制剂应用试验，选择断奶后一周的健康仔驴200头，随即分成2组，每组100头。其中，试验组：饲喂常规饲料和粉状菌剂；对照组：饲喂常规饲料，不添加菌剂，试验周期为21d。复合活菌制剂饲喂量为1.0×108CFU/d/头。
试验期内记录每天各组增重和干物质摄入量，计算头均日增重、采食干物质量、料重比(头均日采食干物质量/头均日增重×100％)。记录每天各组驴出现腹泻的头数，计算腹泻率。腹泻率＝试验期内腹泻病发生次数之和/试验天数×试验头数×100％。
实验结果表明，试验组驴头均日增重显著高于对照组(P<0.05)，且料重比也显著低于对照组(P<0.05)，饲喂驴用促生长复合活菌制剂可提高断奶仔驴生长性能，具体结果见表1。
表1 复合活菌制剂对仔驴生长性能的影响
在预防仔驴腹泻方面，试验组仔驴腹发病率显著低于对照组(P<0.05)，饲喂驴用促生长复合活菌制剂可预防腹泻，具体结果见表2。
表2 驴用促生长复合活菌制剂对仔驴腹泻率的影响
2.驴用促生长复合活菌制剂保存期试验
取活菌制剂干粉，检测总菌数达到1011CFU/g以上。分别储存于-20℃，4℃及室温环境中，储存时间为12个月，每月检测活菌制剂中活菌总数，参考中华人民共和国农业行业标准“NY/T 2131-2012饲料添加剂枯草芽孢杆菌”在保存期内活菌制剂成品中活菌总数应达到109CFU/g。
实验结果表明，在-20℃储存温度条件下，活菌制剂可储存11个月以上。在4℃储存温度条件下，活菌制剂可储存8个月。在室温条件下，活菌制剂可储存6个月。在保存期内活菌制剂中活菌总数可达到109CFU/g以上，具体结果见表3。
表3 温度与储存时间对活菌制剂总活菌数的影响(单位：CFU/g)
3.不同质量配比的复合活菌制剂对仔驴生长性能和腹泻的影响
具体实施方式一的方法步骤d中将粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c按表4中的质量配比混合，进行饲喂试验，具体结果见5。
表4 复合活菌制剂质量配比方案
表5 不同质量配比的复合活菌制剂对仔驴生长性能和腹泻的影响
由表5可知，步骤d中粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c按1:1:1的质量配比复配在提高仔驴生长性能和降低腹泻率方面效果最好。
Claims (10)
1.一种驴用促生长复合活菌制剂，其特征在于所述驴用促生长复合活菌制剂是将干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别依次经过菌种活化、扩大培养、离心浓缩和喷雾干燥处理后复配制成，其中干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的有效活菌数比例为：0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2。
2.根据权利要求1所述一种驴用促生长复合活菌制剂，其特征在于所述干酪乳杆菌为干酪乳杆菌SY3，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌SSYB，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌SY6。
3.一种根据权利要求1所述的驴用促生长复合活菌制剂的制备方法，其特征在于该促生长生物制剂的工艺是按下述步骤进行的：
步骤a、将干酪乳杆菌活化，液体培养基扩大培养至活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，收集发酵液，再经离心浓缩、喷雾干燥，得到粉状制剂a；
步骤b、将解淀粉芽孢杆菌活化，液体培养基扩大培养至活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，收集发酵液，再经离心浓缩、喷雾干燥，得到粉状制剂b；
步骤c、将枯草芽孢杆菌活化，液体培养基扩大培养至活菌数达5.0×109CFU/mL以上时，收集发酵液，再经离心浓缩、喷雾干燥，得到粉状制剂c；
步骤d、然后将粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c复配，得到驴用促生长复合活菌制剂；
其中，步骤d粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c按有效活菌数0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2的比例复配。
4.根据权利要求3所述的一种驴用促生长复合活菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤a中的干酪乳杆菌、步骤b中的解淀粉芽孢杆菌、步骤c中的枯草芽孢杆菌一级、二级液体培养用种子液制备方法为：将菌种接种于5mL液体培养基中，置于35-37℃培养，完成活化，然后划线接种，选取5个以上典型菌落，接种于5-10mL液体培养基，置于35-37℃培养，作为一级种子，取一级种子接种于50-100mL液体培养基中，置于35-37℃培养，即为二级种子。
5.根据权利要求4所述的一种驴用促生长复合活菌制剂的制备方法，其特征在于干酪乳杆菌的菌种及一级种子均接种于MRS液体培养基中，解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的菌种及一级种子分别接种于营养肉汤中；干酪乳杆菌的菌种划线接种于MRSA平板上，解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌种分别划线接种于营养琼脂平板上；干酪乳杆菌的菌种及一级种子的培养条件为微需氧，培养时间为36-48h，解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌种及一级种子的培养条件为振荡培养，培养时间为24-36h。
6.根据权利要求3所述的一种驴用促生长复合活菌制剂的制备方法，其特征在于步骤a中的干酪乳杆菌的二级种子于液态发酵罐中的液态深层培养方法为：发酵培养基为MRS液态培养基，接种量为2％-5％，装液量为70％-80％，35-37℃和pH值6.0-7.0条件下微需氧发酵培养36-48h；步骤b中的解淀粉芽孢杆菌、步骤c中的枯草芽孢杆菌的二级种子于液态发酵罐中的液态深层培养方法为：发酵培养基为营养肉汤，接种量为1％-3％，装液量为60％-80％，在120-190rpm、33-35℃和pH值6.0-7.0条件下发酵培养24-36h。
7.根据权利要求3所述的一种驴用促生长复合活菌制剂的制备方法，其特征在于步骤a中的干酪乳杆菌的二级种子发酵液、步骤b中的解淀粉芽孢杆菌的二级种子发酵液、步骤c中的枯草芽孢杆菌的二级种子发酵液离心浓缩方法为：将发酵培养液1000mL，以5000-8000rpm的转速离心10-15min，加入100mL无菌生理盐水重悬菌泥，加入脱脂乳保护剂，制备成离心浓缩料液。
8.根据权利要求7所述的一种驴用促生长复合活菌制剂的制备方法，其特征在于步骤a中的干酪乳杆菌的发酵液离心浓缩时脱脂乳保护剂添加量为15-18％w/v；步骤b中的解淀粉芽孢杆菌的二级种子发酵液、步骤c中的枯草芽孢杆菌的二级种子发酵液离心浓缩时脱脂乳保护剂添加量为17-20％w/v。
9.根据权利要求3所述的一种驴用促生长复合活菌制剂的制备方法，其特征在于步骤a中的干酪乳杆菌发酵液喷雾干燥过程中，设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数为：出口温度70-80℃、入口温度120-140℃、入料速度1000-1200mL/h；步骤b中的解淀粉芽孢杆菌发酵液、步骤c中枯草芽孢杆菌发酵液喷雾干燥过程中，设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数为：出口温度80-85℃、入口温度140-150℃、入料速度1300-1500mL/h。
10.根据权利要求3-9中任一所述的一种驴用促生长复合活菌制剂的制备方法，其特征在于步骤d将粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c、按质量比1:1:1复配。
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