CN107043724A - 一种地衣芽孢杆菌及其分离方法与应用 - Google Patents

一种地衣芽孢杆菌及其分离方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种地衣芽孢杆菌及其分离方法与应用，属于微生物应用与饲料加工生产领域。本发明提供一种地衣芽孢杆菌能有效的增加偶蹄目动物胃液中纤维素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一种的含量，将上述的地衣芽孢杆菌应用于制备菌剂或者饲料，能较好的改善经济动物饲养过程中饲料利用率低，生长慢的问题；上述菌剂或者饲料能使偶蹄目动物饲料利用率提高，达到快速生长的目的。

Description

一种地衣芽孢杆菌及其分离方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物应用与饲料加工生产领域，具体而言，涉及一种地衣芽孢杆菌及其分离方法与应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高和对健康的日益重视，食品安全也越来越受到大家的重视。
作为动物性食品的供应者，畜牧业在维护食品安全方面具有重要作用。在我国养殖业中，抗生素的过度使用，造成了药物残留以及大量耐药性细菌产生，其结果严重阻碍了畜、禽、水产养殖业的健康持续发展，为食品安全和消费者的身体健康埋下了隐患，因此寻找安全、无残留的抗生素替代品迫在眉睫。包含益生菌的生物饲料添加剂是一种十分理想的部分抗生素的替代品，其中益生菌是开发质量稳定、效果显著、性价比高的生物饲料添加剂的重要基础。但是益生菌的研究和开发的关键问题在于优良菌株的分离和筛选、良好的益生菌处理工艺。目前，益生菌菌种存在以下几个问题：1.大多数的益生菌为不产芽孢的乳酸菌，且多属专性厌氧菌，极易受到温度、氧气、水分及酸碱等外界环境因素的影响，通常益生菌活性保持比较困难；2.多数益生菌在饲料加工过程中难以耐受饲料制粒时的高温；3.菌种本身的特性不好，产酶、抑菌能力差。
益生菌在养猪业和家禽养殖中的应用比较广泛，且饲用效果也得到广泛的验证和肯定。而微生物制剂在反刍动物营养与饲料中的应用的研究较少，尤其是微生物益生菌在鹿的营养饲料中的应用研究更为少见。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种地衣芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12486。
本发明的第二目的在于提供上述的地衣芽孢杆菌的生物学纯培养物。
本发明的第三目的在于一种上述的地衣芽孢杆菌的分离方法，其包括：取梅花鹿瘤胃液，加入生理盐水，振荡混匀，加热后梯度稀释，得到梯度稀释液，利用倾注培养法分离培养梯度稀释液，采用平板划线法纯化菌种，得到地衣芽孢杆菌。
本发明的第四目的在于提供上述的地衣芽孢杆菌在制备菌剂或饲料中的应用。
本发明的第五目的在于提供一种菌剂，其包括上述的地衣芽孢杆菌。
本发明的第六目的在于提供一种饲料，其包括上述的地衣芽孢杆菌。
本发明的第七目的在于提供上述的地衣芽孢杆菌在饲养偶蹄目动物中的应用，上述地衣芽孢杆菌能增加偶蹄目动物胃液中纤维素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一种的含量。
本发明的第八目的在于提供上述的菌剂在饲养偶蹄目动物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
一种地衣芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12486。
上述的地衣芽孢杆菌的生物学纯培养物。
上述的地衣芽孢杆菌的分离方法，其包括：取梅花鹿瘤胃液，加入生理盐水，振荡混匀，加热后梯度稀释，得到梯度稀释液，利用倾注培养法分离培养梯度稀释液，采用平板划线法纯化菌种，得到地衣芽孢杆菌。
上述的地衣芽孢杆菌在制备菌剂或饲料中的应用。
一种菌剂，包括上述的地衣芽孢杆菌。
一种饲料，包括上述的地衣芽孢杆菌。
上述的地衣芽孢杆菌在饲养偶蹄目动物中的应用，上述地衣芽孢杆菌能增加偶蹄目动物胃液中纤维素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一种的含量。
上述的菌剂在饲养偶蹄目动物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供一种地衣芽孢杆菌能有效的增加偶蹄目动物胃液中纤维素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一种的含量，将上述的地衣芽孢杆菌应用于制备菌剂或者饲料，能较好的提高经济动物饲养过程中饲料利用率低，生长慢的问题；上述菌剂或者饲料能使偶蹄目动物饲料利用率提高，达到快速生长的目的。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
地衣芽孢杆菌细胞形态和排列呈杆状、单生，可调整菌群失调达到治疗目的，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。
地衣芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促进饲料中营养素降解，适用于细菌原因引起的肠道菌群失调症以及肠道需要保健的养殖动物。对家禽类动物效果比较显著，如鸡、鸭、鹅等，猪、牛、羊等动物配方枯草芽孢杆菌使用效果更佳。
地衣芽孢杆菌是我国农业部批准使用的饲料级菌株之一。具有菌体繁殖速度快、容易培养、抗逆性强、耐高温、耐酸碱、耐挤压，且能分泌多种酶及氨基酸，所以其产品应用范围广，特别是在医药畜牧业中具有较高的应用价值。
下面对本发明实施例的一种地衣芽孢杆菌及其分离法与应用进行具体说明。
一种地衣芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12486。
该地衣芽孢杆菌的保藏信息：分类命名：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis；于2016年05月20日在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.12486。
上述的地衣芽孢杆菌的生物学纯培养物。
地衣芽孢杆菌为革兰氏阳性菌。
上述的地衣芽孢杆菌的分离方法，其包括：取梅花鹿瘤胃液，加入生理盐水，振荡混匀，加热后梯度稀释，得到梯度稀释液，利用倾注培养法分离培养梯度稀释液，采用平板划线法纯化菌种，得到地衣芽孢杆菌。
动物的肠胃中含有大量的菌群，其中有很多的益生菌，包括地衣芽孢杆菌；本发明从梅花鹿的胃液中提取分离地衣芽孢杆菌，作为动物源的益生菌，能更好的适应在经济动物尤其是反刍动物使用中的应用；地衣芽孢杆菌通过分泌纤维素酶、淀粉酶或胃蛋白酶等，帮助反刍动物降解饲料中的大量纤维素，淀粉等，增加饲料的可吸收性，达到快速增肥饲养动物的目的。
上述的地衣芽孢杆菌在制备菌剂或饲料中的应用。
将具有生物活性的地衣芽孢杆菌，应用于制备饲养经济动物的益生菌菌剂或饲养用饲料，具有较好的经济价值和社会价值。
一种菌剂，其包括上述的地衣芽孢杆菌。
菌剂可以有多种存在状态，可以是地衣芽孢杆菌的菌液，也可以是菌的纯培养物；当然用途也多种多样；地衣芽孢杆菌的种子菌液可以用大规模培养地衣芽孢杆菌，应用于生产。
一种饲料，其包括上述的地衣芽孢杆菌。
将地衣芽孢杆菌应用于制备饲料，能提高饲养动物的消化吸收能力，达到提高经济效益的目的。
上述的地衣芽孢杆菌在饲养偶蹄目动物中的应用，地衣芽孢杆菌能增加偶蹄目动物胃液中纤维素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一种的含量。
地衣芽孢杆菌通过增加动物胃液中的纤维素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一种的含量；通过酶的作用提高对胃液中的饲料等进行作用，提高动物胃液中营养物质的含量，并提高动物的消化吸收能力，达到增肥动物的目的。
上述的菌剂在饲养偶蹄目动物中的应用。
进一步地，偶蹄目动物为反刍亚目的动物。
进一步地，反刍亚目动物为梅花鹿。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供地衣芽孢杆菌的分离与鉴定，具体操作如下：
1.1取梅花鹿的瘤胃液20g，加入到100ml的无菌生理盐水中；
1.2摇床震荡30min，充分溶解混匀；
1.3在85℃水浴15min，按照0、10、102、103、104、105、106、107、108和109一共10个梯度，进行稀释；
1.4采用倾注培养法分离培养菌液，在37℃条件下培养48h；
1.5用接种环挑取单斑，采用平板划线法的方式，接种于平板，进行纯化培养；
1.6重复步骤1.5的操作，连续纯化4代，获得地衣芽胞杆菌及地衣芽胞杆菌的生物学纯培养物。
经过对纯化获得的地衣芽胞杆菌进行形态学观察发现；地衣芽胞杆菌菌落规则，边缘整齐有毛边，中心突出，质地均匀；菌落呈乳白色。经革兰氏染色，地衣芽胞杆菌为杆状革兰氏阳性菌。
实施例2
本实施例提供一种地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌的基本信息是：分类命名：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis；于2016年05月20日在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.12486。
实施例3
本实施例提供一种菌剂和饲料，该菌剂和饲料包括实施例2提供的地衣芽孢杆菌。
该菌剂的制备方法如下：
1.1配制地衣芽孢杆菌的发酵培养基，配方为：红糖1.8％(m/V)、玉米粉1％(m/V)，豆柏2.4％(m/V)，柠檬酸铵1.8％(m/V)、混合盐溶液0.6％(V/V)、消泡剂0.08％(V/V)，按比例配成发酵培养基；
1.2然后调节pH为7.2，经121℃高温蒸汽消毒20min；
1.3降温至37℃时，向发酵培养基中接种菌龄20h的种子液3.5％(V/V)；
1.4在37℃条件下，保持转速250rpm搅拌，发酵培养18h，放罐，得到地衣芽孢杆菌活菌数为1.39×1011cfu/mL。
向发酵罐中加入保护剂(甘油0.8％，谷氨酸钠0.2％和玉米淀粉19％)，再经干燥的得到地衣芽孢杆菌菌剂。
将获得的含有地衣芽孢杆菌的菌剂加入到饲料的预混料中，制成饲养用的饲料。
实验例1
本实验例提供了对实施例2提供的地衣芽孢杆菌的安全性实验。
本实验例采用小鼠灌胃实验，进行安全性实验，具体方法如下：
1.1地衣芽孢杆菌浓度为冻干粉，经平板计数法计数，冻干粉细菌数为5×1014cfu/g；
1.2选用适应饲养2周后的8周龄左右72只大小均匀雌性小鼠，用专用无抗鼠食；
1.3随机分成4组(Ⅰ组为对照组灌服无菌生理盐水，Ⅱ组按照5×1011cfu/只的量灌服地衣芽孢杆菌，Ⅲ组按照5×109cfu/只的量灌服地衣芽孢杆菌，Ⅳ组按照5×107cfu/只的量灌服地衣芽孢杆菌，每组3个重复，每个重复6只；
1.4每日上午9：00灌胃小鼠一次，连续灌服21天。
所有试验鼠试验室温控制为21±3℃，相对湿度为50-70％，正常光照，饲喂标准小鼠饲料，自由饮水，垫料为刨木花，每3天清扫鼠笼一次。试验期间，每天观察并记录实验过程中小鼠的体征、功能代谢、中毒表现及死亡情况，小白鼠临床症状有无异常。
检测指标：
于试验正式期的每3天早上9：00称量小鼠饲料消耗量，实验前后称量小鼠体重；
试验开始和结束当天从每组随机选取5只试验鼠，用双手轻轻挤压小鼠腹部，取粪样，装在5ml离心管，加甘油保存，用于PCR-DGGE微生物区系分析；
血清的准备：于试验结束当天每组随机选5只试验鼠颈动脉取血1.5ml左右，放入2ml离心管，放置在促凝管中，在低温高速离心机4℃、2000rpm/min，离心10min，分离血清，另取1.5ml离心管用于装血清，保存在-20℃冰箱待检测用。检测指标：血清中白蛋白ALB、总蛋白TP、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白总脂LDL、胆固醇CHO、碱性磷酸酶ALP、白细胞介素6、肿瘤坏死因子，并对样品进行检测；
取完整的肝脏、胸腺、脾脏和两侧肾脏并称湿重，分别计算肝脏指数(肝脏湿重/体重)、和胸腺指数(胸腺湿重/体重)、脾脏指数(脾脏湿重/体重)和肾脏指数(双肾湿重/体重)。
表1地衣芽孢杆菌的安全性实验
第Ⅰ组 第Ⅱ组 第Ⅲ组 第Ⅳ组
7天 存活 存活 存活 存活
14天 存活 存活 存活 存活
21天 存活 存活 存活 存活
表2脏器指数
表3地衣芽孢杆菌对小白鼠安全性及生产性能指标影响
从表1可以看出，在使用地衣芽孢杆菌灌胃小鼠21天后，小鼠均存活。说明实施例2提供的地衣芽孢杆菌没有毒性。
通过检测小鼠血清中白蛋白ALB、总蛋白TP、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白总脂LDL、胆固醇CHO、碱性磷酸酶ALP、白细胞介素6、肿瘤坏死因子等指标，结果显示均正常。说明实施例2提供的地衣芽孢杆菌没有毒性。
从表2可以看出，小鼠的各脏器指数与第I组对照组比较，没有较大波动，可以看出地衣芽孢杆菌，没有造成小鼠各脏器异常。
表3综合表明，实施例2提供的地衣芽孢杆菌对小鼠有增重的作用和效果；且日均采食量与增重情况具有一定的相关性，并且对小鼠的免疫器官等没有影响。
综合来看，实施例2提供的地衣芽孢杆菌对小鼠是无毒的，不会对小鼠造成毒性结果，是安全的。
实验例2
本实验例提供对实施例2提供的地衣芽孢杆菌的耐酸性、耐胆盐实验。
耐酸实验
配制营养肉汤，用1.0M的盐酸分别调节pH为2.0、3.0、4.0和5.0，灭菌冷却后，按营养肉汤总体积2％的量接种待检地衣芽胞杆菌，设置正常营养肉汤液体培养基(pH＝7.0)接种培养好的地衣芽孢杆菌作为对照组，每个组3个重复。于37℃，150r/min摇床内培养培养24h后测定菌株的OD600。
表4地衣芽孢杆菌的耐酸实验结果
pH2.0 pH3.0 pH4.0 pH5.0 pH7.0
OD600 0.2035A 0.2640A 0.5414A 1.0167A 0.9065
OD600 0.2081A 0.2730A 0.5928A 0.9337A 1.0233
OD600 0.2047A 0.2691A 0.6032A 0.9289A 0.9486
从表4可以看出，实施例2提供的地衣芽孢杆菌在酸性培养基中依然能较好的生长，具有较好的耐酸性，能够在动物尤其是梅花鹿胃液中存活并发挥作用。
耐胆盐实验
配制含0.15％、0.3％、0.6％胆盐的营养肉汤培养基培养基，灭菌冷却后，按2％的量接种培养好的地衣芽孢杆菌，于37℃，150r/min，摇床内培养，分别于4h和8h取出相应的培养基，取出各种培养基中培养的菌液1毫升以10倍梯度稀释，取105稀释浓度的菌液1毫升加到相应平板上，然后用无菌涂布棒将菌液均匀涂布整个平板，以0h为对照，每组2个重复。
活菌计数采用稀释涂布法，将在各种培养基中培养的菌液以10倍梯度稀释，取适当稀释浓度的菌液1毫升加到涂布LB固体培养基，然后用无菌涂布棒将菌液均匀涂布整个平板，于37℃培养24h后计菌落数，再按公式：
每毫升原菌液活菌数＝同一稀释度2个重复平皿菌落平均数×稀释倍数；
计算出每毫升原菌液活菌总数，以培养0h为对照，计算各菌株存活率。
表5地衣芽孢杆菌的胆盐实验菌落数
表6地衣芽孢杆菌不同浓度胆盐的菌数
0.15％胆盐 0.3％胆盐 0.6％胆盐
0h 1.40×107 1.41×107 1.38×107
4h 1.19×107 9.0×106 5.0×106
8h 9.0×106 4.8×106 2.1×106
从表5和表6的结果看，实施例2提供的地衣芽孢杆菌具有较好的耐胆盐性。
实验例3
本实验例对实施例2提供的地衣芽孢杆菌的碳源利用和化学物质敏感性进行实验。
碳源利用实验
本实验选用多种常见的碳源对实施例2提供的地衣芽孢杆菌的碳源利用实验。
表7 Biolog微平板碳源利用生长实验结果
表中，+表示地衣芽孢杆菌可利用，-表示地衣芽孢杆菌不可利用
从表7可以看出，实施例2提供的地衣芽孢杆菌碳源可选择范围较广。
化学物质敏感性实验
本实验选取常见的化学物质对实施例2提供的地衣芽孢杆菌进行化学敏感性试验。
表8化学物质敏感性实验结果(+：不敏感，-：敏感)
阳性对照 + 1％乳酸钠 + 林可霉素 + 萘啶酸 +
二甲胺四环素 - 夫西地酸 - 盐酸胍 + 氯化锂 +
十四烷硫酸钠 - D-丝氨酸 - 利福霉素SV - 亚碲酸钾 +
2％NaCl + 醋竹桃霉素 - 万古霉素 - 氨曲南 +
4％NaCl + pH6.0 + 四唑紫 - 丁酸钠 +
8％NaCl + pH6.0 + 四唑蓝 -
从表8可以看出，实施例2提供的地衣芽孢杆菌能耐受较多的常见化学物质。
实施例4
本实验例对实施例3提供的地衣芽孢杆菌的制备的菌剂或饲料的饲喂效果的检测。
本实验选用偶蹄动物中的猪形亚目中的猪和反刍亚目中的梅花鹿仔鹿进行饲喂实验。
将实施例3提供的地衣芽孢杆菌的制备的菌剂或饲料按照5×1011cfu/头的量饲喂梅花鹿仔鹿，连续饲喂3个月。实验结束后计算梅花鹿仔鹿日均增重量。
表9梅花鹿日均增重量及瘤胃液中消化酶的含量
从表9可以看出实验组的平均日增重高于对照组，饲喂含有地衣芽孢杆菌的饲料的梅花鹿瘤胃液中纤维素酶、淀粉酶和胃蛋白酶均高于对照组，脂肪酶低于对照组。
在饲喂猪形亚目中的猪的实验中，其结果与梅花鹿仔鹿实验结果一致，猪胃液中纤维素酶、淀粉酶和胃蛋白酶均高于对照组，脂肪酶低于对照组。
综上所述，本发明提供一种地衣芽孢杆菌能有效的增加偶蹄目动物胃液中纤维素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一种的含量，将上述的地衣芽孢杆菌应用于制备菌剂或者饲料，能较好的改善经济动物饲养过程中饲料利用低的问题；上述菌剂或者饲料能使偶蹄目动物饲料利用率，达到快速生长的目的，达到直接提高经济效益的目的，并且具有较好的经济应用价值和社会推广应用价值。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12486。
2.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的生物学纯培养物。
3.一种如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的分离方法，其特征在于，其包括：取梅花鹿瘤胃液，加入生理盐水，振荡混匀，加热后梯度稀释，得到梯度稀释液，利用倾注培养法分离培养所述梯度稀释液，采用平板划线法纯化菌种，得到所述地衣芽孢杆菌。
4.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在制备菌剂或饲料中的应用。
5.一种菌剂，其特征在于，其包括如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌。
6.一种饲料，其特征在于，其包括如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌。
7.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在饲养偶蹄目动物中的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌能增加所述偶蹄目动物胃液中纤维素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一种的含量。
8.如权利要求5所述的菌剂在饲养偶蹄目动物中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述偶蹄目动物为反刍亚目的动物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述反刍亚目动物为梅花鹿。
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