CN109810913A - 一株鼠李糖乳杆菌asd-9及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一株鼠李糖乳杆菌ASD‑9及其应用。本申请的鼠李糖乳杆菌ASD‑9，其保藏号为CGMCC No.14511。本申请的鼠李糖乳杆菌ASD‑9，具有较高的α‑葡萄糖苷酶活性抑制率，能够调节血糖，具有优异的益生作用，并且，具有很强的耐酸和耐胆盐能力，能够长期保存；可以用于制备各种调节血糖的食品、保健品、食品添加剂或药品，为调节血糖提供了一种新的高效原材料。

Description

一株鼠李糖乳杆菌ASD-9及其应用

技术领域

本申请涉及鼠李糖乳杆菌领域，特别是涉及一株鼠李糖乳杆菌ASD-9及其应用。

背景技术

随着社会经济的发展，糖尿病等代谢综合征的发病率及患者总数在全世界范围内呈逐年增加趋势，已成为危害人类生命健康的第三大慢性疾病。糖尿病是一种多病因的代谢性疾病，临床症状为高血糖、葡萄糖耐量降低以及胰岛素释放异常等。主要原因是胰腺细胞分泌的胰岛素减少或胰岛素敏感性降低引起的餐后高血糖，而高血糖又抑制了胰腺分泌胰岛素，减少胰岛素调节外周组织对葡萄糖的吸收能力，从而导致因胰岛素分泌及作用缺陷所引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。

世界卫生组织按糖尿病病因和发病机制将糖尿病分为：胰岛素依赖型的I型糖尿病、非胰岛素依赖型的II型糖尿病、特殊类型和妊娠糖尿病四种类型，其中II型糖尿病患者约占90％以上。II型糖尿病主要特点表现为胰岛素抵抗，即自体产生胰岛素后细胞无法对它作出反应，并会伴有多种并发症，如冠心病、动脉粥样硬化、肾脏病变、神经病变、视网膜病变以及足部病变等，还会出现典型的“三多一少”症状，即多饮、多尿、多食和体重减少现象。

目前，治疗II型糖尿病的口服降糖药物主要有四种：(1)α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)抑制剂：如阿卡波糖、伏格列波糖等；(2)促胰岛素分泌剂：如磺酰脲类、瑞格列奈和那格列奈等；(3)抑制肝脏输出葡萄糖的双胍类和噻唑烷二酮等；(4)缓解胰岛素抵抗的格列酮类等。其中，α-葡萄糖苷酶抑制剂能够可逆地占据α-葡萄糖苷酶与糖的络合位点，抑制α-葡萄糖苷酶催化多糖降解为单糖，从而延缓肠道碳水化合物的吸收。α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过抑制葡萄糖苷酶的活性，使葡萄糖的生成及吸收减缓，降低餐后高血糖，调整血糖水平，从而减少高血糖对胰腺的刺激，提高胰岛素的敏感性，有效地预防和改善糖尿病发症的发生，使患者血糖维持在一定水平，稳定血糖指数。α-葡萄糖苷酶抑制剂具有作用温和持久、无毒或副作用小等优点，受到国内外很多研究者的关注，而它的来源也成为了研究亮点。人们最初是从放线菌和链酶菌中提取的葡萄糖苷酶抑制剂，随着研究的深入，α-葡萄糖苷酶抑制剂的来源已深入周围环境的各个领域。其中，乳酸菌来源的α-葡萄糖苷酶抑制也成了益生菌降糖功能筛选的重要指标。因此，筛选获得新的具有高α-葡萄糖苷酶抑制效果的益生菌，对于II型糖尿病的治疗及其新药物或相关保健品的开发具有重要意义。

发明内容

本申请的目的是提供一株新的鼠李糖乳杆菌ASD-9及其应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ASD-9，其保藏号为CGMCC No.14511。

需要说明的是，本申请的保藏号为CGMCC No.14511的鼠李糖乳杆菌ASD-9，是新发现的一株具有良好的调节血糖功能的菌株，经本申请的研究证实，该菌株在体内、体外都具有很好的降血糖效果，并且对酸和胆汁都有良好的耐受性，这意味着，本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9可以被食用或口服药用，以调节血糖。因此，特意将本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.14511，保藏名称为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ASD-9。

还需要说明的是，本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9不同于现有其它鼠李糖乳杆菌之处在于，研究发现，本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9对α-葡萄糖苷酶的体外活性抑制率大于34％，而乳酸菌一般在10％一下，偶尔有高的也不超过20％，这从原理上解释了申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9的降血糖效果。

本申请的另一面公开了本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9在制备调节血糖的食品、保健品、食品添加剂、药品或组合物中的应用。

本申请的另一面公开了一种组合物，该组合物中含有本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9。

本申请的组合物是指除食品、保健品、食品添加剂、药品以外的其它类型的含有本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9的食用或药用组合物，该组合物可以用于调节血糖。

需要说明的是，由于本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9具有良好的降血糖功能，并且可以食用，因此，完全可以将其制成各种食品、保健品、食品添加剂或药品，用于调节血糖或者起保健作用。

本申请的另一面公开了一种食品，该食品中含有本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9。

优选的，该食品中还含有食品学上可接受的添加剂或辅料。

更优选的，本申请的食品为乳酸饮品或豆乳饮品。

需要说明的是，本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9和现有的乳杆菌一样，可以制成各种食品，例如乳酸饮品、豆乳饮品等，所制备的食品主要起保健作用，因此，对食品中的鼠李糖乳杆菌ASD-9活性菌量或者摄取量不做具体限定，实际应用中，可以根据实际状况灵活选择。本申请的研究显示，每天摄入1.0×10⁹CFU单位的活性鼠李糖乳杆菌ASD-9，能够明显降低动物血中的血糖含量，该活性菌剂量可以作为食品、保健品、食品添加剂或药品的参考用量或参考摄取量。

此外，还需要说明的是，本申请的食品，是广义上的以任何形态存在的可食用物品，并不仅限于乳酸饮品或豆乳饮品，例如还可以是发酵食品，发酵食品也包括动物饲料等。

本申请的另一面公开了一种保健品，该保健品中含有本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9。

需要说明的是，本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9具有良好的调节血糖功能，因此，可以添加到现有的各种保健品中，使其具备良好的调节血糖的保健功能，只要保健品的其它组分与鼠李糖乳杆菌ASD-9之间没有相互抑制或不良副作用即可。

本申请的另一面公开了一种食品添加剂，该食品添加剂中含有本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9。

需要说明的是，本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9可以与通常的食品材料配合食用。例如，谷类及薯类，谷类包括米、面、杂粮，薯类包括马铃薯、红薯等；动物性食物，包括肉、禽、鱼、奶、蛋等；豆类及其制品，包括大豆及其它干豆类；蔬菜水果类，包括鲜豆、根茎、叶菜、茄果等；纯热能食物，包括动植物油、淀粉、食用糖和酒类等；因此，本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9可以单独的作为食品添加剂或者调制剂加入各种食材中直接食用，起到调节血糖的保健作用。

本申请的另一面公开了一种药品，该药品中含有本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9。

优选的，本申请的药品用于调节血糖，调节血糖具体包括抑制α-葡萄糖苷酶的酶活性，药品一天的剂量中，含有至少1.0×10⁹CFU单位的活性鼠李糖乳杆菌ASD-9。

优选的，药品中还含有医学上可接受的载体或辅料。

优选的，载体或辅料选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水和生理食盐水中的至少一种。

可以理解，药品在制成具体的制剂时，通常都需要添加载体或辅料，只要添加的载体或辅料与鼠李糖乳杆菌ASD-9之间没有相互抑制或不良副作用即可。

更优选的，药品为片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂和冻干制剂中的至少一种；

更优选的，鼠李糖乳杆菌片。

更优选的，鼠李糖乳杆菌片中包括鼠李糖乳杆菌ASD-9、膳食纤维、山梨糖醇、微晶纤维素和硬脂酸镁。

本申请的一种优选方案中，鼠李糖乳杆菌片中包括鼠李糖乳杆菌ASD-9的乳酸菌冻干粉20％重量份、膳食纤维60％重量份、山梨糖醇10％重量份、微晶纤维素5％重量份和硬脂酸镁5％重量份，将其混合均匀后，压片制成片剂。

需要说明的是，本申请的药品，由于含有本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9，因此，具有良好的调节血糖的功能；本申请的药品，可以是单独活性成份的鼠李糖乳杆菌ASD-9的各种制剂，也可以与其它活性成份配合使用，只要相互之间不影响活性即可。

可以理解，本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9作为活性菌药品，只要不影响其菌株活性，药品可以采用现有的各种剂型。而本申请的药品中，进一步的还可以包括药品或剂型中常用的辅料，例如稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂等。

本申请的药品中鼠李糖乳杆菌ASD-9活性菌含量，或者药剂量不受特别限制，实际应用中，可以根据给药对象的健康状况灵活选择。但是，本申请的研究显示，每天摄入1.0×10⁹CFU单位的活性鼠李糖乳杆菌ASD-9，能够明显降低动物血中的血糖含量，此用量可以作为药品中鼠李糖乳杆菌ASD-9活性菌含量或者给药剂量参考。

本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9与其它益生菌或者益生材料组合使用时，只要各组分之间没有抑制作用或者不良反应即可，可以理解，最好的情况是各组分之间能够具有功能互补或促进作用，例如可以将本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9制成复合益生菌片，通过与其它益生菌组合，达到更好或更多的活性功能，例如除调节血糖以外，与其它益生菌组合，还可以起到调节肠胃功能、提高免疫力等功能，具体的，可以根据复合益生菌片的各组分而定，在此不做限定。

本申请的有益效果在于：

本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9，具有较高的α-葡萄糖苷酶活性抑制率，能够调节血糖，具有优异的益生作用，并且，具有很强的耐酸和耐胆盐能力，能够长期保存；可以用于制备各种调节血糖的食品、保健品、食品添加剂或药品，为调节血糖提供了一种新的高效原材料。

附图说明

图1是本申请实施例中鼠李糖乳杆菌ASD-9在体外抗胆盐实验的生长曲线图。

本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9，分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus，于2017年08月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.14511。

具体实施方式

本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9，是一株新分离发现的具有良好调节血糖功能的活性菌。本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9，无芽孢，胞壁结构完整；不含质粒，代谢物不产生D-乳酸、吲哚等有毒物质，不表达硝基还原酶，也不具备产生物胺的能力；Gentamicin、Kanamycin、Streptomycin、Tetracycline、Erythromycin、Clindamycin、Chloramphenicol、Amplicilin、Neomycin、Trimethoprim、Ciprofoxacin、Rifampicin、Vancomycin等13种抗生素的最小抑菌浓度也都符合欧洲食品药品监督局(缩写EFSA)的规定。

本申请的鼠李糖乳杆菌ASD-9菌株对模拟人工胃液环境的抗性良好，且体外、体内都具有较高的α-葡萄糖苷酶活性抑制率，降血糖效果明显；可见，本申请新分离发现的鼠李糖乳杆菌ASD-9具备成为药用菌或食用菌的必备条件，能够用于开发新药、食品、保健品、食品添加剂或其它食用或药用组合物。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例一

本例以传统发酵食品为样品为研究对象，从中分离筛选乳酸菌的疑似菌落，然后采用16s DNA扩增对挑取的疑似菌株进行鉴定。详细如下：

(1)培养基配方

本例配制了优化的MRS固体培养基和MRS培养液。

MRS固体培养基，简称MRS培养基，1L的配方为：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，吐温80 1.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂17.5g。

MRS肉汤培养基，即MRS培养液的配方较MRS培养基仅仅是不添加琼脂，其余相同。

配置的培养基和培养液，调整pH至6.5，121℃灭菌20min，然后4℃冷藏备用。

(2)鼠李糖乳杆菌ASD-9菌株的来源及鉴定

以内蒙古农家酸奶发酵食品为样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，将样品稀释至10^-3，将其涂布于本例配制的MRS培养基表面，置于37℃培养箱中培养24-48h，观察菌落形态特征。从中挑取疑似乳酸菌的但菌落划线分离至新的MRS培养基上，37℃过夜培养后，再次进行划线分离纯化。采用无菌牙签从第二划线分离的培养基上挑取若干个单菌落，分别进行编号。选取其中20株单菌落进行16s DNA测序。

本例16s DNA扩增的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列。

SEQ ID NO.1：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’

SEQ ID NO.2：5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’

引物由深圳华大基因研究院合成。

PCR反应体系为，50μL的反应液中包括：10mM dNTPs 1μL、10×buffer 5μL、10mM的上下游引物各1μL、菌液PCR模板1μL、5U/μL的Taq酶1μL，补充ddH₂O补充至50μL。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后进入35个循环：94℃30s、60℃30s、72℃1min，循环结束后，72℃延伸5min，4℃待机。

对PCR扩增产物进行切胶回收，并对回收的PCR产物进行测序。本例采用试剂盒TaKaRa MiniBEST agarose GeL DNA Extraction kit进行切胶回收，详细步骤参见试剂盒说明书。本例的PCR产物由深圳华大基因研究院测序。

测序结果显示，编号为ASD-9的菌株其16s rDNA测序结果为SEQ ID NO.3所示序列。

SEQ ID NO.3：

5’-CGCCGTGCGGGTGCCTATACATGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGTTTATTTCGAAGCTACGCGAAGACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAATCTAGAGATTAGACGTTTCCCTTCGGGGACATGGAAACAGGTGGGTGCATGT-3’

用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，比对结果显示，ASD-9菌株与鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus亲缘关系最近，相似性达到99％，因此，鉴定ASD-9菌株为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌ASD-9，即本例筛选获得的鼠李糖乳杆菌。

将鼠李糖乳杆菌ASD-9的单菌落转接到MRS培养液中进行纯培养，37℃培养18h，以备后续使用。

此外，在MRS培养基中于光学显微镜下观察鼠李糖乳杆菌ASD-9，结果显示，鼠李糖乳杆菌ASD-9无芽孢、胞壁结构完整。

将本例筛选获得的鼠李糖乳杆菌ASD-9于2017年08月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.14511。

(3)细菌安全性

1)抗生素敏感性测试

本例测试了鼠李糖乳杆菌ASD-9对Gentamicin、Kanamycin、Streptomycin、Tetracycline、Erythromycin、Clindamycin、Chloramphenicol、Amplicilin、Neomycin、Trimethoprim、Ciprofoxacin、Rifampicin、Vancomycin等13种抗生素的抗性。具体测试方法如下：

先将13种抗生素分别作一系列的2倍比稀释，分别得到了浓度为64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL的稀释药物。

将稀释的抗生素分别加入96孔板对应孔中，然后对应孔加入鼠李糖乳杆菌ASD-9的MRS培养液，混匀后，37℃培养48h，观察培养结果。本例以每个孔的抗菌药物最小抑菌浓度(缩写MIC)，表征鼠李糖乳杆菌ASD-9的敏感度，测试结果如表1所示。

表1鼠李糖乳杆菌ASD-9对13种抗生素抗性测定结果

抗生素	MIC(μg/mL)	EFSA规定安全值(μg/mL)
			Gentamicin	1	16
Kanamycin	16	64
			Streptomycin	8	32
Tetracycline	8	8
			Erythromycin	0.25	1
Clindamycin	1	1
			Chloramphenicol	4	4
Amplicilin	0.5	4
			Neomycin	2	8
Trimethoprim	64	128
			Ciprofoxacin	2	2
Rifampicin	0.25	0.25
			Vancomycin	8	NR

表1中，NR表示欧洲食品药品监督局对此不作要求，表1的结果显示，本例分离获得的鼠李糖乳杆菌ASD-9对Gentamicin、Kanamycin、Streptomycin、Tetracycline、Erythromycin、Clindamycin、Chloramphenicol、Amplicilin、Neomycin、Trimethoprim、Ciprofoxacin、Rifampicin的最小抑菌浓度都符合欧洲食品药品监督局(缩写EFSA)的规定；鼠李糖乳杆菌ASD-9对Vancomycin的最小抑菌浓度为8μg/mL，这个抗生素虽然在EFSA中没有做要求，但是，本例测得的值也都基本符合预期，可见，本例的鼠李糖乳杆菌ASD-9对抗生素具有较好的敏感性。

此外，采用TIANGEN质粒小提试剂盒DP103对本例的鼠李糖乳杆菌ASD-9进行质粒抽提，结果显示，未发现鼠李糖乳杆菌ASD-9携带任何质粒，表明鼠李糖乳杆菌ASD-9无基因水平转移可能性。

2)代谢物毒性检测

乳酸旋光性检测：使用爱尔兰Megazyme公司的D-/L-乳酸检测试剂盒进行检测。结果显示，本例的鼠李糖乳杆菌ASD-9不产生D-乳酸。

硝酸盐还原酶活性检测：将本例的本例的鼠李糖乳杆菌ASD-9转接于MRS液体培养基中，于37℃培养24h，在无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入硝酸盐培养基中37℃培养5d后，滴加碘化钾溶液和淀粉溶液各10滴，观察实验结果。同时做阳性对照试验。实验结果显示菌液没有变蓝，为阴性反应，而阳性对照有变蓝，说明本例的鼠李糖乳杆菌ASD-9不表达硝基还原酶。

吲哚实验：无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入到蛋白胨水培养基中，37℃培养72h，然后加入吲哚试剂8～10滴，观察实验结果。同时做阳性对照试验。实验结果显示，菌液没有出现红色圆环，而阳性对照显示红色，表明本例的鼠李糖乳杆菌ASD-9代谢不产生吲哚。

氨基脱羧酶活性检测：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳，使培养基变碱性，例如将赖氨酸分解为尸胺，鸟氨酸分解为腐胺，精氨酸分解为精胺；滴加指示剂，例如溴甲酚紫，呈黄色为阴性，呈紫色为阳性。因此，本例在无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入到蛋白胨水培养基中，37℃培养72h，然后加入溴甲酚紫8～10滴，观察实验结果。滴定结果呈黄色，为阴性，说明本例的鼠李糖乳杆菌ASD-9不具备产生物胺的能力。

实施例二

本例对实施例一分离获得的鼠李糖乳杆菌ASD-9进行了体外抑制α-葡萄糖苷酶酶活试验。具体如下：

205μL的体系中包括：50μL浓度0.1mol/L，pH＝6.8的PBS溶液，50μL浓度为20mmol/L的对硝基苯酚-α-D-吡喃葡葡糖苷(缩写PNPG，购自Sigma)溶液，以及25μL的待测样品，将混合物于37℃孵化10min，加入30μL浓度20U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液继续反应20min，再加入50μL浓度为1mol/L的Na₂CO₃作为反应终止液，将反应液于405nm测其吸光值，吸光值与对硝基苯酚PNP的游离量成正比，反应体系中采用pH值为6.8浓度为0.1mol/L的PBS溶液作为α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的空白对照，进行反应后计算乳酸菌对α-葡萄糖苷酶酶活抑制性，其抑制率计算公式为菌体α-葡萄糖苷酶酶活抑制率＝[1-(A-B)/(C-D)]×100％。

其中，A、B、C、D分别为四个待测样品组测定的吸光值，具体的，A为阳性组的吸光值，即含鼠李糖乳杆菌ASD-9菌体溶液以及α-葡萄糖苷酶溶液；B为只含有鼠李糖乳杆菌ASD-9菌体溶液的组测定的吸光值；C为对照组的吸光值，即只含α-葡萄糖苷酶溶液；D为空白组的吸光值，即不含鼠李糖乳杆菌ASD-9菌体溶液也不含α-葡萄糖苷酶溶液。

与此同时，本例采用商业菌株LGG作为对照，采用相同的方法测定其对α-葡萄糖苷酶的酶活抑制率。

结果显示，实施例一分离获得的鼠李糖乳杆菌ASD-9的α-葡萄糖苷酶抑制率为34.1％，抑制率十分显著，而对照菌株LGG仅为16.9％。可见，实施例一分离获得的鼠李糖乳杆菌ASD-9具有很好的α-葡萄糖苷酶活性抑制率。

实施例三

本例对实施例一分离获得的鼠李糖乳杆菌ASD-9的体外耐酸、耐胆汁能力进行了试验，具体如下：

配制模拟胃液SGF：2.0g NaCl，3.2g胃蛋白酶，7mL浓HCl，加水调整至pH3.0，然后用0.2μm微孔滤膜过滤后，即获得本例的SGF液，待用。

挑取鼠李糖乳杆菌ASD-9斜面菌种于MRS培养液中，37℃培养16～18h。菌悬液4000r/min离心15min，去上清，称量菌体湿重，按照0.1g/mL的比例重新悬浮菌体于生理盐水中，再按照1:10的比例加入到SGF液中，充分混匀后置于37℃恒温培养箱中培养2h，分别对培养0h和2h进行细胞计数。细胞计数结果如表2所示。

表2鼠李糖乳杆菌ASD-9对人工胃液SGF的耐受性活菌计数结果

菌株	0h计数	2h计数	存活率
				ASD-9	2.07×10<sup>9</sup>	2.02×10<sup>9</sup>	97.6％

表2的结果显示，实施例一的鼠李糖乳杆菌ASD-9，培养2h后活菌数保持在一个数量级，存活率高达97.6％，表明鼠李糖乳杆菌ASD-9体外有较强的耐酸能力。

进一步的，将活化两次的菌液按1％量接入灭菌的含有重量份0.3％胆盐的10mLMRS培养液进行培养，并测定鼠李糖乳杆菌ASD-9在培养液中的生长曲线，本例重复进行了2次试验，结果如图1所示。图1中，两条曲线分别是两次重复的生长曲线，结果显示，在胆盐的培养基中鼠李糖乳杆菌ASD-9能够正常生长，说明实施例一的鼠李糖乳杆菌ASD-9体外有较强的抗胆汁能力。

实施例四

本例对实施例一分离获得的鼠李糖乳杆菌ASD-9体外调节细胞因子实验，具体如下：

取生长状态良好，处于对数生长期的人THP-1细胞系细胞，离心吸取培养基，废液弃去，加入适量完全培养基，用移液器吹打混匀剥离的细胞，制备成细胞悬液，细胞计数调整密度为5×10⁵cfu/mL，吸取0.9mL细胞悬液接种至24孔板上，2h后吸取上述备用的菌悬液添加至相应孔中，使各孔内乳酸菌悬液的浓度为10⁶cfu/mL浓度，三个重复，培养24h后，吸取上清液，3000r/min离心10min，取上清液，进ELISA测试：白介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及IL-10，实验结果如表3所示，其中各组P<0.05。

表3鼠李糖乳杆菌ASD-9的体外细胞因子调控试验结果

组别	IL-1β/(ng/mL)	IL-6/(ng/mL)	TNF-α(pg/mL)	IL-10/(ng/mL)
					空白对照	40.15±6.56	89.28±3.75	15.68±2.68	19.29±3.46
ASD-9	33.12±2.67	61.45±2.67	12.56±0.94	94.63±3.68

表3的结果显示，实施例一的鼠李糖乳杆菌ASD-9对THP-1细胞系的IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子具有下调作用，对IL-10等抗炎因子具有上调作用，表明鼠李糖乳杆菌ASD-9的确具有抗炎症的作用。

实施例五

本例对实施例一分离获得的鼠李糖乳杆菌ASD-9进行体内有效性研究，本例采用Sprague-Dawley系5周龄大鼠进行体内试验，具体如下：

1.实验菌株的制备

将活化两次的鼠李糖乳杆菌ASD-9接种于MRS液体培养基中，于37℃培养18h，6000r/m离心10min，用灭菌生理盐水洗涤后收集菌体。然后，加入0.85％生理盐水，调整菌体数至1.0×10⁹CFU/mL，然后将活菌按每日使用量分装于15mL离心管，服用剂量为每天2mL/只，每组10只，共6组，饲喂28天。

2.实验动物分组及饲养方式

本例采用Sprague-Dawley系5周龄大鼠，采用链脲佐菌素联合高脂饲料诱导SD系5周龄大鼠，完成高血糖大鼠造模，饲喂至第28天，平均分为6组，每组10只。各组分别按照如下方式继续喂养：

模型组，该组喂养高热量饲料，和蒸馏水；

阳性组，该组喂养高热量饲料，和二甲双胍，二甲双胍按0.3mg/g体重供给；

ASD-9组，该组喂养高热量饲料，和鼠李糖乳杆菌ASD-9；

LGG组，该组喂养高热量饲料，和益生菌LGG；

CCFM0528组，该组喂养高热量饲料，和益生菌CCFM0528；

正常组，该组饲喂标准饲料，和蒸馏水。

以上饲料喂养量相同，蒸馏水、二甲双胍、鼠李糖乳杆菌ASD-9、益生菌LGG和益生菌CCFM0528在各组中每天每只2mL灌胃，持续28天。

其中，高热量饲料自行配制，是在购买的标准饲料的基础上添加脂肪或高脂肪物质，具体配方为：78.8％标准饲料、10％猪油、10％蛋黄粉、l％胆固醇、0.2％胆盐。标准饲料为购置于河南天驰实验动物饲料厂的鼠类专用饲料。益生菌LGG为商业菌株，可市售购买；益生菌CCFM0528购自CGMCC，保藏号为CGMCC No.7317，记载于专利CN 201310220050.6中。

3.样品采集与分析测试

正式试验前及第28天时间段进行采血。采血方法为绝食一夜后，于大鼠股静脉采血，凝血后4000r/m离心10min分离血清。检测空腹血糖、餐后2h血糖、糖化血红蛋白、脂联素和TNF-α的含量，及第28天测定肝组织SOD值。

4.实验结果

实验结果如表4所示，其中各组P<0.05。

表4动物试验结果

表4的结果显示，ASD-9组大鼠灌胃的第28天空腹血糖指标比模型组降低了22.2％，ASD-9组第28天餐后血糖指标比模型组降低了40.6％，表明鼠李糖乳杆菌ASD-9具有体内降血糖的功能，且其它指标表明，鼠李糖乳杆菌ASD-9对高血糖导致的体内炎症环境也有缓解作用。并且，本例的鼠李糖乳杆菌ASD-9喂养28天后，餐后2h血糖浓度明显低于LGG组和CCFM0528组，说明本例的鼠李糖乳杆菌ASD-9降血糖效果比对照菌株LGG和CCFM0528更好。

实施例六

本例分别将实施例一分离获得的鼠李糖乳杆菌ASD-9制成常用的药品和食品，具体如下：

(1)鼠李糖乳杆菌片剂

配方：CFU10⁹的鼠李糖乳杆菌ASD-9的冻干粉20％、膳食纤维60％、山梨糖醇10％、微晶纤维素5％、硬脂酸镁5％；以上组分均为重量份，将各组分混合均匀后，压片制成片剂。其中，鼠李糖乳杆菌ASD-9的冻干粉为采用冻干机将其菌悬液在无菌环境下冷冻抽真空干燥而成。

(2)鼠李糖乳杆菌发酵酸牛乳

将奶粉和水进行混合，均质，以121℃超高温灭菌300s杀菌，冷却到42℃，接入活化好的发酵剂：保加利亚乳杆菌和嗜热乳杆菌菌粉总共接入量为重量份0.4％。在42℃下发酵10h，冷却后加入重量份1％CFU为10⁸的鼠李糖乳杆菌ASD-9，搅拌，灌装即可。

其中，奶粉为酸奶制备中常规使用的奶粉。

(3)以上药品和食品的药效试验

本例采用实施例五相同的方法对本例的鼠李糖乳杆菌片剂和鼠李糖乳杆菌发酵酸牛乳进行体内降血糖试验。

其中，鼠李糖乳杆菌片剂捣碎后加无菌水制成的悬液，调整菌数至1.0×10⁹CFU/mL。鼠李糖乳杆菌发酵酸牛乳同样加无菌水制成的悬液，调整菌数至1.0×10⁹CFU/mL。以此替换实施例五中的活菌悬液。

喂养方法和后续的采血、测量方法都与实施例五相同。

结果显示，用鼠李糖乳杆菌ASD-9的药品和食品喂养高脂饲料大鼠28天后抽血检测，发现喂养鼠李糖乳杆菌发酵酸牛乳的大鼠，与第0天相比其血糖下降了28％，P<0.05，第0天的餐后血糖浓度为4.96mmol/L，28天后的餐后血糖浓度为3.57mmol/L；喂养鼠李糖乳杆菌片的大鼠与喂养鼠李糖乳杆菌发酵酸牛乳的大鼠效果相当，28天后的餐后血糖浓度下降了约28.2％，P<0.05。可见，添加鼠李糖乳杆菌ASD-9的药品和食品，其鼠李糖乳杆菌ASD-9在大鼠体内定植并发挥了作用，表明添加鼠李糖乳杆菌ASD-9的药品和食品的确有体内降低血糖的功效。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大三生园科技有限公司

<120> 一株鼠李糖乳杆菌ASD-9及其应用

<130> 17I25289

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat catggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tagggttacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1046

<212> DNA

<213> 鼠李糖乳杆菌ASD-9的16s rDNA测序结果

<400> 3

cgccgtgcgg gtgcctatac atgcagtcga acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat 60

catgatttac atttgagtga gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga 120

agcgggggat aacacctgga aacagatgct aataccgcat aacaacttgg accgcatggt 180

ccgagcttga aagatggctt cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag 240

atggtggggt aacggctcac catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc 300

cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca 360

caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa 420

aactctgttg ttaaagaaga acatatctga gagtaactgt tcaggtattg acggtattta 480

accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540

tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc 600

cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag 660

tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg 720

cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag 780

ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt 840

cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac 900

tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtgtttattt cgaagctacg 960

cgaagacctt accaggtctt gacatactat gcaatctaga gattagacgt ttcccttcgg 1020

ggacatggaa acaggtgggt gcatgt 1046

Claims (10)

1.一株鼠李糖乳杆菌ASD-9，其保藏号为CGMCC No.14511。

2.根据权利要求1所述鼠李糖乳杆菌ASD-9，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌ASD-9对α-葡萄糖苷酶的体外活性抑制率大于34％。

3.根据权利要求1或2所述的鼠李糖乳杆菌ASD-9在制备调节血糖的食品、保健品、食品添加剂、药品或组合物中的应用。

4.一种组合物，其特征在于：所述组合物含有权利要求1或2所述的鼠李糖乳杆菌ASD-9。

优选的，所述组合物可用于调节血糖。

5.一种食品，其特征在于：所述食品中含有权利要求1或2所述的鼠李糖乳杆菌ASD-9。

优选的，所述食品中还含有食品学上可接受的添加剂或辅料；

优选的，所述食品为乳酸饮品或豆乳饮品。

6.一种保健品，其特征在于：所述保健品中含有权利要求1或2所述的鼠李糖乳杆菌ASD-9。

7.一种食品添加剂，其特征在于：所述食品添加剂中含有权利要求1或2所述的鼠李糖乳杆菌ASD-9。

8.一种药品，其特征在于：所述药品中含有权利要求1或2所述的鼠李糖乳杆菌ASD-9。

9.根据权利要求8所述的药品，其特征在于：所述药品用于调节血糖，所述药品一天的剂量中，含有至少1.0×10⁹CFU单位的活性鼠李糖乳杆菌ASD-9。

10.根据权利要求8或9所述的药品，其特征在于：所述药品中还含有医学上可接受的载体或辅料；

优选的，所述载体或辅料选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水和生理食盐水中的至少一种；

优选的，所述药品为片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂和冻干制剂中的至少一种；

更优选的，所述药品为鼠李糖乳杆菌片，所述鼠李糖乳杆菌片中包括鼠李糖乳杆菌ASD-9、膳食纤维、山梨糖醇、微晶纤维素和硬脂酸镁。