CN113293118A - 一种鼠李糖乳杆菌lr3001及其应用 - Google Patents

一种鼠李糖乳杆菌lr3001及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113293118A
CN113293118A CN202110795438.3A CN202110795438A CN113293118A CN 113293118 A CN113293118 A CN 113293118A CN 202110795438 A CN202110795438 A CN 202110795438A CN 113293118 A CN113293118 A CN 113293118A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactobacillus rhamnosus
alpha
glucosidase
strain
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110795438.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113293118B (zh
Inventor
王静
单宝龙
任宝涛
张化朋
刘虹
庄金丽
李凤娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Phoenix Bio Tech Co ltd
Original Assignee
Shandong Phoenix Bio Tech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Phoenix Bio Tech Co ltd filed Critical Shandong Phoenix Bio Tech Co ltd
Priority to CN202110795438.3A priority Critical patent/CN113293118B/zh
Publication of CN113293118A publication Critical patent/CN113293118A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113293118B publication Critical patent/CN113293118B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/175—Rhamnosus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LR3001及其应用，已于2020年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020705，地址为中国武汉武汉大学。本发明还提供了所述鼠李糖乳杆菌LR3001在制备降血糖产品和减肥减脂产品中的应用。本发明提供的鼠李糖乳杆菌分离于西藏林芝地区的雪莲菌，具有较高的抑制α‑葡萄糖苷酶和α‑淀粉酶活性的能力；同时，该菌株具有良好的安全性，对10种抗生素均敏感，不产生D‑乳酸，不表达硝基还原酶，不产生吲哚，不产生生物胺；菌株安全无毒，可广泛应用于健康食品中。

Description

一种鼠李糖乳杆菌LR3001及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体为一种鼠李糖乳杆菌LR3001及其应用。
背景技术
Ⅱ型糖尿病(T2DM)是一种发病机制较复杂的慢性代谢紊乱性疾病，以胰岛素抵抗和胰岛细胞损伤导致的慢性高血糖为主要特征。传统治疗糖尿病药物有双胍类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类等，α-葡萄糖苷酶抑制剂是20世纪90年代开发的降糖药物，是目前临床治疗T2DM的一线口服药物。α-葡萄糖苷酶抑制剂主要作用于位于肠系膜刷状缘的α-葡萄糖苷酶，通过抑制α-葡萄糖苷酶分解多糖为葡萄糖的作用，从而减缓葡萄糖的吸收速度和降低血糖水平，α-葡萄糖苷酶抑制剂具有作用温和持久、无毒或副作用小等优点，受到国内外很多研究者的关注，而它的来源也成为了研究亮点。目前常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂有主要有阿卡波糖(Acarbose)、伏格列波糖(Voglibose)和米格列醇。阿卡波糖最初是从游动放线菌的次级代谢物中分离而来，因此许多α-葡萄糖苷酶抑制剂的微生物源研究都是从土壤中的放线菌入手，目前，已用于临床治疗的α-葡萄糖苷酶抑制剂也主要来源于放线菌(井冈霉素产生菌和野尻霉素产生菌)。随着研究的深入，α-葡萄糖苷酶抑制剂的来源已深入周围环境的各个领域。其中，乳酸菌来源的α-葡萄糖苷酶抑制也成了益生菌降糖功能筛选的重要指标。
乳酸菌被公认是安全的食品级微生物，广泛应用于发酵食品生产和食品保藏方面，已经有非常悠久的历史，对人体具有多种益生功能，常见的有乳酸杆菌、双歧杆菌和芽孢杆菌等。由于乳酸菌的天然、安全和益生特性，近年来已成为防治糖尿病的研究热点。
因此，开发出具有较高α-葡萄糖苷酶抑制效果、同时具有较高安全性、具有降血糖和更多功能的益生菌将具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鼠李糖乳杆菌LR3001及其应用。采用的技术方案如下所述：
作为本发明的第一个方面，在于提供了一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)菌株LR3001，已于2020年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020705，地址为中国武汉武汉大学。
本发明提供的菌株从西藏林芝地区的雪莲菌中筛选得到，在实施例抗生素敏感性测试中，发现该鼠李糖乳杆菌LR3001对10种抗生素均敏感，证实该鼠李糖乳杆菌具有良好的安全性。
在代谢物毒性试验实施例中，证实本发明提供的鼠李糖乳杆菌LR3001代谢不产生D-乳酸，不表达硝基还原酶，不产生吲哚，不产生生物胺。
在实施例α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力检测中，发现鼠李糖乳杆菌LR3001对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率明显高于市售的鼠李糖乳杆菌LGG(ATCC53103)。
在实施例α-淀粉酶活性的抑制能力检测中，发现鼠李糖乳杆菌LR3001对α-淀粉酶活性的抑制率明显高于市售的鼠李糖乳杆菌LGG(ATCC53103)。
基于所述鼠李糖乳杆菌LR3001对于α-葡萄糖苷酶活性和α-淀粉酶活性的的抑制能力，可见，本发明提供的鼠李糖乳杆菌LR3001具有降血糖的效果，因此，作为本发明的第二个方面，在于提供所述鼠李糖乳杆菌LR3001在制备降血糖组合物中的应用。
在实施例减肥功能评价中，显示不同剂量鼠李糖乳杆菌LR3001可以显著降低高能量饮食大鼠的体重和脂体比，具有一定的减肥减脂效果，因此，作为本发明的第三个方面，在于提供所述鼠李糖乳杆菌LR3001在制备减肥减脂组合物中的应用。
耐酸、耐胆盐试验实施例显示，鼠李糖乳杆菌LR3001在pH2.0的MRS培养基中2h存活率为96.8％，具有很好的耐酸性；在0.2％猪胆盐中2h的存活率为52.4％，在0.3％猪胆盐中2h的存活率为40.2％，均高于标准菌株；可见具有较好的耐受人工胃肠的能力。
另外，作为本发明的第四个方面，在于提供一种组合物，所述组合物包含鼠李糖乳杆菌LR3001。所述组合物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性和α-淀粉酶活性的能力，因而具有降低血糖的功能和用途；还具备减肥减脂的作用。所述组合物选自食品、保健食品和药品。
所述组合物还包含载体或辅料，所述载体或辅料选自常用的赋形剂、增溶剂、粘合剂、崩解剂等成分。
所述组合物剂型可以为粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂等常用制剂形式。
所述鼠李糖乳杆菌通过生产发酵得菌粉，菌粉加工成减肥或糖尿病食品，直接食用或冲服饮用，使用方便，可起到预防糖尿病或肥胖的作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的发酵乳杆菌分离于西藏林芝地区的雪莲菌，该菌株具有良好的安全性，对10种抗生素均敏感，不产生D-乳酸，不表达硝基还原酶，不产生吲哚，不产生生物胺；能保证菌株安全性，可以在食品中添加应用；
(2)本发明提供的鼠李糖乳杆菌，具有较高的抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的能力，而抑制α-葡萄糖苷酶的活性是调控糖尿病的主要方法之一，体外具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的乳酸菌是潜在的辅助抗糖尿病的益生菌株；
(3)本发明提供的鼠李糖乳杆菌可直接应用于减肥减脂和降血糖产品中，使用方便，起到预防糖尿病或肥胖的作用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是鼠李糖乳杆菌及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶体外抑制率对比图；
图2是鼠李糖乳杆菌及阿卡波糖对α-淀粉酶体外抑制率对比图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
抑制α-葡萄糖苷酶的活性是调控糖尿病的主要方法之一，乳酸菌具有的调节血糖的功能有可能通过这种机制发挥作用，因此体外具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的乳酸菌将是潜在的辅助抗糖尿病的益生菌株。另外，益生菌对宿主发挥有益作用的前提是能够通过胃肠道的一系列物理和化学障碍到达肠道，并在肠道中定植。因此，一株良好的益生菌必须对模拟的人胃肠道条件具有耐受性，可顺利到达肠道并在肠道内发挥一定的功效作用。
相关培养基配方及缓冲液配方：
乳酸细菌培养基(MRS)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 6.2-6.6。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 6.2～6.4，加入琼脂，121℃灭菌15min，趁热倒平板。
磷酸缓冲液(Phosphate buffer solution，PBS)：磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g。加去离子水800mL充分搅拌溶解，然后加入稀盐酸调pH到7.4，最后定容到1L。
试验中采用的参考菌株为标准菌：Lactobacillus rhamnosus(LGG；ATCC53103)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
雪莲菌为购自网络销售平台的陇之源雪莲菌。
实施例1：鼠李糖乳杆菌的分离
购买西藏林芝地区的雪莲菌，选取适量雪莲菌，置于灭菌玻璃容器中，加入巴氏灭菌纯牛奶，搅拌均匀后用玻璃纸封口，温度37℃，静置发酵10h左右后，挑取发酵产物在MRS固体培养基平板上划线，培养24h后挑取大小形态不一的单菌落在新鲜的平板上划线，然后挑取单菌落到斜面，斜面培养好后镜检菌落形态，镜检无杂菌后进行鉴定。
实施例2：鼠李糖乳杆菌的鉴定
纯化后的乳酸菌在MRS培养基中培养1d后取1mL发酵液10000rpm离心1min，尽量吸净上清，收集菌体，按照TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取DNA。以提取的DNA为模板，PCR(聚合酶链式反应)扩增16S rDNA，在细菌的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCC/ATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)。PCR的反应体系为25μL：模板DNA(大约80ng)，100umol/L dNTP，1.5mmol/LMgCl2，正向和反向引物各0.4umol/L和1UTaq DNA聚合酶。PCR过程为95℃预变性5min后，进行下述30个循环：94℃变性30s，55℃退火1min；72℃延伸1.5min，最后72℃保温10min。4℃保存。PCR结束后，取2μLPCR产物在1％(m/V)琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为1×TAE。电泳结束后，用0.5ug/g溴化乙啶溶液对凝胶染色10min，回收溴化乙啶溶液，用蒸馏水冲洗凝胶后，在紫外灯下观察。如果PCR扩增成功，则可见到相应大小为1.5kb的条带。浓缩16S rDNA的PCR产物：16S rDNA的PCR产物中加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20℃30min。12000r/min离心10min，弃上清液。自然晾干，加入15ul无菌双蒸水溶解DNA沉淀。利用商品化的DNA回收试剂盒对浓缩后的PCR产物进行回收。PCR产物送去上海生工测序。测序结果如序列表1所示。将测得的16S rDNA长度约为500bp的部分序列提交到GenBank，使用Blast程序来寻找与其有最大同源性的序列如果两者之间的16S rDNA同源性大于97.5％，则可认为它们属于同一个种，结果显示，5个菌落比对结果均为鼠李糖乳杆菌。
实施例3：细菌安全性
1)抗生素敏感性测试
本例测试了鼠李糖乳杆菌LR3001对Penicillin G,Ampicillin,Vancomycin,Cotrimoxazole,Rifampicin,Gentamicin,Streptomycin,Tetracycline,Chloramphenicol，Erythromycin 10种抗生素的抗性。具体测试方法如下：
灭菌平板中倒入20mLMRS培养基，冷却凝固备用。发酵培养好的鼠李糖乳杆菌进行活菌计数后，用生理盐水稀释到104～105后，吸取10μL到凝固好的空白MRS平板培养基上，用涂布棒涂布均匀。涂布好后，往培养皿中放置杭州滨和微生物试剂有限公司的药敏纸片，一个平皿中大约放置2～3个药敏纸片，每种抗生素做3个平行。结果见表1。
表1鼠李糖乳杆菌LR3001药敏试验抑菌圈直径
Figure BDA0003162651800000051
Figure BDA0003162651800000061
由表1可知，参照《乳酸细菌现代研究实验技术》中列出标准，鼠李糖乳杆菌LR3001对所检测的10种抗生素都有较好的敏感性，能够安全用于食品中。
2)代谢物毒性检测
乳酸旋光性检测：使用爱尔兰Megazyme公司的D-/L-乳酸检测试剂盒进行检测。结果显示，本例的鼠李糖乳杆菌LR3001不产生D-乳酸。
硝酸盐还原酶活性检测：将本例的本例的鼠李糖乳杆菌LR3001转接于MRS液体培养基中，于37℃培养18h，按4％的接菌量接入硝酸盐培养基中37℃培养5d后，滴加碘化钾溶液和淀粉溶液各10滴，观察实验结果。实验结果显示菌液没有变蓝，为阴性反应，而阳性对照变蓝，说明本例的鼠李糖乳杆菌LR3001不表达硝基还原酶。
吲哚实验：无菌条件下，将活化好的菌株按4％的接菌量接入到蛋白胨水培养基中，37℃培养72h，然后加入吲哚试剂8～10滴，观察实验结果。实验结果显示，菌液没有出现红色圆环，而阳性对照显示红色，表明本例的鼠李糖乳杆菌LR3001代谢不产生吲哚。
氨基脱羧酶活性检测：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳，使培养基变碱性，例如将赖氨酸分解为尸胺，鸟氨酸分解为腐胺，精氨酸分解为精胺。滴加指示剂，例如溴甲酚紫，呈黄色为阴性，呈紫色为阳性。因此，本例在无菌条件下，将活化好的菌株按4％的接菌量接入到蛋白胨水培养基中，37℃培养72h，然后加入溴甲酚紫8～10滴，观察实验结果。滴定结果呈黄色，为阴性，说明本例的鼠李糖乳杆菌ASD-9不具备产生物胺的能力。
实施例4：α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力检测
4.1乳酸菌的培养及发酵液的制备
发酵上清液的制备：将活化好的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，37℃培养16～24h，培养液经8000～12000r/min，10min，4℃离心后上清液即为发酵上清液(FS)。
菌悬液的制备：将实验室-80℃保存的冻干管菌粉接入已灭菌的MRS斜面培养基中37℃培养16～24h，然后从斜面上挑取1-2环菌泥接种于50mLMRS液体培养基中，37℃，静置培养16～24h，连续传代3次。培养液经8000～12,000r/min离心收集菌体，PBS洗涤3次，重悬于PBS，调整菌数1×109CFU/mL。
无细胞提取液的制备：将菌液按1～5％的比例，接种在MRS液体中，37℃静置培养16～24h，在8000～12000r/min，10min，4℃条件下将发酵液离心，收集菌体，PBS洗涤3次，重悬于PBS，调整菌数1×109CFU/mL，在菌悬液中加入10％的溶菌酶37℃处理2.5h，将处理后的菌悬液置于冰浴中，在功率为360～800W条件下超声破碎细胞，工作5s，间歇5～7s，全程时间30～60min，8000～12000r/min，10min，4℃条件下将破碎后的液体离心，收集上清液，上清液即为无细胞提取物。
将上述得到的发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)和无细胞提取液经100℃加热20min后，制成热灭活的发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)和无细胞提取液。
4.2鼠李糖乳杆菌LR3001体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的检测
具体方法为：
首先，提取猪小肠α-葡萄糖苷酶备用，提取方法为新鲜的猪小肠粘膜用磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.8)冲洗干净，然后用载玻片刮取小肠粘膜加入等体积的PBS(pH6.8)进行低温研磨。研磨充分的混合液在4℃下于12000r/min离心20min，收集上清液冻存于-80℃，使用时用PBS(pH6.8)稀释10倍使用。
反应体系为100μL。首先将25μL的底物4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，10mmol/L)和25μL的样品混匀后37℃孵育10min，然后加入50μLα-葡萄糖苷酶混匀后于37℃反应30min。随后迅速加入100μL Na2CO3(0.1mol/L)终止反应，用酶标仪测定405nm处的吸光度。每组实验设置3个平行。样品的吸光度用样品空白对照(体系中用50μL PBS(pH值6.8)代替α-葡萄糖苷酶)的吸光度进行校准。阴性对照(体系中无抑制α-葡萄糖苷酶的样品)用25μL PBS(pH值6.8)代替样品，阴性空白对照(体系中没有α-葡萄糖苷酶活性)用25μLPBS(pH值6.8)代替样品，50μL PBS(pH值6.8)代替α-葡萄糖苷酶。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式为：
α-葡萄糖苷酶抑制率＝(1-(A-B)/(C-D))×100％
式中：A为样品在405nm处的吸光度；B为样品空白对照在405nm处的吸光度；C为阴性对照在405nm处的吸光度；D为阴性空白对照在405nm处的吸光度。
结果见图1，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为46.86±4.74％，说明阿卡波糖具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，与临床结果一致。鼠李糖乳杆菌LR3001未灭活的菌悬液、发酵上清液、无细胞提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为35.23±3.18％、20.34±2.87％和23.58±2.88％。另外，鼠李糖乳杆菌LR3001灭活的菌悬液、发酵上清液、无细胞提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为22.34±1.68％、13.55±1.17％和15.28±1.36％。而对照菌株LGG未灭活的菌悬液、发酵上清液、无细胞提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为17.1％±1.68％、17.82±0.98％和20.62±1.93％，灭活的菌悬液、发酵上清液、无细胞提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为12.2±0.75％、11.82±0.42％和12.62±0.65％，因此，上述结果表明鼠李糖乳杆菌LR3001未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液、无细胞提取物均对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用，且明显高于商业菌株LGG，说明鼠李糖乳杆菌LR3001可以产生一定胞内和胞外活性物质，起到抑制α-葡萄糖苷酶作用。
4.3鼠李糖乳杆菌LR3001体外抑制α-淀粉酶活性的检测
取质量浓度为2mg/mL用pH值为7.0的磷酸缓冲液配制的α-淀粉酶溶液2mL，加2mL样液(4.1乳酸菌的培养及发酵液的制备中制得的乳酸菌菌悬液、发酵上清液、无细胞提取液)，37℃下反应30min后加2mL质量分数为1％的可溶性淀粉，37℃下反应15min，加碘液显色，在660nm测OD值。抑制率计算公式为：
α-淀粉酶酶活抑制率＝(1-(A-B)/(C-D))×100％
式中：A为样品空白组含有样品溶液不含α-淀粉酶溶液；B为样品组含有样品溶液以及α-淀粉酶溶液；C为空白组不含有样品溶液以及α-淀粉酶溶液；D为对照组不含有样品溶液含α-淀粉酶溶液。
结果如图2所示，阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率为37.82±2.02％，说明阿卡波糖具有抑制α-淀粉酶活性的作用，与临床结果一致。鼠李糖乳杆菌LR3001未灭活的菌悬液、发酵上清液、无细胞提取物对α-淀粉酶的抑制率分别为30.86±1.65％、15.85±1.02％和17.67±1.34％。另外，鼠李糖乳杆菌LR3001灭活的菌悬液、发酵上清液、无细胞提取物对α-淀粉酶的抑制率分别为22.01±1.04％、11.67±0.84％和14.88±1.29％，而对照菌株LGG未灭活的菌悬液、发酵上清液、无细胞提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为23.3％±1.68％、12.82±0.47％和15.62±0.76％，灭活的菌悬液、发酵上清液、无细胞提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为14.9±0.25％、7.82±0.42％和10.58±0.26％，因此，上述结果表明鼠李糖乳杆菌LR3001未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液、细胞破碎物上清液均对α-淀粉酶具有较强的抑制作用，且明显高于商业菌株LGG。
实施例5：耐酸耐胆盐能力
5.1耐酸性试验
取发酵16～24h的菌液1～5mL，加入用10mol/L的盐酸调pH2.0的50～100mLMRS培养基中，以菌液加入MRS培养基的处理液为对照，于37℃处理2h。取0.5～1mL处理液进行10倍梯度稀释，在平板上作菌落计数，从而计算出乳酸菌的存活率，以不调pH的MRS处理液活菌数为对照。
存活率(％)＝(待测pH的菌液活菌数/MRS培养基的菌液活菌数)×100。
结果显示，菌株发酵液在pH3.0的MRS培养基中2h存活率为96.8％，标准菌株在pH3.0的MRS培养基中2h存活率为90.8％，菌株耐酸能力显著高于标准菌株。
5.2耐胆盐试验
取发酵16～24h的菌液1～5mL，加入猪胆盐浓度为和0.2％和0.3％的50～100mLMRS培养基中，以菌液加入不加胆盐的MRS培养基的处理液为对照，于37℃处理2h。取样进行平板菌落计数，计算乳酸菌存活率。
存活率(％)＝(待测胆盐浓度的菌液活菌数/不加胆盐的菌液活菌数)×100。
结果显示，菌株在0.2％猪胆盐中2h的存活率为52.4％，在0.3％猪胆盐中2h的存活率为40.2％，标准菌株在0.2％猪胆盐中2h的存活率为30.3％，在0.3％猪胆盐中2h的存活率为24.2％，菌株耐胆盐能力显著高于标准菌株。
实施例6：减肥功能评价
根据《保健食品检验与评价技术规范》中减肥功能检验方法，选用体重范围150±10g SD雄性大鼠(实验动物及饲料购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)，每组8-12只，实验设空白对照组、模型对照组和三个剂量组，适应性喂养5d后，空白对照组继续采用基础饲料饲喂，其余给予高热量饲料(基础饲料80％、猪油10％、蛋黄粉10％)喂养14d，称重淘汰1/3肥胖抵抗大鼠，随机分配为4组，分别为模型对照组和低、中、高三个剂量组，继续采用高热量饲料喂养，低、中、高剂量组分别经口给予LR3001生理盐水菌悬液2×108、4×108、8×108CFU/(kg·d)，空白对照组和模型对照组给予同等量生理盐水。
每周记录摄食量、称量体重，45d后称体重，剖腹取体脂(睾丸及肾周围脂肪垫)并称重。实验组的体重或增重显著低于模型对照组，体脂重量显著低于模型对照组，摄食量不显著低于模型对照组，可判定减肥功能结果阳性。
表2不同剂量LR3001对大鼠体重的影响
分组 给药前体重/g 给药45d后体重/g 给药45d后体增重/g
空白对照组 199.72±29.31 345.45±28.24 145.47±30.14
模型对照组 245.34±35.90 447.84±36.02<sup>＊</sup> 203.29±36.16<sup>＊</sup>
低剂量组 243.95±33.24 415.39±30.73<sup>※</sup> 171.58±31.50<sup>※</sup>
中剂量组 243.08±29.63 403.28±26.73<sup>※</sup> 161.08±25.88<sup>※</sup>
高剂量组 246.26±23.70 383.61±20.49<sup>※</sup> 142.25±19.30<sup>※</sup>
注：＊p＜0.05，与空白对照组比较具有显著性差异；※p＜0.05，与模型对照组比较具有显著性差异。
表3不同剂量LR3001对大鼠体脂比和摄食量的影响
分组 脂体比/％ 每日摄食量/g
空白对照组 4.06±0.76 22.75±5.19
模型对照组 5.84±0.92<sup>＊</sup> 21.39±4.06
低剂量组 5.11±0.71 22.24±4.85
中剂量组 4.32±0.58<sup>※</sup> 20.80±5.64
高剂量组 4.01±0.60<sup>※</sup> 20.53±3.99
注：＊p＜0.05，与空白对照组比较具有显著性差异；※p＜0.05，与模型对照组比较具有显著性差异。
不同剂量LR3001对大鼠减肥功能结果见表2、表3，与模型对照组比较，在摄食量无显著差异基础上，不同剂量LR3001可以显著降低高能量饮食大鼠的体重(p＜0.05)，中剂量和高剂量LR3001可以显著降低高能量饮食大鼠的脂体比，动物实验评价结果显示，LR3001具有一定的减肥减脂功效，起到预防糖尿病或肥胖的作用，且减肥效果随着剂量加大而不断增强。
实施例7：降低血糖功能评价
参照《保健食品检验与评价技术规范》进行辅助降血糖功能检验评价。
选用成年昆明小鼠，体重26±2g，每组8-12只，实验设模型对照组和三个剂量组，适应性喂养7d后，禁食24h，给予四氧嘧啶45mg/kg(BW·iv)造模，6d后禁食4h，采用血糖仪进行剪尾取血测定血糖，选定血糖值10-25mmol/L造模成功动物，按照血糖水平分配为4组，分别为模型对照组和低、中、高三个剂量组，低、中、高剂量组分别经口给予LR3001生理盐水菌悬液2×108CFU、4×108、8×108/(kg·d)，模型对照组给予同等量生理盐水，连续30d，禁食4h，测定试验后空腹血糖值，计算实验前后血糖下降率。
血糖下降百分率＝(实验前血糖值-实验后血糖值)/实验前血糖值×100％
糖耐量测定方法，禁食4h，不同组给予不同受试样品，15min后给予葡萄糖2.0g/kg,然后测定给葡萄糖后0、0.5、2h的血糖值，计算各时间点血糖曲线下面积的变化。
血糖曲线下面积＝1/2×(0小时血糖值+0.5小时血糖值)×0.5+1/2×(2小时血糖值+0.5小时血糖值)×1.5＝0.25×(0小时血糖值+4×0.5小时血糖值+3×2小时血糖值)
表4不同剂量LR3001对小鼠血糖水平的影响
分组 血糖下降率/％ 血糖值/0h 血糖值/2.0h 血糖曲线下面积
模型对照组 7.75±6.35 16.62±5.21 24.89±7.04 37.25±3.18
低剂量组 13.40±4.82<sup>※</sup> 14.79±4.55 17.73±5.24<sup>※</sup> 31.60±2.57<sup>※</sup>
中剂量组 21.69±7.47<sup>※※</sup> 12.96±4.28<sup>※</sup> 15.38±5.76<sup>※※</sup> 28.77±4.93<sup>※</sup>
高剂量组 30.95±9.03<sup>※※</sup> 11.73±5.19<sup>※※</sup> 12.04±3.52<sup>※※</sup> 24.52±4.68<sup>※※</sup>
注：※p＜0.05，与模型对照组比较具有显著性差异，※※p＜0.01，与模型对照组比较具有非常显著性差异。
不同剂量LR3001对小鼠降低血糖功能评价结果见表4，与模型对照组比较，不同剂量LR3001可以降低高血糖模型小鼠的血糖水平，同时，降低血糖曲线下面积，增加小鼠的糖耐量水平，评价结果说明LR3001具有潜在的降低高血糖的功能，并且与现有技术中具有降血糖的菌种相比，菌数更低。
实施例8：包含鼠李糖乳杆菌LR3001的组合物
将实施例1分离获得的鼠李糖乳杆菌LR3001制备成食品、保健食品或药品等形式的组合物，所述组合物可以为冻干菌粉等粉剂形式，或者为片剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂等常用的保健食品或药物的制剂形式。所述组合物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性和α-淀粉酶活性的能力，因而具有降低血糖的功能和用途；还具备减肥减脂的作用。
所述鼠李糖乳杆菌通过生产发酵得菌粉，菌粉加工成减肥或糖尿病食品，直接食用或冲服饮用，使用方便，可起到预防糖尿病或肥胖的作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东凤凰生物有限公司
<120> 一种鼠李糖乳杆菌LR3001及其应用
<130> 2021.07.01
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ccggcttcgg gtgttacaaa ctctcatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa 60
cgtattcacc gcggcgtgct gatccgcgat tactagcgat tccgacttcg tgtaggcgag 120
ttgcagccta cagtccgaac tgagaatggc tttaagagat tagcttgacc tcgcggtctc 180
gcaactcgtt gtaccatcca ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg 240
atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtcttacta gagtgcccaa 300
ctaaatgctg gcaactagtc ataagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc 360
acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcattt tgcccccgaa ggggaaacct 420
gatctctcag gtgatcaaaa gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat 480
taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcaaccttg 540
cggtcgtact ccccaggcgg aatgcttaat gcgttagctg cggcactgaa gggcggaaac 600
cctccaacac ctagcattca tcgtttacgg catggactac cagggtatct aatcctgttc 660
gctacccatg ctttcgagcc tcagcgtcag ttacagacca gacagccgcc ttcgccactg 720
gtgttcttcc atatatctac gcatttcacc gctacacatg gagttccact gtcctcttct 780
gcactcaagt ttcccagttt ccgatgcact tcctcggtta agccgagggc tttcacatca 840
gacttaaaaa accgcctgcg ctcgctttac gcccaataaa tccggataac gcttgccacc 900
tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggttg gataccgtca 960
cgccgacaac agttactctg ccgaccattc ttctccaaca acagagtttt acgacccgaa 1020
agccttcttc actcacgcgg cgttgctcca tcagacttgc gtccattgtg gaagattccc 1080
tactgctgcc tcccgtagga gtttgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc cgatcaacct 1140
ctcagttcgg ctacgtatca ttgccttggt gagccgttac ctcaccaact agctaatacg 1200
ccgcgggtcc atccaaaagc gatagcttac gccatctttc agccaagaac catgcggttc 1260
ttggatttat gcggtattag catctgtttc caaatgttat cccccactta agggcaggtt 1320
acccacgtgt tactcacccg tccgccactc gttcaaaatt aaatcaagat gcaagcacct 1380
ttcaat 1386

Claims (7)

1.一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LR3001，其特征在于，已于2020年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020705，地址为中国武汉武汉大学。
2.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌LR3001在制备降血糖组合物中的应用。
3.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌LR3001在制备减肥减脂组合物中的应用。
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LR3001。
5.根据权利要求4所述的一种组合物，其特征在于，所述组合物选自食品、保健食品和药品。
6.根据权利要求4所述的一种组合物，其特征在于，所述组合物还包含载体或辅料，所述载体或辅料选自赋形剂、增溶剂、粘合剂、崩解剂。
7.根据权利要求4所述的一种组合物，其特征在于，所述组合物剂型选自粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂制剂形式。
CN202110795438.3A 2021-07-14 2021-07-14 一种鼠李糖乳杆菌lr3001及其应用 Active CN113293118B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110795438.3A CN113293118B (zh) 2021-07-14 2021-07-14 一种鼠李糖乳杆菌lr3001及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110795438.3A CN113293118B (zh) 2021-07-14 2021-07-14 一种鼠李糖乳杆菌lr3001及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113293118A true CN113293118A (zh) 2021-08-24
CN113293118B CN113293118B (zh) 2022-04-08

Family

ID=77331021

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110795438.3A Active CN113293118B (zh) 2021-07-14 2021-07-14 一种鼠李糖乳杆菌lr3001及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113293118B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116064285A (zh) * 2022-08-19 2023-05-05 浙江大学 降血糖鼠李糖乳杆菌zjuids07及其应用
CN116218733A (zh) * 2023-03-13 2023-06-06 广东悦创生物科技有限公司 一株鼠李糖乳酪杆菌xy5及其在制备抗过敏和助消化食品药品中的应用
CN116376770A (zh) * 2023-04-04 2023-07-04 仁仁微生物科技研究(沈阳)有限公司 一种鼠李糖乳酪杆菌rh0121在制备降血糖制品中的应用
CN117645965A (zh) * 2024-01-29 2024-03-05 潍坊康地恩生物科技有限公司 一株具有降解肠道吲哚、缓解慢性肾衰功能的鼠李糖乳酪杆菌

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108410761A (zh) * 2018-03-06 2018-08-17 山东凤凰生物有限公司 一株具有降亚硝酸盐、抗氧化的鼠李糖乳杆菌及筛选分离方法
JP2019004756A (ja) * 2017-06-23 2019-01-17 Ｊｘｔｇエネルギー株式会社 グルコシダーゼ阻害能を有する乳酸菌
CN109810913A (zh) * 2017-11-21 2019-05-28 华大精准营养（深圳）科技有限公司 一株鼠李糖乳杆菌asd-9及其应用
KR20200012236A (ko) * 2018-07-26 2020-02-05 바이오스트림테크놀러지스(주) 신규 유산균 및 이를 이용한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 유산균 발효물의 제조방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019004756A (ja) * 2017-06-23 2019-01-17 Ｊｘｔｇエネルギー株式会社 グルコシダーゼ阻害能を有する乳酸菌
CN109810913A (zh) * 2017-11-21 2019-05-28 华大精准营养（深圳）科技有限公司 一株鼠李糖乳杆菌asd-9及其应用
CN108410761A (zh) * 2018-03-06 2018-08-17 山东凤凰生物有限公司 一株具有降亚硝酸盐、抗氧化的鼠李糖乳杆菌及筛选分离方法
KR20200012236A (ko) * 2018-07-26 2020-02-05 바이오스트림테크놀러지스(주) 신규 유산균 및 이를 이용한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 유산균 발효물의 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HARSH PANWAR等: "Lactobacillus strains isolated from infant faeces possess potent inhibitory activity against intestinal alpha- and beta-glucosidases suggesting anti-diabetic potential", 《EUR J NUTR》 *
刘顺等: "具有潜在降血糖作用乳酸菌的筛选", 《食品工业科技》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116064285A (zh) * 2022-08-19 2023-05-05 浙江大学 降血糖鼠李糖乳杆菌zjuids07及其应用
CN116064285B (zh) * 2022-08-19 2023-08-11 浙江大学 降血糖鼠李糖乳杆菌zjuids07及其应用
CN116218733A (zh) * 2023-03-13 2023-06-06 广东悦创生物科技有限公司 一株鼠李糖乳酪杆菌xy5及其在制备抗过敏和助消化食品药品中的应用
CN116218733B (zh) * 2023-03-13 2023-09-12 广东悦创生物科技有限公司 一株鼠李糖乳酪杆菌xy5及其在制备抗过敏和助消化食品药品中的应用
CN116376770A (zh) * 2023-04-04 2023-07-04 仁仁微生物科技研究(沈阳)有限公司 一种鼠李糖乳酪杆菌rh0121在制备降血糖制品中的应用
CN116376770B (zh) * 2023-04-04 2023-10-13 江西仁仁健康微生态科技有限公司 一种鼠李糖乳酪杆菌rh0121在制备降血糖制品中的应用
CN117645965A (zh) * 2024-01-29 2024-03-05 潍坊康地恩生物科技有限公司 一株具有降解肠道吲哚、缓解慢性肾衰功能的鼠李糖乳酪杆菌
CN117645965B (zh) * 2024-01-29 2024-05-10 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一株具有降解肠道吲哚、缓解慢性肾衰功能的鼠李糖乳酪杆菌

Also Published As

Publication number Publication date
CN113293118B (zh) 2022-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113293118B (zh) 一种鼠李糖乳杆菌lr3001及其应用
CN109810912B (zh) 一株植物乳杆菌lh-511及其应用
CN106282072B (zh) 一种复合乳酸菌微生态制剂及其制备方法与应用
CN108102959B (zh) 人源性降胆固醇植物乳杆菌zy08及其应用
CN106957810B (zh) 一种乳酸片球菌及其用途
CN112011481B (zh) 一株防治畜禽细菌性腹泻的罗伊氏乳杆菌及其应用
CN113293113B (zh) 一株长双歧杆菌mi-186及其应用
CN110777087B (zh) 一种约氏乳杆菌及其应用
CN111849810B (zh) 拮抗幽门螺旋杆菌的乳酸菌zjuids03及其应用
CN109749957B (zh) 一种具有水产病原菌拮抗特性的格氏乳杆菌制剂的制备及应用
CN109810913B (zh) 一株鼠李糖乳杆菌asd-9及其应用
CN113832058A (zh) 乳双歧杆菌BLa80在制备降血脂和调节肠道菌群的药物或食品中的应用
CN116024130B (zh) 一株降血尿酸发酵乳杆菌a21215及其应用
CN110023486B (zh) 一种嗜酸乳杆菌及其培养方法和应用
CN110982726A (zh) 一种卷曲乳杆菌及其应用
CN116083325B (zh) 一种改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN116445321A (zh) 降核苷降血尿酸罗伊氏乳杆菌a21160及其应用
CN114752529A (zh) 植物乳杆菌hom3201菌株及其活菌制剂、制备方法和用途
CN113088468B (zh) 干酪乳杆菌Ma.GLRGJ 1及其应用
CN114085789A (zh) 戊糖片球菌ma.wtpqj01及其应用
CN116694512B (zh) 一株可用于饲料黄曲霉毒素B1净化的耐高温枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60及其应用
CN109576165B (zh) 一种贝酵母菌及其应用
CN116421632A (zh) 乳酸片球菌在制备具有减脂作用的食品、保健品或药物中的应用
CN113913334B (zh) 一株粪肠球菌ef-za1107-06及其应用
CN116445327A (zh) 一种降血脂多元益生菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 271099 No. 17 Huayuan Road, Taishan District, Tai'an City, Shandong Province

Applicant after: Shandong Fenghuang Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 271000 No.28 Chuangye street, Eastern New District, Tai'an City, Shandong Province

Applicant before: SHANDONG PHOENIX BIO-TECH. Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant