CN110122877A - 鼠李糖乳杆菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)在调节免疫力方面的用途，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511，分类命名为：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus。该鼠李糖乳杆菌对机体具有良好的免疫调节功效，对炎症因子表达的抑制作用、对抗炎因子表达的促进作用以及对淋巴细胞增殖的促进作用显著优于现有商业鼠李糖乳杆菌菌株，其对机体的免疫调节功能显著优于现有鼠李糖乳杆菌菌株。

Description

鼠李糖乳杆菌及其用途
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地，本发明涉及鼠李糖乳杆菌及其用途，更具体地，本发明涉及鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌在调节免疫力方面的用途、鼠李糖乳杆菌在制备药物、保健品、食品或组合物中的用途、组合物、药物、鼠李糖乳杆菌片剂、食品以及酸牛乳。
背景技术
炎症是感染及许多疾病最基本的病理过程。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动防御反应，但是过度的炎症反应也是有害的，例如长期炎症反应分泌的很多炎症因子会对正常组织的造成破坏、促进肿瘤发生等。免疫与炎症是一个问题的两个方面，免疫力的高低决定人的健康程度。人体的免疫力部分取决于遗传基因，部分取决于环境的影响，如饮食、睡眠、运动、压力等，其中饮食中的益生菌类食品、保健品是近年来调节免疫力的重要研究目标。
益生菌是肠道中的正常菌群，能够定殖于肠道细胞，当乳酸菌数量足够大时，可优先粘附于肠上皮细胞，抑制病原菌的粘附定殖，并且释放抗菌肽、有机酸等来抑制病原菌生长繁殖。益生菌能够调节机体特异性和非特异性免疫应答，有助于维持机体在健康状态时免疫功能的正常水平。益生菌进入消化道后被肠黏膜内特有的M细胞摄取，进而递呈给巨噬细胞，益生菌表面的多种微生物相关分子模型(MAMP)与巨噬细胞的表面模式识别受体(PRR)相互作用，刺激它们产生下游细胞因子，调节免疫相关反应。益生菌的细胞壁成分如肽聚糖、脂磷壁酸、脂阿拉伯甘露聚糖等可被巨噬细胞的TLR识别，TLR是PRR中的一种重要受体。
益生菌能够激活不同部位巨噬细胞的增殖，如淋巴集结、脾脏和腹膜中的巨噬细胞。研究发现乳酸杆菌、双歧杆菌均能增强巨噬细胞增殖活性。巨噬细胞是单核巨噬细胞系统的主要组成部分，具有吞噬和杀伤多种病原微生物、处理和呈递抗原、分泌细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β)等作用，在炎症、感染和肿瘤等许多疾病过程中均发挥了重要作用。有些益生菌能够通过调节巨噬细胞抗炎细胞因子的分泌来调节炎症反应，避免组织损伤。炎症因子包括IL-1、TNF-α和IL-6等，它们在炎症反应中起关键作用。目前，益生菌及其组分对巨噬细胞免疫功能的影响及其作用机理已成为研究热点。
益生菌对巨噬细胞免疫功能的影响具有菌株特异性，因此对不同菌株及其组分的免疫功能需作系统和进一步深入研究。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
本申请的发明人对其筛选出的一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus，于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14511)(在本申请中，该株鼠李糖乳杆菌被称作鼠李糖乳杆菌ASD-9)开展功能验证实验后惊喜地发现，鼠李糖乳杆菌ASD-9对炎症因子表达的抑制作用、对抗炎因子表达的促进作用以及对淋巴细胞增殖的促进作用显著优于现有商业鼠李糖乳杆菌菌株，其对机体的免疫调节功能显著优于现有鼠李糖乳杆菌菌株。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)在调节免疫力方面的用途，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511，分类命名为：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9对机体具有良好的免疫调节功效，对炎症因子表达的抑制作用、对抗炎因子表达的促进作用以及对淋巴细胞增殖的促进作用显著优于现有商业鼠李糖乳杆菌菌株，其对机体的免疫调节功能显著优于现有鼠李糖乳杆菌菌株。
在本发明的第二方面，本发明提出了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)在制备药物、保健品、食品或组合物中的用途，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511，分类命名为：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，所述药物、保健品、食品或组合物用于下列的至少之一：治疗、预防或缓解炎症；调节免疫力；抑制炎症因子表达；促进抗炎因子表达；增进淋巴细胞增殖。发明人通过实验验证，根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9在抑制炎症因子表达、促进抗炎因子表达、促进淋巴细胞增殖、调节免疫力功效方面优于现有鼠李糖乳杆菌菌株，利用根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9所制备的药物、保健品、组合物或食品在治疗、预防或缓解炎症、调节免疫力、抑制炎症因子表达、促进抗炎因子表达以及增进淋巴细胞增殖方面具有优势。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述炎症为肠炎。根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9具有很好的肠黏附能力和对肠道病原菌有广谱的抑菌作用，利用根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9所制备的药物、保健品或食品在治疗、预防或缓解肠炎方面效果更优。
根据本发明的实施例，所述肠炎是由产肠毒素大肠杆菌所导致的。根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9所制备的药物、保健品或食品在治疗、预防或缓解由产肠毒素大肠杆菌所导致的肠炎方面效果更优。
根据本发明的实施例，所述鼠李糖乳杆菌的浓度为1.0×106CFU/mL～1.0×109CFU/mL。进而利用鼠李糖乳杆菌ASD-9所制备的药物、保健品或食品在治疗、预防或缓解炎症、调节免疫力、抑制炎症因子表达、促进抗炎因子表达、增进淋巴细胞增殖方面效果更优。
根据本发明的实施例，所述炎症因子包括选自TNF-α、IL-1β、IL-6的至少之一。根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9能够显著抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。
根据本发明的实施例，所述炎症因子为IL-1β。发明人发现，根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9在抑制炎症因子IL-1β的表达方面显著优于现有商业鼠李糖乳杆菌。
根据本发明的实施例，所述抗炎因子包括选自IL-10、TGF-β的至少之一。根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9能够显著促进抗炎因子IL-10、TGF-β的表达。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包含：前面所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14511，分类命名为：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus。根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9在抑制炎症因子表达、促进抗炎因子表达、促进淋巴细胞增殖、调节免疫力功效方面优于现有鼠李糖乳杆菌菌株，包含根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9的组合物具有好的缓解炎症、调节免疫的功效。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物包含：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511，分类命名为：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus。根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9在抑制炎症因子表达、促进抗炎因子表达、促进淋巴细胞增殖、调节免疫力功效方面优于现有鼠李糖乳杆菌菌株，包含根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9的药物具有好的缓解炎症、调节免疫的功效。
根据本发明的实施例，所述药物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括：药学上可接受的辅剂。
根据本发明的实施例，所述药学上可接受的辅剂包括稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂的至少之一。
根据本发明的实施例，所述药物呈片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、冻干制剂的至少一种。进而，根据本发明实施例的药物方便给药，适于保持鼠李糖乳杆菌的最佳活性。
根据本发明的实施例，所述药物的给药剂量不受特别限制，实际应用中，可以根据给药对象的健康状况灵活选择。根据本发明的一些实施例，该实施例所述的药物为复合益生菌片，将所述药物以1.0×109CFU/天的剂量对肠炎模型小鼠进行干预，被干预小鼠的炎症得到明显缓解，并增强了免疫功能。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种鼠李糖乳杆菌片剂。根据本发明的实施例，所述鼠李糖乳杆菌片剂包括：20质量份的鼠李糖乳杆菌冻干粉、60质量份的膳食纤维、10质量份的山梨糖醇、5质量份的微晶纤维素以及5质量份的硬脂酸镁，其中，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511，分类命名为：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，所述冻干粉中所述鼠李糖乳杆菌的含量为5.0×109CFU/g。根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌片剂具有显著更优的调节免疫力的功效。
根据本发明的实施例，上述鼠李糖乳杆菌片剂还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，基于冻干粉的总重量，所述鼠李糖乳杆菌冻干粉进一步包括：7.3质量％海藻糖，3.8质量％甘露醇，0.14质量％硫酸锰。进而冻干粉中的鼠李糖乳杆菌可保持较高活性。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种食品。根据本发明的实施例，所述食品包含：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511，分类命名为：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus。根据本发明实施例的食品具有较好的缓解炎症、调节免疫的功效。
需要说明的是，本申请所述的食品应做广义的理解，任何可咀嚼、吞咽或能为机体提供能量的物质均可视为食品，如膨化食品、乳制品、饼干、口香糖、冰激凌等。
根据本发明的实施例，上述食品还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述食品进一步包括：食品学上可接受的添加剂。进而所述食品的口感更佳。
根据本发明的实施例，所述食品为牛乳、口香糖、饼干、压片糖果、固体饮料等。进而鼠李糖乳杆菌可在食品中保持较佳的活性，适于在机体中发挥调节免疫力的功效。
另外，需要说明的是，本发明的鼠李糖乳杆菌ASD-9可以与通常的食品中所使用的食品材料配合食用。例如，谷类及薯类：谷类包括米、面、杂粮，薯类包括马铃薯、红薯等；动物性食物，包括肉、禽、鱼、奶、蛋等；豆类及其制品，包括大豆及其他干豆类；蔬菜水果类，包括鲜豆、根茎、叶菜、茄果等；纯热能食物，包括动植物油、淀粉、食用糖和酒类等。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种酸牛乳。根据本发明的实施例，所述酸牛乳包括：0.1～0.5质量％鼠李糖乳杆菌冻干粉、0.4质量％保加利亚乳杆菌和嗜热乳杆菌粉、15～20质量％奶粉以及余量的水，其中，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511，分类命名为：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，所述冻干粉中所述鼠李糖乳杆菌的含量为5.0×1010CFU/g。根据本发明实施例的酸牛乳具有显著更优的免疫调节功效。
根据本发明的实施例，上述酸牛乳还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述酸牛乳是通过如下方式获得的：
1)将所述奶粉和水进行混合、均质、灭菌以及冷却处理，其中，所述灭菌是在121℃的条件下进行300s，所述冷却处理后的温度为42℃，
2)向冷却处理产物中接入活化发酵剂并进行发酵处理，所述发酵剂包括保加利亚乳杆菌和嗜热乳杆菌菌粉，所述发酵是在42℃的条件下进行10h，
3)将发酵处理产物进行冷却处理，并将冷却后产物与所述鼠李糖乳杆菌进行混合，以便获得所述酸牛乳。
通过上述方式获得的酸牛乳营养价值高、益生菌含量高、鼠李糖乳杆菌活性高。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种用于调节免疫力的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511，分类命名为：鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌ASD-9对机体具有良好的免疫调节功效，对炎症因子表达的抑制作用、对抗炎因子表达的促进作用以及对淋巴细胞增殖的促进作用显著优于现有商业鼠李糖乳杆菌菌株，其对机体的免疫调节功能显著优于现有鼠李糖乳杆菌菌株。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的ASD-9在光学显微镜下的结构图；
图2是根据本发明实施例的ASD-9黏附HT-29细胞系的结果图；
图3是根据本发明实施例的ASD-9抑制肠道病原菌生长的结果图；
图4是根据本发明实施例的ASD-9干预小鼠后小鼠体重变化趋势的结果图；
图5是根据本发明实施例的ASD-9干预小鼠后小鼠结肠粘膜组织形态学变化的病理切片结果图；以及
图6是根据本发明实施例的ASD-9干预小鼠后小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β的变化结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
以下实施例通过体外益生特性评估，单核巨噬细胞炎症模型评估筛选出了一株有抗炎效果的ASD-9菌株，为了验证该菌株在体内的免疫调节功效，发明人采用了一种肠炎小鼠模型来开展功能验证实验。产肠毒素大肠杆菌作为外源菌，感染后引起小鼠腹泻、诱导肠道炎症发生。灌服大肠杆菌诱导的肠炎模型是一种研究外源菌感染诱发的肠炎、宿主免疫反应、微生态制剂治疗肠炎机制的理想模型。
根据下面的实施例可以看出，本发明选用的鼠李糖乳杆菌ASD-9(ASD-9于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14511)具有较好的抗肠炎作用以及调节免疫力功效。具体表现在显著缓解产肠毒素大肠杆菌所致的肠炎小鼠的表观状态，降低小鼠肠道炎症的反应，抑制炎症因子表达并促进抗炎因子表达，增进淋巴细胞增殖等。
下面将对实施例作具体介绍。
实施例1鼠李糖乳杆菌菌株的来源及鉴定
以内蒙古农家酸奶发酵食品为样品，取1g酸奶样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，将样品稀释1000倍，将其涂布于配制的MRS固体培养基表面，置于37℃培养箱中培养24～48h，观察菌落形态特征。从中挑取疑似乳酸菌的单菌落划线分离至新的MRS培养基上，37℃过夜培养后，再次进行划线分离纯化。采用无菌牙签从第二划线分离的培养基上挑取若干个单菌落，分别进行编号。选取其中20株单菌落进行16s DNA测序。
其中，1L的MRS固体培养基包括：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，吐温80 1.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂(德国Merck公司)17.5g；
MRS肉汤培养基配方较MRS固体培养基仅无琼脂。
MRS培养基的pH调至6.5，121℃灭菌20min。培养基制备完成，4℃冷藏备用。
本例16s DNA扩增的引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列。
5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(SEQ ID NO：1)。
5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO：2)。
引物由深圳华大生命科学研究院合成。
PCR反应体系为，50μL的反应液中包括：10mM dNTPs 1μL、10×buffer 5μL、10mM的上下游引物各1μL、菌液PCR模板1μL、5U/μL的Taq酶1μL，ddH2O补充至50μL。
PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后进入35个循环：94℃30s、60℃30s、72℃1min，循环结束后，72℃延伸5min，4℃待机。
对PCR扩增产物进行切胶回收，并对回收的PCR产物进行测序。本例采用试剂盒TaKaRa MiniBEST agarose GeL DNA Extraction kit进行切胶回收，详细步骤参见试剂盒说明书。本例的PCR产物由深圳华大生命科学研究院测序。
测序结果显示，编号为ASD-9的菌株其16s rDNA测序结果为SEQ ID NO：3所示序列。
5’-CGCCGTGCGGGTGCCTATACATGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGTTTATTTCGAAGCTACGCGAAGACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAATCTAGAGATTAGACGTTTCCCTTCGGGGACATGGAAACAGGTGGGTGCATGT-3’(SEQ ID NO：3)。
用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，比对结果显示，ASD-9菌株与鼠李糖乳杆菌亲缘关系最近，相似性达到99％，因此，鉴定ASD-9菌株为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌ASD-9，即本例筛选获得的鼠李糖乳杆菌。本例筛选获得的鼠李糖乳杆菌ASD-9于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14511。
将鼠李糖乳杆菌ASD-9的单菌落转接到MRS培养液中进行纯培养，37℃培养18h，以备后续使用。此外，在MRS培养基中于光学显微镜下观察革兰氏染色后的鼠李糖乳杆菌ASD-9，结果显示，鼠李糖乳杆菌ASD-9无芽孢、胞壁结构完整，具体光学显微镜照片参见附图1。
实施例2鼠李糖乳杆菌ASD-9抗炎益生特性评估
1、HT-29结肠癌细胞系模型评估ASD-9肠黏附能力
定植和黏附是菌株发挥益生功能的前提。发明人以HT-29人结肠癌细胞来近似模拟机体结肠细胞，研究ASD-9对机体肠道的黏附能力。黏附试验过程如下：首先，将HT-29细胞进行消化，用不含双抗的1640培养基稀释将细胞浓度调整至1×106cell/mL；然后，滴加0.5mL上述浓度的细胞于含细胞爬片的12孔板中，静置培养使其长成致密单层细胞。同时，将待测菌株培养活化2代，用1640培养液将菌液重悬至2×108CFU/mL的浓度。最后，取1mL菌悬液加入到12孔板中，取代原来的1640培养基，共孵育90min，孵育结束后用PBS漂洗除去未黏附的细菌，漂洗4次。然后甲醇固定细胞爬片上的贴壁细胞与黏附的ASD-9菌体，20min后用潘红染色，进行显微镜观察并统计黏附比。统计结果显示，ASD-9对HT-29细胞系有较好的黏附能力，黏附比为7.45CFU/cell，黏附情形见附图2。
2、牛津杯法评估ASD-9MRS发酵液的抑菌能力
2.1乳酸菌发酵液制备
ASD-9乳酸菌接种在MRS培养基中，37℃复活，18h后传代，再接种到20ml MRS液中培养24h，把发酵液在4℃、4 000r/min的条件下离心20min，去除菌体，取上清液，用于后续处理，MRS培养基作为对照。
2.2指示菌培养
将各病原菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)甘油种分别接种于5ml普通肉汤中，37℃，160rpm摇床培养18h，活化3代后用于本试验。
2.3牛津杯法测定抑菌能力
在直径9cm的培养皿中加20mL灭菌固体培养基，待凝固以后，用灭菌吸管分别吸取0.1mL指示菌液(调整菌液浓度为107CFU/ml)于固体培养基平板中，然后用灭菌接种铲涂抹均匀，在每个平皿内等距离放置牛津杯，每个牛津杯加入200μL上述发酵上清液。室温静止4h后，于37℃培养48h后观察平皿，测量并记录抑菌圈直径。结果见表1，抑菌圈见附图3。
表1：ASD-9对3株肠道病原菌有广谱的抑菌作用(单位：mm)
抑菌能力 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 铜绿假单胞菌
ASD-9 11 19 17
实施例3THP-1炎症细胞模型评估ASD-9的免疫调节功效
于6孔细胞培养板中添加含100ng/ml PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)的RPMI1640培养基诱导1.0x106cell/mL THP-1细胞系72h，此时成熟的巨噬细胞均呈现贴壁生长状态。更换培养基后加入终浓度为1.0x106CFU/mL的ASD-9共培养6h。轻轻吸走含菌的培养基并用PBS液洗涤贴壁生长的THP-1细胞层。向贴壁生长的THP-1培养孔中添加含1ug/mL LPS(Lipopolysaccharides)的培养基孵育细胞6h。之后采用酶联免疫试剂盒(R&DSystems)检测细胞培养上清液中三种促炎症因子TNF-α，IL-1β，IL-6的含量变化。本次实验使用具有免疫调节作用的商业菌株LGG作为阳性对照，诱导为巨噬细胞的THP-1与未经益生菌及LPS共培养处理的为空白组，诱导为巨噬细胞的THP-1与未经益生菌共培养及经LPS处理的为炎症组，每组三个重复，所有过程的细胞孵育均在二氧化碳培养箱中进行(37℃，5％CO2)。实验结果见表2，各组p<0.05，结果表明ASD-9组中各促炎因子水平远低于炎症组，具有缓解巨噬细胞炎症反应的作用，且抗炎作用效果好于阳性对照组(鼠李糖乳杆菌LGG，商业菌株，购置于CGMCC)，其中对IL-1β的抑制显著优于阳性对照LGG组。
实验结果表明，在LPS刺激THP-1细胞后，导致免疫应答反应过激。而通过ASD-9处理能够通过降低促炎因子的表达，从而下调细胞免疫过激现象，具有免疫调节的作用。
表2：ASD-9对LPS刺激的THP-1细胞炎症因子表达的抑制作用(单位：p g/mL，各组P<0.05)
实施例4肠炎小鼠模型评估ASD-9在体内的免疫调节效应
1、实验菌株的制备
将活化两次的菌株接种于液体培养基中，于37℃培养18h，6000r/m离心10min，用灭菌生理盐水洗涤后收集菌体。然后，加入0.85％生理盐水，调整菌体数至5.0×109CFU/mL，然后将活菌按每日使用量分装于15mL离心管。
2、实验动物分组及ASD-9干预措施
BALB/c 4周龄小鼠40只，随机分为4组。小鼠饲养在恒温(21-22℃)房间，12h光暗循环。禁食24h后进行灌胃。各组小鼠实验前灌服0.2mL NaHCO3溶液。30min后，对照组：生理盐水0.2mL，灌服10天；炎症组：连续灌胃7天生理盐水，之后连续灌胃大肠杆菌(浓度：1.0×108CFU/mL)3天；ASD-9组：连续灌胃ASD-9(浓度：2.0×109CFU/mL)7天；LGG组：连续灌胃LGG(浓度：2.0×109CFU/mL)7天，之后连续灌胃大肠杆菌(浓度：1.0×108CFU/mL，)3天。各组小鼠每天灌胃一次，每次灌胃0.2mL，直至第10天，每日观察小鼠形态并记录。
3、体重测定
实验开始后，每日观察小鼠精神状态，粪便情况。每隔2天测量各组小鼠体重，计算平均值。实验开始前各组小鼠体重无明显差异，粪便干燥呈颗粒状。灌胃大肠杆菌的小鼠，第4天开始出现体重下降趋势，并且进食量减退，活动性变差，小鼠粪便带血并且不成形，说明肠炎造模成功。ASD-9组整体与对照组无显著差别，无论是小鼠日常行为还是体重变化，第6天后，ASD-9组小鼠的体重略高于LGG组，说明提前灌胃ASD-9能很好干预肠炎症的发生程度。各组小鼠体重变化见附图4。
4、炎症标本采集及组织学检查
实验第15天，处死各组小鼠取结肠组织，用生理盐水将肠内容物冲洗干净。截取1cm肠段，浸泡于中性福尔马林液中固定24h后，制作石蜡切片并进行HE染色。
对照组小鼠结肠无明显病理变化。炎症组小鼠肠黏膜发生溃疡，严重充血，并伴随化脓现象，肠腔充满炎性分泌物，肠腺间隙增宽。ASD-9组肠腺间隙明显小于炎症组，腺体排列整齐，无化脓现象，炎症程度明显轻于炎症组及LGG组，与正常组差别不大。说明ASD-9提前干预小鼠能显著缓解产肠毒素大肠杆菌对小鼠造成的炎症感染程度，ASD-9在缓解产肠毒素大肠杆菌对小鼠造成的炎症感染程度发面优于LGG。各组小鼠病理切片见附图5。
5、小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β的测定
实验第15天，经眼眶采血，然后颈椎脱臼处死。收集血液室温静止30分钟，离心后的血清置于离心管中。根据TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β ELISA试剂盒(购于R&D Systems)检测方法检测小鼠外周血中细胞因子含量。检测结果显示，ASD-9显著抑制血清中炎症因子TNF-α、IL-6的表达，并显著促进抗炎因子IL-10和TGF-β的表达，从而降低炎症；ASD-9在抑制血清中炎症因子TNF-α、IL-6的表达、促进抗炎因子IL-10和TGF-β的表达方面优于LGG。具体见附图6。
6、ASD-9促进淋巴细胞增殖
15天后处死小鼠，无菌取出脾脏，置于5mL RPMI 1640培养液中，用1mL注射器的针芯轻轻碾压；将碾压过的脾脏同培养液一起经200目不锈钢筛网过滤后将细胞悬液轻轻加入到淋巴细胞分离液上层，3000r/min离心20min；吸取乳白色的淋巴细胞层转入离心管中，用RPMI 1640培养液洗涤2次；最后用RPMI 1640完全培养基(含10％胎牛血清)重悬细胞，调整细胞浓度为l×105cell/mL。
将四组实验小鼠的淋巴细胞，分别都加入2个孔中，每孔1mL，然后分别在第一孔加入100μL刀豆球蛋白A溶液(ConA液，50μg/mL)，第二孔加入100μL蒸馏水，置5％CO2，37℃培养72h，作3个平行样，共计6孔。培养结束前4小时，每孔吸去上清液0.7mL，加入0.7mL无血清RPMI 1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶溶解，以570nm波长测定光密度值，检测两孔的差值。
实验结果：对产肠毒素大肠杆菌诱导的肠炎小鼠模型的脾淋巴细胞增殖试验中，ADS-9组淋巴细胞光密度差值高于炎症组、对照组和LGG组，差异有显著性意义(P<0.05)(见表3)。表明鼠李糖乳杆菌ADS-9组的脾淋巴细胞转化试验结果为阳性，与LGG组相比效果更为显著，鼠李糖乳杆菌ASD-9在免疫力低下小鼠体内具有增强免疫力的作用，且在免疫力低下小鼠体内的增强免疫力效果显著优于LGG，可见ASD-9具有免疫调节功能。
表3：ASD-9促进脾淋巴细胞转化(各组p<0.05)
组别 OD<sub>570</sub>差值
对照组 0.48
炎症组 0.50
LGG组 0.50
ASD-9组 0.53
实施例5药物及食品的制备
1、鼠李糖乳杆菌片剂制备方法
鼠李糖乳杆菌ASD-9的冻干粉(5.0×109CFU/g)20％(鼠李糖乳杆菌培养液离心得到的菌泥添加冻干保护剂海藻糖7.3％，甘露醇3.8％，硫酸锰0.14％悬浮，置于4℃冰箱预冻1h，再置于-20℃冰箱预冻1h至固化，然后转移到-80℃冰箱冻结1h。冻干机开机预冻5min至温度降为-55℃，将处理好的菌体转移至冻干机冻干24h，即获得鼠李糖乳杆菌冻干粉)、膳食纤维60％、山梨糖醇10％、微晶纤维素5％、硬脂酸镁5％，将其混合均匀后，压片制成片剂。
2、鼠李糖乳杆菌发酵酸牛乳制备方法
将奶粉和水进行混合，均质，以121℃超高温灭菌300s杀菌，冷却到42℃，接入活化好的发酵剂：保加利亚乳杆菌和嗜热乳杆菌菌粉共0.4％。在42℃下发酵10h，冷却后加入0.1％5.0×1010CFU/g的鼠李糖乳杆菌ASD-9，搅拌，灌装即可。
3、以上药品及食品的药效试验
试验方案：同实施4，其中灌胃的样品改为以上两种药品及食品捣碎后加无菌水制成的悬液，调整菌数至1.0×109CFU/mL。
用含鼠李糖乳杆菌菌株的药品或食品干预小鼠7天后，再采用产肠毒素大肠杆菌灌胃干预组小鼠致炎症，15天后，从实验小鼠的表观状态、病理组织学观察、血清细胞因子、脾淋巴细胞转化反应试验检测结果表明，鼠李糖乳杆菌ASD-9在小鼠体内具有调节免疫力功效。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市华大农业应用研究院
深圳华大三生园科技有限公司
<120> 鼠李糖乳杆菌及其用途
<130> PIDC3180313
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 16s DNA扩增的引物
<400> 1
agagtttgat catggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 16s DNA扩增的引物序列
<400> 2
tagggttacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1046
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ASD-9的菌株的16s rDNA序列
<400> 3
cgccgtgcgg gtgcctatac atgcagtcga acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat 60
catgatttac atttgagtga gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga 120
agcgggggat aacacctgga aacagatgct aataccgcat aacaacttgg accgcatggt 180
ccgagcttga aagatggctt cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag 240
atggtggggt aacggctcac catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc 300
cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca 360
caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa 420
aactctgttg ttaaagaaga acatatctga gagtaactgt tcaggtattg acggtattta 480
accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540
tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc 600
cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag 660
tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg 720
cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag 780
ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt 840
cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac 900
tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtgtttattt cgaagctacg 960
cgaagacctt accaggtctt gacatactat gcaatctaga gattagacgt ttcccttcgg 1020
ggacatggaa acaggtgggt gcatgt 1046

Claims (10)

1.鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)在调节免疫力方面的用途，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511。
2.鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)在制备药物、保健品、食品或组合物中的用途，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511，所述药物、保健品、食品或组合物用于下列的至少之一：
治疗、预防或缓解炎症；
调节免疫力；
抑制炎症因子表达；
促进抗炎因子表达；
增进淋巴细胞增殖。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述炎症为肠炎；
任选地，所述肠炎是由产肠毒素大肠杆菌所导致的。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌的浓度为1.0x106CFU/mL～1.0×109CFU/mL；
任选地，所述炎症因子包括选自TNF-α、IL-1β、IL-6的至少之一；
优选地，所述炎症因子为IL-1β；
任选地，所述抗炎因子包括选自IL-10、TGF-β的至少之一。
5.一种组合物，其特征在于，包含：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511。
6.一种药物，其特征在于，包含：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511；
任选地，所述药物进一步包括：药学上可接受的辅剂；
任选地，所述药学上可接受的辅剂包括稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂的至少之一；
任选地，所述药物呈片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、冻干制剂的至少一种。
7.一种鼠李糖乳杆菌片剂，其特征在于，包括：20质量份的鼠李糖乳杆菌冻干粉、60质量份的膳食纤维、10质量份的山梨糖醇、5质量份的微晶纤维素以及5质量份的硬脂酸镁，
其中，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511，
所述冻干粉中所述鼠李糖乳杆菌的含量为5.0×109CFU/g；
任选地，基于冻干粉的总重量，所述鼠李糖乳杆菌冻干粉进一步包括：7.3质量％海藻糖，3.8质量％甘露醇，0.14质量％硫酸锰。
8.一种食品，其特征在于，包含：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511；
任选地，所述食品进一步包括：食品学上可接受的添加剂；
任选地，所述食品为乳制品、口香糖、饼干、压片糖果或固体饮料。
9.一种酸牛乳，其特征在于，包括：0.1～0.5质量％鼠李糖乳杆菌冻干粉、0.4质量％保加利亚乳杆菌和嗜热乳杆菌粉、15～20质量％奶粉以及余量的水，
其中，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511，
所述冻干粉中所述鼠李糖乳杆菌的含量为5.0×1010CFU/g；
任选地，所述酸牛乳是通过如下方式获得的：
1)将所述奶粉和水进行混合、均质、灭菌以及冷却处理，
其中，所述灭菌是在121℃的条件下进行300s，
所述冷却处理后的温度为42℃，
2)向冷却处理产物中接入活化发酵剂并进行发酵处理，所述发酵剂包括所述保加利亚乳杆菌和嗜热乳杆菌菌粉，所述发酵是在42℃的条件下进行10h，
3)将发酵处理产物进行冷却处理，并将冷却后产物与所述鼠李糖乳杆菌进行混合，以便获得所述酸牛乳。
10.一种用于调节免疫力的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，所述鼠李糖乳杆菌于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14511。
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