CN110331116A - 鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents

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胡诚
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Abstract

本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌，本发明所述鼠李糖乳杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18210。本发明所述鼠李糖乳杆菌可以应用于防治轮枝镰孢菌。可以用于玉米防霉。

Description

鼠李糖乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域。更具体地说，本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌及其应用。
背景技术
镰刀菌属广泛分布与自然界中，镰刀菌有些种可产生毒素，污染粮食、蔬菜和饲料，人畜误食会中毒，比如轮枝镰孢菌；镰刀菌也能侵染多种经济作物，引起水稻、小麦、玉米、蚕豆、蔬菜等的赤霉病，棉花的枯萎病，香蕉枯萎病等。
以前常用一些物理方法和添加化学防腐剂方法防止农作物腐败变质和延长货架期。但物理方法存在使用范围窄、能耗大、设备造价高等缺点而难以广泛推广；化学防腐剂又存在着安全隐患，长期食用会危害人体健康，且许多腐败菌已对化学防腐剂产生抗性。近年来国内外许多研究机构及发酵剂专业公司加大了抗霉菌乳酸菌菌株选育及应用研究，如帝斯曼(DSM)的Lb.amylovorus DSM 19280，丹麦丹尼斯克(DANISCO)公司研发的商品化乳酸菌发酵剂HOLDBACTM已用于发酵乳及肉制品中抑制酵母、霉菌、单核细胞增多性李斯特杆菌及其它有害菌的生长，取代化学防腐剂而延长发酵食品的货架期。但是在应用中发现现有菌株存在抗霉菌活性不稳定、抗菌谱窄等不足，严重限制其产业应用。因此，迫切需要研究及开发高效、安全的抗霉菌乳酸菌菌株及其制剂。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种鼠李糖乳杆菌，其对轮枝镰孢菌具有显著的抑制作用。还提供了一种鼠李糖乳杆菌在用于玉米防霉中的应用，可以防止玉米长霉。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种鼠李糖乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.18210。
所述的鼠李糖乳杆菌的16S rDNA如SEQ ID No:1所示。
提供一种鼠李糖乳杆菌在防治轮枝镰孢菌中的应用。
提供一种鼠李糖乳杆菌在农作物防霉中的应用。
优选的是，所述的鼠李糖乳杆菌在玉米防霉中的应用。
提供一种鼠李糖乳杆菌在制备防治轮枝镰孢菌的产品中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：鼠李糖乳杆菌对轮枝镰孢菌具有显著的抑制作用，可以防止玉米长霉。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的所述鼠李糖乳杆菌双层平板拮抗法的抑菌结果图；
图2为本发明所述鼠李糖乳杆菌琼脂柱法的抑菌结果图；
图3为本发明所述鼠李糖乳杆菌牛津杯法的抑菌结果图；
图4为本发明玉米防霉试验第1组的抑菌结果图；
图5为本发明玉米防霉试验第2组的抑菌结果图；
图6为本发明玉米防霉试验第3组的抑菌结果图；
图7为本发明玉米防霉试验第4组的抑菌结果图；
图8为的a、b、c、d为不同抑菌能力的抑菌效果图；
图9为2，30，53，61，89，91，92，100，103号菌株的抑菌率柱形图。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
本发明所述的鼠李糖乳杆菌的分离和鉴定：
在无菌操作下取10g待测青贮饲料样品，切碎放入装有100ml无菌蛋白胨水的锥形瓶中，在摇床中200r/min摇动1h，使样品附着的乳酸菌均匀分散在液体中，取上清液配置成8个梯度的乳酸菌稀释液。然后分别取10-5、10-6、10-7、10-8稀释液吸取100μl涂布在MRS平板培养基上，静置约30min，倒置于37℃恒温培养箱中培养48h，选择菌落密度适中、生长良好、溶钙圈明显的菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验。筛选出多种乳酸菌菌落，挑取单菌落，在MRS固体培养基上划线，37℃恒温培养4h，重复划线分离培养3次，得到多种纯化的单菌株，即乳酸菌。将乳酸菌用MRS肉汤培养基富集(37℃，24h)，与等体积的甘油混合，封装，置于超低温冰箱内保存备用。乳酸菌按1:1比例保藏在30％的甘油中，-80℃低温冰箱保存。
对多种纯化的单菌株进行筛选，得到轮枝镰孢菌的抑制率高的多株菌株；
对筛选的多株菌株进行16SrDNA鉴定，得到16S rDNA如SEQ ID No:1所示的菌株，即为鼠李糖乳杆菌。
将鼠李糖乳杆菌用MRS肉汤培养基富集(37℃，24h)，与等体积的甘油混合，封装，置于超低温冰箱内保存备用。鼠李糖乳杆菌按1:1比例保藏在30％的甘油中，-80℃低温冰箱保存。
本发明所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)已于2019年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.18210。
<实施例2>
轮枝镰孢菌的抑制试验：
1、原料准备：
制备鼠李糖乳杆菌上清液：
取冻存的鼠李糖乳杆菌株进行活化传代培养。按2％的接种量，将活化后的鼠李糖乳杆菌接种于MRS液体培养基，37℃培养48h，经离心(8000r/min，15min)收集上清液。将上清液用0.22μm无菌滤膜过滤，取滤下液即为鼠李糖乳杆菌上清液。
制备轮枝镰孢菌孢子悬浮液：
按6％的接种量移取轮枝镰孢菌种子液(OD560nm值为3.0)至装有50ml PDB培养基的250ml的三角瓶中，在200r/min、30℃条件下的摇床中培养3d，得到待测轮枝镰孢菌。
吸取培养在PDB培养基中待测轮枝镰孢菌200μl涂布在PDA固体培养基平皿，30℃恒温培养3d左右至长满整个平皿，用含有0.05％(V/V)吐温80的灭菌水冲洗平皿，采用400目无菌纱布过滤除去菌丝，过滤后的孢子悬浮液使用血球计数板调节孢子浓度至106ml-1，得轮枝镰孢菌孢子悬浮液，简称孢子悬浮液。
2、双层平板拮抗法检测鼠李糖乳杆菌对轮枝镰孢菌的拮抗作用：
下层培养基为固体MRS琼脂培养基，鼠李糖乳杆菌上清液在下层培养基划线，37℃中培养48h后，倾注10ml上层PDA培养基，并将106cfu/ml孢子悬浮液于上层培养基涂布。30℃培养48h，观察抑菌情况。
3、琼脂柱法：
取10％鼠李糖乳杆菌上清液加入PDA培养基，以纯PDA培养基为对照。取轮枝镰孢菌，用直径6mm的打孔器截取菌块，再将菌块接到PDA培养基中央，30℃恒温培养箱培养并观察，采用十字交叉法每24h测量菌体的直径，直至对照培养皿中菌丝体完全长满即可，并计算面积，求出抑菌率。试验平行3次。抑菌率计算公式如下：
抑菌率(％)＝(1-样品组菌饼面积/空白组菌饼面积)×100％
4、微量稀释法：
取80μl 106cfu/ml的孢子悬浮液添加到含有100μl PDB培养基和20μl鼠李糖乳杆菌上清液的96孔板中，将孔板放入生化培养箱中30℃恒温培养，以20μl MRS肉汤培养基代替鼠李糖乳杆菌上清液作为对照组。观察每个孔板里孢子的生长情况，并在48h及以后每隔12h测量一次抑菌率，每组平行3次。鼠李糖乳杆菌上清液的抑菌率公式如下：
抑菌率(％)＝(1-ODLAB/ODMRS)×100％
式中：ODLAB表示实验组培养时的OD580nm；ODMRS表示MRS肉汤作为对照培养时的OD580nm。
5、牛津杯法：
在固体PDA培养基中将孢子悬液涂布于培养基上，将牛津杯轻轻放到平板上，静置5min后取200μl鼠李糖乳杆菌上清液注入牛津杯中。30℃培养48h，观察抑菌情况。
<实施例3>
玉米防霉试验：
如表1所示，在100ml锥形瓶中放入10g新鲜玉米粒，分为四组，再分别加入5ml孢子悬浮液+5ml鼠李糖乳杆菌上清液，5ml孢子悬浮液+5ml灭菌水，5ml鼠李糖乳杆菌上清液+5ml灭菌水，10ml灭菌水浸泡玉米粒，30℃24h后倒出水分，之后将玉米放入平皿中，每日分别喷鼠李糖乳杆菌上清液和灭菌水，前两组喷灭菌水，后两组喷鼠李糖乳杆菌上清液。观察霉菌生长情况。
表1
<轮枝镰孢菌的抑制效果>
1、双层平板拮抗法得到的结果：如图1所示，鼠李糖乳杆菌线与霉菌有很大间隔，中间形成的抑菌区域极大。
2、琼脂柱法得到的结果：如图2所示，计算得到其抑菌率为48.89％。
3、微量稀释法得到的结果：第84h时，未有霉菌出现，抑菌率如表2所示。
表2
4、牛津杯法得到的结果：如图3所示，实验发现，抑菌直径为14.19mm。
5、玉米防霉试验结果：如图4～7所示，实验发现，在第3d，第1组孢子悬浮液+灭菌水和第2组灭菌水均出现不同情况的白色菌丝。而喷鼠李糖乳杆菌上清液的第3组和第4组两组至第10d时仍未发现有霉菌长出。说明鼠李糖乳杆菌抑菌效果显著。
<鼠李糖乳杆菌筛选过程及结果>
1、取冻存的132株乳酸菌菌株进行活化传代培养。按2％的接种量，将活化后的乳酸菌接种于MRS液体培养基，37℃培养48h，经离心(8000r/min，15min)收集上清液。将上清液用0.22μm无菌滤膜过滤，得到乳酸菌上清液。
2、按6％的接种量移取轮枝镰孢菌种子液(OD560nm值为3.0)至装有50ml PDB培养基的250ml的三角瓶中，在200r/min、30℃条件下的摇床中培养3d；
吸取培养在PDB培养基中待测轮枝镰孢菌菌株200μl涂布在PDA固体培养基平皿，30℃恒温培养3d左右至长满整个平皿，用含有0.05％(V/V)吐温80的灭菌水冲洗平皿，采用400目无菌纱布过滤除去菌丝，过滤后的孢子悬浮液使用血球计数板调节孢子浓度至106ml-1，得轮枝镰孢菌孢子悬浮液。
3、初选
使用双层平板拮抗法筛选对轮枝镰孢菌具有拮抗作用的乳酸菌。下层培养基为固体MRS琼脂培养基，乳酸菌在下层培养基划线，37℃中培养48h后，倾注10ml上层PDA培养基，并将106cfu/ml菌悬液于上层培养基涂布。30℃培养48h，观察抑菌情况。
结果分析：
将双层平板拮抗法得到的结果通过对抑菌区域大小分为“+++”“++”“+”“-”四个等级。“+++”表示其抑菌能力最为突出，乳酸菌线与霉菌有很大间隔，中间形成的抑菌区域极大。“-”表示此方法显示无明显抑菌性，乳酸菌线与霉菌接壤。如图8所示，分别展示了不同抑菌能力的抑菌效果图。
初筛结果发现，抑菌能力为“+++”的共有17株(13％)，抑菌能力为“++”的共有58株(44％)，抑菌能力为“+”的共有46株(35％)，抑菌能力为“-”的共有11株(8％)。
4、对初筛得到的乳酸菌的16SrDNA基因鉴定
对初筛的乳酸菌进行分析，选取后续实验需要的菌株进行16SrDNA鉴定。具体操作步骤为：
乳酸菌DNA的提取→DNA电泳检测→PCR扩增→PCR产物电泳检测→测序。将初筛出的乳酸菌发酵液2ml离心，弃去上清液，采用细菌基因组DNA提取试剂盒依照说明书步骤进行DNA提取。利用正向引物为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、反向引物1492R(5’-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3’)扩增乳酸菌的16S rDNA序列。
PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR是否成功，将成功PCR的产物委托华大基因公司进行测序。通过核酸BLAST技术，将测序结果与NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)里的Genbank数据库比对，对待测菌株的菌属类别及同源性进行分析。
鉴定分析结果如表3所示：
表3
通过分析发现抑菌效果优异的菌株中主要以鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌为主。而抑菌能力为“-”的菌株则种属各异，但未发现植物乳杆菌。
5、抗轮枝镰孢菌的乳酸菌复筛实验
通过对鼠李糖乳杆菌菌株2，30，53，61，89，91，92，100，103号菌株进行复筛，选取最终目标菌株。
为了更加全面精确的分析出初筛出的乳酸菌菌株的抑菌能力，分别采用琼脂柱法和微量稀释法对抑菌活性进行检测。
复筛方法1：琼脂柱法取10％上清发酵液加入PDA培养基，以纯PDA培养基为对照。取供试菌株，用直径6mm的打孔器截取菌块，再将菌块接到PDA培养基中央，30℃恒温培养箱培养并观察，采用十字交叉法每24h测量菌体的直径，直至对照培养皿中菌丝体完全长满即可，并计算面积，求出抑菌率。试验平行3次。抑菌率计算公式如下：
抑菌率(％)＝(1-样品组菌饼面积/空白组菌饼面积)×100％
复筛方法2：微量稀释法
取80μl106cfu/ml的孢子悬浮液添加到含有100μl PDB培养基和20μl不同乳酸菌的上清液中的96孔板，将孔板放入生化培养箱中30℃恒温培养，以20μl MRS肉汤培养基代替乳酸菌的上清液作为对照组。观察每个孔板里孢子的生长情况，并在48h及以后每隔12h测量一次抑菌率，每组平行3次。乳酸菌上清液的抑菌率公式如下：
抑菌率(％)＝(1-ODLAB/ODMRS)×100％
式中：ODLAB表示实验组培养时的OD580nm；ODMRS表示MRS肉汤作为对照培养时的OD580nm。
结合两种抑菌方法，分析各乳酸菌的抑菌能力，选取最佳菌株及其对比菌株进行后续实验。
结果分析：如图9所示的柱形图，分析61，91，103号抑菌率较高，分别为51.95％，48.89％，52.28％。89号菌株抑菌率最低，无明显抑菌性，抑菌率为6.94％。
6、微量稀释法测定其抑菌率
通过微量稀释法加入不同上清液后观察微孔内的孢子生长情况，在24h是对照组已经浑浊，89号观察到有霉菌零星长出，48h时，2，53，61，89号均有霉菌长出，其中89号的霉菌数量最多，但因其附着于底且并未铺满，所以并没有直观反映在吸光度上。在72h时89号菌霉菌已铺满底部，孔内较为浑浊。84h时，仅有2，91，100号菌株未有霉菌出现，其他孔内均有霉菌出现，部分孔内白色菌丝长于液体表面。将所有数据进行汇总，如表4所示。
表4
通过表4可看出在48h时，抑菌率均在78％～84％之间，在72h时89号抑菌率降为65.80％，96h时仅有2，91，100号菌株抑菌率仍在80％以上。故此方法2，91，100号展现出了更加良好的抑菌性。
根据两种方法复筛，综合观察分析，91号菌株为抑菌效果最为显著。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农产品加工研究所
<120> 鼠李糖乳杆菌及其应用
<130> CN19B11668A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1373
<212> DNA
<213> 乳酸菌
<400> 1
tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcgtgctg atccgcgatt 60
actagcgatt ccgacttcgt gtaggcgagt tgcagcctac agtccgaact gagaatggct 120
ttaagagatt agcttgacct cgcggtctcg caactcgttg taccatccat tgtagcacgt 180
gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt 240
gtcaccggca gtcttactag agtgcccaac taaatgctgg caactagtca taagggttgc 300
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ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 480
cccgtcaatt cctttgagtt tcaaccttgc ggtcgtactc cccaggcgga atgcttaatg 540
cgttagctgc ggcactgaag ggcggaaacc ctccaacacc tagcattcat cgtttacggc 600
atggactacc agggtatcta atcctgttcg ctacccatgc tttcgagcct cagcgtcagt 660
tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg catttcaccg 720
ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc cgatgcactt 780
cctcggttaa gccgagggct ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc tcgctttacg 840
cccaataaat ccggataacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 900
agccgtggct ttctggttgg ataccgtcac gccgacaaca gttactctgc cgaccattct 960
tctccaacaa cagagtttta cgacccgaaa gccttcttca ctcacgcggc gttgctccat 1020
cagacttgcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt 1080
gtctcagtcc caatgtggcc gatcaacctc tcagttcggc tacgtatcat tgccttggtg 1140
agccgttacc tcaccaacta gctaatacgc cgcgggtcca tccaaaagcg atagcttacg 1200
ccatctttca gccaagaacc atgcggttct tggatttatg cggtattagc atctgtttcc 1260
aaatgttatc ccccacttaa gggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt ccgccactcg 1320
ttcaaaatta aatcaagatg caagcacctt tcaataatca gaactcgttc gac 1373

Claims (6)

1.鼠李糖乳杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.18210。
2.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌，其特征在于，16S rDNA如SEQ ID No:1所示。
3.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在防治轮枝镰孢菌中的应用。
4.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在农作物防霉中的应用。
5.如权利要求4所述的鼠李糖乳杆菌在玉米防霉中的应用。
6.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备防治轮枝镰孢菌的产品中的应用。
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