CN110157646A

CN110157646A - 一株抑制真菌生长的乳酸菌及其在馒头制作中的应用

Info

Publication number: CN110157646A
Application number: CN201910463030.9A
Authority: CN
Inventors: 王雁萍; 郝湘妹; 王宇航; 刘海东
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2039-05-30
Also published as: CN110157646B

Abstract

本发明公开了一株抑制真菌生长的乳酸菌及其在馒头制作中的应用。本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493的分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，该菌株已于2019年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17179。本发明从1255株植物来源的乳酸菌中筛选到1株抑制真菌性能较强的乳酸菌，并将之在馒头制作过程中添加发面，能够有效抑制成品馒头在存放过程中的真菌污染，有效延长了馒头的保质期，达到了有机防腐的目的。

Description

一株抑制真菌生长的乳酸菌及其在馒头制作中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株抑制真菌生长的乳酸菌及其在馒头制作中的应用。

背景技术

真菌容易在温暖潮湿的环境中生长繁殖。生活中很多食物会由于发霉而不能食用，从而造成大量浪费。化学防腐剂能够延长食品保质期，但对健康不利，应用健康绿色环保的生物防腐方法，延长食品保质期是明智之举。

在近几年的研究中，研究学者筛选出来的具有抑制真菌性能的乳酸菌主要有乳明串珠菌、乳酸链球菌、植物乳杆菌以及罗伊氏菌等，通过进行各种实验，对抑菌物质进行了定性及定量研究，主要有乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、苯基乳酸、乙醇、过氧化氢、二乙酰、二氧化碳、乙醛、细菌素及其他未被特征化的化合物。在作为防腐剂添加到食品的过程中，延长保质期是首要任务，但不可避免的，一些乳酸菌的发酵产物对食品的风味会有很大的影响，所以要有选择性的添加。

发明内容

本发明的一个目的是提供植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493。

本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.17179。

本发明的ZZUA493菌株被鉴定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，该菌株已于2019年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

本发明的另一个目的是提供一种抑制真菌剂。

本发明提供的抑制真菌剂的活性成分为上述植物乳杆菌Lactobacillusplantarum ZZUA493或其培养液或其菌悬液或其发酵产物或其发酵上清液。

在本发明的一个具体实施例中，所述ZZUA493发酵液的制备方法如下：将ZZUA493菌株接种于MRS液体培养基中，30℃培养48h，得到OD₆₀₀＝2.6的ZZUA493菌液，将ZZUA493菌液8000r离心5min，收集上清液，即为ZZUA493发酵上清液。

在本发明的另一个具体实施例中，所述ZZUA493菌悬液的制备方法如下：将ZZUA493菌株接种于MRS液体培养基中，30℃培养24h，得到ZZUA493培养液，将ZZUA493培养液8000r离心5min，收集菌体，然后用无菌水清洗菌体，再用无菌水将菌体稀释至菌浓度为(2.3～2.8)×10⁸cfu/mL，即为ZZUA493菌悬液。

本发明又有一个目的是提供上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或上述抑制真菌剂的新用途。

本发明提供了上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或上述抑制真菌剂在抑制真菌生长中的应用。

本发明还提供了上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或上述抑制真菌剂在制备抑制真菌生长的产品中的应用。

本发明还提供了上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或上述抑制真菌剂在作为抑菌剂或防腐剂或有机防腐剂中的应用。

上述应用中，所述真菌具体可为黑曲霉Aspergillus niger和/或黄曲霉Aspergillus flavus和/或米曲霉Aspergillus oryzae和/或长枝木霉TrichodermaIongibranchiatum。

本发明还提供了上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或上述抑制真菌剂在制作馒头中的应用。

本发明还提供了上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或上述抑制真菌剂在制备制作馒头的产品中的应用。

本发明还提供了上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或上述抑制真菌剂在延长馒头保质期中的应用。

本发明还提供了上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或上述抑制真菌剂在制备延长馒头保质期的产品中的应用。

上述应用中，所述馒头可为乳酸菌馒头。

本发明的最后一个目的是提供一种馒头的制作方法。

本发明提供的馒头的制作方法包括如下步骤：

1)将上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493菌悬液、面粉和水混匀，醒发，得到面糊；

2)将所述面糊、面粉、水和干酵母混匀，醒发，得到面团；

3)将所述面团分割成多个面坯，醒发，并将醒发后的面坯蒸熟，得到所述馒头。

上述方法中，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493菌悬液的浓度为(2.3～2.8)×10⁸cfu/mL。

进一步的，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493菌悬液的制备方法具体如下：将上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493接种至MRS液体培养基中，(28-30)℃培养(10-24)h，(7500-8500)r离心(4-8)min，收集菌体，然后用无菌水清洗菌体，再用无菌水将菌体稀释至菌浓度为(2.3～2.8)×10⁸cfu/mL，得到所述菌悬液。

更进一步的，所述培养的条件可为30℃培养24h；所述离心的条件可为8000r离心5min。

上述方法中，所述1)中，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493菌悬液、所述面粉和所述水的配比可为2mL:(90-110)g:(90-110)g；所述醒发的条件可为(28-30)℃醒发(12-15)h。具体地，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493菌悬液、所述面粉和所述水的配比为2mL:100g:100g；所述醒发的条件为30℃醒发14h。

所述2)中，所述面糊、所述面粉、所述水和所述干酵母的质量比可为(90-110)g:(140-160)g:(40-60)g:1g；所述醒发的条件可为(20-25)℃醒发(4-6)h。具体地，所述面糊、所述面粉、所述水和所述干酵母的质量比为100g:150g:50g:1g；所述醒发的条件为室温醒发5h。

所述3)中，每个所述面坯的质量为(45-55)g；所述醒发的条件为(20-25)℃醒发(30-50)min。具体地，每个所述面坯的质量为50g；所述醒发的条件为室温醒发40min。

本发明从1255株植物来源的乳酸菌中筛选到1株抑制真菌性能较强的乳酸菌，并将之在馒头制作过程中添加发面，通过添加合适的乳酸菌来增加馒头的抗菌性，相应的也会提升馒头的保存期，同时也避免了食物的浪费。本发明的乳酸菌解决了馒头在存储期间存在的保质期短、容易发霉变质的问题，能够有效抑制成品馒头在存放过程中的真菌污染，延长馒头保质期，达到了有机防腐的目的，具有良好的应用前景。

保藏说明

菌种名称：植物乳杆菌

拉丁名：Lactobacillus plantarum

菌株编号：ZZUA493

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年01月14日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17179

附图说明

图1为96孔板中乳酸菌抑制真菌效果。

图2为双层平板划线法乳酸菌抑制真菌效果。

图3为不同菌株发酵上清液中有机酸的含量。

图4为在培养皿上ZZUA493菌落的具体观察结果。

图5为ZZUA493菌株革兰氏染色结果(目镜10X，物镜100X)。

图6为系统发育树。

图7为ZZUA493菌株发酵上清液不同处理组的抑菌率。

图8为ZZUA493菌株对不同真菌的抑制作用。A为培养24h的ZZUA493对黑曲霉的抑制作用；B为培养48h的ZZUA493对黑曲霉的抑制作用；C为培养24h的ZZUA493对米曲霉的抑制作用；D为培养48h的ZZUA493对米曲霉的抑制作用；E为培养24h的ZZUA493对长枝木霉的抑制作用；F为培养48h的ZZUA493对长枝木霉的抑制作用；G为培养24h的ZZUA493对黄曲霉的抑制作用；H为培养48h的ZZUA493对黄曲霉的抑制作用。

图9为馒头制作流程。1为制备酸面糊，30℃放置14h；2为100份面糊+150份面粉+50份水+1份干酵母，搅拌均匀；3为室温(20℃-25℃)下醒发5h；4为将面团切割成50g/个面坯，室温(20℃-25℃)下醒发40min；5为1500W，40min蒸熟。

图10为不同处理方法制作的馒头受真菌污染情况。A为将各组处理馒头放置于干净的袋子中6天后的观察结果；B为将各处理组馒头做切片处理后放置于灭菌的培养皿中6天后的观察结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的面粉是香满园的产品，货号为GB/T 1355；下述实施例中的干酵母是安琪酵母股份有限公司的产品，货号为GB/T20886，均购自河南省郑州市大学路北路永辉超市。

下述实施例中的MRS液体培养基的配方如下：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、吐温80 1g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1L；pH6.2。

下述实施例中的MRS固体培养基的配方如下：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、吐温80 1g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂粉15g、蒸馏水1L；pH6.2。

下述实施例中的黑曲霉Aspergillus niger是从苜蓿样品中分离得到的。具体分离方法如下：取苜蓿样品10g分别加入到90mL无菌水摇匀，10倍梯度稀释，然后分别取10^-1、10^-3、10^-5倍样品稀释液各20uL涂布在PDA固体培养基(真菌培养基)上，放于37℃恒温培养箱培养3天，挑取生长出来的真菌单菌落划线到PDA固体培养基，再次扩大培养，备用。

实施例1、ZZUA493菌株的获得和保藏

一、ZZUA493菌株的分离

1、菌株来源

1255株乳酸菌(苜蓿附生乳酸菌)：将中部地区的115个苜蓿样品用剪刀切碎成2～3cm左右，各样品均取10g分别加入到90mL无菌水摇匀，10倍梯度稀释，然后分别取10^-1、10^-3、10^-5倍样品稀释液各20uL涂布在MRS固体培养基上，放于厌氧培养箱培养48h，依其菌落的大小、形态和颜色，挑取MRS上生长的单菌落，进行过氧化氢排除和革兰氏染色实验。将过氧化氢酶阴性及革兰氏阳性的1255菌株暂定为乳酸菌。再通过下述生理生化实验挑取鉴定为乳酸菌的菌株进行抑菌实验。

2、初筛

采用96孔板法对步骤1获得的1255株乳酸菌进行初筛。具体步骤如下：将乳酸菌分别从平板上挑至MRS液体培养基中，30℃培养24h，8000r离心5min，取上清190uL加入96孔板中，再加入浓度为1.28×10⁷cfu/mL的黑曲霉孢子悬浮液10uL，放置37℃恒温培养箱，24h后筛选具有抑制真菌效果的菌株。

结果如图1所示(透明孔为抑菌效果好的乳酸菌菌株)。结果表明：从1255株乳酸菌中筛选出3株乳酸菌，分别将其命名为ZZUA493、ZZUA570和ZZUA606。

3、复筛

采用双层平板划线法对步骤2获得的3株乳酸菌进行复筛。具体步骤如下：下层倾倒MRS固体培养基，将乳酸菌菌株划线至平板上，每个平板划两条2.5cm左右的线作为两个重复组，放置于厌氧箱分别培养24h和48h，上层平板倾倒含有黑曲霉菌孢子的真菌培养基(将浓度为4×10⁵cfu/mL的黑曲霉孢子悬浮液以3％的接种量接入MRS液体培养基)放置30℃恒温培养箱，24h后观察结果。

结果如图2所示。结果表明：从图中可以很明显的看出菌株ZZUA493抑菌效果比较好。

4、乳酸、乙酸、苯乳酸含量的检测

采用HPLC方法测定步骤2获得的3株乳酸菌发酵48h的发酵上清液中乳酸(LA)、乙酸(AA)、苯乳酸(PLA)的含量。具体步骤如下：将三株菌分别接入MRS液体培养基中培养48h，8000r离心5min，取上清经滤膜过滤后放入高效液相色谱进行乳酸(LA)、乙酸(AA)、苯乳酸(PLA)含量检测。

结果如图3和表1所示。结果表明：菌株ZZUA493与ZZUA570对比：LA与AA含量无显著差异，但PLA含量ZZUA493＞ZZUA570；菌株ZZUA493与ZZUA606对比：AA含量无显著差异，但PLA和LA含量ZZUA493＞ZZUA606。

表1、不同菌株发酵上清液中有机酸的含量

	LA(mg/mL)	AA(mg/mL)	PLA(mg/mL)
				ZZUA 493	28.47	15.47	75.68
ZZUA 570	25.35	16.82	8.67
				ZZUA 606	15.32	16.64	25.27

二、ZZUA493菌株的鉴定

1、形态鉴定

观察培养皿上ZZUA493菌落的形状、颜色、大小等(图4)，细胞的形态(球菌、杆菌等)用革兰氏染色后，在显微镜下1000倍油镜观察(图5)。

2、生理生化鉴定

过氧化氢酶试验：ZZUA493菌株经纯化后，培养24h，挑取少量单菌落，涂布于滴加了浓度为3％的过氧化氢溶液的平板上，观察是否有气泡产生。有气泡产生则为阳性反应，对应菌株不是乳酸菌菌株；无气泡产生则为阴性反应，对应菌株可能是乳酸菌菌株。结果表明：ZZUA493菌株在该实验中并无气泡产生。

葡萄糖产酸产气试验：将ZZUA493菌株接种于含有4mL MRS液体培养基的杜氏小管中，30℃下培养48h，观察管内有无气泡产生。若有气泡产生，则为阳性反应，对应发酵类型为异性发酵，若无气泡产生，则为阴性反应，对应发酵类型为同型发酵。结果表明：ZZUA493菌株在该实验中并无气泡产生。

耐盐试验：将ZZUA493菌株接种到NaCl质量分数分别为3％和6.5％的MRS液体培养基中，30℃下培养48h，肉眼观测菌株的生长情况。结果表明：ZZUA493菌株在两种状态下长势良好。

耐酸碱试验：将ZZUA493菌株接种到pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的MRS液体培养基中，30℃下放置7d，肉眼观测菌株的生长情况。结果表明：ZZUA493在3.0-10.0的pH环境中生长状态良好。

耐高温试验：将ZZUA493菌株接种到MRS液体培养基中，分别在4℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃条件下放置7d，肉眼观测菌株的生长情况。结果表明：ZZUA493菌株在4℃及50℃条件下涨势微弱，其他温度条件下生长状态良好。

具体结果如表2和表3所示。

表2、生理生化实验结果

表3、生理生化实验结果

3、分子鉴定

提取ZZUA493菌株的基因组DNA，采用27F/1492R通用引物(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行测序。

测序结果表明：ZZUA493菌株16S rDNA基因序列如序列表中序列1所示。基于16SrDNA基因序列使用软件MEGA构建的系统发育树如图6所示。

三、ZZUA493菌株的保藏

经过上述鉴定结果表明：本发明的ZZUA493菌株为植物乳杆菌，其分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，该菌株已于2019年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.17179。

实施例2、ZZUA493菌株在抑制真菌中的应用

1、ZZUA493发酵上清液的制备

将实施例1获得的ZZUA493菌株接种于MRS液体培养基中，30℃培养48h，得到OD₆₀₀＝2.6的ZZUA493菌液，将ZZUA493菌液8000r离心5min，收集上清液，即为ZZUA493发酵上清液。

2、ZZUA493发酵上清液的处理

对ZZUA493发酵上清液进行不同处理，根据处理方法的不同分为如下各个实验组：

CFS+Protease：

胰蛋白酶：取ZZUA493发酵上清液，用1mol/L NaOH调pH至7.8-8.5，然后向ZZUA493发酵上清液中加入胰蛋白酶，使其终浓度为2mg/mL，并放置于37℃水浴锅反应2h，80℃失活5min，最后将pH调至初始pH值3.859。

胃蛋白酶：取ZZUA493发酵上清液，用1mol/L HCl调pH至1.5-2，然后向ZZUA493发酵上清液中加入胃蛋白酶，使其终浓度为2mg/mL，并放置于37℃水浴锅反应2h，80℃失活5min，最后将pH调至初始pH值3.859。

蛋白酶K：取ZZUA493发酵上清液，用1mol/L NaOH调pH至7.8-8.2，然后向ZZUA493发酵上清液中加入蛋白酶K，使其终浓度为2mg/mL，并放置于37℃水浴锅反应2h，80℃失活5min，最后将pH调至初始pH值3.859。

CFS+Catalase：

过氧化氢酶：取ZZUA493发酵上清液，用1mol/L NaOH调pH至7.0-7.2，然后向ZZUA493发酵上清液中加入过氧化氢酶，使其终浓度为2mg/mL，并放置于37℃水浴锅反应2h，80℃失活5min，最后将pH调至初始pH值3.859。

CFS+pH4.0：取ZZUA493发酵上清液，用1mol/L NaOH调pH至4.0。

CFS+pH5.0：取ZZUA493发酵上清液，用1mol/L NaOH调pH至5.0。

CFS+pH6.5：取ZZUA493发酵上清液，用1mol/L NaOH调pH至6.5。

CFS+pH7.0：取ZZUA493发酵上清液，用1mol/L NaOH调pH至7.0。

CFS+Heat：

60℃：取ZZUA493发酵上清液放置60℃水浴锅中作用2h。

80℃：取ZZUA493发酵上清液放置80℃水浴锅中作用2h。

100℃：取ZZUA493发酵上清液放置100℃水浴锅中作用2h。

CFS：不做任何处理的ZZUA493发酵上清液。

3、抑菌实验

取190uL步骤2中各个实验组及对照组获得的ZZUA493处理液，加入10uL浓度为1.28×10⁷cfu/mL的黑曲霉孢子悬浮液，放置30℃恒温箱24h，酶标仪检测吸光度，并按照如下公式计算抑菌率：抑菌率(％)＝100-(OD_LAB×100/OD_control)。其中，OD_LAB表示48h之后霉菌孢子在乳酸菌无细胞上清液(ZZUA493发酵上清液)中的OD₆₀₀值，OD_control表示48h之后霉菌孢子在MRS液体培养基中的OD₆₀₀值。整个实验一式三份进行。

结果如图7所示。从图中可以看出，本发明的ZZUA493菌株发酵上清液具有抑制真菌生长的功能。其中不同蛋白酶和过氧化氢酶处理过的实验组的抑菌率没有变化，不同温度处理过的实验组的抑菌率也没有变化。通过调节pH发现：pH值越接近中性，抑菌率越小，故此推测菌株ZZUA493发酵产物中主要是有机酸在起作用。

按照上述双层平板划线方法，将黑曲霉Aspergillus niger替换为黄曲霉Aspergillus flavus(从桔子样品中分离得到)、米曲霉Aspergillus oryzae(从馒头样品中分离得到)以及长枝木霉Trichoderma Iongibranchiatum(从馒头样品中分离得到)，检测ZZUA493菌株对其他真菌的抑菌作用。结果表明：本发明的ZZUA493菌株对黄曲霉、米曲霉以及长枝木霉也均有不同强度的抑菌作用(图8)。

实施例3、ZZUA493菌株在制备乳酸菌馒头中的应用

乳酸菌馒头的制作流程如图9所示。具体步骤如下：

一、菌悬液和酸面糊制备

1、菌悬液的制备

将ZZUA493菌株接种于MRS液体培养基中，30℃培养24h，8000r离心5min，收集菌体，用无菌水清洗菌体3～4次，并用无菌水稀释至OD₆₀₀＝0.5～0.6，得到菌悬液。菌悬液浓度为(2.3～2.8)×10⁸cfu/mL。

2、酸面糊的制备

实验组：2份(mL)菌悬液+100份(g)水+100份(g)面粉；

CK1组：2份(mL)无菌水+100份(g)水+100份(g)面粉；

将实验组和CK1组中的各组分混匀，30℃醒发14h，分别得到实验组面糊和CK1组面糊。

3、pH测定

取0.5g实验组和CK1组面糊放置于2mL蒸馏水里面震荡，测量pH。

结果表明：实验组面糊的pH＝3.9～4.1，CK1组面糊的pH＝6.2。

二、一次醒发

1、CK2组面糊的制备

CK2组：2份无菌水(mL)+100份(g)水+100份(g)面粉，混匀至面糊状。

2、一次醒发

实验组：100份(g)实验组面糊+150份(g)面粉+50份(g)水+1份(g)干酵母；

CK1组：100份(g)CK1组面糊+150份(g)面粉+50份(g)水+1份(g)干酵母；

CK2组：100份(g)CK2组面糊+150份(g)面粉+50份(g)水+1份(g)干酵母；

将实验组、CK1组和CK2组中的各组分搅拌均匀，室温下一次醒发5h，分别得到实验组面团、CK1组面团和CK2组面团。

3、pH测定

取0.5g实验组面团、CK1组面团、CK2组面团放置于2mL蒸馏水里面震荡，测量pH。

结果表明：实验组面团在一次醒发前的pH＝5.2，CK1组面团在一次醒发前的pH＝6.6，CK2组面团在一次醒发前的pH＝6.7。实验组面团在一次醒发后的pH＝4.6，CK1组面团在一次醒发后的pH＝6.0，CK2组面团在一次醒发后的pH＝6.5。

三、二次醒发

将上述步骤二获得的各组面团再加入5-8g面粉，分割成多个面坯(50g/个面坯)，室温下二次醒发40min。

四、蒸馒头

将步骤三获得的各组面坯用电磁炉在爱仕达不锈钢两层复底蒸锅QVL1526中蒸40min，电磁炉设置的参数为1500W。

五、不同处理组馒头气味

馒头蒸熟后，检测各组馒头气味。结果表明：实验组馒头气味为酸香味，CK1组馒头气味为恶臭味，CK2组气味为馒头香味。CK1与CK2相比，CK1面糊经过37℃发酵14h之后变质，馒头蒸熟后存在难闻气味，与实验组差之甚远。

六、不同处理组馒头保质期

将实验组和两个对照组CK1组、CK2组的馒头分别放入干净的袋子中。室温下(23℃左右)封口放置6天。每组设置三个平行，记录时间。每天拍照片，观察实验组与对照组制作的馒头受真菌污染情况。

将实验组和两个对照组CK1组、CK2组的馒头做切片处理，分别放入灭过菌的干燥的平皿中。室温下封口放置6天。每组设置三个平行，记录时间。每天拍照片，观察实验组与对照组制作的馒头受真菌污染情况。

观察结果如图10所示。图10A为将各组处理馒头放置于干净的袋子中的观察结果；图10B为将各处理组馒头做切片处理后放置于灭过菌的干燥的平皿中的观察结果。

从图中可以看出：加入乳酸菌的实验组与对照组CK1、CK2相比，在同等时间内受污染程度更小，从而实现延长保质期、便于储存的目的。

序列表

<110>郑州大学

<120>一株抑制真菌生长的乳酸菌及其在馒头制作中的应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1463

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

cattgcgggt gctataatgc aagtcgaacg aactctggta ttgattggtg cttgcatcat 60

gatttacatt tgagtgagtg gcgaactggt gagtaacacg tgggaaacct gcccagaagc 120

gggggataac acctggaaac agatgctaat accgcataac aacttggacc gcatggtccg 180

agcttgaaag atggcttcgg ctatcacttt tggatggtcc cgcggcgtat tagctagatg 240

gtggggtaac ggctcaccat ggcaatgata cgtagccgac ctgagagggt aatcggccac 300

attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa 360

tggacgaaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga agggtttcgg ctcgtaaaac 420

tctgttgtta aagaagaaca tatctgagag taactgttca ggtattgacg gtatttaacc 480

agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt 540

ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagcctt 600

cggctcaacc gaagaagtgc atcggaaact gggaaacttg agtgcagaag aggacagtgg 660

aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg 720

ctgtctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagtatgg gtagcaaaca ggattagata 780

ccctggtagt ccataccgta aacgatgaat gctaagtgtt ggagggtttc cgcccttcag 840

tgctgcagct aacgcattaa gcattccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctgaaactca 900

aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagctacgcg 960

aagaacctta ccaggtcttg acatactatg caaatctaag agattagacg ttcccttcgg 1020

ggacatggat acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080

gtcccgcaac gagcgcaacc cttattatca gttgccagca ttaagttggg cactctggtg 1140

agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat 1200

gacctgggct acacacgtgc tacaatggat ggtacaacga gttgcgaact cgcgagagta 1260

agctaatctc ttaaagccat tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag 1320

tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380

cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gtcggtgggg taacctttta 1440

ggaaccagcc gcctaaggtg aca 1463

Claims

1.植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.17179。

2.一种抑制真菌剂，其活性成分为权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillusplantarum ZZUA493或其培养液或其菌悬液或其发酵产物或其发酵上清液。

3.权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或权利要求2所述的抑制真菌剂在抑制真菌生长中的应用；

或，权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或权利要求2所述的抑制真菌剂在制备抑制真菌生长的产品中的应用。

4.权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或权利要求2所述的抑制真菌剂在作为抑菌剂或防腐剂或有机防腐剂中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述真菌为黑曲霉Aspergillus niger和/或黄曲霉Aspergillus flavus和/或米曲霉Aspergillus oryzae和/或长枝木霉TrichodermaIongibranchiatum。

6.权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或权利要求2所述的抑制真菌剂在制作馒头中的应用；

或，权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或权利要求2所述的抑制真菌剂在制备制作馒头的产品中的应用。

7.权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或权利要求2所述的抑制真菌剂在延长馒头保质期中的应用；

或，权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493或权利要求2所述的抑制真菌剂在制备延长馒头保质期的产品中的应用。

8.一种馒头的制作方法，包括如下步骤：

1)将权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493菌悬液、面粉和水混匀，醒发，得到面糊；

2)将所述面糊、面粉、水和干酵母混匀，醒发，得到面团；

3)将所述面团中加入面粉，分割成多个面坯，醒发，并将醒发后的面坯蒸熟，得到所述馒头。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493菌悬液的浓度为(2.3～2.8)×10⁸cfu/mL。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：

所述1)中，所述权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZUA493菌悬液、所述面粉和所述水的配比为2mL:(90-110)g:(90-110)g；所述醒发的条件为(28-30)℃醒发(12-15)h；

所述2)中，所述面糊、所述面粉、所述水和所述干酵母的质量比为(90-110)g:(140-160)g:(40-60)g：1g；所述醒发的条件为(20-25)℃醒发(4-6)h；

所述3)中，每个所述面坯的质量为(45-55)g；所述醒发的条件为(20-25)℃醒发(30-40)min。