CN104320980B - 含有乳酸片球菌j9的保健食品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过共培养乳酸片球菌(Pediococcus？acidilactici)微生物制备的食品组合物以及制备该食品组合物的方法。根据本发明制备的食品组合物含有细菌素，从而提高了食品的稳定性和寿命。更具体地，本发明涉及通过所述方法生产的大酱或者清麴酱，以及生产所述大酱或者清麴酱的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有乳酸片球菌J9(PediococcusacidilacticiJ9)的保健食品。
背景技术
乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)产生细菌素(美国专利No.5260212和No.5175252)，而细菌素被认为是一种相当广泛使用的抗菌剂。含有细菌素的酸奶登记在美国专利No.5445835中。然而，乳酸片球菌与芽孢杆菌(Bacillus)不容易共培养。
由乳酸菌产生的乳酸被认为能增加肠内酸性(pH)以加强小肠的蠕动，从而促进消化和吸收，并且能控制大肠的蠕动，从而防止便秘和腹泻。
通过给牛奶接种乳酸菌，随后发酵并固化来生产酸奶和饮料，作为市售的发酵乳。
用于生产酸奶的乳酸菌的例子包括保加利亚乳酸菌(Lacticacidbacteriabulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)等。通过分别在低温下培养这些乳酸菌并适当地混合其中的两种或三种来赋予发酵乳产品独特的风味。这些发酵乳产品不能经受高温和低pH的环境，因此，这些发酵乳产品不能到达人类的肠道中。
市售的谷物发酵的含酶产品通过利用被称为“米曲霉”(A.oryzae)的单菌种在30℃到35℃发酵获得。
韩国建国大学利用从美国阿肯色大学获得的乳酸片球菌进行了研究和实验，结果发现由乳酸片球菌产生的细菌素(一种天然抗生素物质)破坏了引起食物中毒的李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的细胞壁，并在6小时之后细菌的数量减少了1.0×105倍。
然而，还没开发出利用谷物的含有乳酸片球菌产生的细菌素的保健食品。
本发明的发明人发现当共培养乳酸片球菌和芽孢杆菌时，容易对pH进行控制，从而进一步促进食品发酵，并且发明人基于此发现完成了本发明。通常，共培养乳酸片球菌和芽孢杆菌是困难的。然而，基于本发明人新分离出的乳酸片球菌能够很好的与芽孢杆菌共培养这一发现，完成了本发明。
发明内容
技术问题
因此，考虑到以上问题完成了本发明，并且本发明的一个目标是提供一种通过共培养乳酸片球菌和芽孢杆菌制备的食物组合物。
本发明的另一个目标是提供一种制备保健食品的方法，包括共培养乳酸片球菌和芽孢杆菌。
技术方案
依照本发明的一方面，可以通过提供一种保健食品来实现以上目标和其他目标。所述保健食品通过以下方法来制备，所述方法包括：准备至少一种A类谷物和至少一种B类谷物，所述A类谷物选自于由糙米和大豆组成的组中，所述B类谷物选自于由黑米、大麦，和高粱组成的组中；通过将所述A类谷物和所述B类谷物的混合物浸入水中来将其浸泡；利用蒸汽来蒸煮通过浸泡得到的浸泡后的谷物；冷却蒸煮后的谷物；将预先培养的乳酸片球菌J9和芽孢杆菌属菌株添加到上述冷却后的谷物中；将所得到的谷物加到固体存储容器中，并在40℃至45℃的温度和50﹪至70﹪的湿度下固体培养微生物20至48小时；在40℃至45℃的温度和20﹪至40﹪的湿度下进一步固体培养上述固体培养的产物30至60小时；并且干燥所得到的固体培养的产物，然后研磨。
为了鉴定源自于韩国传统的豆瓣酱(清麴酱)的显示了优越的耐热性的乳酸菌，通过分子生物学方法对根据本发明的乳酸片球菌J9的16srRNA碱基序列进行了分析。利用NCBI的BLAST程序对筛选的菌株的碱基序列的同源性进行了比较。结果，乳酸片球菌的同源性被鉴定为99﹪，而这种菌株被称为“乳酸片球菌J9”(PediococcusacidilacticiJ9)。根据本发明的乳酸片球菌具有针对tae的抗菌活性，其中tae是菌血症和中耳炎的病原体，并且是社区获得性肺炎最主要的病原体。因此，根据本发明的乳酸片球菌J9存放于韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM-11320P。
芽孢杆菌属(bacillus)细菌可以是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)。将芽胞杆菌属细菌的pH保持在适合培养乳酸片球菌J9的水平，以便提高发酵效率。对于食品并没有限制，食品可以是大酱或者清麴酱。
培养周期、培养温度和培养湿度的上限考虑到培养微生物所需要的成本和时间来确定，其下限以满足获得培养周期、培养程度、和培养效率的充分条件来确定。
使用糙米和大豆作为主要原料的原因是利用乳酸片球菌J9(KCCM11320P)和枯草芽孢杆菌之间的pH控制能力。乳酸菌的增殖导致葡萄糖形成有机酸乳酸，从而降低pH浓度并导致酸化。然而，枯草芽孢杆菌在发酵期间增加pH值以将pH值保持在6.0的中性水平上，从而有利于乳酸菌。
当将谷物接种了乳酸菌、乳酸片球菌J9，并高温发酵时，完全不能观察到引发食物中毒的李斯特菌。发酵之后，乳酸菌在谷物中增殖并且细菌细胞的数量达到1.2×109CFU/g。乳酸菌的有益作用是抑制人体肠道中的有害细菌的增长，加强肠道蠕动，从而促进排便。
依照本发明的另一方面，提供一种制备保健食品的方法。该方法包括：准备至少一种A类谷物和至少一种B类谷物，所述A类谷物选自于由糙米和大豆组成的组中，所述B类谷物选自于由黑米、大麦，和高粱组成的组中；通过将所述A类谷物和所述B类谷物的混合物浸入水中来将其浸泡；利用蒸汽来蒸煮通过浸泡获得的浸泡后的谷物；冷却蒸煮后的谷物；将预先培养的乳酸片球菌J9和芽孢杆菌属菌株添加到上述冷却后谷物中；将所得到的谷物加到固体存储容器中，并在40℃至45℃的温度和50﹪至70﹪的湿度下固体培养微生物20至48小时；在40℃至45℃的温度和20﹪至40﹪的湿度下进一步固体培养上述固体培养的产物30至60小时；并且干燥所得到的固体培养的产物，然后研磨。
芽孢杆菌属细菌可以是枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌。将芽胞杆菌属细菌的pH保持在适合培养乳酸片球菌J9的水平，以便提高发酵效率。对于食品并没有限制，食品可以是大酱或者清麴酱。
依照本发明的另一方面，提供了乳酸片球菌J9(KCCM11320P)，其能与芽孢杆菌很好地共培养。从随后将描述的实例2中可以看出，乳酸片球菌J9是能与芽孢杆菌很好地共培养，并具有优越的pH值稳定性和耐强酸性的菌株(参照以下实例3)。
有益效果
根据本发明的食品组合物含有乳酸片球菌，并抑制由于感染微生物而对谷物发酵产品的损害，从而提高产品的稳定性和寿命。
依照根据本发明的制备食品组合物的方法，由于通过芽孢杆菌控制pH，从而高效地培养乳酸片球菌J9，并提高细菌素的产量，从而增加了所制备的食品组合物的稳定性和寿命。
从以上可以看出，由于发酵期间乳酸片球菌J9在高温下增殖，含有乳酸片球菌J9的食品组合物能防止被其他微生物污染，并且由于在发酵期间，表面干燥改善了进入到谷物中的微生物的糖酵解。另外，由于乳酸片球菌J9和芽孢杆菌属微生物之间相互的pH缓冲行为，这些微生物被高效地增殖。含有乳酸片球菌J9的食品组合物具有与益生菌相同的作用，例如，促进肠道蠕动的作用(其是乳酸菌固有的作用)，抑制有害细菌并提高免疫力的作用。另外，根据在学术界中与乳酸片球菌菌种相关的最新研究，在微生物发酵中产生的作为天然抗生素的细菌素和乳酸据称表现出对引起消化性溃疡，比如胃溃疡或者十二指肠溃疡的幽门螺旋菌(H.pylori)的抗菌活性以及对引起食物中毒的细菌的抑制活性。根据本发明的乳酸片球菌表现出对作为引起肺炎的细菌——肺炎链球菌(S.pneumoniae)的抑制活性。因此，含有乳酸片球菌J9的食品组合物有望提高国民健康。
[最佳实施例]
以下，将参照实例更详细地描述本发明。本发明保护的范围由权利要求书限定，并不限于这些实例。本发明可以由与本发明主题相关领域的技术人员以不同的实施例实现，并且本发明的这些不同的实施例同样落入由本发明的权利要求书限定的权利范围内。
(实例1)利用乳酸片球菌J9(KCCM11320P)菌株制备食品
通过接种乳酸片球菌J9(KCCM11320P)菌株来制备谷物发酵的含酶产品的方法如下：用作主要材料的谷物是60﹪的糙米和大豆，为了改善口味，添加了黑稻、大麦和高粱，使得谷物的总重量为200kg。将谷物浸泡在水中12小时。洗涤后，将谷物放在蒸煮机中在蒸汽下蒸煮大约40分钟。将蒸煮过的谷物冷却。以相对于谷物总重量的0.1﹪的量在瓶中培养乳酸片球菌J9、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。将各微生物的数量调整为1.0×109CFU/g。将微生物培养液与2L蒸馏水混合，并且用此混合物给蒸煮后的谷物接种。将接种过的谷物堆放在塑料盒中，然后，在温度为42℃，湿度为60﹪的环境下在发酵设备中固体培养24小时。然后，将接种过的作物在内部温度为42℃，湿度为40﹪以下的环境下进行表面干燥48小时，以将微生物渗入到谷物中，从而促进糖酵解。表面干燥后，将接种过的谷物在干燥器中强力干燥以停止发酵。在研磨机中将干燥后的谷物均匀地研磨至50目。
(实例2)测量增殖的乳酸片球菌J9和芽孢杆菌属微生物的数量
将每1mg的样本中加入9ml的无菌生理盐水并以10-7的比例稀释，利用用于测量的溴甲酚紫平板计数琼脂培养70小时后，通过数黄色的菌落数目来测量乳酸片球菌J9的数量。按照以上同样的方式将芽孢杆菌属微生物培养在营养肉汤琼脂培养基中，数白色的菌落进行计数。细菌的数目如以下表1所示。
表1
| 乳酸片球菌J9 | 芽孢杆菌属 | |
| CFU/g | 1.2×109 | 1.3×109 |
从以上的表1中可以看出，每1g的样品中的微生物能很好地增殖到约109个。另外，在微生物增殖期间，众所周知形成了作为次级代谢产物的天然抗生素(细菌素、Pediosin)以及酶。
(实例3)乳酸片球菌的抗菌活性的测试
培养乳酸片球菌，然后利用快速启动牛血清蛋白(BSA)标准试剂盒(美国伯乐公司)来测量细菌的浓度。结果细菌的浓度是0.465毫克/毫升。以15000转/分的转速转5分钟以浓缩培养液，并收集上层清液。然后，用0.2微米的过滤器(美国Milipore公司)过滤剩余物以移除细菌，从而制备乳酸片球菌的提取物。
利用标准的平板比较法，在温度为37℃的CO2恒温培养器中培养以下表2中所示的六种标准菌株24小时。
表2
将每个标准的菌株的单个菌落形成单元接种在血琼脂平板上，并且以5μl、10μl、20μl和100μl接种乳酸片球菌提取物。将菌株放在清洁台上在空气中干燥约10分钟，并将其在温度为37℃的CO2恒温培养器中培养24小时。然后，通过测量斑点的大小来测量抑制区域的直径，结果如表3所示。
表3
| 名称 | ATCC号 | 结果 | |
| 1 | 绿脓杆菌 | 27853 | 无影响 |
| 2 | 金黄色葡萄球菌 | 29213 | 无影响 |
| 3 | 肺炎链球菌 | 49619 | 有影响 |
从以上的表3中可以看出，乳酸片球菌提取物抑制ATCC号为49619的肺炎链球菌的生长。不同的提取物浓度的抑制直径并不都是以5μl计算，并且10μl、20μl和100μl的不同提取物浓度的抑制直径(mm)分别为3mm、6mm和13mm。在接种乳酸片球菌提取物和没有培养细菌的区域没有观察到肺炎链球菌特有的α溶血性，这意味着抑制了肺炎链球菌细菌的生长。
(实例4)乳酸片球菌J9的pH稳定性的测试
首先，将含0.5﹪乳酸杆菌MRS培养基(DifcoLaboratories公司)用200毫升的蒸馏水稀释并进行灭菌，然后，用HCl溶液将稀释液的pH值调整到3.0。
用生理盐水将乳酸片球菌J9稀释成密度为3.0×108CFU/g的稀释液并提前保存30分钟。用乳酸片球菌J9的溶液以10％的比例给pH值为3.0的水溶液接种，在37℃培养一个或两个小时后，测量乳酸菌的数量。将每1mg的样本中加入9ml的无菌生理盐水，以10-7的比例稀释，利用用于测量的溴甲酚紫平板计数琼脂培养70小时后，通过数黄色的菌落数目来测量乳酸片球菌J9的数量。
结果证实了细菌的数量根本没有改变。这意味着乳酸片球菌J9具有优越的pH稳定性并且耐强酸。因此，当乳酸片球菌J9穿过人体的胃和肠道时，活的乳酸片球菌J9很有可能到达人体的肠道中。
表4
| 耐酸性测试 | 乳酸片球菌J9 |
| 一小时后细菌数量(CFU/g) | 1.9×108 |
| 两小时后细菌数量(CFU/g) | 1.2×108 |
(实例5)证实乳酸片球菌J9的耐热性的测试
首先，将乳酸片球菌J9在乳酸杆菌MRS培养基(DifcoLaboratories公司)中培养，并将其浸入到200毫升90℃蒸馏水的恒温浴中2分钟。
将每1mg的样本中添加9ml的无菌生理盐水，以10-7的比例稀释，利用用于测量的溴甲酚紫平板计数琼脂培养70小时后，通过数黄色的菌落数目来测量乳酸片球菌J9的数量。
结果，就细菌的数量而言，作为测试前的对照组的乳酸片球菌J9是2.9×1010，而在90℃中浸泡两分钟后细菌的数量是2.0×109，这意味着乳酸片球菌J9具有优越的耐热性。
表5
为了说明本发明，尽管已经公开了本发明优选的实施例，但本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明所附权利要求书所公开的范围和精神的情况下，可以对本发明做出各种修改、增加和替换。
Claims (9)
1.一种保健食品，其由以下方法制备，该方法包括：
准备至少一种A类谷物和至少一种B类谷物，所述A类谷物选自由糙米和大豆组成的组中，所述B类谷物选自由黑米、大麦和高粱组成的组中；
通过将所述A类谷物和所述B类谷物的混合物浸入水中来将其浸泡；
利用蒸汽蒸煮通过浸泡得到的浸泡后的谷物；
冷却蒸煮后的谷物；
将预先培养的乳酸片球菌J9(PediococcusacidilacticiJ9)和芽孢杆菌(bacillus)属菌株添加到上述冷却后的谷物中，其中所述乳酸片球菌J9保藏于韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM11320P；
将所得到的谷物加入固体存储容器中，并在40℃至45℃的温度和50﹪至70﹪的湿度下固体培养微生物20至48小时；
在40℃至45℃的温度和20﹪至40﹪的湿度下进一步固体培养上述固体培养的产物30至60小时；以及
干燥所得到的固体培养的产物，然后研磨。
2.根据权利要求1所述的保健食品，其中，芽孢杆菌属细菌是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或者短小芽孢杆菌(B.pumilus)。
3.根据权利要求1所述的保健食品，其中，所述食品是大酱。
4.根据权利要求1所述的保健食品，其中，所述食品是清麴酱。
5.一种制备保健食品的方法，所述方法包括：
准备至少一种A类谷物和至少一种B类谷物，所述A类谷物选自由糙米和大豆组成的组中，所述B类谷物选自由黑米、大麦和高粱组成的组中；
通过将所述A类和所述B类谷物的混合物浸入水中来将其浸泡；
利用蒸汽蒸煮通过浸泡得到的浸泡后的谷物；
冷却蒸煮后的谷物；
将预先培养的乳酸片球菌J9(PediococcusacidilacticiJ9)和芽孢杆菌(bacillus)属菌株添加到所述冷却后的谷物中，其中所述乳酸片球菌J9保藏于韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM11320P；
将所得到的谷物加入固体存储容器中，并在40℃至45℃的温度和50﹪至70﹪的湿度下固体培养微生物20至48小时；
在40℃至45℃的温度和20﹪至40﹪的湿度下进一步固体培养上述固体培养的产物30至60小时；以及
干燥所得到的固体培养的产物，然后研磨。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，芽孢杆菌属细菌是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或者短小芽孢杆菌(B.pumilus)。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述食品是大酱。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述食品是清麴酱。
9.乳酸片球菌J9，该乳酸片球菌J9具有针对肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的抗菌活性；该乳酸片球菌J9与芽孢杆菌(bacillus)属菌株共培养时快速地增长；当将其添加到食品中时，提高食品的稳定性，其中所述乳酸片球菌J9保藏于韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM11320P。
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