KR102169087B1 - 과면역성 피부염 증상 완화 효과가 우수한 신규한 페디오코커스 애시디락티시 lrcc 5296 - Google Patents
과면역성 피부염 증상 완화 효과가 우수한 신규한 페디오코커스 애시디락티시 lrcc 5296 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 페디오코커스 애시디락티시 엘알씨씨 5296 균주에 관한 것으로, 상기 균주는 생균과 사균 모두에서 혈청 내 IgE와 Histamine을 감소를 통해 과면역성 피부염 증상 완화 효과, 즉 아토피 피부염 완효효과를 가지며, 생균과 사균 모두 마우스의 대식세포에서 NO(Nitric Oxide) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha)의 발현이 유도되었고 마우스의 비장세포에서 Th1 사이토카인(cytokine)인 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ(Interfeton-gamma)의 생산을 유도함으로써 면역 증강 활성을 가지는 균주에 관한 것이다.
Description
본 명세서는 사균 및 생균 모두 면역 증강과 과면역성 피부염 증상을 완화시키는 효과를 갖는 신규한 페디오코커스 애시디락티시 엘알씨씨 5296 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
유산균은 사람의 소화관에 서식하면서 우리 몸의 면역 능력을 활성화 시키고 비타민K, 비타민B군 등을 합성할 뿐 아니라 유해성분의 합성, 체내로의 흡수 및 에너지 대사 등을 조절하는 것으로 알려져 있다. 특히 살아있는 유산균, 프로바이오틱스는 면역 기능을 부활시켜 질병의 감염을 예방하고, 항암효과를 나타낸다. 또한 유해 세균이나 바이러스를 감지하고, 임파구의 증식을 촉진하여 비정상세포의 증식을 억제한다. 아울러 장내 유해균의 군집 속에 정착하여 박테리오신이라는 항균물질을 내어 장내 유해균들의 생장을 억제하는 효과가 있으며 정착하여 지속적인 효과를 낸다.
그러나 프로바이오틱스는 생균으로 생산, 보관, 유통하는 전 과정에서 저온과 같은 적절할 환경을 지키지 못한 경우 균이 죽을 수도 있고, 경구 투여 시 위장관을 거치면서 위산과 담즙산에 영향을 받을 수 있다.
이러한 단점을 극복할 수 있는 방법으로 사균에 대한 연구가 지속적으로 발표되고 있다. 사균은 일반적으로 열처리를 한 유산균 균체 성분으로, 보관 중의 안전성을 확보할 수 있을 뿐만 아니라 적은 양으로 많은 수의 유산균 사균체를 섭취할 수 있고, 몸속에 존재하는 유익균을 왕성하게 활동하도록 함으로써 기존 장내 유익균들을 증강시켜 정장 효과도 뛰어나다.
그러므로 최근에는 기대하는 기능성에 맞추어 생균 및 사균을 알맞게 섭취를 하고자 하고 있다. 실제 설사 증상에 대한 처방이나 항생제 처방시 항생제 복용에 의한 설사를 예방하기 위해서 사균제 처방이 늘어나고 있고, 각종 알러지 질환, 장투과성항진 증상, 염증성 장질환 등에 적용할 때는 생균제를 선택하는 것이 장내 생태계 자체를 개선하고 전신적인 건강 증진 효과를 기대할 수 있다.
그러므로 생균과 사균 두가지 타입 모두에서 면역 증강 효과가 있으면서 과하게 증가한 면역에 대한 알러지, 즉 아토피 피부염 등에 효과를 동시에 가진다면 식품 적용성이 높고 다양해 높은 이용가치가 있을 것으로 예상된다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 일측면은 생균과 사균 두가지 타입 모두에서 면역 증강 효과가 있으며 생균일 때 내산성 및 내열성이 높은 균주 신규한 균주를 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면에서, 생균과 사균 두가지 타입 모두에서 NO(Nitric Oxide) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha)중 어느 하나 이상의 발현 증진을 통한 면역 증강 효과와 과면역 조절 효과가 있는, 신규한 균주를 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면에서, 생균과 사균 두가지 타입 모두에서 사이토카인의 생산을 유도하여 면역 증강 효과와 과면역 조절 효과가 있는, 신규한 균주를 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면에서, 생균과 사균 두가지 타입 모두에서 IgE와 Histamine의 감소를 유도하여 과면역성 피부염을 감소시키는 효과가 있는, 신규한 균주를 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면에서, 신규한 균주인 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici LRCC5296) 균주를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 측면은, 내산성, 내담즙산성, 내열성 및 장부착능이 우수한 상기 신규한 균주를 포함하는 식품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 내산성, 내담즙산성, 내열성 및 장부착능이 우수한 상기 신규한 균주를 포함하는 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은 면역 증강 효과를 가지는 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici LRCC5296) 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 균주는 상기 균주는 기탁번호가 KCCM12115P인, 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici LRCC5296 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 균주는 생균체 및 사균체 중 어느 하나 이상의 형태인, 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 중 어느 하나의 균주를 포함하는 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 식품 조성물은 면역 증진용 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 식품 조성물은 대식세포에서 NO(Nitric Oxide) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha)의 발현을 유도하거나, 비장세포에서 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ(Interferon-gamma)의 생산을 유도하여 면역력을 증진시키는, 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 식품 조성물은 IgE와 Histamine을 감소시킴으로서 과면역성 피부염 증상을 완하시키는, 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 중 어느 하나의 균주를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 약학 조성물은 면역 증진용 혹은 과면역성 피부염 감소용 약학 조성물일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 약학 조성물은 대식세포에서 대식세포에서 NO(Nitric Oxide) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha)의 발현을 유도하거나, 비장세포에서 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ(Interferon-gamma)의 생산을 유도하여 면연력을 증진시키거나 과면역성 피부염을 감소시키는 , 약학 조성물일 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 생균과 사균 두가지 타입 모두에서 과면역성 피부염 감소 효과가 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 생균과 사균 두가지 타입 모두에서 아토피 피부염 감소 효과가 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 생균과 사균 두가지 타입 모두에서 면역 증강 효과가 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 생균 타입에서 내산성이 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 생균 타입에서 내열성이 우수하다.
본 발명의 다른 측면에 따른 균주를 포함하는 식품 조성물은 생균과 사균 두가지 타입 모두에서 과면역성 피부염 감소 효과가 우수하다.
본 발명의 다른 측면에 따른 균주를 포함하는 식품 조성물은 생균과 사균 두가지 타입 모두에서 아토피 피부염 감소 효과가 우수하다.
본 발명의 다른 측면에 따른 균주를 포함하는 식품 조성물은 생균과 사균 입 모두에서 면역 증강 효과가 우수하다.
본 발명의 다른 측면에 따른 균주를 포함하는 식품 조성물은 생균 타입에서 내산성이 우수하다.
본 발명의 다른 측면에 따른 균주를 포함하는 식품 조성물은 생균 타입에서 내열성이 우수하다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른 균주를 포함하는 약학 조성물은 생균과 사균 두가지 타입 모두에서 과면역성 피부염 감소 효과가 우수하다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른 균주를 포함하는 약학 조성물은 생균과 사균 두가지 타입 모두에서 아토피 피부염 감소 효과가 우수하다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른 균주를 포함하는 약학 조성물은 생균과 사균 입 모두에서 면역 증강 효과가 우수하다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른 균주를 포함하는 약학 조성물은 생균 타입에서 내산성이 우수하다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른 균주를 포함하는 약학 조성물은 생균 타입에서 내열성이 우수하다.
도 1은 본원발명 실험예 4-(3)의 피부염 관능 평가 결과이다.
도 2는 본원발명 실험예 4-(3)의 귀두께 측정 결과이다.
도 3은 본원발명 실험예 4-(3)의 소양감 증상 평가 결과이다.
도 4는 본원발명 실험예 4-(4)의 혈청 내 IgE 및 Histamine 측정결과이다.
도 5는 본원발명 실험예 4-(5)의 피부 조직병리학적 검사 결과이며, 구체적으로, CM 은 Cutaneous muscle, EP 는 Epidermis, DE 는 Dermis, HF 는 Hair follicle이고, Scale bars 는 80 μm이었다.
도 2는 본원발명 실험예 4-(3)의 귀두께 측정 결과이다.
도 3은 본원발명 실험예 4-(3)의 소양감 증상 평가 결과이다.
도 4는 본원발명 실험예 4-(4)의 혈청 내 IgE 및 Histamine 측정결과이다.
도 5는 본원발명 실험예 4-(5)의 피부 조직병리학적 검사 결과이며, 구체적으로, CM 은 Cutaneous muscle, EP 는 Epidermis, DE 는 Dermis, HF 는 Hair follicle이고, Scale bars 는 80 μm이었다.
본 발명의 일측면은 사균 및 생균 모두 과면역성 피부염 증상 완효 효과를 가지며, 면역 증강 효과를 갖는 신규한 페디오코커스 애시디락티시 엘알씨씨 5296 균주에 관한 것이다. 보다 상세하게는 혈청내 IgE 및 히스타민 감소 효과를 가지며, 마우스의 대식세포에서 NO(Nitric Oxide) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha)의 발현이 유도되었고 생균과 사균 모두 마우스의 비장세포에서 Th1 사이토카인(cytokine)인 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ(Interferon-gamma)의 생산을 유도함으로써 과면역성 피부염 증상 완화 및 면역 증강 활성을 가지는 페디오코커스 애시디락티시 엘알씨씨 5296 균주 및 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일측면은 생균과 사균 모두 우수한 괌녀역성 피부염 증상 완화 효과를 가지는 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici LRCC5296) 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 균주는 기탁번호가 KCCM12115P인, 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici LRCC5296) 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 균주는 김치로부터 분리 및 동정된 페디오코커스 애시디락티시 신규 균주임을 특징으로 한다
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 일측면은 과면역성 피부염 증상 완화 효과를 가지는 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici LRCC5296) 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 면역 증강 효과를 추가적으로 가지는 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici LRCC5296) 균주이다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCCM12115P인, 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici LRCC5296) 균주이다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 생균체 및 사균체 중 어느 하나 이상의 형태인, 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici LRCC5296) 균주이다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 식품 조성물은 아토피 피부염 완화 또는 예방용 식품 조성물이다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 아토피 피부염 완화 또는 예방용 식품 조성물은 혈청 내 IgE와 Histamine을 감소시키는, 식품 조성물이다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 식품 조성물은 면역 증진용 식품 조성물이다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 식품 조성물은 대식세포에서 대식세포에서 NO(Nitric Oxide) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha)의 발현을 유도하거나, 비장세포에서 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ(Interfeton-gamma)의 생산을 유도하여 면연력을 증진시키는, 식품 조성물이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 약학 조성물은 과면역성 피부염 증상 완화 또는 예방용 약학 조성물이다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 약학 조성물은 면역 증진용 약학 조성물이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험예 1 : 균주 동정 및 특성 파악
본 발명의 발명자들은 전통 김치로부터 수 백종의 유산균을 분리하였다. 이후 면역 증강 효과를 가진 균주를 분리하기 위해 마우스 유래 대식세포인RAW264.7세포를 이용하였다. RAW264.7세포는 한국 세포주 은행에서 분양 받아 사용하였으며 10% FBS 함유 DMEM배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 대식세포는 탐식세포라고도 하며, 체내 모든 조직에 분포하여 면역계에서 매우 중요한 역할을 담당하는 세포이다. 정상 상태보다 체외의 세균 및 바이러스에 의하여 활성화되었을 때 잠재적 병원체를 제거하는데 더욱 효율적으로 작용하며, 대표적으로 식세포작용과 면역 매개 물질을 분비하는 등 시료의 면역 활성능을 측정하는 다수의 연구에서 사용되고 있다.
RAW 264.7 세포에 대한 세포 독성이 없는 102종의 유산균을 우선 선별하였고, 이후 NO 생성량 및 TNF-α 및 IL-6 발현량이 높은 균주 1종을 선별하였다. 세포생존율은 MTT assay, NO assay는 Greiss assay kit(Promega)를 이용하였고 TNF-α 및 IL-6은 ELISA방법으로 측정하였다.
이후, 상기 균주의 특성을 파악하고, 상기 균주를 동정하기 위하여 하기 실험을 실시하였다.
(1) 인공위액 및 인공장액 저항성
인공위액에 대한 생존율을 확인하기 위해 pH 2.5로 조정한 MRS broth를 제조하여 121℃에서 15분간 살균한 뒤, 1000 unit의 펩신(pepsin)을 여과(0.22um)하여 첨가하였다. 상기 분리된 균주를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 배양하고 상기 배양액을 인공위액 배지에 10%가 되도록 접종하였다. 그런 다음 항온수조 (37℃, 120rpm)에 넣고 1시간, 2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1ml을 채취하여 멸균 희석액을 이용한 다단희석을 통해 생균수를 측정하였다. 0시간, 1시간, 2시간 반응 후의 생균수 측정 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 2시간 동안 pH 2.5인 상태에서도 거의 세포 사멸이 일어나지 않아 내산성이 뛰어난 것을 확인하였다.
반응시간 | CFU/ml | Log(CFU/ml) |
0시간 | 5.10E+08 | 8.7 |
1시간 | 4.50E+08 | 8.7 |
2시간 | 4.30E+08 | 8.6 |
(2) 내담즙성
인공장액에 대한 생존율을 확인하기 위해 인공 담즙 성분인 0.3% 옥스갈(oxgall)을 첨가한 MRS broth를 제조하여 121℃에서 15분간 살균하였다. 상기 균주를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 배양하고 상기 배양액을 인공장액 배지에 10%가 되도록 접종하였다. 그런 다음 항온 수조 (37℃, 120rpm)에 넣고 1시간, 2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1ml을 채취하여 멸균 희석액을 이용한 다단희석을 통해 생균수를 측정하였다. 0시간, 1시간, 2시간 반응 후의 생균수 측정 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 2시간이 지난 후에도 로그 생균수 값이 거의 변하지 않아 인공장액에서도 높은 생존율을 확인할 수 있었다.
반응시간 | CFU/ml | Log(CFU/ml) |
0시간 | 4.00E+08 | 8.6 |
1시간 | 3.10E+08 | 8.5 |
2시간 | 3.00E+08 | 8.5 |
(3) 내열성
내열성을 확인하기 위해 상기 균주를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 배양하고 상기 배양액을 인공장액 배지에 10%가 되도록 접종하였다. 그런 다음 항온 수조 (50℃, 120rpm)에 넣고 1시간, 2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1ml을 채취하여 멸균 희석액을 이용한 다단희석을 통해 생균수를 측정하였다. 0시간, 1시간, 2시간 반응 후의 생균수 측정 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 2시간이 지난 후 30% 정도의 생존율을 보였으며 고온에서도 내성을 가지고 있음이 확인되었다.
반응시간 | CFU/ml | Log(CFU/ml) |
0시간 | 4.80E+08 | 8.7 |
1시간 | 2.80E+08 | 8.4 |
2시간 | 1.40E+08 | 8.1 |
(4) 장관부착능
장관부착능을 In vitro 상에서 확인하기 위하여 사람 유래 장관세포인 Caco-2를 사용하였다. 세포를 24well plate에 1x106 cells/well 이 되도록 분주한 뒤 완전하게 단일층을 형성할 때까지 배양하였다. 완전 단일층을 형성한 Caco-2세포의 배지를 걷어내고 PBS로 여러 번 세척한 뒤 DMEM배지 1.8ml을 첨가하였다.
여기에 배양한 상기 균주를 5x108 cfu/ml이 되도록 희석하여 상기 플레이트 웰에 접종하고 이후 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간동안 배양하였다.
반응시간 | CFU/ml | Log(CFU/ml) |
전 | 3.90E+07 | 7.6 |
후 | 5.80E+06 | 6.8 |
표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 균주는 14.9%에 이르는 높은 장관부착능을 보였다.
(5) 당 이용성 분석 및 유전 동정
상기 균주의 당 이용성을 분석하기 위하여 API 테스트를 실시하였다. 이용 가능한 당은 표 5와 같았다.
당 | 발효 유무(+:양성반응, -:음성반응) |
글리세롤 | - |
에리쓰리톨 | - |
D-아라비노오스 | - |
L-아라비노오스 | + |
리보오스 | + |
D-자일로오스 | + |
L-자일로오스 | - |
아도니톨 | - |
자일로사이드 | - |
갈락토오스 | + |
D-글루코오스 | + |
D-프럭토오스 | + |
D-만노오스 | + |
L-소르보오스 | - |
람노오스 | - |
둘시톨 | - |
이노시톨 | - |
만니톨 | - |
솔비톨 | - |
D-만노사이드 | - |
D-글로코사이드 | - |
글루코사민 | + |
아미그달린 | + |
알부틴 | + |
에스큘린 | - |
살리신 | + |
셀로비오스 | + |
말토오스 | - |
락토오스 | - |
멜리비오스 | - |
사카로오스 | - |
트레할로오스 | + |
이눌린 | - |
멜리지토오스 | - |
D-라피노오스 | - |
아미돈 | - |
글리코겐 | - |
자일리톨 | - |
겐티오비오스 | + |
D-투라노오스 | - |
D-릭소오스 | - |
D-타가토오스 | + |
D-푸코오스 | - |
L-푸코오스 | - |
D-아라비톨 | - |
L-아라비톨 | - |
글루코네이트 | - |
2-글루코네이트 | - |
5-글루코네이트 | - |
유전동정과정은 하기와 같았다. 16s rRNA 유전자 동정을 하기 위해 518F(5' CCAGCAGCCGCGGTAATACG 3')와 805R(5'TACCAGGGTATCTAATCC 3') 프라이머를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 분석결과는 하기의 결과와 같다.
-518F 프라이머를 사용한 분석 결과
GAAAATAGGGTATCGGGATTTATTGGGCGTAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAACCTAAGAGATTAGGCGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAAACCGCGAGGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTACAGGGGTAAACCGGTA
-805R 프라이머를 사용한 분석 결과
TGACTTCATATTGGTGCAGCTTCGAGCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATTAGACTTAAAAGACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCACTGGGTGAACAGTTACTCTCACCCACGTTCTTCTTTAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCATCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCCAGAAGTGATAGCAGAGCCATCTTTTAAAAGAAAACCAGGCGGTTTTCTCTGTTATACGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCTGCTTCTGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCACTTCGTATTAAAATCTCATTCAGTGCAAGCACGTCATGATCAATTAACGGAAGTTCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCAT
염기서열 분석 결과 상기 균주는 Pediococcus 속 균주와 최대 99% 상동성을 (Partial Sequence) 가지는 것을 확인하였다.
이에 본 발명자는 상기 균주를 새로운 페디오코커스 애시디락티시균주로 동정하였고, 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296으로 명명하여 한국미생물보존센터에 2017년 9월 15일자로 기탁하였다. 기탁번호는 KCCM12115P 이다.
실험예 2 :
in vitro
면역 증강 지표 측정
본 실험에 사용된 세포주는 마우스 유래 대식세포 RAW264.7로, 10% FBS 함유 DMEM배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 비교군으로 LGG균주를 사용하였으며 크리스찬 한센에서 구매하였다. Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)는 세계적으로 가장 유명한 프로바이오틱스 균주이며 1990년 이후 식품 및 건기식 제품으로 사용되었다. 1000건이 넘는 문헌과 300건이 넘는 임상연구를 보유하고 있다. LGG 및 상기 LRCC5296균주를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 배양하고 상기 배양액을 8000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 균체를 얻은 후 멸균된 PBS로 2회 세척하였다. 그런 다음 균체를 PBS에 현탁하여 100℃에서 20분간 살균처리 하였다. 24well plate에 깔린 RAW264.7에 준비한 유산균을 5X106 cfu/ml 처리하였다. 배양 24시간 후 표 6의 지표물질을 측정하였다. NO assay는 Greiss assay kit(Promega)를 이용하였고 TNF-α 및 IL-6은 ELISA, 세포생존율은 MTT assay 방법으로 측정하였다.
처리 | 지표물질(무처리 대비 비율) | |||
NO | TNF-α | IL-6 | 세포생존율 | |
무처리 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 100 |
LPS | 4.90 | 4.12 | 11.66 | 66 |
LRCC5296 | 3.38 | 3.98 | 5.26 | 120 |
LGG | 3.47 | 3.92 | 5.90 | 102 |
표 6에서와 같이, 양성대조군인 10 μg/ml LPS처리에 의해 NO, TNF-α 및 IL-6이 증가하는 것을 보아 면역 세포의 반응은 잘 이루어 지고 있었으며, LRCC5296의 지표물질의 발현은 LGG와 비슷한 수치로 증가함이 관찰되었다.
실험예 3 : 면역 증강 효과 마우스 투여 실험
(1) 실험 군 설정
실험군은 표 7와 같이 설정하였다.
군 | 성별 | 동물수 | 투여량(cfu/head/day) | 투여물질 | 투여경로 |
G1 | M | 8 | - | 부형제 | 경구 |
G2 | M | 8 | - | 부형제 | 경구 |
G3 | M | 8 | 4 x 109 | 5296 생균 | 경구 |
G4 | M | 8 | 4 x 109 | 5296 사균 | 경구 |
G5 | M | 8 | 4 x 109 | L. rham. G Blend-30 | 경구 |
G1: 정상군
G2-G5: Cyclophosphamide 투여군
G2: 부형제대조군
G3-G4: 시험물질(LRCC5296)투여군
G5: 대조물질투여군(LGG 유산균)
(2) 관찰 및 검사
투여 후 일반증상의 종류 및 증상의 정도를 1 일 1 회 관찰하였고, 개체별로 기록하였다. 투여개시일은 Day 1으로 설정하였다. 체중은 입수 시, 군분리 시, 투여개시 시, 부검일 및 시험기간 중 주 1 회 측정하였다. Cyclophosphamide를 Day 21 에 150 mg/kg로 복강 투여하여 면역억제를 유발하였다. 부검일(Day 29)에 흉선, 비장을 적출하여 무게를 측정하였다.
시험물질 투여기간 동안 특이할 만한 이상증상은 관찰되지 않았다. 체중관찰에서, 부형제대조군(G2)은 정상군(G1)과 비교하여 통계학적으로 유의한 변화는 보이지 않았으며 시험물질 투여군(G3-G4) 및 대조물질 투여군(G5)은 부형제 대조군(G2)과 비교하여 통계학적으로 유의한 체중 변화는 관찰되지 않았다. 부검 시 적출한 비장 및 흉선 무게 측정 결과, 비장의 무게에서 모든 시험물질 투여군(G3-G4)과 대조물질 투여군(G5)은 부형제 대조군(G2)과 비교하여 절대중량 및 상대중량 모두 유의한 변화는 없었다.
(3) 비장세포의 증식 및 사이토카인 분비능 측정
1) 비장세포 준비
적출한 비장을 배양액(RPMI 1640, 10 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin)으로 세척하였다. 멸균 perti-dish에서 비장을 분쇄하고 배양액을 더하여 현탁한 다음, 40 ㎛ cell strainer를 이용하여 균질화 하였다. 균질화된 비장세포 현탁액을 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고, pellet에 RBC lysis buffer를 첨가하고 실온에서 반응시켜 적혈구를 파괴하였다. DPBS를 첨가하여 lysis buffer 효과를 완화시킨 다음, 원심분리를 하였다. 상층액을 제거하고, pellet(비장세포)에 배양액을 더하여 세포를 현탁 하였다.
2) 비장세포 proliferation rate 측정
비장세포를 2 x 105 cells/well 농도가 되도록 배양액으로 희석하여 96 well plate에 분주하였다. Concanavalin A (Con A) 5 μg/mL 및 lipopolysaccharide(LPS) 10 μg/mL의 농도가 되도록 첨가한 다음, 72 시간 동안 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 배양하였다. 각 well에 20 μL의 CCK-8을 첨가하여 2 시간 동안 반응시킨 후, ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표 8에서 ConA-induced 및 LPS-induced splenocyte prolioferation 측정 결과, 시험물질 투여군(G3-G4) 및 대조물질 투여군(G5)에서 유의한 변화는 없었다.
그룹 | 증식 | ||||
무처리 | CON A | LPS | |||
(O.D450nm) | (O.D450nm) | (%) | (O.D450nm) | (%) | |
G1 | 0.250 ± 0.004 | 1.129 ± 0.046 | 100.0 | 0.724 ± 0.044 | 100.0 |
G2 | 0.253 ± 0.003 | 0.758 ± 0.036 | 0.0 | 0.451 ± 0.020 | 0.0 |
G3 | 0.252 ± 0.005 | 0.764 ± 0.053 | 1.4 | 0.469 ± 0.027 | 6.6 |
G4 | 0.253 ± 0.006 | 0.768 ± 0.067 | 2.7 | 0.473 ± 0.037 | 8.1 |
G5 | 0.258 ± 0.007 | 0.809 ± 0.094 | 13.7 | 0.539 ± 0.040 | 32.1 |
G1: 정상군
G2-G5: Cyclophosphamide 투여군
G2: 부형제대조군
G3-G4: 시험물질(LRCC5296)투여군
G5: 대조물질투여군
3) 비장 내 cytokine 분비능 측정
비장세포를 2 x 106 cells/well 농도가 되도록 배양액으로 희석하여 24 well plate에 분주하였다. Con A 5 μg/mL 농도가 되도록 첨가하고, 72 시간 동안 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 배양한 다음, 상층액을 취하였다. Con A가 첨가된 비장세포 상층액 중의 IL-2, IFN-γ, TNF-α를 ELISA kit를 이용하여 비장 내 ConAinduced splenocyte의 cytokine 분비능을 측정하여 표 9로 나타내었다.
IFN-γ는 정상군(G1)에 비해 부형제대조군(G2)에서 통계학적 유의성은 없었으나, 12 % 감소경향이 나타났다. 부형제대조군(G2)에 비해 시험물질 5296 투여군(G3-G4)에서 유의적인 증가가 관찰되었으며(P<0.05 or P<0.01)며, 대조물질 투여군(G5)에서도 유의적인 증가가 관찰되었다(P<0.05).
TNF-α는 정상군(G1)에 비해 부형제대조군(G2)에서 통계학적 유의성은 없었으나, 20.36 % 감소경향이 나타났다. 부형제대조군(G2)에 비해 시험물질 5296 투여군(G3-G4)에서 유의적인 증가가 관찰되었으며(P<0.05)며, 대조물질 투여군(G5)에서도 유의적인 증가가 관찰되었다(P<0.05).
CON A | ||
그룹 | IFN-γ (ng/mL) |
TNF-α (pg/mL) |
G1 | 11.25 ± 1.15 | 114.12 ± 12.51 |
G2 | 9.90 ± 1.68 | 90.88 ± 14.14 |
G3 | 15.72 ± 1.97 | 226.90 ± 51.81 |
G4 | 15.84 ± 1.32 | 193.98 ± 25.89 |
G5 | 15.11 ± 1.03 | 137.85 ± 11.52 |
G1: 정상군
G2-G5: Cyclophosphamide 투여군
G2: 부형제대조군
G3-G4: 시험물질(LRCC5296)투여군
G5: 대조물질투여군
실험예 4 : 아토피 완화 마우스 투여 실험
(1) 실험 군 설정
실험군은 표 10와 같이 설정하였다.
군 | 성별 | 동물수 | 투여량(cfu/head/day) | 투여물질 | 투여경로 |
G1 | M | 6 | - | 부형제 | 경구 |
G2 | M | 6 | - | 부형제 | 경구 |
G3 | M | 6 | 4 x 109 | 5296 생균 | 경구 |
G4 | M | 6 | 4 x 109 | 5296 사균 | 경구 |
G5 | M | 6 | 0.2ml | Dexamethasone | 도포 |
G1: 정상군
G2-G5: 아토피 유발군
G2: 부형제대조군
G3-G4: 시험물질(LRCC5296)투여군
G5: 대조물질투여군(Dexamethasone)
(2) 아토피 피부염 유발
NC/Nga 마우스를 1 주일간 순화하고 졸레틸 마취 후 등배부(귀 하단부에서부터 꼬리 상단부까지)를 깨끗하게 제모하고 미세상처가 치유되도록 24 시간 방치하였다. Acetone과 Olive oil을 3:1로 혼합된 기제에 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (DNCB)를 녹여서 만든 1 % DNCB 용액을 등배부에 200 μL로 1 차 도포하였다. 1 차 도포 4 일 후에 2 차 도포를 실시하였으며, 1 차 도포 7 일 후에 0.4 % DNCB 용액을 주 3 회 또는 4 회 등배부에 150 μL씩 4 주간 도포하여 아토피를 유발하였다. 시험물질은 0.4 % DNCB 용액을 도포하기 전에 투여하였다.
(3) 피부염 및 소양감 증상 평가
군분리 시 및 1 회/주 사진촬영을 실시하였으며, 등 부위의 피부병변 정도를 보기 위해 육안으로 관찰하였을 때 각 군의 아토피성 피부염 상태는 홍반(Erythema), 피부건조(Dry skin), 부종&혈종(Edema & Hematoma), 짓무름(Erosion), 태선화(Lichenification) 등의 5 항목에 대하여 증상에 따라 없음(0), 약함(1), 중증도(2), 심함(3)으로 채점하여 합산함으로써 최소 0 점에서 최고 15 점 사이의 평가점수를 부여하였다. 평가는 주 1 회, 동일한 시험자가 동일한 시간에 수행하였다.
일반적으로 피부염 증상 측정 시 관찰하는 귀두께 측정(Ear thickness) 또한 진행하였으며, 시험물질의 투여기간동안 1 회/주 귀두께를 버니어캘리퍼스를 이용하여 측정하였다. 소양감 증상 평가(Itching behavior test)는 시험물질투여 4 주차에 동물을 투명한 cage에 옮기고 30 분 동안 등 부위의 피부를 긁는(scratch) 횟수를 육안으로 관찰하였다. 뒷다리로 긁는 행동은 scratching behavior 1 회로 기록하고 연속으로 여러 번 긁는 행동 또한 1 회로 기록하였다.
피부염 관능평가는 도 1에 나타내었다. 부형제대조군(G2)은 정상군(G1)에 비해 모든 시험 기간동안에 통계학적으로 유의한 score 증가가 관찰되었다. 시험물질 5296 생균군(G3)은 2 및 3 주차에 통계학적으로 유의한 score 감소가 관찰되었으며, 5296 사균군(G4)는 2, 3 및 4 주에 통계학적으로 유의한 score 감소가 관찰되었다. 대조물질인 Dexamethasone 투여군(G5)는 2, 3 및 4 주에 통계학적으로 유의한 score 감소가 관찰되었다.
귀두께 측정 결과는 도 2에 나타내었다. 부형제대조군(G2)은 정상군(G1)에 비해 통계학적으로 유의한 변화는 없었으며, 5296 생균군(G3)과 5296 사균군(G4) 및 대조물질투여군(G5)에서는 부형제대조군(G2)에 비해 통계학적으로 유의한 변화는 없었다.
소양감 증상 평가(Scratch 횟수) 결과는 도 3에 나타내었으며, 부형제대조군(G2)에서 23.5±10.6 회로 관찰되었다. 5296 생균군(G3)과 5296 사균군(G4) 및 대조물질투여군(G5)에서는 부형제대조군(G2)에 비해 통계학적으로 유의한 변화는 없었다.
(4) 혈액학적 검사 및 IgE, Histamine 측정
4주차 시험 종료 다음 날, 시험동물을 isoflurane으로 마취하여 후대정맥으로 최대량을 채혈한 후, 그 중 약 0.25 mL를 항응고제인 EDTA-3K가 들어있는 CBC bottle에 주입하였다. 혈액은 자동 혈액분석기(ADVIA 2120, SIEMENS, USA)로 백혈구(WBC), 호중구(NEU), 림프구(LYM), 단핵구(MONO), 호산구(EOS), 호염구 (BASO), 대형비염색성세포(LUC) 등을 측정하였다. 또한 분리된 혈청에서 IgE와 Histamine을 측정하기 위하여 IgE ELISA kit(Shibayagi, #AKRIE-0101, #633-02899) 및 histamine(ENZO, ENZ-KIT140) ELISA kit을 이용하여 정량분석하였다.
WBC, Neurophil, Lymphocyte, monocyte 측정결과는 표 11에 나타내었다.
군 | WBC | Neurophil | Lymphocyte |
G1 | 1.81 | 0.34 | 1.30 |
G2 | 1.90 | 1.37 | 0.39 |
G3 | 3.32 | 1.46 | 1.55 |
G4 | 3.35 | 1.98 | 1.17 |
G5 | 2.58 | 0.87 | 1.52 |
WBC 측정에서, 부형제대조군(G2)은 정상군(G1)에 비해 통계학적으로 유의한 변화는 없었으나, 시험물질 5296 생균, 5296 사균 투여군(G3-G4)는 부형제대조군(G2)에 비해 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다.
Neutrophil은 5926 사균 투여군(G4)에서 부형제대조군(G2)에 비해 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었고, Lymphocyte는 시험물질 5296 생균군(G3)과 5296 사균군(G4)에서 부형제대조군(G2)에 비해 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다. Eosinophil 측정에서, 부형제대조군(G2)은 정상군(G1)에 비해 통계학적으로 유의한 변화는 없었으나, 5296 사균군(G4)에서 부형제대조군(G2)에 비해 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다.
나머지 항목의 monocyte 및 large unstained cell은 표 12에 나타내었다.
군 | Monocyte | Eosinophil | Large unstained cell | Basophil |
G1 | 0.05 | 0.11 | 0.01 | 0.00 |
G2 | 0.05 | 0.06 | 0.03 | 0.00 |
G3 | 0.06 | 0.22 | 0.03 | 0.00 |
G4 | 0.05 | 0.12 | 0.03 | 0.00 |
G5 | 0.05 | 0.11 | 0.03 | 0.00 |
부형제대조군(G2)은 정상군(G1)에 비해 통계학적으로 유의한 변화가 없었고, 5296 생균군(G3)과 5296 사균군(G4)에서도 부형제대조군(G2)에 비해 통계학적으로 유의한 변화는 없었다. 대조물질투여군(G5)는 부형제대조군(G2)에 비해 neutrophil의 유의한 감소와(P<0.05) lymphocyte의 유의한 증가가 관찰되었다.
혈청 내 IgE 및 Histamine 측정결과는 도 4에 나타내었다.
IgE와 histamine 모두 부형제대조군(G2)은 정상군(G1)에 비해 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다. 특히 IgE는 5296 사균군(G4)과 대조물질투여군(G5)에서 부형제대조군(G2)에 비해 통계학적으로 유의한 감소가 관찰되었다. Histamine 측정 결과, 5296 생균군(G3), 5296 사균군(G4) 및 대조물질투여군(G5)에서 부형제대조군(G2)에 비해 통계학적으로 유의하게 histamine이 감소하였다.
(5) 피부 조직병리학적 검사
채혈이 완료된 시험 동물의 장기 이상 유무를 확인하였다. 아토피 유발 부위를 절취하여 절반은 10 % 중성 완충 포르말린 용액에 고정하여 H&E 및 Masson's trichrome stain을 하여 조직병리학적 검사를 실시하였다. 검사 항목은 전체 피부 두께(full skin thickness, μm/skin), 상피 두께(epithelial thicknesses, μm/skin), 염증세포 수(inflammatory cell, cell/mm2), 비만세포 수(mast cell, cell/mm2)및 진피 내 collagen 비율(collagen fibers, %/mm2)을 실시하였다.
조직병리학적 검사 결과는 표 13 및 14에 나타내었다.
군 | 전체 피부 두께 (μm/skin) |
상피 두께 (μm/skin) |
염증세포 수 (cells/mm2 of dermis) |
G1 | 284.36±11.47 | 12.65±1.04 | 18.67±3.00 |
G2 | 627.48±54.59 | 98.33±4.19 | 254.83±28.87 |
G3 | 658.19±47.53 | 111.14±5.02 | 251.33±38.97 |
G4 | 694.57±71.05 | 102.96±8.80 | 271.67±40.05 |
G5 | 508.41±40.98 | 57.16±4.93 | 175.67±11.63 |
군 | 비만세포 수 (cells/mm2 of dermis) |
진피 내 콜라겐 비율 (%/mm2 of dermis) |
G1 | 11.67±0.95 | 61.17±0.62 |
G2 | 82.33±3.32 | 77.13±1.54 |
G3 | 94.67±8.97 | 74.67±1.78 |
G4 | 89.00±5.67 | 77.95±1.53 |
G5 | 52.00±4.03** | 63.16±0.69** |
피부의 조직병리학적 검사에서 전체피부 두께 측정 결과, 부형제대조군(G2)은 정상군(G1)에 비해 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었으나, 5296 유산균 투여군 및 대조물질 투여군에서는 유의한 변화는 없었다.
조직병리학적 검사 결과 사진은 도 5와 같았다.
조직병리학적 검사 항목은 대부분 유사한 결과가 확인되었는데, 전체 피부 두께, 상피 두께, 염증세포 수, 비만세포 수, 진피내 콜라겐 비율 등에서 부형제대조군(G2)은 정상군(G1)에 비해 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다. 또한 5296 사균군(G4)과 대조물질투여군(G5)에서 부형제대조군(G2)에 비해 유의적으로 감소한 결과가 나타났다.
Claims (7)
- 과면역성 피부염 증상 완화 효과를 가지며, 기탁번호가 KCCM12115P이며, 김치로부터 유래한 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici LRCC5296) 균주.
- 제 1항에 있어서,
상기 균주는 면역 증강 효과를 추가적으로 가지는 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici LRCC5296) 균주. - 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 균주는 생균체 및 사균체 중 어느 하나 이상의 형태인, 페디오코커스 애시디락티시 LRCC5296(Pediococcus acidilactici LRCC5296) 균주. - 제 1항 내지 제 2항 및 제 4항 중 어느 한 항에 따른 균주를 포함하는 식품 조성물.
- 제 5항에 있어서,
상기 식품 조성물은 아토피 피부 개선용 식품 조성물. - 제 5항에 있어서,
상기 식품 조성물은 면역 증진용 식품 조성물.
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