CN107217018A - 高抗性枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种发酵降解玉米蛋白粉的枯草芽孢杆菌，菌剂及其在发酵降解玉米蛋白粉中的应用。本发明提供的枯草芽孢杆菌既可产生蛋白酶活性，又对亚硫酸钠具有很强抗性，并且还对大肠杆菌具有较强的抑制作用。该菌株可发酵降解玉米蛋白粉，发酵液经喷雾干燥后获得的发酵玉米蛋白粉，小肽含量高，同时具有抗氧化活性、蛋白酶活性及含活性益生芽孢杆菌等特性，该枯草芽孢杆菌及其微生物菌剂可发酵玉米蛋白粉生产动物饲料。

Description

高抗性枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物饲料领域，具体地说涉及一种枯草芽孢杆菌，以及该枯草芽孢杆菌在发酵玉米蛋白粉等饲料中的应用。
背景技术
玉米蛋白粉是玉米湿法加工淀粉厂主要的副产物之一，由玉米籽粒经过0.1％-0.2％的亚硫酸钠浸泡、破碎、洗涤后湿磨制得的粗淀粉乳再经分离压滤干燥而成(吴亚梅,等.现代食品科技,2007,23(4):97-100)。玉米蛋白粉蛋白质含量60％以上，其余约为20％的淀粉和少量酯类、玉米黄素、叶黄素等(张雁凌,等.食品科学,2011,32(18):348-351)。由于玉米蛋白粉中的蛋白质主要为不溶性的醇溶蛋白，而且氨基酸组成不平衡，食味差，严重影响其在食品和饲料工业中的应用(李秀梅,等.食品科技,2009,34(9):21-24；云霞,等.食品工业科技,2002,23(11):69-71)。
玉米肽是通过水解玉米蛋白粉加工而来，由分子量小且活性高的短肽分子组成。其分子量小，营养丰富，比氨基酸和蛋白质更易于被吸收利用；玉米肽水溶性高,粘度低，安全性能高，无毒副作用。具有降血压、抗疲劳、抗氧化、分解酒精、降血脂等功能。目前，生产玉米活性肽的方法主要有酶解法和微生物发酵法(巨芳,等.中国食物与营养,2009,20(8):27-29；王芳,等.食品研究与开发,2010,31(10):168-170)。将玉米蛋白经酶或微生物发酵水解得到的小分子高活性玉米肽具有易于消化吸收和抗氧化、延缓衰老等功能(王立江.中国调味品,2011,36(9):14-18)。
微生物发酵法制备活性肽具有减少苦味产生、降低生产成本等优点，是一种具有发展潜力的处理方法(Zhang H,等.Journal of the Science of Food&Agriculture,2013,93(13):3264-3270；田京歌,等.食品安全质量检测学报,2013,4(3):753-759)。国内已有研究者采用芽孢杆菌(张文学,等.粮食与饲料工业,2015,12(8):47-50；王燕,等.饲料工业,2014,35(15):19-23；张智，等.中国粮油学报,2009,24(12):36-41.)和真菌(文超婷,等.中国粮油学报,2016,31(2):103-108)对玉米蛋白粉进行发酵和工艺优化方面的研究报道。徐艳阳等(食品研究与开发,2014,35(19):75-79.)对纳豆芽孢杆菌发酵法制备玉米肽工艺进行了试验研究。在最优发酵条件下，玉米蛋白粉的水解度为11.17％。吴泽柱等(食品科学,2009,30(17):195-199)对枯草芽孢杆菌k-1水解玉米蛋白粉的培养基进行优化，玉米蛋白粉发酵的水解度由末优化前的9.64％上升到11.84％，提高了23％。
亚硫酸钠是食品工业中常用的一种防腐剂,对许多细菌具有抑制作用(汪玲玲,等.食品科学,2013,34(15):62-65；王征征,等.食品工业科技,2016,37(14):291-296)，由于玉米蛋白粉加工过程中使用了亚硫酸钠从而使得玉米蛋白粉原料中残留有该物质，因此，能够发酵天然玉米蛋白粉的菌株应具备一定的抗亚硫酸钠的能力。具有较好的抗亚硫酸钠能力的菌株在发酵玉米蛋白粉生产中将具有优势。
中国专利检索文献：中国专利(CN200810064297.2)公布一种富含益生菌的发酵饲料及其制备方法。中国专利(CN200810064296.8)公布了一种抗氧化活性肽及其制备方法。中国专利(CN201110427348.5)公布了一种饲用低聚肽添加剂及其制备方法。中国专利(申请号201610241962.5)公开了一种保健型速溶蛋白粉的制作方法。目前已报道的发酵玉米蛋白粉的菌株存在发酵底物浓度不高或水解效率不高等不足。更重要的是，目前尚未见对亚硫酸钠具有抗性，同时又对具有发酵玉米蛋白粉产生较高的小肽和蛋白酶活性的益生枯草芽孢杆菌的报道。
发明技术内容：
本发明的一个目的是提供一种对亚硫酸钠具有较强耐受能力、可高效降解玉米蛋白粉，并可抑制大肠杆菌生长的枯草芽孢杆菌菌株。
本发明的另一个目的是提供含有枯草芽孢杆菌的菌剂。
本发明的另一个目的是提供枯草芽孢杆菌发酵玉米蛋白粉制备玉米蛋白粉的方法。
本发明的再一个目的是提供制备枯草芽孢杆菌固体菌剂的方法。
本发明的再一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌及菌剂在发酵玉米蛋白粉生产动物饲料中的应用。
本发明公开了一株新的枯草芽孢杆菌，其特征在于,该菌株为枯草芽孢杆菌X1-1Bacillus subtilis X1-1，保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017301，保藏日期是2017年5月31日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctcc@whu.edu.cn。
枯草芽孢杆菌X1-1菌株是从湖北省武汉市饲料市场的饲料原料中经分离筛选获得。该菌株有如下特征：枯草芽孢杆菌X1-1在玉米蛋白粉培养基中发酵产碱性蛋白酶活达106.23(U/mL)。该菌株对大肠杆菌具有较强抑制作用。该菌株能够在含0.2g/L的亚硫酸钠培养基和玉米蛋白粉培养基中生长良好。经该菌株液态发酵和喷雾干燥后制备的发酵玉米蛋白粉的粗蛋白和小肽含量分别达69.7％和47.6％，蛋白酶活达2217U/g，并具有较好的抗氧化功能和动物饲喂效果。
枯草芽孢杆菌X1-1株形态特征是：菌落呈乳白色，表面平整粗糙，比较干燥，不透明，边缘不整齐，细胞为短杆状，产芽孢。
枯草芽孢杆菌X1-1株生化特征是：可利用葡萄糖，蔗糖、甘露醇、D-木糖、淀粉。能在含7％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中生长。
枯草芽孢杆菌X1-1株生长特征是：牛肉膏蛋白胨平板上划线接种，分别在37℃至45℃下培养均生长良好；在含0.2％亚硫酸钠培养基和玉米蛋白粉培养基中生长良好。
枯草芽孢杆菌T1株16S rDNA基因序列分析显示：枯草芽孢杆菌X1-1株与Bacillussubtilis CICC 10071菌株的同源性大于99％。
本发明还公开了一种含枯草芽孢杆菌X1-1的菌剂，该菌剂组合物主要成份是枯草芽孢杆菌X1-1株及其胞外产物和发酵基质。
本发明的还公开了枯草芽孢杆菌X1-1及其微生物菌剂在发酵玉米蛋白粉上的应用。
本发明的还公开了枯草芽孢杆菌X1-1及其微生物菌剂在发酵生产畜禽动物饲料中的应用。
在本发明中采用的参比菌株均为普通微生物菌种，其中枯草芽孢杆菌CICC10071登载于中国工业微生物菌种保藏管理中心目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。
本发明公开的益生菌剂为固态或液态。优先的，本发明公开的X1-1芽孢杆菌菌剂为固态。
本发明还公开了制备固态菌剂的方法，包括如下步骤：
(1)X1-1菌种活化：用接种环挑取一环X1-1菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养20-24h；
(2)种子液的制备：挑取一环经活化的X1-1菌株接入装有100mL含0.2％亚硫酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养24h备用。
(3)固体发酵培养基制备：按玉米粉25％，麸皮30％，米糠25％，豆粕20％，料：水＝1:1，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料方盒中，121℃灭菌30min后冷却待用；
(4)固体菌剂培养：按5-10％接种量接入预先培养好的X1-1种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置37℃恒温培养箱中培养2天，每12h搅拌一次；
(5)干燥及粉碎：将上述发酵完毕的X1-1固体培养物置于55℃烘箱中烘至含水率低于15％，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置干燥、阴凉处或冰箱保鲜层中保藏；
固态样品中X1-1芽孢杆菌的活菌数达150-300亿cfu/克。
本发明的优点：
1、枯草芽孢杆菌X1-1菌株具有很强的抗亚硫酸钠的能力，能够在含0.2g/L的亚硫酸钠培养基和玉米蛋白粉培养基中生长良好，而参比菌株则不抗亚硫酸钠，在这2种含亚硫酸钠的培养基上几乎不能生长。
2、枯草芽孢杆菌X1-1菌株产蛋白酶活性高，在玉米蛋白粉发酵培养基中产碱性蛋白酶活达106.2(U/mL)，比参比菌株酶活高1倍以上，并且该菌株还同时具有产酸性蛋白酶和中性蛋白酶的能力；该菌株具有很强的发酵水解玉米蛋白粉的能力，发酵后发酵液中的可溶性蛋白含量占总蛋白的比例可达75.2％，比发酵前提高4.63倍。
3、经X1-1菌株液态发酵和喷雾干燥后制备的发酵玉米蛋白粉粗蛋白、小肽含量高，并具有蛋白酶活性、含活性芽孢和较好的抗氧化功能。发酵玉米蛋白粉样品的蛋白酶活达2217U/g，粗蛋白和小肽含量分别为69.7％和47.6％，比玉米蛋白粉原料分别提高了1.81倍和5.35倍。
4、经X1-1菌株发酵制备的发酵玉米蛋白粉具有较好的适口性和动物饲养效果。发酵后的玉米蛋白粉可等量替代15％-30％豆粕饲养肉仔鸡并取得相同的养殖效果。
5、该菌株对大肠杆菌具有较强抑制作用，具有益生菌功能。
附图说明
图1是枯草芽孢杆菌X1-1菌株的系统发育树图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例
实施例1枯草芽孢杆菌X1-1菌株的分离与鉴定
1.1枯草芽孢杆菌X1-1菌株的分离:从武汉市饲料市场上采集饲料原料样品，称取饲料样品10g，加至装有90mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀后置于80℃恒温水浴锅中处理20min，摇匀稀释后，取10-3、10-4、10-5三个稀释梯度涂布到玉米蛋白粉平板筛选培养基上，每个稀释梯度做3个重复，置30℃恒温培养箱中培养72h，观察测定菌落周围透明圈的大小，芽孢杆菌透明圈(H/C)值如表1所示。选取透明圈(H/C)值较大的5个菌株，分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃，170rpm条件下振荡培养后，按10％接种量分别接种于玉米蛋白粉发酵培养基中，在37℃，170rpm条件下发酵培养48h后，离心(4000r，10min)，取上清液为待测样品，按照福林酚试剂法测定发酵液中上清液的碱性蛋白酶活性，测定其蛋白酶活性。筛选到的5株芽孢杆菌菌株蛋白酶活测定结果如表1所示。采用此方法经筛选后获得1株在玉米蛋白粉发酵培养基中能产生较高蛋白酶活性的芽孢杆菌，菌株编号为X1-1,其在玉米蛋白粉发酵培养基中的碱性蛋白酶活性达106.23U/mL(表2)。
表1芽孢杆菌在玉米蛋白粉平板上的透明圈(H/C)值
表2芽孢杆菌发酵玉米蛋白粉产碱性蛋白酶活性测定结果
本发明人将分离的一株新的枯草芽孢杆菌X1-1株(Bacillus subtilis X1-1)保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017301，保藏日期是2017年5月31日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctcc@whu.edu.cn。
1.2枯草芽孢杆菌X1-1株的鉴定：通过形态特征观察、生理生化测定及16S rDNA基因序列分析结果对X1-1进行鉴定。在鉴定中，本实验选择枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisCICC10071菌株作为对照菌株。枯草芽孢杆菌为常用普通微生物菌种，登载于中国工业菌种保藏中心目录中，处于公开状态，科学工作者可向保藏中心索取。
1.2.1枯草芽孢杆菌X1-1株形态特征是：菌落呈乳白色，表面平整粗糙，比较干燥，不透明，边缘不整齐，细胞为短杆状，产芽孢。
1.2.2通过16S rDNA序列分析进行系统发育地位鉴定：
将分离纯化得到的细菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃，170rpm的条件下振荡培养16h，再利用细菌基因组试剂盒提取基因组DNA。
采取试剂盒抽提得到细菌DNA后，通过PCR扩增16S rDNA，配置50μL的反应体系，细菌的16S rDNA引物为27F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。
PCR循环程序为：94℃预变性5min，94℃50s，54℃50s，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。扩增得到的细菌PCR产物送至金唯智生物科技有限公司测序，测序的长度在1400bp左右，测序结果采用BioaEdit软件序列图谱人工校对拼接，拼接后的序列在NCBI核酸序列数据库中进行同源序列搜索比对。根据同源序列搜索结果，选取测试菌株关系较近的模式菌株的16S rDNA序列区序列，用MEGA软件采取邻接法构建系统发育树。
实验得到1042bp的基因序列，在Genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，X1-1与Bacillus subtilis CICC10071的同源性超过99％，符合Kuttzman&Robnett所定的同种内不同菌株见差异不超过1％的标准。图1是根据16S rDNA序列所做的系统发育树。
1.2.3：枯草芽孢杆菌X1-1株的生理生化实验测定结果：见表3。根据16S rDNA序列分析结果和生理生化实验测定结果，参照文献报道(东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社,2001,267-295.),可判断X1-1菌为枯草芽孢杆菌。
表3枯草芽孢杆菌X1-1株的生理生化实验结果
测定项目 结果 测定项目 结果
接触酶 + 葡萄糖 +
厌氧生长 － 木糖 +
甲基红试验 + 甘露醇 +
硝酸盐还原 + 蔗糖 +
45℃生长 + 甘油 －
pH 5.7生长 + 发酵葡萄糖产气 －
7％NaCl生长 + 利用柠檬酸盐 +
淀粉水解 + 分解酪素 +
实例2枯草芽孢杆菌X1-1抑制大肠杆菌能力比较
将枯草芽孢杆菌X1-1和大肠杆菌种子液培养18h，离心后取上清液经过无菌滤膜过滤，分别调整到适当的浓度。吸取0.1mL大肠杆菌无菌滤液涂布于LB平板上，用无菌镊子取灭菌后的牛津杯(外径8mm)置于其上，轻压，使杯底紧贴于培养基上。每个牛津杯加入0.15mL芽孢杆菌无菌滤液。然后将培养皿置于30℃恒温培养24h，测抑菌圈直径(包括牛津杯直径)。X1-1与参比菌株Bacillus subtilis CICC10071对大肠杆菌抑菌圈直径值(D-d)结果见4。由表4可知，枯草芽孢杆菌X1-1抑制大肠杆菌的能力比参比菌株明显强。
表4芽孢杆菌对大肠杆菌的抑菌圈直径值(D-d)
实施例3枯草芽孢杆菌X1-1株抗亚硫酸钠能力和产蛋白酶能力比较分析
3.1 2株芽孢杆菌在含亚硫酸钠及玉米蛋白粉培养基中的生长结果
考虑到玉米蛋白粉的生产是由玉米经过亚硫酸钠浸泡而来，使得玉米蛋白粉中有含硫化合物残留。亚硫酸钠是一种常用的食品防腐剂，对一般细菌的生长具有抑制作用。能够在玉米蛋白粉培养基中生长的细菌应具有一定的抗亚硫酸钠的能力。因此，本实验对X1-1和参比菌株的耐亚硫酸钠的能力进行了测试。将2种待测菌株经牛肉膏蛋白胨培养基活化后，按5％的接种量分别接种于不含亚硫酸钠的牛肉膏培养基中和含2g/L亚硫酸钠的牛肉膏培养基中，37℃、170rpm振荡培养48h，不同时间取样采用稀释平板测数法分别测定各样品在牛肉膏平板上形成的菌落数，测定结果见表5。结果表明，在牛肉膏培养基中2株芽孢杆菌的生长情况相似，但在含亚硫酸钠的牛肉膏培养基和玉米蛋白粉发酵培养基中，X1-1菌株的生长能力显著优于参比菌株，表明亚硫酸钠对X1-1菌株的生长无抑制作用，但对参比菌株CICC10071的生长具有明显的抑制作用。由于玉米蛋白粉中含有一定量的亚硫酸钠，因此，参比菌株CICC10071在玉米蛋白粉发酵培养基中的生长也受到明显抑制。
表5亚硫酸钠对不同芽孢杆菌菌株生长的影响(x108CFU/mL))
3.2 2株芽孢杆菌在不同培养基中产蛋白酶能力的比较
将X1-1与参比菌株CICC10071分别接种于在牛肉膏蛋白胨培养基和玉米蛋白粉发酵培养基中，37℃、170rpm振荡培养48h，取样测定各菌株发酵液的碱性蛋白酶活性。结果表明(表6)，这2株芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基中的蛋白酶活相差并不大，但在玉米蛋白粉发酵培养基中，X1-1菌株的蛋白酶活比CICC10071菌株的酶活高2倍以上。显然，这种差异是由于CICC10071菌株在玉米蛋白粉发酵培养基中生长能力较弱引起的。而X1-1菌株在玉米蛋白粉培养基中能够生长良好并产生较高的蛋白酶活性，与其对亚硫酸钠具有较强的抗性有关。
表6 2株芽孢杆菌在不同培养基中的蛋白酶活测定结果
3.3枯草芽孢杆菌X1-1菌株产多种蛋白酶能力分析
挑取经平板活化的X1-1菌株接种于牛肉膏液体培养基中培养，再将此种子液按5％比例接种于玉米蛋白粉发酵培养基中，于不同温度下170rpm摇床培养48h后离心取上清液，按照福林酚试剂法分别测定其酸、中、碱性蛋白酶活。测定结果(表7)表明，枯草芽孢杆菌X1-1具有产多种蛋白酶的能力，其中产中性蛋白酶能力最强，产酸性蛋白酶的能力最弱。36℃培养温度下该菌株产蛋白酶酶活性最高，其碱性蛋白酶活最高为106.2U/mL，中性蛋白酶最高可达120U/mL。
表7枯草芽孢杆菌X1-1的产蛋白酶特性
实施例4 X1-1芽孢杆菌固体菌剂的制备方法
按照如下步骤进行：
(1)X1-1菌种活化：用接种环挑取一环X1-1菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养20-24h。
(2)种子液的制备：挑取一环经活化的X1-1菌株接入装有100mL含0.2％亚硫酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养24h备用。
(3)固体发酵培养基制备：按玉米粉25％，麸皮30％，米糠25％，豆粕20％，料：水＝1:1，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料方盒中，121℃灭菌30min后冷却待用。
(4)固体菌剂培养：按5-10％接种量接入预先培养好的X1-1种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置37℃恒温培养箱中培养2天，每12h搅拌一次。
(5)干燥及粉碎：将上述发酵完毕的X1-1固体培养物置于55℃烘箱中烘至含水率低于15％，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置干燥、阴凉处或冰箱保鲜层中保藏。
(6)采用稀释平板测数法检测样品中X1-1芽孢杆菌的活菌数达150-300亿cfu/克。
实施例5枯草芽孢杆菌X1-1及其微生物菌剂在发酵玉米蛋白粉中的应用
5.1枯草芽孢杆菌发酵玉米蛋白粉样品的制备方法
(1)X1-1菌种活化：用接种环挑取一环X1-1菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，在恒温培养箱中37℃培养20h。
(2)种子液的制备：挑取一环经活化的X1-1菌株接入装有100mL的牛肉膏蛋白胨三角瓶液体培养基中，37℃180r/min摇床培养24h备用。
(3)玉米蛋白粉发酵培养基制备：玉米蛋白粉4.0g/100mL、KH2PO4 1.65g/L、K2HPO40.5g/L、CaCl2 0.1g/L、NaCl 0.5g/L、蛋白胨2.0g/L、蒸馏水1.0L、pH 7.5。混合均匀，配制成液体发酵培养基，并以500mL装瓶量分装于1000mL三角瓶中，121℃灭菌20min后冷却待用。
(4)液体发酵方法及发酵效果测定：按6％接种量接种X1-1种子液于玉米蛋白粉液体发酵培养基中，培养温度36℃，摇瓶转速180rpm，发酵时间72h。取样测定结果为：发酵前发酵液的可溶性蛋白占总蛋白含量为13.4％，发酵后的玉米蛋白粉可溶性蛋白含量达75.2％，发酵后可溶性蛋白占总蛋白含量提高了4.63倍。
(5)发酵玉米蛋白粉喷雾干燥样品制备方法：对玉米蛋白粉发酵液进行喷雾干燥，物料进风温度为180℃，出风温度控制在75℃～90℃之间，蠕动泵转速为1800mL/h，风机速度为50Hz。
5.2发酵玉米蛋白粉生化指标及抗氧化能力的测定结果
通过枯草芽孢杆菌X1-1液体发酵和喷雾干燥制备的发酵玉米蛋白粉样品，经感官品尝无明显苦味，而经碱性蛋白酶水解的玉米蛋白粉溶液具有明显的苦味。因此，与酶解法相比，发酵法制备的玉米肽在口感上具有一定优势。玉米蛋白粉发酵前后的生化指标测定结果见表8所示。与未发酵的玉米蛋白粉原料相比，经X1-1菌株发酵后的玉米蛋白粉粗蛋白和小肽含量分别提高了1.81倍和5.35倍，并含活性芽孢杆菌益生菌数量达2×108cfu/g，蛋白酶活性达2217U/g。
粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法(GB5009.5-2010)。小肽含量的测定采用凯氏定氮法(QB/T2653-2004)。
表8玉米蛋白粉发酵前后生化指标的对比(以绝干样品计算)
发酵玉米蛋白粉的抗氧化能力测定采用DPPH法：取1.0g玉米肽，置于装有100mL无菌水的三角瓶中，在常温下超声30min后，稀释到不同浓度。取不同浓度的玉米肽溶液2.0mL与2.0mL DPPH溶液置于同一带塞试管中混匀，在室温下静置40分钟后，以甲醇为空白，在517nm的波长下测定吸光值，每组数据测定3组平行样，取平均值。维生素c溶液作为对照样品。玉米蛋白粉原料、发酵玉米蛋白粉溶液和维生素c的浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、5.0mg/mL、10mg/mL，其清除率结果见表9所示。结果表明，发酵玉米蛋白粉浓度达到1.0mg/mL时，其清除率达76.51％，其清除DPPH自由基的能力开始高于维生素c，浓度达到2.0mg/mL时，其清除效果趋于稳定，最高可达96.0％，比玉米蛋白粉原料对DPPH的清除效果提高了近1倍。
表9玉米肽对DPPH的清除率(％)
5.3发酵玉米蛋白粉饲养肉鸡试验结果及分析
为了测试用X1-1菌剂发酵的玉米蛋白粉的饲养效果，选择200只出壳健康科宝500肉仔鸡公雏，随机分为5组，每组4个重复，每个重复10只。五组分别饲喂豆粕、15％玉米蛋白粉替代豆粕、30％玉米蛋白粉替代豆粕、15％发酵玉米蛋白粉替代豆粕、30％发酵玉米蛋白粉替代豆粕。鸡舍温度第1周控制在35℃，以后每周降低3℃，至试验结束。各组试验鸡自由采食和饮水。每日上午7:00加料和水，试验期为21天。试验过程中无鸡只死亡。试验结果见表10。由表10可知,玉米蛋白粉发酵与否对平均日增重和料肉比有极显著影响(p≤0.001),豆粕的替换量(15％与30％)极显著影响采食量。用发酵玉米蛋白粉替代豆粕的15％-30％对0～21日龄肉鸡的生产性能无显著影响。表明采用X1-1菌剂发酵的玉米蛋白粉具有较好的替代豆粕的功能。
表10两因素(玉米蛋白粉与发酵玉米蛋白粉)两水平(替代豆粕15％与30％)试验肉鸡0～21日龄生产性能比较

Claims (6)

1.一株能发酵降解玉米蛋白粉的枯草芽孢杆菌，其特征在于,该菌株为枯草芽孢杆菌X1-1 Bacillus subtilis X1-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017301。
2.一种含权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌X1-1的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为枯草芽孢杆菌X1-1菌体及其代谢产物。
3.根据权利要求 2中 所述的微生物菌剂，其特征在于所述的菌剂为固态菌剂。
4.制备权利要求2中所述的菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
（1） X1-1菌种活化：用接种环挑取一环X1-1菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养20-24h；
（2）种子液的制备：挑取一环经活化的X1-1菌株接入装有100mL含0.2%亚硫酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养24h备用；
（3） 固体发酵培养基制备：按玉米粉25%，麸皮30%，米糠25%，豆粕20%，料：水=1:1，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料方盒中，121℃灭菌30min后冷却待用；
（4） 固体菌剂培养：按5-10%接种量接入预先培养好的X1-1种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置37℃恒温培养箱中培养2天，每12h搅拌一次；
（5）干燥及粉碎：将上述发酵完毕的X1-1固体培养物置于55℃烘箱中烘至含水率低于15%，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置干燥、阴凉处或冰箱保鲜层中保藏；
其中，菌剂样品中X1-1 芽孢杆菌的活菌数达150-300亿cfu/克。
5.权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌X1-1在发酵降解玉米蛋白粉中的应用。
6.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌X1-1菌剂在发酵降解玉米蛋白粉中的应用。
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