CN110591932A - 一株控制果蔬采后病害的酵母菌ma及其使用方法 - Google Patents

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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Abstract

本发明公开一株控制果蔬采后病害的酵母菌MA及其使用方法。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17903。该菌株用于果蔬采后病害防治的抑菌谱广、效果稳定。该酵母菌的使用方法为菌株活化，菌体用无菌水配成1×107细胞/mL的菌悬液；将菌悬液喷洒于香蕉及枇杷表面，风干，放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，恒温恒湿贮藏。该酵母可以控制香蕉的炭疽病和枇杷炭疽病，并同时控制香蕉镰刀菌、枇杷尖孢炭疽菌、链格孢、葡萄座腔菌等。

Description

一株控制果蔬采后病害的酵母菌MA及其使用方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株控制果蔬采后病害的酵母菌及其使用方法。
背景技术
果蔬与人类生活息息相关，富含糖类、维生素、淀粉以及有机酸等，但是不易于贮藏，由于采后保鲜不当，引起巨大的经济损失。据统计，每年果蔬采后腐 烂高达约8000万吨，相当于造成经济损失约750亿元，占果蔬产业总值大于30%。其中，真菌性病害引起的腐烂变质是果实采后损失中最严重的因素。目前国内外应用于果蔬采后保鲜大多采用化学杀菌剂，但长期使用化学杀菌剂不仅病原菌易产生抗药性、污染环境，而且也可能危害人类的健康。因此各国相关领域科研工作者一直致力于找寻新型，高效，清洁的生防技术，能够减少以及逐步取代化学杀菌剂的使用。因此，利用拮抗菌进行采后防治以及其广阔的应用前景已迅速发展为研究热点之一。
目前用于生物防治的微生物主要有酵母、土壤放射菌、芽孢杆菌、链霉菌、假单胞菌等。拮抗酵母菌防治果实采后病害是当前已被证明的安全、高效的新技术，且在多个范畴显示出极大利用潜力。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术难题，提供一株用于果蔬采后病害生物防治的抑菌谱广、效果稳定的酵母MA及其制备和使用方法。
上述用于果蔬采后病害生物防治的酵母MA，其分类命名为：Saturnispora diversa MA ，于2019年6月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏；保藏地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号；菌株保藏编号为CGMCC No. 17903。
上述的酵母Saturnispora diversa MA，是从自然发酵的芒果醪液中筛选分离到的，菌株对香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、枇杷尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、链格孢（Alternaria sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、新壳梭孢菌（ Neofusicoccum parvum ），具有明显的抑菌效果。
上述酵母Saturnispora diversa MA应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜。
上述酵母Saturnispora diversa MA应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜按照以下步骤进行：将Saturnispora diversa MA菌悬液喷洒于水果表面，风干，贮藏。
上述酵母菌Saturnispora diversa MA菌悬液的制备方法为，将酵母Saturnispora diversa MA菌株用NYDA培养基活化，挑取单菌落至NYDB液体培养基里，于28℃，180r/min条件下培养8h，8000rpm离心1min收集菌体，用无菌水洗3遍，将菌体用无菌水配制成浓度为1×107细胞/mL的菌悬液。所述NYDA培养基：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL， 121℃灭菌30min；NYDB培养基：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌30min。
进一步的，上述酵母Saturnispora diversa MA应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜，所述水果为枇杷或者香蕉；喷洒菌悬液后的贮藏具体为：放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，密封后，枇杷于20℃，香蕉于28℃，80%HR环境贮藏。
上述酵母Saturnispora diversa MA应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜的方法，能有效延长果蔬贮藏期。
本发明的优点：
(1)本发明所提供的Saturnispora diversa MA为本实验室从芒果发酵液中筛选得到，其对人体无害，安全性高。
(2)本发明所使用的Saturnispora diversa MA抑菌谱广，可以同时控制香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、枇杷尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、链格孢（Alternaria sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）。
(3)本发明所提供的Saturnispora diversa MA在NYDB培养基中生长良好，培养6小时可以进入对数生长期，性状稳定，且单独使用一定浓度该菌悬液便能有效防治多种果蔬采后病害，使用成本低，市场前景广阔。
(4)本发明所提供的Saturnispora diversa MA可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，且不污染环境，社会和生态效益显著。
通过以下实施实例更加详细的说明本发明。以下实施实例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
附图说明
图1Saturnispora diversa MA的菌落形态图。
图2为本发明Saturnispora diversa MA的26S rDNA Dl/D2区核酸序列进化关系图。
图3为Saturnispora diversa MA广谱性效果图。 A&B 香蕉盘长孢菌，第11天抑菌效果图；C&D枇杷胶孢炭疽菌，第11天抑菌效果图；E&F 香蕉镰刀菌，第11天抑菌效果图；G&H链格孢，第11天抑菌效果图；I&J葡萄座腔菌，第11天抑菌效果图；K&L 枇杷尖孢炭疽菌，第4天抑菌效果图；M&N 新壳梭孢菌，第4天抑菌效果图。
图4为Saturnispora diversa MA对不同水果病变直径的影响。 A、香蕉病变直径；B、枇杷病变直径。“*”代表差异显著((P<0.05)。
图5为Saturnispora diversa MA对不同水果炭疽病的抑制效果图。
图6为Saturnispora diversa MA对不同水果贮藏期间腐烂率的影响。A、香蕉贮藏期间腐烂率的变化；B、枇杷贮藏期间腐烂率的变化。“*”“#”代表差异显著((P<0.05)。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1 酵母菌Saturnispora diversa MA的筛选鉴定
1、MA的筛选：
从福州大学校园芒果树上采回来的新鲜芒果，用20vol%酒精浸泡10秒，后用蒸馏水将芒果冲洗三次，完成果皮表面的初步清洗。用果汁机将芒果打成果泥，转入250mL锥形瓶中，盖上无菌透气封口膜，于28℃发酵24小时。发酵完毕后，取发酵液等梯度稀释成100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，各取100μL于NYDA培养基（酵母粉5g，牛肉膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L， 121℃湿热灭菌20min)平板上进行涂布，28℃培养24小时，挑取大小、形态、颜色不同的菌株于NYDA培养基平板上三区划线进行菌株纯化，28℃培养，重复多次，直至得到单菌落为止。挑取纯化后的单菌落，接入NYDB培养基（酵母粉5g，牛肉膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min）中，28℃，180rpm，培养12小时后，与香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）做平板对峙实验，选出具有明显抑菌效果的菌株，命名为MA，并保存于甘油中备用。
2、形态学特征
筛选所得MA, 于NYDB培养基（酵母粉5g，牛肉膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min）活化（28℃，180 rpm）培养12h，在NYDA固体培养基平板（酵母粉5g，牛肉膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L， 121℃湿热灭菌20min)上涂布，28℃培养24h，菌落呈卵圆形、边缘整齐、表面光滑、质地均匀、易挑起（见图1）。
3、分子遗传学鉴定
以通用正向引物 NL1: 5'－GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'和反向引物NL4: 5'－GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'进行PCR扩增筛选菌株的26S rDNA D1/D2区核酸序列（ SEQ IDNO.1），测序结果在NCBI数据库中进行比对，下载同源性高的基因序列。将所有的序列导入MEGA5软件使用Construct/Test Neighbor-Joining Tree法构建系统进化树（见图2），确定筛选到的菌株为Saturnispora diversa MA。
实施例2酵母菌Saturnispora diversa MA抑菌性检测
将活化后的Saturnispora diversa MA按3%的接种量接种到NYDB培养基中，于28℃、180r/min条件下培养8h，1000r/min离心l min，弃上清，无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成浓度为1×107细胞/mL酵母菌Saturnispora diversa MA的菌悬液。
将香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）、香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、枇杷尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、链格孢（Alternaria sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）分别接种到PDA培养基平板上，28℃下培养7-10d，刮取适量孢子，用无菌水配制成浓度为1×105个/mL的孢子悬液。
将30μL 1×107细胞/mL的Saturnispora diversa MA菌悬液接入PDA 平板中央直径为0.6cm的孔中，2h后接入30μL 1×105个/mL的孢子悬液，以无菌水作为对照组。于28℃下培养，观察其生长情况。
结果见图3，图3结果表明：Saturnispora diversa MA可以明显抑制香蕉盘长孢菌、枇杷胶孢炭疽菌、香蕉镰刀菌、链格孢、葡萄座腔菌，实验进行至11天时，未为发现致病菌的菌丝生长。Saturnispora diversa MA对枇杷尖孢炭疽菌、新壳梭孢菌的抑菌效果稍弱，实验进行到第四天时，能观察到致病菌的菌丝。
实施例3酵母菌Saturnispora diversa MA的应用
枇杷及香蕉果实先用20vol%酒精除去果实表面气泡，再用0.5wt%次氯酸钠进行表面消毒，用蒸馏水清洗，于室温下自然风干。在果实赤道部位用打孔器打1个直径为3mm(宽) ×3mm(深)的孔，每孔注30μL的拮抗菌浓度为1×107细胞/mL酵母菌Saturnispora diversa MA的菌悬液，对照水果注入30μL无菌水。2h后，枇杷接种浓度为1×105个/mL的枇杷胶孢炭疽菌孢子悬液30μL，香蕉接种1×105个/mL香蕉盘长孢菌孢子悬液30μL。晾干后将果实装入0.015mm厚的聚乙烯薄膜袋内，置于20℃、80%的相对湿度下贮藏。每个处理组10个水果，实验重复3次。测定其病变直径。检测结果见图4，图4结果表明：A中对照组香蕉第3天开始出现腐烂，但是接种了Saturnispora diversa MA和香蕉盘长孢菌的实验组第7天才开始出现腐烂，并且实验组的病变直径明显小于对照组，说明Saturnispora diversa MA可以在香蕉上有效抑制香蕉盘长孢菌；B中对照组和接种了Saturnispora diversa MA和枇杷胶孢炭疽菌的实验组都在第4天开始出现腐烂，实验观察至13天，实验组的病变直径明显小于对照组，说明Saturnispora diversa MA可以在枇杷上抑制枇杷胶孢炭疽菌，延缓病害进程。枇杷及香蕉果实先用20vol%酒精除去果实表面气泡，再用0.5wt%次氯酸钠进行表面消毒，用清水清洗，于室温下自然风干。用1×107细胞/mL的Saturnispora divers MA喷洒，果面喷湿范围约80%-100%，以无菌水作为对照，以1-甲基环丙烯（1-MCP）熏蒸作为阳性对照。2h后待果面自然晾干，香蕉喷洒香蕉盘长孢菌的孢子 (1×105个/mL) 悬液，枇杷喷洒枇杷胶孢炭疽菌的孢子 (1×105个/mL) 悬液，果面喷湿范围约70%-90%，果实自然晾干，放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，枇杷置于(20±1)℃、80%的湿度下贮藏，香蕉置于(28±1)℃、80%的湿度下贮藏，每隔2 d取样观察保鲜效果，并测定腐烂率。
腐烂率=（坏果/总果）×100%。
Saturnispora diversa MA对不同水果炭疽病的抑制效果见图5。图5结果表明：Saturnispora diversa MA能有效延长香蕉和枇杷的保质期，Saturnispora diversa MA喷洒组香蕉保藏12天才刚开始出现轻微病斑，对照组已有50%出现较重病斑。枇杷保藏至第10天时，对照组约60%出现较严重病斑，Saturnispora diversa MA喷洒组仅有10%出现轻微病斑。
Saturnispora diversa MA对不同水果贮藏期间腐烂率的影响见图6。图6结果表明：对照组的香蕉及枇杷的腐烂率明显大于Saturnispora diversa MA喷洒组，Saturnispora diversa MA喷洒组的香蕉腐烂率大于1-MCP熏蒸组，说明Saturnispora diversa MA能有效降低香蕉保藏期间的腐烂率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一株控制果蔬采后病害的酵母菌MA及其使用方法
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> NL1
<400> 1
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> NL4
<400> 2
ggtccgtgtt tcaagacgg 19
<210> 3
<211> 548
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.1
<400> 3
cccagggggg atgcctcagt agcggcgagt gagcggcaaa agctccactt tgaaagcgtt 60
tcgacgcgtt gtagtgcggt tcagtctttg agtgacggat gactaagtcc cctggaacgg 120
ggtgccatag agggtgagag ccccgtgagt tgtcttttta gctctttaag tctttaccaa 180
agagtcgagt tgtttgggaa tgcagctcta agtgggtggt aaattccatc taaggctaaa 240
taccggcgag agaccgatag cgaacaagta cagtgatgga aagatgaaaa gcactttgaa 300
aagagagtga aacagtacgt gaaattgttg aaagggaagg gtatttggcc cgacatgggt 360
tctgtgcacc gttgcctctt gtaggcggcg ctctgctgga gcctgggcca gcatcagttt 420
tccggcgagg ataagaagtt ttgaaccaca ttgtggggat gagtttgatg ctcgcatggg 480
ggactgagga ctgccgttgt aggatgctgg cataacggcc aaataccgcc cgtcttgaaa 540
cacggacc 548

Claims (8)

1.一株控制果蔬采后病害的酵母菌MA，其特征在于：所述酵母菌MA的分类命名为：Saturnispora diversa MA，于2019年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.17903。
2.根据权利要求1所述的一株控制果蔬采后病害的酵母菌MA，其特征在于：所述酵母菌Saturnispora diversa MA对香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、枇杷尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、链格孢（Alternaria sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）具有抑制作用。
3.如权利要求1所述的一株控制果蔬采后病害的酵母菌MA应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜。
4.根据权利要求3所述的一株控制果蔬采后病害的酵母菌MA应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜，其特征在于：具体应用方法为：将Saturnispora diversa MA菌悬液喷洒于水果表面，风干，贮藏。
5.根据权利要求4所述的一株控制果蔬采后病害的酵母菌MA应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜，其特征在于，所述Saturnispora divers MA的菌悬液的制备方法为：将酵母Saturnispora diversa MA菌株用NYDA培养基活化，挑取单菌落至NYDB液体培养基里，于28℃，180r/min条件下培养8h，8000rpm离心1min收集菌体，用无菌水洗3遍将菌体用无菌水配制成浓度为1×107细胞/mL的菌悬液。
6.根据权利要求5所述的一株控制果蔬采后病害的酵母菌MA应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜，其特征在于：所述NYDA培养基为：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL， 121℃灭菌30min；NYDB培养基为：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌30min。
7.根据权利要求5所述的一株控制果蔬采后病害的酵母菌MA应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜，其特征在于：所述水果为枇杷或者香蕉；喷洒菌悬液后的贮藏具体为：放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，密封后，枇杷于20℃，香蕉于28℃，80%HR环境贮藏。
8.根据权利要求5所述的一株控制果蔬采后病害的酵母菌MA应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜，其特征在于：上述酵母MA应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜能有效延长果蔬贮藏期。
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