CN113943664A - 一株控制香蕉采后病害的酵母菌p4及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一株用于香蕉采后病害的酵母菌P4及其使用方法。所述酵母菌P4在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.22561。所述酵母菌P4的使用方法为：菌株活化，菌体用无菌水配成1×108 cells/mL的菌悬液；将菌悬液喷洒于香蕉表面，自然晾干后，放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，恒温恒湿贮藏。所述酵母菌P4可以控制香蕉炭疽病，同时该菌株抑菌谱较广，可以控制黄曲霉、拟盘多毛孢属、枇杷胶孢炭疽菌、香蕉镰刀菌等。

Description

一株控制香蕉采后病害的酵母菌P4及其使用方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株控制香蕉采后病害的酵母菌P4及其使用方法。
背景技术
香蕉（Musa nana Lour）主要种植于亚热带地区，如我国的福建、广东和广西等地，其市场前景好，经济效益高，在促进亚热带地区的农业经济中有着十分重要的地位。我国作为世界香蕉生产的第三大国家，2019年产量达到1166万吨。作为世界四大水果之一，香蕉因其果肉软糯香甜，广受人们的喜爱。同时香蕉极具药用价值，其果肉富含类黄酮和维生素等具有抗氧化活性的物质，能够减少自由基堆积，延缓衰老和预防心血管疾病，香蕉皮还能用于治疗如烧伤、腹泻、糖尿病等疾病。但香蕉在采收和贮藏的过程中容易遭受病原菌的侵染，其中炭疽病菌主要危害香蕉果实，导致品质劣变，经济损失严重。因此，采取一定的保鲜措施延长香蕉果实的货架期，对减少经济损失、增加果农收入是当重之急。目前国内外应用于香蕉采后保鲜大多采用化学杀菌剂，但长期使用化学杀菌剂不仅易导致病原菌产生抗药性，还会导致污染环境等问题，而且化学杀菌剂也可能危害人类的健康。因此各国相关领域科研工作者一直致力于找寻新型、高效、清洁的生防技术，能够减少以及逐步取代化学杀菌剂的使用，利用生防菌进行采后防治以及其广阔的应用前景已迅速发展为一个研究热点之一。在目前研究的生物防治手段中，生防酵母的优势更加明显，相对于其他生物防治剂，酵母具备生长速度快、营养依赖性、抗逆性强等特点，因此，生防酵母作为一种生物防治剂防治果实采后病害是一种有效的手段。
本发明中的Wickerhamomyces pijperi 酵母菌株P4为本实验室从枇杷发酵液中筛选得到，其对人体无害，安全性高。研究证明，其能显著抑制香蕉炭疽病菌、黄曲霉、拟盘多毛孢属、枇杷胶孢炭疽菌、香蕉镰刀菌的生长，并能够明显降低香蕉采后炭疽病害的发生，能为更好地研究利用该菌株防治果蔬病害提供依据，并为实现微生物杀菌剂的工业化应用奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术难题，提供一株用于香蕉采后病害生物防治的抑菌谱广、效果稳定的酵母P4及其制备和使用方法。
上述用于香蕉采后病害生物防治的酵母P4，分类命名为：皮杰普氏威克汉姆酵母Wickerhamomyces pijperi P4 ，于2021年5月18日在保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），菌株保藏编号为CGMCC No.22561。
上述的酵母Wickerhamomyces pijperi P4，是从新鲜的无病害的枇杷果实中筛选分离到的，菌株对香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、黄曲霉属（Aspergillus flavus具有明显的抑菌效果。
上述酵母Wickerhamomyces pijperi P4应用于香蕉采后病害防治和贮藏保鲜。
上述酵母Wickerhamomyces pijperi P4应用于香蕉采后病害防治和贮藏保鲜按照以下步骤进行：将Wickerhamomyces pijperi P4菌悬液喷洒于香蕉表面，风干，贮藏。
上述酵母Wickerhamomyces pijperi P4菌悬液的制备方法为：将酵母Wickerhamomyces pijperi P4菌株用NYDA培养基活化，挑取单菌落至NYDB培养基里，于28℃，180r/min条件下培养8 h，5000 rpm离心1min收集菌体，用无菌水洗3遍，将菌体用无菌水配制成浓度为1×108 cells/mL的菌悬液。所述NYDA培养基：酵母膏5 g，牛肉浸膏8 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，121℃灭菌30 min；NYDB培养基：酵母膏5 g，牛肉浸膏8 g，葡萄糖10 g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌30 min。
上述酵母Wickerhamomyces pijperi P4应用于香蕉采后病害防治和贮藏保鲜，所述喷洒菌悬液后的贮藏条件具体为：放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，密封后，于28℃，80%相对湿度环境贮藏。
上述酵母Wickerhamomyces pijperi P4应用于香蕉采后病害防治和贮藏保鲜的方法，能有效延长果蔬贮藏期。
本发明的优点：
(1)本发明所提供的Wickerhamomyces pijperi 菌株P4为本实验室从新鲜的无病害的枇杷果实中筛选得到，其对人体无害，安全性高。
(2)本发明所使用的Wickerhamomyces pijperi P4抑菌谱广，可以同时控制香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、黄曲霉属（Aspergillus flavus）等致病菌的生长。
(3)本发明所提供的Wickerhamomyces pijperi P4在NYDB培养基中生长良好，培养10小时可以进入稳定生长期，性状稳定，且使用浓度为1×108 cells/mL菌悬液就能有效防治香蕉采后病害，使用成本低，市场前景广阔。
(4)本发明所提供的Wickerhamomyces pijperi P4可以替代化学杀菌剂，防治香蕉果实采后病害，减少使用化学杀菌剂造成的农药残留、污染环境、危害人体健康等不良后果。
通过以下实施实例更加详细地说明本发明。以下实施实例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
附图说明
图1为Wickerhamomyces pijperi P4的菌落形态图。
图2为Wickerhamomyces pijperi P4在显微镜400x放大倍率下的菌体形态图。
图3为Wickerhamomyces pijperi P4的26S rDNA Dl/D2区核酸序列进化关系图。
图4为Wickerhamomyces pijperi P4广谱性效果图。A&B 香蕉炭疽病菌，第6天抑菌效果图；C&D 枇杷胶孢炭疽菌，第6天抑菌效果图；E&F 香蕉镰刀菌，第6天抑菌效果图；G&H葡萄座腔菌，第6天抑菌效果图；I&J 拟盘多毛孢属，第6天抑菌效果图；K&L 黄曲霉属，第6天抑菌效果图。
图5为Wickerhamomyces pijperi P4对香蕉果实炭疽病的生防效果图。
图6为香蕉果实的病情指数。对照组：无菌水；P4：1×108 cells/mL的Wickerhamomyces pijperi P4菌悬液；阳性对照组：1-MCP（1-甲基环丙烯）。“*”“#”代表差异显著（P<0.05）。
图7为香蕉果实的腐烂率。对照组：无菌水；P4：1×108 cells/mL的Wickerhamomyces pijperi P4菌悬液；阳性对照组：1-MCP（1-甲基环丙烯）。“*”“#”代表差异显著（P<0.05）。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的培养基及其配制方法如下：
NYDA培养基：酵母粉5 g，牛肉膏8 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1000mL，121℃湿热灭菌30min；
NYDB培养基：酵母粉5 g，牛肉膏8 g，葡萄糖10 g，蒸馏水定容至1000 mL，121℃灭菌30 min。
下述实施例中所用到的病原菌：香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）、黄曲霉属（Aspergillus flavus），公众可从腐烂的水果表面获得，以重复本申请实验。
实施例1
1.P4的筛选
采摘自福建省福州市芋坑村的新鲜的无病害的枇杷果实，对其进行预处理（先用75%（V/W）酒精浸泡30 s，再用0.5%(V/W）次氯酸钠浸泡10 s，最后用蒸馏水清洗3次），用无菌手术刀将预处理后的枇杷果实样品去核，取果肉和果皮在无菌研钵中捣烂后，加无菌蒸馏水100 mL混匀，用无菌蒸馏水等梯度稀释成100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，然后各取100 μL于NYDA培养基平板上进行涂布，28℃培养24小时，挑取大小、形态、颜色不同的菌株于NYDA培养基平板上三区划线进行菌株纯化，28℃培养，重复多次，直至得到单菌落为止。挑取纯化后的单菌落，接入NYDB培养基中，28℃，180 rpm，培养12 h后，与香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）做平板对峙实验，选出具有明显抑菌效果的菌株，命名为P4，并用60%（V/W）甘油保藏于-80℃超低温冰箱中备用。
2.P4的形态学特征
从超低温冰箱取出甘油贮藏的Wickerhamomyces pijperi P4，28℃快速解冻，于NYDB培养基活化（28℃，180 rpm）培养12 h，然后在NYDA培养基平板上三区划线，28℃培养24 h，观察培养基上的菌落形态，并在显微镜下观察菌体形态。如图1和图2所示，P4菌落为乳白色不透明、边缘光滑整齐、质地湿润、易挑起，菌体形态为卵圆形、出芽生殖。
3.分子遗传学鉴定P4
以通用正向引物 NL1（SEQ ID No.1）：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’和反向引物NL4（SEQ ID No.2）：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’对P4菌株的26S rDNA D1/D2区核酸序列（SEQ ID No.3）进行PCR扩增，测序结果导入NCBI数据库中进行比对，下载同源性高的基因序列，利用MEGA5软件构建系统进化树（见图3），确定筛选到的P4菌株为皮杰普氏威克汉姆酵母（Wickerhamomyces pijperi）。
实施例2
将活化后的Wickerhamomyces pijperi P4按2% 的接种量接种到5 mL NYDB培养基中（活化方法同实施例1），于28℃、180 r/min条件下培养8 h，5000 r/min离心l min，弃上清，无菌水反复清洗菌体3次，然后利用血球计数板，用无菌水制备浓度为1×108 cells/mL的Wickerhamomyces pijperi P4菌悬液。
将香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、黄曲霉属（Aspergillus flavus）分别接种到PDA培养基平板上，28℃下培养7-10 d，刮取适量孢子，用无菌水配制成浓度为1×105 spores/mL的孢子悬液。
取30 μL 1×108 cells/mL的Wickerhamomyces pijperi P4菌悬液接入PDA 平板中央直径为0.9 cm的孔中，平板正置2 h后接入1×105 spores/mL的孢子悬液30 μL，以无菌水作为对照组。于28℃下培养，观察其生长情况。
结果见图4，结果表明：Wickerhamomyces pijperi P4可以明显抑制香蕉炭疽病菌、枇杷胶孢炭疽菌、香蕉镰刀菌、拟盘多毛孢属和黄曲霉的生长，实验进行至6天时，未见PDA平板打孔部位致病菌的菌丝生长，Wickerhamomyces pijperi P4对葡萄座腔菌的抑菌效果稍弱，实验进行到第6天时，明显观察到致病菌的菌丝生长。
实施例3
香蕉果实先用20%（V/W）酒精除去果实表面气泡，再用0.5%（V/W）次氯酸钠进行表面消毒，最后用蒸馏水清洗2遍，于室温下自然晾干。用1×108 cells/mL的Wickerhamomyces pijperi P4菌悬液喷洒香蕉果实（喷洒范围为果实表面80%-100%湿润），以无菌水作为对照，以1-甲基环丙烯（1-MCP）作为阳性对照（按照1.2g/m3的用药量密闭熏蒸），待香蕉果实自然晾干后接种1×105 spores/mL炭疽病菌分生孢子悬浮液（接种方式同Wickerhamomyces pijperi P4），自然晾干，放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，置于(28±1)℃、80%相对湿度下贮藏，每隔2 d取样观察香蕉果实保鲜效果，并测定病情指数和腐烂率。测定时，每组选取20个香蕉果实，计算所测定香蕉果实的腐烂率和病情指数。
腐烂率=（坏果数/总果数）×100%。
病情指数分为5级。根据病斑面积占据整个果实的果皮面积的百分比进行分级：0级（无病斑）；1级（病斑面积占据整个果实的果皮面积的百分比小于25%）；2级（病斑面积占据整个果实的果皮面积的百分比为25%~50%）；3级（病斑面积占据整个果实的果皮面积的百分比为50%~75%）；4级（病斑面积占据整个果实的果皮面积的百分比大于75%）。每组30个香蕉，隔天观察并记录结果。计算公式：病情指数=[∑(病害级别×该级别果实数)/（总果实个数×最高病害级别）]×100%。
Wickerhamomyces pijperi P4对香蕉采后的生防效果见图5，结果表明：在第8 d时对照组香蕉果实已经出现明显的炭疽病病斑，在第10 d时，对照组香蕉果实表面病斑覆盖面积变大，果实腐烂严重；Wickerhamomyces pijperi P4处理组在第10 d才开始出现病斑，且病斑面积小于10%，表明Wickerhamomyces pijperi P4能够延长香蕉果实的贮藏期，减少病害的发生。
香蕉果实病情指数见图6所示，结果表明：对照组香蕉果实的病情指数在第6-10 d之间迅速增加，第10 d的病情指数达到81.4%，相对于对照组，Wickerhamomyces pijperi P4处理组病情指数的增长速度均小于对照组，表明Wickerhamomyces pijperi P4能有效降低香蕉保藏期间的病情指数。
香蕉果实腐烂率见图7所示，结果表明：对照组果实从第6 d开始腐烂，而Wickerhamomyces pijperi P4处理组从第8 d开始腐烂，且在贮藏时间内，Wickerhamomyces pijperi P4处理组的腐烂率均显著低于对照组，表明Wickerhamomyces pijperi P4能有效降低香蕉果实的腐烂率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一株控制香蕉采后病害的酵母菌P4及其使用方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtccgtgtt tcaagacgg 19
<210> 3
<211> 581
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccaaagtatt gcctcagtac ggcgagtgaa gcggcaagag ctcaaatttg aaatctggta 60
ctttcagtgc ccgagttgta atttgaagat tgtactctgg agttggccct tatctatgtt 120
ccttggaaca ggacgtcaca gagggtgaga atcccgtgcg atggggagcc cgactccatg 180
tagagtgctc tcgaagagtc gagttgtttg ggaatgcagc tctaagtggg tggtaaattc 240
catctaaagc taaatattgg cgagagaccg atagcgaaca agtacagtga tggaaagatg 300
aaaagaactt tgaaaagaga gtgaaaaagt acgtgaaatt gttgaaaggg aaggttatta 360
gatcagactt ggtgtttggc gatattcagt ctctcgtaga ctgttcactc gcctttcgct 420
gggccagcat cggtttgggc ggcaggataa tggctgttga acgtggcttc tccggaagtg 480
ttatagcttc agctgatact gcctgcctag accgaggact gcggcttctg cctaggatgc 540
tggcgtaatg atctaatatc gcccgtcttg aaacacggac c 581

Claims (8)

1.一株控制香蕉采后病害的酵母菌P4，其特征在于：所述酵母菌P4的分类命名为皮杰普氏威克汉姆酵母Wickerhamomyces pijperi P4，于2021年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 22561。
2.根据权利要求1所述的一株控制香蕉采后病害的酵母菌P4，其特征在于：所述酵母菌P4对香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、黄曲霉属（Aspergillus flavus）具有抑制作用。
3.如权利要求1所述的一株控制香蕉采后病害的酵母菌P4应用于香蕉采后病害防治和贮藏保鲜。
4.根据权利要求3所述的一株控制香蕉采后病害的酵母菌P4应用于香蕉采后病害防治和贮藏保鲜，其特征在于：具体应用方法为：将Wickerhamomyces pijperi P4菌悬液喷洒于香蕉表面，风干，贮藏。
5.根据权利要求4所述的一株控制香蕉采后病害的酵母菌P4应用于香蕉采后病害防治和贮藏保鲜，其特征在于：所述Wickerhamomyces pijperi P4菌悬液的制备方法为：将Wickerhamomyces pijperi P4菌株用NYDA培养基活化，挑取单菌落至NYDB液体培养基里，于28℃，180 r/min条件下培养8h，5000rpm离心1min收集菌体，用无菌水洗3遍，将菌体用无菌水配制成浓度为1×108 cells/mL的菌悬液。
6.根据权利要求5所述的一株控制香蕉采后病害的酵母菌P4应用于香蕉采后病害防治和贮藏保鲜，其特征在于：所述NYDA培养基为：酵母膏5 g，牛肉浸膏8 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL， 121℃灭菌30 min；NYDB培养基为：酵母膏5 g，牛肉浸膏8 g，葡萄糖10 g，蒸馏水1000 mL，121℃灭菌30 min。
7.根据权利要求4所述的一株控制香蕉采后病害的酵母菌P4应用于香蕉采后病害防治和贮藏保鲜，其特征在于：香蕉喷洒菌悬液后的贮藏具体为：放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，密封后，28℃，80%相对湿度贮藏。
8.根据权利要求4所述的一株控制香蕉采后病害的酵母菌P4应用于香蕉采后病害防治和贮藏保鲜，其特征在于：所述Wickerhamomyces pijperi P4应用于香蕉采后病害防治和贮藏保鲜能有效延长香蕉果实贮藏期。
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