CN109715784A - 细菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能够结合至A、B和/或O血型抗原或是酸和/或胆汁耐受性的细菌或其代谢物,其在益生菌组合物和食物产品中的用途及其选择方法。本发明还涉及所述细菌和代谢物用于预防和/或治疗胃肠道疾病的用途。
Description
技术领域
本发明涉及新颖细菌及其代谢物,其在益生菌组合物和食物产品中的用途、选择益生菌的方法以及个性化益生菌组合物或食物产品的方法。本发明还涉及所述细菌、代谢物和组合物用于预防和/或治疗胃肠道疾病的用途。
背景技术
人体被无数的微生物所定殖,这些微生物代表了超过1000种细菌物种。微生物群的组成和密度对每个身体部位都是特定的。大多数细菌生命体存在于胃肠道(GIT)中,特别是在大肠的肠腔中,其中存在两个群体,即肠腔和黏膜相关的群体,它们彼此之间存在差异。微生物群在人类健康中起着重要的作用。微生物群促进肠组织成熟、宿主营养、病原体耐受性、上皮细胞增殖、宿主能量代谢和免疫应答。GIT微生物群的组成和多样性的改变与若干疾病相关联,例如炎症性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、类风湿性关节炎、特应性湿疹、哮喘和1型糖尿病。
成人的微生物群随着时间的推移是相当稳定的,且在个体中是独特的。同卵双胞胎中优势微生物群体的相似性高于无亲缘关系的受试者,说明宿主遗传因素对微生物群组成有影响。一些动物研究表明,主要组织相容性复合物参与肠道微生物群的遗传调节。然而,人们对究竟是哪些基因或其他因素决定或调节了微生物组成谱知之甚少。
覆盖肠道上皮的黏膜层作为宿主防御的第一层起着重要的作用,但它也使肠微生物群与宿主之间能够发生接触。黏液主要由黏蛋白、含有蛋白质核心的大型糖蛋白和附着的低聚糖组成。尽管黏液层阻止了细菌与结肠上皮细胞的直接接触,但它为GIT细菌提供了黏附位点,因此在细菌定殖中起着重要作用。分泌的黏液除了为细菌提供黏附位点外,还提供了内源性底物。在碳水化合物来源有限的情况下,黏液可能是主要的营养来源。
血型抗原附着在红细胞膜的各种成分上,在红细胞上表达的抗原决定个体的血型。主要的两种血型称为ABO(血型为A、B、AB和O)和Rh(血型为Rh D-阳性或Rh D-阴性)。ABO血型抗原在个体的分泌型(约占西方人群的80%)黏液中表达。ABO抗原的表达是位点特异性的。例如,在GIT中,包括ABO血型抗原在内的岩藻糖多糖的表达向肠的远部减少。一些微生物,例如幽门螺杆菌和一些其他致病菌和病毒,已经被证明使用ABO血型抗原作为黏附受体(Boren等人1993,Imberty和Varrot 2008)。ABO抗原结合能力也被报道用于乳杆菌属物种,后者倾向于以菌株特定的方式黏附(Uchida等人2006)。例如,双歧杆菌和多形拟杆菌也能够特异性利用血型抗原,例如ABO抗原的多糖结构(Martens等人2008、Xiao等人2010)。个体ABO血型的状态也会影响宿主微生物群的相对比例(等人2012)。
许多目前可商购的益生菌补充剂和微生物群调节产品对于在促进每个个体所希望的健康效果方面是无效的,而且效果通常因人而异。因此,对能够更有效地介导健康效果的更具特异性的或个人定制的产品存在持续需求。
发明内容
本发明基于发明人的以下惊人发现:某些菌株在体外对ABO血型抗原的一种或多种显示增强的黏附性。这一发现使选择ABO血型特异性细菌用于益生菌组合物并治疗或预防胃肠道疾病成为可能。
尽管不希望受理论的束缚,据信由于ABO血型的多糖结构在黏膜中很丰富,并作为细菌黏附位点和营养来源,所以益生菌与一种或多种ABO抗原的更强的结合将通过增强所述益生菌与黏膜的相互作用改善其在胃肠道的定殖。益生菌还可以显示出通过阻断某些也与ABO抗原结合的致病微生物的黏附和侵袭而增强的健康效果。附着在ABO抗原上的益生菌还可以通过提供宿主细胞与益生菌之间更紧密和更持久的接触来增强益生菌的应答。当益生菌定殖得更紧密且更持久时,可进一步使宿主更容易获得益生菌产生的任何有益代谢物。
诸位发明人进一步证明某些益生菌对酸和/或胆汁有更强的耐受性。这些特性可能有助于细菌或其代谢物在胃和胃肠道的条件下生存,因此是对益生菌有利的特性。如果该菌株在酸奶等产品中发酵,那么酸耐受性也可能是有益的。
因此,本发明提供了一种细菌或其代谢物,其特征在于:
a)与卷曲乳杆菌LMG18199相比,A抗原的平均黏附率超过100%;和/或
b)与卷曲乳杆菌LMG18199相比,B抗原的平均黏附率超过100%;和/或
c)与卷曲乳杆菌LMG18199相比,O抗原的平均黏附率超过100%;和/或
d)如在酸耐受性测定中定义的,当在pH 2.5测量1.5小时时,以对数变化表示的平均酸耐受性大于-2.6;和/或
e)如在胆汁耐受性测定中定义的,以在0.9%脱水新鲜胆汁中的生长与无胆汁MRS中的生长的百分比表示的平均胆汁耐受性超过40%。
本发明的细菌能以DSM 32111、DSM 32108、DSM 32107、DSM 32098、DSM 32104、DSM32112、DSM 32109、DSM 32105、DSM 32110、DSM 32103、DSM 32099、DSM 32106、DSM 32097、DSM 32114、DSM 32115或其突变体、变体和/或子代保藏。
根据本发明的另一个方面,提供了一种益生菌组合物,该组合物包含根据本发明的细菌或其代谢物以及合适的载体。
本发明的益生菌组合物可以包含根据本发明的2、3、4、5或6种细菌菌株或其代谢物的组合,任选地与一种或多种另外的细菌菌株组合。
该益生菌组合物可进一步包含益生元组分。
本发明还提供了生产本发明的益生菌组合物的方法,该方法包括将所选的细菌或其代谢物与合适的载体组合。
本发明进一步提供了包含根据本发明的益生菌组合物的食物产品。
根据本发明的另一个方面,提供了选择细菌或其代谢物的方法,该方法包括:
a)将A抗原、B抗原、O抗原或其组合与一种或多种测试细菌混合;
b)将A抗原、B抗原、O抗原或其组合与一种或多种罗伊氏乳杆菌RC-14对照细菌混合;
c)孵育步骤a)和步骤b)的所述混合物;
d)对比所述测试细菌和罗伊氏乳杆菌RC-14与所述A抗原、B抗原、O抗原或其组合的黏附亲和力;以及
e)选择相比于罗伊氏乳杆菌RC-14与所述A抗原、B抗原、O抗原或其组合具有更高的黏附亲和力的细菌。
在一个实施例中,步骤(b)中的混合物在单独小瓶中孵育。
在另一个实施例中,该方法是基于荧光的方法。
在另外的实施例中,选择如下细菌,所述细菌具有:
a)A抗原的平均荧光黏附强度超过549;
b)B抗原的平均荧光黏附强度超过519;和/或
c)O抗原的平均荧光黏附强度超过746。
本发明仅一步提供了通过本发明的方法选择的细菌或其代谢物。
在另一方面,本发明提供了本发明的细菌或代谢物或通过本发明的方法选择的细菌或代谢物、或本发明的益生菌组合物用于制造预防和/或治疗胃肠道疾病的制剂的用途。
本发明还提供了本发明的细菌或代谢物或通过本发明的方法选择的细菌或代谢物、或本发明的益生菌组合物,用于预防和/或治疗胃肠道疾病。
在另一个方面,本发明提供了预防和/或治疗胃肠道疾病的方法,该方法包括给予受试者药学有效量的根据本发明的细菌或其代谢物或通过本发明的方法选择的细菌或其代谢物,或本发明的益生菌组合物。
具体实施方式
除非另外定义,本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典],第20版,John Wiley and Sons[约翰威利父子公司],纽约(1994),以及Hale和Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],纽约州(1991)为技术人员提供了本披露中所使用的许多术语的通用词典。
本公开并不受本文披露的示例性方法和材料的限制,并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开的实施例的实践或测试。数值范围包括限定范围的数值在内。
本文提供的标题并不是对本公开的各个方面或实施例的限制,这些方面或实施例可以通过将本说明书作为一个整体来参考而得到。因此,把说明书作为一个整体参考时,以下即将定义的术语得以更全面地定义。
术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施例之前,应理解本公开并不限于所描述的具体实施例,因为这些实施例当然可以变化。还应当理解,本文使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的,而并不意图是限制性的,因为本公开的范围仅由所附权利要求限定。
在提供数值范围的情况中,应理解,该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限的个位的十分之一,除非上下文另有清楚规定)也被具体披露。在所陈述的范围中的任何规定值或中间值与所陈述的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围,被涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中,而且其中任一个、没有一个或两个极限值被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开中,但依据所陈述的范围中的任何被具体排除的极限值而定。在所陈述的范围包含极限值的一个或两个的情况下,将那些所包含的极限值的一个或两个排除在外的范围也包含在本公开中。
必须注意,除非上下文另外明确指示,否则如本文和所附权利要求中所使用,单数形式“一个/一种(a/an)”和“该”包括复数指示物。
本文讨论的出版物只是针对它们在本申请的提交日之前的公开而提供。本文中的内容都不应理解为承认此类出版物构成所附权利要求书中的现有技术。
应该理解的是,在以下情况下,与本发明的一个广泛方面相关的所述优选实施例同样适用于本文所述的本发明的其他广泛方面相关的所述优选实施例的每一个。进一步应当理解,除非上下文中另外指出,否则本文所述的优选实施例可以被组合。
如本文所使用的,术语“细菌(bacterium)”或“细菌的(bacterial)”是指任何细菌种类、菌株或其组合,且不限于目前公认的益生菌。然而,本发明使用的细菌菌株是适合人类和/或动物消费的菌株。本领域技术人员将容易地知道来自本文所述的属中的特定物种和/或菌株,其用于食物和/或农业工业中并且其通常被认为适合于人类和/或动物消费。此类细菌菌株典型地是非致病性的,并且通常认为对于人类使用是安全的(例如GRAS)。
术语“细菌”一词通常用来指整个细菌,例如整个活的细菌。
适用于本发明的细菌包括但不限于双歧杆菌属、短杆菌属、丙酸杆菌属、乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、小球菌属、明串珠菌属和/或酒球菌属。
在一个实施例中,该细菌属于乳杆菌属。合适的乳杆菌菌株包括:嗜酸乳杆菌、噬淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、短乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、阴道乳杆菌(L.vaginalis)、弯曲乳杆菌、保加利亚德氏乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、詹氏乳杆菌、黏膜乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌和瘤胃乳杆菌。
在另外的方面,本发明还提供了新颖的细菌菌株DGCC11884、DGCC11864、DGCC11860、DGCC11873、DGCC11852、DGCC11853、DGCC11865、DGCC1925、DGCC11866、DGCC5111、DGCC11854、DGCC11858、DGCC11887、DGCC11862和DGCC11881。这些菌株已经由杜邦营养生物科学公司(兰格布罗盖德1,邮政信箱17,DK-1001,哥本哈根K)根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2015年7月29日保藏于莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(布伦瑞克英豪丰大街7B,邮编D-38124(Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)),登录号DSM 32111、DSM 32108、DSM32107、DSM 32098、DSM 32104、DSM 32112、DSM 32109、DSM 32105、DSM 32110、DSM 32103、DSM 32099、DSM 32106、DSM 32097、DSM 32114、DSM 32115。
我们特此确认保藏人已授权本申请人在本申请中参考这些保藏的生物材料,并且无保留且不可反悔地同意其保藏的生物材料对公众开放。
本发明进一步提供了所保藏的细菌菌株的突变体、变体和/或子代。
如本文所使用的,术语“突变体”是指由亲代(即保藏)菌株的修饰而产生的任何微生物。例如,突变体可能是由对保藏的菌株进行基因修饰而产生的微生物。
如本文所使用的,术语“变体”是指来源于亲代(即保藏菌株)的天然存在的微生物。例如,变体可能是适应特定细胞培养条件而产生的微生物。
如本文所使用的,术语“子代”意指由任何一种保藏菌株繁殖或增殖而产生的任何微生物。因此,“子代”意指任何一种保藏菌株的任何直系后代。因此,子代菌株本身可以被识别为与亲代(即保藏)菌株相同的菌株。对于本领域技术人员显而易见的是,由于无性繁殖的过程,子代菌株在基因上几乎与亲代菌株完全相同。因此,在一个实施例中,子代可以在基因上与亲代相同,并可被认为是亲代菌株的“克隆”。可替代地,子代可以实质上在基因上与亲代菌株完全相同。
在全长细菌基因组中,突变体、变体或子代与其亲代菌株相比至少具有90%、95%、98%、99%、99.5%或99.9%的序列同一性。此外,突变体、变体或子代将保留与保藏的亲代菌株相同的表型,例如,突变体或变体可能显示出与亲代菌株相同或等效的体外A、B和/或O血型抗原黏附水平。
如本文中所使用的术语“代谢物”是指在益生菌产品的制造和储存期间以及在哺乳动物中的胃肠道转运期间,细菌的生长、生存、持续、转运或存在期间,作为细菌代谢的结果,由细菌产生或修饰的所有分子。实例包括所有有机酸、无机酸、碱、蛋白质和肽、酶和辅酶、氨基酸和核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、糖脂、维生素、所有生物活性化合物、含有无机组分的代谢物、以及所有小分子,例如亚硝酸分子或含有亚硫酸的分子。
一种或多种代谢物典型地从细胞培养的上清液中获得,其中将细菌细胞从上清液中除去。在一个实施例中,细胞可以在厌氧条件下在37℃下在MRS培养基中生长6到24小时。根据进一步的实施例,细菌细胞培养可生长到细胞密度至少约OD6000.5、1.0、1.5、2.0、2.5或3.0,例如从1.5到2.5OD600。细胞可适当地通过离心或通过过滤除去。显而易见的是,上清液可以直接用于本发明的制剂中,或者在使用前可以通过任何合适的方法从上清液中分离出一种或多种代谢物。
本发明中适用的代谢物包括但不限于来自上述提及的细菌的任一种的代谢物。
根据本发明,该细菌或其代谢物的特征在于参照对照菌株,其与特定ABO血型抗原的黏附。与抗原的黏附性可通过将细菌或其代谢物与抗原混合来测量,并根据任何合适的测试或测定来测量黏附性。在一个实施例中,该方法是基于荧光的方法。例如,可以将血型抗原生物素化,并与待测试的细菌样品组合,然后转移到涂有链霉素的平板上,并用例如荧光染料等合适的染料检测附着的细菌。抗原可与任何固定的基质结合进行亲和结合测定,细菌与固定的基质结合可使用合适的抗体、荧光染色剂或比色染色剂检测或通过使用例如放射性标记等任何标记技术对细菌进行标记检测。也可以反过来完成,通过将细菌成分附着在固定的基质上,以及通过研究血型抗原是否可以结合。
根据本发明的一个方面,将抗原黏附与卷曲乳杆菌LMG18199(可获得自BCCM/LMG菌种保藏中心)进行比较。根据本发明的另一个方面,将抗原黏附与罗伊氏乳杆菌RC-14(可获得自丹麦克里斯蒂安·汉森公司(Chr.Hansen))进行比较。
根据本发明的另一个方面,所述细菌或其代谢物是根据其对胆汁和/或酸的耐受性而选择的。这些特性可能有助于细菌或其代谢物在胃和胃肠道的条件下生存,因此是对益生菌有利的特性。
任何合适的胆汁耐受性测定可用于确定平均胆汁耐受性。在一个实施例中,胆汁抗性测定包括在培养基(例如MRS)中孵育菌株培养物,所述培养基含有定义量的脱水新鲜胆汁(如牛胆汁,可由来自BD的品牌名DifcoTM获得),例如0.9%或0.3%在37℃下在厌氧条件下孵育24小时。孵育前后测定生长情况,胆汁耐受性结果用含胆汁生长(OD)与不含胆汁生长的百分比表示。
任何合适的酸耐受性测定可用于确定平均酸耐受性。在一个实施例中,酸耐受性测定包括在37℃下在合适的培养基(例如PBS)中在中性pH(即pH 7.2)水平和在一个比较酸性pH(例如pH 2.5或pH 3.5)孵育细菌细胞至少90分钟。十倍稀释系列生长于MRS琼脂,并且在厌氧条件下在37℃下孵育48h后菌落计数。酸耐受性结果表示为暴露在酸性条件下后与中性pH相比CFU的生长对数减少。
在优选的实施例中,该细菌或其代谢物的特征在于参照对照菌株,其与特定ABO血型抗原的黏附,以及其酸和/或胆汁耐受性。因此,本发明提供了一种细菌或其代谢物,其特征在于:
a)与卷曲乳杆菌LMG18199相比,A、B和/或O抗原的平均黏附率超过100%;以及
b)如在酸耐受性测定中定义的,在pH 2.5测量1.5小时时,以对数变化表示的平均酸耐受性大于-2.6,和/或如在胆汁耐受性测定中定义的,以在0.9%脱水新鲜胆汁中的生长与无胆汁MRS中的生长的百分比表示的平均胆汁耐受性超过40%。
本发明进一步提供了益生菌组合物,其包含根据本发明方法选择的一种或多种细菌菌株。该组合物可包含单个菌株,或本发明的2、3、4、5、6、7、8、9或10种菌株的组合。该益生菌组合物可进一步包含另外的菌株,例如可商购的益生菌细菌菌株。
根据一个实施例,本发明的益生菌组合物还包含一种或多种另外的细菌菌株。
在一些实施例中,另外的微生物可以是来自以下一个或多个属的细菌:乳球菌属、链球菌属、小球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、短杆菌属和漫游球菌属。在一个优选的实施例中,至少一种另外的益生菌微生物选自乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、双歧杆菌属和酵母属(Saccharomyces)。
在优选的实施例中,另外的益生菌微生物是细菌,优选益生乳酸菌和/或益生双歧杆菌。在一个实施例中,优选的另外的微生物来自乳杆菌属或双歧杆菌属或其混合物。合适地,微生物可以是来自物种嗜酸乳杆菌、弯曲乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸双歧杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌的菌株。在一个实施例中,优选地,微生物可以是来自嗜酸乳杆菌、弯曲乳杆菌、唾液乳杆菌和/或乳酸双歧杆菌的菌株。
双歧杆菌可以是任何具有益生菌效应的双歧杆菌,典型地使用属于动物双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌和青春双岐杆菌物种的菌株。
乳酸菌可以是下列任何一种:嗜酸乳杆菌、噬淀粉乳杆菌(Lactobacillisamylovorus)、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、和唾液乳杆菌。
根据一个实施例,本发明的益生菌组合物进一步包括一种或多种,例如2、3、4或5种以下可商购的菌株的组合:嗜酸乳杆菌NCFM;乳酸双歧杆菌BL-04;副干酪乳杆菌LPC37;乳酸双歧杆菌HN019、和/或乳酸双歧杆菌Bi-07。
如本文所使用的,术语“益生菌”是指活微生物,如果给予足够的量,对接受者的健康有益。它们适合人类消费,因此无致病性且无毒性。这些益生菌菌株通常具有通过消化道上部存活的能力。益生菌典型地一方面经由与消化道中的驻留菌群的生态相互作用以及另一方面经由“GALT”(肠道相关淋巴组织)以积极的方式影响免疫系统的能力对健康行使有益效果。当给予足够数量的益生菌时,它们有能力在肠道内存活。然而,它们不会越过肠道屏障,因此它们的主要作用是在胃肠道的肠腔和/或肠壁上诱导的。然后它们在给予期间形成驻留菌群的一部分。这种定殖(或临时定殖)允许益生菌细菌行使有益效果,例如抑制存在于菌群中的潜在致病性微生物以及与肠的免疫系统相互作用。
虽然没有益生菌使用的下限或上限,但是已经表明,至少106-1012,例如至少106-1010,例如108-109cfu作为日剂量可能在受试者中有效地实现所希望的健康效应。因此,根据本发明使用的益生菌可以包含从106至1012CFU的细菌/g支持物,并且更具体地从108至1012CFU的细菌/g支持物,典型地对于冻干形式是109至1012CFU/g。
合适地,该细菌可以以从约106至约1012CFU的微生物/剂,典型地约108至约1012CFU的微生物/剂的剂量给予。术语“每剂量”意指每天或每次摄入(典型地每天)向受试者提供这种量的微生物。例如,如果微生物将在食物产品中(例如在酸奶中)给予-则酸奶将典型地含有从约108至1012CFU的微生物。然而,可替代地,这种量的微生物可以分成多次给予,每次给予由较小量的微生物负荷组成,只要受试者在任何特定时间(例如每24小时期间)接受的微生物的总量是从约106至约1012CFU的微生物.例如约108至约1012CFU的微生物。
根据本发明,有效量的微生物的至少一个菌株可以是至少106CFU的微生物/剂量,例如从约106至约1012CFU的微生物/剂量,例如约108至约1012CFU的微生物/剂量。
CFU代表“菌落形成单位”。“支持物”意指食物产品、膳食补充剂或药学上可接受的支持物或载体。
虽然可以根据本发明单独施用细菌或代谢物(即没有任何支持物、稀释剂或赋形剂),但他们通常作为产品的一部分(特别是作为食物产品、膳食补充剂或药物制剂的组分)在载体或支持物上或载体或支持物中施用。这些产品典型地含有本领域技术人员熟知的另外的组分。
可以从组合物中获益的任何产品都可以用于本发明。这些包括但不限于食物,特别是水果蜜饯(fruit conserve)和乳制品以及乳制品衍生产品和药品。
本发明的细菌组合物可以配制成营养补充剂。细菌组合物可以是呈例如胶囊、片剂、粉末或乳剂等形式。
典型的益生菌成分是冻干粉,每克含有例如1010-1012个活的益生菌细胞。该粉末可进一步包含适当的载体,例如脱脂牛奶或糖,典型地低聚糖,例如蔗糖或海藻糖。
可替代地,该细菌组合物可以用例如藻酸盐、淀粉或黄原胶等载体包封。一种典型的胶囊制剂每个胶囊可含有大约109-1011个活的益生菌细胞。
本发明的益生菌组合物可以另外地含有一种或多种益生元。如本文中所使用的术语“益生元组分”是指用于支持或增强益生菌健康效果或协助益生菌生长和/或活性的任何化合物、营养素或另外的微生物。典型地,益生元是碳水化合物(例如寡糖),但该定义不排除非碳水化合物。益生元的最普遍的形式在营养上被归类为可溶性纤维。在某种程度上,膳食纤维的许多形式表现出一定水平的益生元作用。
在一个实施例中,益生元是选择性发酵的成分,其允许胃肠道微生物群落中的组成和/或活性的特定改变,赋予宿主安宁和健康益处。
合适地,根据本发明,益生元可以以0.01至100g/天、例如0.1至50g/天、或0.5至20g/天的量使用。在一个实施例中,根据本发明,益生元可以以1至10g/天、例如2至9g/天、或3至8g/天的量使用。在另一个实施例中,根据本发明,益生元可以以5至50g/天、例如10至25g/天的量使用。
益生元的膳食来源的实例包括大豆、菊粉来源(例如菊芋(Jerusalemartichoke)、豆薯和菊苣根)、生燕麦(raw oat)、未加工的小麦、未加工的大麦和雪莲果。
合适的益生元的实例包括藻酸盐、黄原胶、果胶、刺槐豆胶(LBG)、菊粉、瓜耳胶、半乳寡糖(GOS)、果寡糖(FOS)、聚右旋糖(即)、乳糖醇、乳蔗糖、大豆寡糖、异麦芽酮糖(PalatinoseTM)、异麦芽寡糖、葡萄糖寡糖、木寡糖、甘露寡糖、β-葡聚糖、纤维二糖、棉子糖、龙胆二糖、蜜二糖、木二糖、环糊精、异麦芽糖、海藻糖、水苏糖、潘糖、出芽短梗霉聚糖、毛蕊花糖、半乳甘露聚糖和所有形式的抗性淀粉。益生元的特别优选的实例是聚右旋糖。
本发明的益生菌组合物可以用作,或者可以用于制备,食物产品。此处,术语“食物”以广义使用,并且涵盖人类的食物以及动物的食物(即饲料)。在一个方面,该食物用于人类消费。
食品可以处于溶液的形式或作为固体-这取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。
典型的益生菌食物产品每日剂量可能含有大约109-1011个活的益生菌细胞。该益生菌可作为益生菌成分(例如冻干粉)掺入食物产品中,或可在该产品中培养。
当用作或用于制备食物(例如功能性食物)时,本发明的组合物可以与以下中的一种或多种结合使用:营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、和营养活性成分。
举例来说,本发明的益生菌组合物可以用作软饮料、果汁或饮料的成分,该软饮料、果汁或饮料包含乳清蛋白、健康茶、可可饮料、奶饮料和乳酸菌饮料、酸奶和饮用酸奶、奶酪、冰淇淋、冰糕和甜点、糕点糖果、饼干蛋糕和蛋糕混合物、休闲食物、平衡食物和饮料、水果馅料、保健浆汁、巧克力面包馅料、奶酪蛋糕口味馅料、水果风味蛋糕馅料、蛋糕和甜甜圈糖衣、即时烘焙填充奶油、饼干馅料、即食面包馅料、低热量馅料、成人营养饮料、酸化大豆/果汁饮料、无菌/蒸馏巧克力饮料、酒吧混合物、饮料粉剂、钙强化大豆/纯巧克力奶、钙强化咖啡饮料。
该益生菌组合物可以进一步用作以下食物产品中的成分:例如美国奶酪酱、用于磨碎和切碎的干酪的抗结块剂、点心盘、奶油干酪、干混散打无脂肪酸性稀奶油、冷冻/解冻乳制品鲜奶油、冷冻/解冻稳定的打发奶油、低脂肪和清淡的天然切达干酪、低脂瑞士式酸奶、充气冷冻甜点、硬盒冰淇淋、标签友好的经济改进且大容量硬盒冰淇淋、低脂冰淇淋:软冰淇淋、烧烤酱、奶酪蘸酱、松软干酪敷料、干混阿尔弗雷多(Alfredo)酱、混合奶酪酱、干混番茄酱等。
如本文中所使用的术语“乳制品”意在包括含有动物和/或植物来源的奶的培养基。作为动物来源的奶,可以提及奶牛、绵羊、山羊或水牛的奶。作为植物来源的奶,可以提及可根据本发明使用的任何植物来源的可发酵物质,特别是源自大豆、大米或谷物的可发酵物质。
根据一个具体的方面,根据本发明使用的食物产品是发酵奶或人源化奶。
对于某些方面,本发明可以用于有关酸奶生产中,例如发酵的酸奶饮料、酸奶、饮用酸奶、奶酪、发酵奶油、基于奶的甜点等。
合适地,组合物可以进一步用作一种或多种乳酪应用、肉类应用、或包含保护性培养物的应用中的成分。
本发明还提供了制备食物或食物成分的方法,该方法包括将根据本发明的组合物与另一种食物成分混合。
有利地,本发明涉及已经与本发明的益生菌组合物(以及任选地与其他组分/成分)接触的产品,其中该组合物以能够改善该产品的营养和/或健康益处的量使用。
如本文中所使用的术语“接触”是指将本发明的组合物间接或直接应用到该产品中。可使用的应用方法的实例包括但不限于:在包含组合物的材料中处理产品、通过将组合物与产品混合而直接应用、将组合物喷洒至产品表面上或将产品浸入组合物的配制品中。
在本发明的产品是食物的情况下,本发明的组合物典型地与该产品混合。可替代地,可以在食物的乳剂或原始成分中包含组合物。在另外的替代性方案中,组合物可以作为调味料、浆汁、着色剂混合物等应用。
对于一些应用而言,重要的是,使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。这允许组合物能赋予如下有利特性中的一种或多种:营养和/或健康益处。
本发明的组合物可以用受控量的微生物应用于点缀、包衣和/或浸渍产品。
在一个实施例中,将组合物用于发酵乳或蔗糖强化乳或具有蔗糖和/或麦芽糖的乳酸培养基,其中所得到含有全部组合物成分的-即根据本发明的所述微生物的培养基可以作为成分以合适的浓度例如像以在最终产品中提供106-1010cfu的日剂量的浓度-添加到酸奶中。根据本发明的微生物可以在酸奶发酵之前或之后使用。
有利地,当该产品是食物产品时,益生菌应该通过正常的“最迟销售”日期或“截止”日期(在该日期期间食物产品由零售商出售)保持有效。有效时间可以有用地超过这样的日期,直到当食物腐败变得明显时的正常新鲜期结束。期望的时间长度和正常保质期将随食物而变化,并且本领域普通技术人员将认识到,保质期时间取决于食物的种类、食物的大小、储存温度、加工条件、包装材料和包装设备而变化。
本发明的细菌组合物可以用作-或可以添加到-功能性食物中。如本文所使用的,术语“功能性食物”意指不仅能够提供营养效果和/或味道,还能够向消费者递送另外的有益效果(例如,附加的健康益处)的食物。
因此,功能性食物是具有掺入其中的组分或成分(例如本文所述的那些)的普通食物,其赋予食物特定的功能性益处-例如医学或生理学益处-而不是纯粹的营养效果。虽然没有对功能性食品的法律定义,但它们通常是指在市场上销售的具有特定健康效应的食品。
一些功能性食物是保健营养品。如本文所使用的,术语“保健营养品”意指不仅能够提供营养效果和/或味道满足,还能够向消费者递送治疗(或其他有益)效果的食品。保健营养品跨越了在食物和药物之间的传统分界线。
根据另一个方面,本发明涉及细菌或其代谢物在用于预防和/或治疗胃肠道疾病中的用途,该细菌或其代谢物显示出与至少一种ABO血型抗原结合,或由一种或多种此类细菌组成的益生菌组合物在用于预防和/或治疗胃肠道疾病的用途。
如本文所使用的,术语“胃肠道疾病”包括任何与胃肠道有关的疾病或障碍。该障碍可能是例如已知与胃肠道微生物群的组成和多样性改变有关的。胃肠道疾病可能是炎症性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、便秘或腹泻。
当用作或用于制备药物时,本发明的组合物可以与以下中的一种或多种结合使用:药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的辅剂、药学活性成分。
药学上可接受的支持物可以是处于例如压制片剂、片剂、胶囊、软膏、栓剂或可饮用溶液的形式的支持物。以下提供了其他合适的形式。
药物可以是处于溶液的形式或作为固体-取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。
根据本发明,可以以任何合适的形式使用细菌或其代谢物或益生菌组合物,无论是单独时还是与其他组分或成分组合存在时。用于本发明的细菌在本文中可以称为“该组合物”。同样地,包含本发明的组合物和其他组分和/或成分(即成分-例如食物成分、功能性食物成分或药物成分)的组合能以任何合适的形式使用。
根据本发明,细菌或其代谢物或益生菌组合物可以以固体或液体配制品的形式或其替代物的形式使用。固体配制品的实例包括但不限于可以是可湿润的、喷雾干燥的或冷冻干燥的片剂、胶囊、尘剂、颗粒和粉末。液体配制品的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳剂。
针对速释型、迟释型、调释型、缓释型、脉冲释放型或控制释放型应用,形式的合适的实例包括片剂、丸剂、胶囊、珠剂、溶液或悬浮液中的一种或多种,其可包含调味剂或染色剂。
举例来说,如果本发明的组合物以片剂形式使用-例如用作功能性成分-那么这些片剂也可以包含以下各项中的一种或多种:辅料,例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸;崩解剂,例如淀粉(例如玉米、马铃薯、木薯淀粉)、乙醇酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐;造粒黏结剂,例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶;润滑剂,例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石可以包括在内。
用于制备这些形式的营养上可接受的载体的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡类、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、黏性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethrai)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于这些形式的合适的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。
对于水性悬浮液和/或酏剂,可将本发明的组合物与不同的甜味剂或调味剂、调色物质或染料进行组合,与乳剂和/或悬浮剂进行组合,以及与稀释剂(例如水、丙二醇和甘油及其组合))进行组合。
形式还可以包括明胶胶囊、纤维胶囊、纤维片剂或纤维饮料。
对技术人员将显而易见的是,该制剂在理想情况下应该能够在通过胃肠道的运输过程中保持稳定;例如,它可能对蛋白降解耐受,在酸性pH下稳定,对胆汁的洗涤作用耐受。
本发明进一步以编号段落的形式提供以下披露内容:
1.一种细菌或其代谢物,其特征在于:
a)与卷曲乳杆菌LMG18199相比,A抗原的平均黏附率超过100%;和/或
a)与卷曲乳杆菌LMG18199相比,B抗原的平均黏附率超过100%;和/或
b)与卷曲乳杆菌LMG18199相比,O抗原的平均黏附率超过100%。
2.根据段落1所述的细菌或其代谢物,其中所述细菌或其代谢物的特征还在于:
c)如在酸耐受性测定中定义的,当在pH 2.5测量1.5小时时,以对数变化表示的平均酸耐受性大于-2.6;和/或
d)如在胆汁耐受性测定中定义的,以在0.9%脱水新鲜胆汁中的生长与无胆汁MRS中的生长的百分比表示的平均胆汁耐受性超过40%。
3.根据段落1或2所述的细菌,其中所述细菌以DSM 32111、DSM 32108、DSM 32107、DSM 32098、DSM 32104、DSM 32112、DSM 32109、DSM 32105、DSM 32110、DSM 32103、DSM32099、DSM 32106、DSM 32097、DSM 32114、DSM 32115或其突变体、变体和/或子代保藏。
4.一种益生菌组合物,其包含根据段落1至3中任一项所述的细菌或其代谢物。
5.根据段落4所述的益生菌组合物,其进一步包含合适的载体。
6.根据段落4或5中任一项所述的益生菌组合物,其包含2、3、4、5或6种如在权利要求1至3中任一项中定义的细菌菌株或其代谢物的组合,任选地与一种或多种另外的菌株组合。
7.根据段落4至6中任一项所述的益生菌组合物,其中该组合物进一步包含一种或多种另外的细菌菌株。
8.根据段落7所述的益生菌组合物,其中所述一种或多种另外的细菌菌株选自:嗜酸乳杆菌NCFM;乳酸双歧杆菌BL-04;副干酪乳杆菌LPC37;乳酸双歧杆菌HN019、和/或乳酸双歧杆菌Bi-07。
9.根据段落8所述的益生菌组合物,其包含DAVE034、嗜酸乳杆菌NCFM;乳酸双歧杆菌BL-04;副干酪乳杆菌LPC37;乳酸双歧杆菌HN019、和乳酸双歧杆菌Bi-07。
10.根据段落4至9中任一项所述的益生菌组合物,其中该组合物是针对个体A、B、AB或O血型个性化的,该个性化通过包含当与卷曲乳杆菌LMG18199相比时显示出针对适当的一种或多种血型抗原的超过100%的抗原黏附率的一种或多种细菌实现。
11.根据段落4至10中任一项所述的益生菌组合物,其进一步包含至少一种益生元组分。
12.一种生产根据段落4至11中任一项所述的益生菌组合物的方法,该方法包括将所选的细菌或其代谢物与合适的载体组合。
13.一种食物产品、膳食补充剂、医疗食品、保健或药物组合物,其包含根据段落4至11中任一项所述的益生菌组合物。
14.一种选择细菌或其代谢物的方法,该方法包括:
a)将A抗原、B抗原、O抗原或其组合与一种或多种测试细菌混合;
b)将A抗原、B抗原、O抗原或其组合与一种或多种罗伊氏乳杆菌RC-14对照细菌混合;
c)孵育步骤a)和步骤b)的所述混合物;
d)对比所述测试细菌和罗伊氏乳杆菌RC-14与所述A抗原、B抗原、O抗原或其组合的黏附亲和力;以及
e)选择相比于罗伊氏乳杆菌RC-14与所述A抗原、B抗原、O抗原或其组合具有更高的黏附亲和力的细菌。
15.根据段落14所述的方法,其中步骤(b)中的所述混合物在单独小瓶中孵育。
16.根据段落14或15所述的方法,其中所述方法是基于荧光的方法。
17.根据段落16所述的方法,其中选择如下细菌,所述细菌具有:
i)A抗原的平均荧光黏附强度超过549;
ii)B抗原的平均荧光黏附强度超过519;和/或
iii)O抗原的平均荧光黏附强度超过746。
18.根据段落14至17中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括:
f)在pH 2.5测定步骤e)中所选的细菌的平均酸耐受性1.5小时;如/或
g)测定步骤e)中所选的细菌在0.9%胆汁中的平均胆汁耐受性;以及
h)选择一种或多种细菌,所述细菌当在pH 2.5测量1.5小时时,以对数变化表示的平均酸耐受性大于-2.56,和/或以在0.9%胆汁中的生长与无胆汁MRS中的生长的百分比表示的平均胆汁耐受性超过40.16%。
19.一种细菌或其代谢物,其是根据段落14至18中任一项所述的方法选择的。
20.根据段落19所述的细菌,其中所述细菌以DSM 32111、DSM 32108、DSM 32107、DSM 32098、DSM 32104、DSM 32112、DSM 32109、DSM 32105、DSM 32110、DSM 32103、DSM32099、DSM 32106、DSM 32097、DSM 32114、DSM 32115或其突变体、变体和/或子代保藏。
21.一种益生菌组合物,其包含根据段落19至20中任一项所述的细菌或其代谢物。
22.根据段落21所述的益生菌组合物,其进一步包含合适的载体。
23.根据段落21或22中任一项所述的益生菌组合物,其包含2、3、4、5或6种如在段落19至20中任一项中定义的细菌菌株或其代谢物的组合,任选地与一种或多种另外的菌株组合。
24.根据段落21至23中任一项所述的益生菌组合物,其中该组合物进一步包含一种或多种另外的细菌菌株。
25.根据段落24所述的益生菌组合物,其中所述一种或多种另外的细菌菌株选自:嗜酸乳杆菌NCFM;乳酸双歧杆菌BL-04;副干酪乳杆菌LPC37;乳酸双歧杆菌HN019、和/或乳酸双歧杆菌Bi-07。
26.一种食物产品、膳食补充剂、医疗食品、保健或药物组合物,其包含根据段落21至25中任一项所述的益生菌组合物。
27.根据段落1-3或19-20中任一项所述的或根据段落14-18中任一项所述的方法选择的细菌或代谢物、或根据段落4-11或21-25中任一项所述的益生菌组合物在制造用于预防和/或治疗胃肠道疾病的制剂中的用途。
28.根据段落1-3或19-20中任一项所述的或根据段落14-18中任一项所述的方法选择的细菌或代谢物、或根据权利要求4-11或21-25中任一项所述的益生菌组合物,用于预防和/或治疗胃肠道疾病。
29.一种预防和/或治疗胃肠道疾病的方法,该方法包括以药学有效量向受试者给予根据段落1-3或19-20中任一项所述的或根据段落14-18中任一项所述的方法选择的细菌或其代谢物、或根据段落4-11或21-25中任一项所述的益生菌组合物。
30.一种针对A、B、AB或O血型的个体个性化益生菌组合物或食物产品的方法,该方法通过选择益生菌组合物或食物产品中含有的一种或多种细菌实现,所述细菌当与罗伊氏乳杆菌RC-14或卷曲乳杆菌LMG18199对比时显示出针对适当的一种或多种血型抗原的超过100%的抗原黏附率。
31.一种基本上如本文中参考附图所描述的细菌、代谢物、益生菌组合物、食物产品、方法、使用的细菌或代谢物、其用途或组合。
现仅以举例的方式参照以下实例来描述本发明。
实例
材料&方法
菌株的益生菌特性
在pH 2.5和pH 3.5下1.5h测试菌株的酸耐受性,在0.9%和0.3%的牛胆汁(Difco)胆汁浓度下24h测试菌株的胆汁耐受性(Saarela等人2009)。简言之,在MRS肉汤中在厌氧条件下在37℃下一式两份培养菌株18h。沉淀的细胞用10ml PBS pH 7.2洗涤两次,并悬浮于0.01mol/L PBS pH 7.2,这样样品的光学密度(OD600)是1(等于1x 108CFU/ml)。通过在PBS pH 7.2孵育细胞,测试其酸耐受性。在37℃下,PBS pH 2.5和PBS pH 3.5孵育90分钟。十倍稀释系列生长于MRS琼脂,并且在厌氧条件下在37℃下孵育48h后菌落计数。酸耐受性结果表示为暴露在pH 2.5或3.5下(与pH 7.2下相比)CFU的生长对数减少。通过在含有0.9%牛胆汁的MRS中和含有0.3%牛胆汁的MRS中和在普通MRS中在37℃下在厌氧条件下孵育1∶10稀释的菌株培养物24h测试胆汁耐受性。通过Multiskan RC(实验室系统公司(Labsystems))测定OD595孵育前后的生长情况。胆汁耐受结果表示为在0.9%或0.3%的牛胆汁中生长(OD)与无胆汁的MRS中生长(OD)的%。另外,将该菌株的酸和胆汁耐受性与鼠李糖乳杆菌LGG(VTT E-96666)菌株的酸和胆汁耐受性进行比较。所有测量均一式两份进行,并对大多数菌株重复两次。
ABH抗原黏附
所有菌株均测试ABH的黏附能力(H抗原对应血型O表型)。测试的血型抗原A、B、H(Elicityl)悬浮于PBS pH 7.2中并生物素化。将菌株在厌氧条件下在MRS板上在37℃下孵育48h-72h。将单个菌落再次接种至10ml MRS肉汤中并在厌氧条件下在37℃下孵育过夜。用10ml PBS pH 7.2洗涤细胞两次,并在PBS pH 7.2中再悬浮,使样品的OD(600nm)设置为1(等于1x 108cfu/ml)。将1ml样品和1ml 10μg/ml生物素化的抗原溶液混合在一起,并在室温下缓慢摇动孵育30分钟,并将100μl混合物转移到时间分辨荧光免疫分析(Delfia)涂有链霉素的96-孔板上(瓦拉克公司(Wallac)),所述板用200μl PBS pH 7.2洗涤两次,随后用SuperBlock(皮尔斯公司(Pierce))洗涤三次(2x 200μl+1x 100μl),以及用200μl无菌水洗涤一次。为了使链霉素与生物素相互作用,将板在室温下孵育30分钟并伴随缓慢搅拌,随后用200μl无菌水洗涤孔三次。在两次洗涤之间,孵育板5分钟。为检测附着的细菌,向孔中添加200μl Syto9染料(1∶6稀释)(英杰公司(Invitrogen))并在黑暗中孵育15分钟。采用Wallac Viktor2 1420多标签计数器(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))测量孔内Syto-9染色强度。以四个重复来进行所有的测量,并重复结果至少两次。将菌株黏附与罗伊氏乳杆菌RC-14(可获得自丹麦克里斯蒂安·汉森公司(Chr.Hansen))进行比较。
实例1
采用了若干不同的标准来选择本发明的细菌,这些细菌在益生菌组合物生产中具有有利的特性。
使用的标准和选择的截止值如下表2中所示。
表2.截止值
如上文在材料和方法部分中所示的进行测定。对于许多菌株,这些分析的结果如下所示,包括对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG、RC-14、GR-1和卷曲乳杆菌LMG18199。
表3.在pH 2.51.5小时的酸耐受性研究的结果。
表4.在pH 3.51.5小时的酸耐受性研究的结果
表5.胆汁耐受性研究结果,在0.9%牛胆汁中的生长和在不含胆汁的MRS中的生长的%。
表6.胆汁耐受性研究结果,在0.3%牛胆汁中的生长和在不含胆汁的MRS中的生长的%。
表7.在上表5和表6中作为对照的MRS中的生长。
本测定未获得DSM 32097的数据。
根据上述获得的数据和所使用的选择标准,根据在用于益生菌组合物中的适用性选择了若干菌株。下表11显示了基于A、B、O抗原黏附效果优于对照菌株的那些菌株,且这些菌株显示胆汁和/或酸耐受力增强。5个菌株(DSM 32104、DSM 32112、DSM 32109、DSM 32110和DSM 32106)的A、B和/或O黏附性与对A抗原黏附良好的对照菌株卷曲乳杆菌LMG18199相比相同或更好(Uchida等人2006)。
表11.基于如表2中定义的标准,菌株按其性质进行分组
实例3(胃肠健康-疼痛)
雄性大鼠(体重约200-220g)术前准备进行腹部肌肉肌电图检查,以测量其对随后结肠肿胀的疼痛应答。然后结肠直肠肿胀测试前,给大鼠管饲每种益生菌(每日剂量为107、108和/或109CFU)或生理盐水7-21天。大鼠在肿胀测试前3-5天习惯于聚丙烯通道。从栓子切除术探针取下用于肿胀的气囊,并插入距肛门1厘米处的直肠,并固定在尾的根部。然后使用探针与恒压器相连,诱导肿胀的水平增加。功能成分使结肠壁肿胀,并导致疼痛阈值增加或腹部肌肉收缩减少。测量每个压力水平对应的收缩,并在组间进行比较。
实例4(胃肠健康-炎症)
雄性大鼠(体重约200-220g),每只管饲每种益生菌或生理盐水15天,然后诱导三硝基苯磺酸(TNBS)结肠炎。禁食过夜后直肠内输注TNBS,最大量为80mg/kg(于0.3ml 50%乙醇中)。TNBS输注后2至4天,大鼠进行结肠肿胀测试并处死。处死后,收集组织标本、血液和胃肠道内容物作进一步分析,例如下列一项或多项:
炎症的评分
新鲜的组织标本由经验丰富的科学家目测评分,以确定炎症的水平。
炎症标志物的表达
在液氮中速冻结肠切片。用可商购试剂盒提取RNA并转化为cDNA。用RT-qPCR分析结肠组织中炎症标志物(例如IL-6、TNF-α、IL-1β)、基质金属蛋白酶(MMP)及其组织抑制剂的表达。
结肠组织学
从石蜡包埋的组织中切取组织学样品,在显微镜下观察,计数浸润的免疫细胞。
循环炎症标志物
离心血液以分离血浆。随后用可商购ELISA试剂盒测定炎症标志物(例如IL-6、TNF-α、IL-1β、hsCRP)。
循环脂多糖
离心血液以分离血清。使用标准试剂盒对血清样品中的脂多糖进行分析,该试剂盒基于可商购的鲎阿米巴样细胞提取物(LAL试剂盒)。
肠道微生物群分析
通过提取DNA分析来自粪便或盲肠的肠道微生物群。然后对样品进行肠道微生物测序。由训练有素的生物信息学家分析结果。
上述说明书中提及的所有出版物通过引用结合在此。本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域的技术人员将是显而易知的,而不背离本发明的范围和精神。虽然已结合特定优选实施例描述了本发明,但应当理解,要求保护的本发明不应不适当地限于这类特定实施例。实际上,对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的、用于执行本发明的所描述的实施例的各种修改旨在落入如下权利要求书的范围内。
Claims (15)
1.一种细菌或其代谢物,其特征在于:
a)与卷曲乳杆菌(L.crispatus)LMG18199相比,A抗原的平均黏附率超过100%;和/或
b)与卷曲乳杆菌LMG18199相比,B抗原的平均黏附率超过100%;和/或
c)与卷曲乳杆菌LMG18199相比,O抗原的平均黏附率超过100%和/或
d)如在酸耐受性测定中定义的,当在pH 2.5测量1.5小时时,以对数变化表示的平均酸耐受性大于-2.6;和/或
e)如在胆汁耐受性测定中定义的,以在0.9%脱水新鲜胆汁中的生长与无胆汁MRS中的生长的百分比表示的平均胆汁耐受性超过40%。
2.根据权利要求1所述的细菌,其中所述细菌保藏为DSM 32111、DSM 32108、DSM32107、DSM 32098、DSM 32104、DSM 32112、DSM 32109、DSM 32105、DSM 32110、DSM 32103、DSM 32099、DSM 32106、DSM 32097、DSM 32114、DSM 32115或其突变体、变体和/或子代。
3.一种益生菌组合物,其包含根据权利要求1或2中所述的细菌或其代谢物,以及合适的载体。
4.根据权利要求3所述的益生菌组合物,其包含2、3、4、5或6种如在权利要求1或2中定义的细菌菌株或其代谢物的组合,任选地与一种或多种另外的菌株组合。
5.根据权利要求4所述的益生菌组合物,其中所述一种或多种另外的细菌菌株选自:嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM;乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)BL-04;副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LPC37;乳酸双歧杆菌HN019、和/或乳酸双歧杆菌Bi-07。
6.根据权利要求5所述的益生菌组合物,其包含DSM 32109、嗜酸乳杆菌NCFM;乳酸双歧杆菌BL-04;副干酪乳杆菌LPC37;乳酸双歧杆菌HN019、和乳酸双歧杆菌Bi-07。
7.一种生产根据权利要求3至6中任一项所述的益生菌组合物的方法,该方法包括将所选的细菌或其代谢物与合适的载体组合。
8.一种食物产品、膳食补充剂、医疗食品、保健或药物组合物,其包含根据权利要求3至6中的任一项所述的益生菌组合物。
9.一种选择细菌或其代谢物的方法,该方法包括:
f)将A抗原、B抗原、O抗原或其组合与一种或多种测试细菌或其代谢物混合;
g)将A抗原、B抗原、O抗原或其组合与一种或多种罗伊氏乳杆菌RC-14对照细菌混合;
h)孵育步骤a.和步骤b.的所述混合物;
i)对比所述测试细菌或其代谢物和罗伊氏乳杆菌RC-14与所述A抗原、B抗原、O抗原或其组合的黏附亲和力;以及
j)选择相比于罗伊氏乳杆菌RC-14与所述A抗原、B抗原、O抗原或其组合具有更高的黏附亲和力的细菌或其代谢物。
10.一种选择细菌或其代谢物的方法,该方法包括:
a)在pH 2.5测定细菌或其代谢物的平均酸耐受性1.5小时;和/或
b)测定细菌或其代谢物在0.9%胆汁中的平均胆汁耐受性;以及
c)选择一种或多种细菌或其代谢物,所述细菌或其代谢物当在pH 2.5测量1.5小时时,以对数变化表示的平均酸耐受性大于-2.6,和/或以在0.9%胆汁中的生长与无胆汁MRS中的生长的百分比表示的平均胆汁耐受性超过40%。
11.一种细菌或其代谢物,其是根据权利要求9或10所述的方法选择的。
12.根据权利要求1、2或11中任一项所述的或根据权利要求9或10中任一项所述的方法选择的细菌或代谢物、或根据权利要求3至6中任一项所述的益生菌组合物在制造用于预防和/或治疗胃肠道疾病的制剂中的用途。
13.根据权利要求1、2或11中任一项所述的或根据权利要求9或10中任一项所述的方法选择的细菌或代谢物、或根据权利要求3至6中任一项所述的益生菌组合物,用于预防和/或治疗胃肠道疾病。
14.一种预防和/或治疗胃肠道疾病的方法,该方法包括以药学有效量向受试者给予根据权利要求1、2或11中任一项所述的或根据权利要求9或10中任一项所述的方法选择的细菌或其代谢物、或根据权利要求3至6中任一项所述的益生菌组合物。
15.一种基本上如本文中参考附图所描述的细菌、代谢物、益生菌组合物、食物产品、方法、使用的细菌或代谢物、其用途或组合。
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