JP2019528738A - 細菌 - Google Patents
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Abstract
Description
a)L.クリスパタス(L.crispatus)LMG18199と比較されるときに100%超の平均A抗原接着;および/または
b)L.クリスパタス(L.crispatus)LMG18199と比較されるときに100%超の平均B抗原接着;および/または
c)L.クリスパタス(L.crispatus)LMG18199と比較されるときに100%超の平均O抗原接着;および/または
d)耐酸性評価分析に規定されているように1.5時間pH2.5で測定されるときにlog変化として表される−2.6超の平均酸耐性;および/または
e)耐胆汁性評価分析に規定されているように胆汁なしのMRSでの増殖の百分率として0.9%脱水新鮮胆汁での増殖として表される40%超の平均胆汁耐性
で特徴付けられる細菌またはその代謝産物を提供する。
a)1つ以上の試験細菌を、A抗原、B抗原、O抗原またはそれらの組み合わせと混ぜ合わせる工程と;
b)1つ以上のラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)RC−14対照細菌を、A抗原、B抗原、O抗原またはそれらの組み合わせと混ぜ合わせる工程と;
c)工程a)およびb)の前記混合物を培養する工程と;
d)試験細菌およびラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)RC−14の前記A抗原、B抗原、O抗原またはそれらの組み合わせへの接着の親和性を比較する工程と;
e)ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)RC−14よりも前記A抗原、B抗原、O抗原またはそれらの組み合わせへの高い接着の親和性を有する細菌を選択する工程と
を含む細菌またはその代謝産物の選択方法が提供される。
a)549超の蛍光の平均A抗原接着強度;
b)519超の蛍光の平均B抗原接着強度;および/または
c)746超の蛍光の平均O抗原接着強度
を有する細菌が選択される。
本発明に使用するのに好適な細菌には、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、ステレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、ペジオコッカス(Pediococcus)属、リューコノストック(Leuconostoc)属および/またはオエノコッカス(Oenococcus)属が含まれるが。それらに限定されない。
a)L.クリスパタス(L.crispatus)LMG18199と比較されるときに100%超の平均A、Bおよび/またはO抗原接着;ならびに
b)耐酸性評価分析に規定されているように1.5時間pH2.5で測定されるときにlog変化として表される−2.6超の平均酸耐性、および/または耐胆汁性評価分析に規定されているように胆汁なしのMRSでの増殖の百分率として0.9%脱水新鮮胆汁での増殖として表される40%超の平均胆汁耐性で特徴付けられる細菌またはその代謝産物を提供する。
1.下記:
a)L.クリスパタス(L.crispatus)LMG18199と比較されるときに100%超の平均A抗原接着;および/または
a)L.クリスパタス(L.crispatus)LMG18199と比較されるときに100%超の平均B抗原接着;および/または
b)L.クリスパタス(L.crispatus)LMG18199と比較されるときに100%超の平均O抗原接着
で特徴付けられる細菌またはその代謝産物。
c)耐酸性評価分析に規定されているように1.5時間pH2.5で測定されるときにlog変化として表される−2.6超の平均酸耐性;および/または
d)耐胆汁性評価分析に規定されているように胆汁なしのMRSでの増殖の百分率として0.9%脱水新鮮胆汁での増殖として表される40%超の平均胆汁耐性
でさらに特徴付けられる段落1に記載の細菌またはその代謝産物。
a)1つ以上の試験細菌を、A抗原、B抗原、O抗原またはそれらの組み合わせと混ぜ合わせる工程と;
b)1つ以上のラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)RC−14対照細菌を、A抗原、B抗原、O抗原またはそれらの組み合わせと混ぜ合わせる工程と;
c)工程a)およびb)の前記混合物を培養する工程と;
d)試験細菌およびラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)RC−14の前記A抗原、B抗原、O抗原またはそれらの組み合わせへの接着の親和性を比較する工程と;
e)ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)RC−14よりも前記A抗原、B抗原、O抗原またはそれらの組み合わせへの高い接着の親和性を有する細菌を選択する工程と
を含む細菌またはその代謝産物の選択方法。
i)549超の蛍光の平均A抗原接着強度;
ii)519超の蛍光の平均B抗原接着強度;および/または
iii)746超の蛍光の平均O抗原接着強度
を有する細菌が選択される方法。
f)工程e)において選択された細菌の平均酸耐性を1.5時間pH2.5で評価分析する工程;および/または
g)工程e)において選択された細菌の平均胆汁耐性を0.9%胆汁で評価分析する工程;および
h)1.5時間pH2.5で測定されるときにlog変化として表される−2.56超の平均酸耐性および/または胆汁なしのMRSでの増殖の百分率として0.9%胆汁での増殖として表される40.16%超の平均胆汁耐性を有する1つ以上の細菌を選択する工程
をさらに含む方法。
菌株のプロバイオティック特性
菌株の酸耐性は、1.5時間pH2.5およびpH3.5において、胆汁耐性は、24時間0.9%および0.3%Oxgall(Difco)胆汁濃度において試験した(Saarelaら 2009)。手短に言えば、菌株を、18時間37℃で嫌気性条件下にMRSブロスで正副2通り培養した。ペレット化細胞を10mlのPBS pH7.2で2回洗浄し、試料の光学密度(OD600)が1である(1×108CFU/mlに等しい)ように0.01モル/LのPBS pH7.2に再懸濁させた。酸耐性は、細胞を、37℃で90分間PBS pH7.2、PBS pH2.5およびPBS pH3.5において培養することによって試験した。10倍希釈シリーズをMRS寒天上で増殖させ、コロニーを、37℃で嫌気性条件下に48h培養後にカウントした。酸耐性についての結果は、pH7.2と比較してpH2.5または3.5への暴露後のCFUの増殖log減少として表した。胆汁耐性は、1:10希釈菌株培養物を、嫌気性条件下に24時間37℃で0.9%Oxgall雄牛の胆汁を含有するMRS、0.3%Oxgallを含有するMRSでおよび平板MRSで培養することによって試験した。増殖は、Multiskan RC(Labsystems)によってOD595として培養前後に測定した。胆汁耐性結果は、胆汁なしのMRSでの増殖(OD)と比較して0.9%または0.3%Oxgall入りMRSでの%増殖(OD)として表した。さらに、菌株の酸および胆汁耐性を、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)LGG(VTT E−96666)菌株のそれと比較した。測定は全て、正副2通り行い、菌株のほとんどについて2回繰り返した。
ABH接着能は、全ての菌株について試験した(H抗原は、血液型O表現型に相当する)。試験される血液型抗原A、BおよびH(Elicityl)を、PBS pH7.2に懸濁させ、ビオチン化した。菌株を、48〜72時間37℃でMRS平板において嫌気条件下に培養した。単一コロニーを10mlのMRSブロスに再植菌し、37℃で嫌気条件下に一晩培養した。細胞を10mlのPBS pH7.2で2回洗浄し、試料のOD(600nm)が1に設定される(1×108cfu/mlに等しい)ように、PBS pH7.2に再懸濁させた。1mlの試料と1mlの10μg/mlのビオチン化抗原溶液とを混合し、室温で30分間ゆっくり振盪して培養し、100μlの混合物を、Delfia Streptavidin(ストレプトアビジン)被覆96ウェルプレート(Wallac)へ移し、平板を200μlのPBS pH7.2で2回洗浄し、これに、SuperBlock(Pierce)3回(2×200μl+1×100μl)でのおよび1回200μlの滅菌水での洗浄が続いた。ストレプトアビジン−ビオチン相互作用については、平板を、ゆっくりとかき混ぜて室温で30分間培養し、その後ウェルを200μlの滅菌水で3回洗浄した。洗浄の間に、平板を5分間培養した。結合した細菌を検出するために、200μlのSyto9染料(1:6希釈された)(Invitorogen)をウェルに添加し、暗所で15分間培養した。ウェル中のSyto−9菌株の強度は、Wallac Viktor21420マルチラベルカウンター(Perkin Elmer)で測定した。測定は全て4反復で行い、結果は少なくとも2回繰り返した。菌株の接着は、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)RC−14(Christian Hansen A/S,Denmarkから入手可能な)と比較した。
多数の異なる判定基準を用いて、プロバイオティック組成物の製造にとって有利な特性を有するだろう本発明の細菌を選択した。
およそ200〜220gの重さがある雄ラットを、後で結腸拡張への疼痛反応を測定するために腹部筋肉の筋電図検査用に外科的に準備する。ラットを次に、結腸直腸拡張試験前の7〜21日間各プロバイオティクス(107、108および/もしくは109CFUの1日用量)または生理食塩水で強制飼養する。ラットを、拡張試験前に3〜5日ポリプロピレン・トンネルに慣れさせる。膨張のために使用されるバルーンを、塞栓除去プローブから取り、肛門から1cmのところで直腸中へ挿入し、尾の基底で固定する。拡張のレベルの増加を次に、圧調節器に連結されたプローブで誘導させる。機能性成分は、直腸壁を鈍感にさせ、痛覚閾値の増加または腹部筋肉の収縮の減少をもたらす。各圧力レベルに対応する収縮を測定し、グループ間で比較する。
およそ200〜220gの重さがある雄ラットを、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)結腸炎を誘導する前に15日間各プロバイオティクスまたは生理食塩水で強制飼養する。TNBSを、0.3mlの50%エタノール中最大80mg/kgで一晩絶食後に直腸内に注入する。TNBS注入の2〜4日後に、ラットを直腸拡張試験にかけ、犠牲にする。犠牲にして、組織検体、血液およびGI内容物を、下記の1つ以上などの、さらなる分析のために集める:
新鮮な組織検体を、炎症のレベルを測定するために経験を積んだ科学者によって目視採点する。
結腸のセクションを、液体窒素中で瞬間凍結する。RNAを抽出し、商業的に入手可能なキットでcDNAに変換する。直腸組織中の、IL−6、TNF−アルファ、IL−1ベータ、マトリックス・メタロプロテイナーゼ(MMP)およびそれらの組織阻害剤などの、炎症性指標の発現を、RT−qPCRで分析する。
組織学試料は、パラフィン中に埋め込まれた組織からカットし、浸潤免疫細胞を数えるために顕微鏡下で可視化する。
血液を遠心分離して血清を分離する。炎症性指標(IL−6、TNF−アルファ、IL−1ベータ、hsCRPなどの)を次に、商業的に入手可能なELISAキットで測定する。
血液を遠心分離して血清を分離する。リポ多糖類は、商業的に入手可能である、Limulus変形細胞抽出物(LALキット)をベースとする標準キットを使用して血清試料から分析する。
腸管微生物叢は、DNAを抽出することによって糞または盲腸から解析する。試料は次に、腸管微生物シークエンシングを受ける。結果は、熟練したバイオインフォーマティシアンによって解析される。
Claims (15)
- 下記:
a)L.クリスパタス(L.crispatus)LMG18199と比較して100%超の平均A抗原接着;および/または
b)L.クリスパタス(L.crispatus)LMG18199と比較して100%超の平均B抗原接着;および/または
c)L.クリスパタス(L.crispatus)LMG18199と比較して100%超の平均O抗原接着;および/または
d)耐酸性評価分析に規定されているように1.5時間pH2.5で測定してlog変化として表される−2.6超の平均酸耐性;および/または
e)耐胆汁性評価分析に規定されているように胆汁なしのMRSでの増殖の百分率として0.9%脱水新鮮胆汁での増殖として表される40%超の平均胆汁耐性
で特徴付けられる細菌またはその代謝産物。 - 前記細菌が、DSM 32111、DSM 32108、DSM 32107、DSM 32098、DSM 32104、DSM 32112、DSM 32109、DSM 32105、DSM 32110、DSM 32103、DSM 32099、DSM 32106、DSM 32097、DSM 32114、DSM 32115またはそれらの突然変異株、変異株および/もしくは後代として寄託されている請求項1に記載の細菌。
- 請求項1または2に記載の細菌またはその代謝産物と、好適なキャリアとを含むプロバイオティック組成物。
- 任意選択で1つ以上のさらなる細菌株と組み合わせて、請求項1または2に記載されるような2、3、4、5または6つの細菌株またはそれらの代謝産物の組み合わせを含む、請求項3に記載のプロバイオティック組成物。
- 前記1つ以上のさらなる細菌株が、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)NCFM;ビフィドバクテリウム・ラクチス(Bifidobacterium lactis)BL−04;ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)LPC37;ビフィドバクテリウム・ラクチス(Bifidobacterium lactis)HN019、および/またはビフィドバクテリウム・ラクチス(Bifidobacterium lactis)Bi−07から選択される、請求項4に記載のプロバイオティック組成物。
- DSM 32109、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)NCFM;ビフィドバクテリウム・ラクチス(Bifidobacterium lactis)BL−04;ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)LPC37;ビフィドバクテリウム・ラクチス(Bifidobacterium lactis)HN019およびビフィドバクテリウム・ラクチス(Bifidobacterium lactis)Bi−07を含む請求項5に記載のプロバイオティック組成物。
- 請求項3〜6のいずれか一項に記載のプロバイオティック組成物の製造方法であって、前記方法が、前記選択された細菌またはその代謝産物を好適なキャリアと組み合わせる工程を含む方法。
- 請求項3〜6のいずれか一項に記載のプロバイオティック組成物を含む食品、栄養補助食品、医療食品、栄養補給または医薬組成物。
- f)1つ以上の試験細菌またはそれらの代謝産物を、A抗原、B抗原、O抗原またはそれらの組み合わせと混ぜ合わせる工程と;
g)1つ以上のラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)RC−14対照細菌を、A抗原、B抗原、O抗原またはそれらの組み合わせと混ぜ合わせる工程と;
h)工程a.およびb.の前記混合物を培養する工程と;
i)前記試験細菌またはそれらの代謝産物およびラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)RC−14の前記A抗原、B抗原、O抗原またはそれらの組み合わせへの接着の親和性を比較する工程と;
j)ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)RC−14よりも前記A抗原、B抗原、O抗原またはそれらの組み合わせへの高い接着の親和性を有する細菌またはその代謝産物を選択する工程と
を含む細菌またはその代謝産物の選択方法。 - a)細菌またはその代謝産物の平均酸耐性を1.5時間pH2.5で評価分析する工程;および/または
b)前記細菌またはその代謝産物の平均胆汁耐性を0.9%胆汁で評価分析する工程;および
c)1.5時間pH2.5で測定されるときにlog変化として表される−2.6超の平均酸耐性および/または胆汁なしのMRSでの増殖の百分率として0.9%胆汁での増殖として表される40%超の平均胆汁耐性を有する1つ以上の細菌またはその代謝産物を選択する工程
を含む細菌またはその代謝産物の選択方法。 - 請求項9または10の方法によって選択される細菌またはその代謝産物。
- 胃腸疾患を予防するおよび/または治療するための調合物の製造のための、請求項1、2もしくは11のいずれか一項に記載のまたは請求項9もしくは10のいずれか一項に記載の方法によって選択された細菌もしくは代謝産物、または請求項3〜6のいずれか一項に記載のプロバイオティック組成物の使用。
- 胃腸疾患の予防および/または治療での使用のための、請求項1、2もしくは11のいずれか一項に記載のまたは請求項9もしくは10のいずれか一項に記載の方法によって選択された細菌もしくは代謝産物、または請求項3〜6のいずれか一項に記載のプロバイオティック組成物。
- 請求項1、2もしくは11のいずれか一項に記載のまたは請求項9もしくは10のいずれか一項に記載の方法によって選択された細菌もしくは代謝産物、または請求項3〜6のいずれか一項に記載の細菌組成物を、薬学的に有効な量で対象者に投与する工程を含む胃腸疾患の予防および/または治療方法。
- 実質的に図面に関連して本明細書に記載されるような細菌、代謝産物、プロバイオティック組成物、食品、方法、使用のための細菌もしくは代謝産物、使用またはそれらの組み合わせ。
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