WO2006059408A1 - ヒトabo式血液型結合性乳酸菌 - Google Patents

ヒトabo式血液型結合性乳酸菌 Download PDF

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WO2006059408A1
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lactic acid
acid bacteria
type
blood group
human
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PCT/JP2005/011043
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Tadao Saito
Yasushi Kawai
Hideaki Uchida
Katsunori Kimura
Kakuhei Isawa
Keisuke Furuichi
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Meiji Dairies Corporation
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    • G01N2333/335—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Lactobacillus (G)

Definitions

  • the present invention relates to lactic acid bacteria and screening of lactic acid bacteria.
  • the binding mechanism of lactic acid bacteria in the human intestine has not yet been elucidated. From previous studies on intestinal lactic acid bacteria, it has been confirmed that L. casei has binding properties to glycolipid sugar chains, and L. reuteri and L. cri spatus have binding properties to collagen. Furthermore, a lectin-like protein that binds to the intestinal lactobacilli has been identified.
  • Intestinal mucin is a mucinous high molecular weight glycoprotein with an infinite number of mucin-type sugar chains linked to a polypeptide (core protein, apomucin) via a 0-glycoside bond.
  • intestinal settled lactic acid bacteria acquire intestinal connectivity by binding to the sugar chain of intestinal mucin through a lectin-like protein on the surface of the bacteria, and stably increase it. It is thought that breeding is planned.
  • Human ABO blood groups are distinguished by the type of antigenic substance expressed on the surface of erythrocytes.
  • the antigenic site of this ABO blood group substance is a sugar chain having a specific chemical structure (ABO blood group antigen).
  • ABO blood group antigen Both type A and type B antigens are molecules composed of three sugars, and a -N-acetylethyl latatosamine is bound to a basic structure called a type H antigen composed of two sugars in a specific binding mode. Is type A antigen and ⁇ -galactose is bound to type B antigen.
  • Type IV blood Humans of type IV blood express the type A antigen
  • humans of type B blood express the type B antigen
  • humans of type AB blood express both the type A antigen and the type B antigen on the erythrocyte surface.
  • type 0 blood humans express H-type antigens of the basic structure.
  • This method is an epoch-making method in which the adsorptive power between lactic acid bacteria and ABO blood group antigens is detected using surface plasmon resonance spectrum (SPR), and lactic acid bacteria that are compatible with the blood type are selected. Specifically, when ABO blood group antigen or intestinal mucin is used as a ligand and the lactic acid bacterium is brought into contact with the ligand immobilized on the chip, the binding between the lactic acid bacterium and the ligand is accompanied by the binding. This is a method for detecting mass changes that occur on the sensor chip as surface plasmon resonance (SPR) signals.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the present inventors have carried out the above method and confirmed that the Lactobacillus crispatus JCM8778 strain and the Lactobacillus acidophilus OLL2769 strain are A-type antigen recognizable (Patent Document 1, Non-Patent Document 5).
  • probiotic lactic acid bacteria including yogurt As the demand for food is expected to increase, the acquisition of blood group-binding lactic acid bacteria with even better binding properties has been awaited.
  • Patent Document 1 JP 2004-101249 A
  • Non-Patent Document 1 Junko Amano, Biochemistry, Japan Biochemical Society, 1999, No. 71, p.274 -277
  • Patent Document 3 Holgersson, J., Jovall, PA, and Breimer, ME, Glycosphingolipids of human large intenstine: detailed structural characterization with special reference to blood group compounds and bacterial receptor structures.J. Biochem, (Tokyo), 110, 120 -131 (1991).
  • Non-Patent Document 4 Vanak, J., Ehrmann, J., Drimalova, D., Nemec, M., monoclonal antibo dies in the detection of blood group antigens A and B in the mucosa of the large inte stine.Cas Lek Cesk , 18, 364-367 (1988).
  • Non-Patent Document 5 Uchida, H. et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (5), 1004-1010 (20 04).
  • Patent Document 6 Holmes, S. D. et al, Studies on the interaction of Staphylococcus aure us and Staphylococcus epidermidis with fibronectin using surface plasmon resonance (BIACORE). J. Microbiological Methods, 28, 77-84 (1997).
  • Non-Patent Document 7 Fratamico, P. M. et al, Detection of Escherichia coli 0157: H7 using a surface plasmon resonance biosensor. Biotechnol. Techniques., 7, 571-576 (1998). Disclosure of the Invention
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and the problem to be solved by the present invention is to find a novel intestinal-binding lactic acid bacterium suitable for human ABO blood group.
  • Means for solving the problem [0009]
  • the inventors of the present invention who have solved the above-mentioned problems have implemented the lactic acid bacteria screening method based on the surface plasmon resonance spectrum described above. Although the above method has already been established as a screening method for lactic acid bacteria, an attempt has been made by the present inventors to set a “selection reference value” in the screening method for lactic acid bacteria in order to make it suitable for large-scale screening.
  • Non-patent document 6 Examples of detection using protein A or protein G immobilized on a chip via an antibody (Non-Patent Document 7) are known.
  • the RU value indicating the binding of viable cells is about 100 It is 1000R U.
  • examples of lactic acid bacteria studied by surface plasmon resonance spectrum are not known except for reports by the present inventors (Patent Document 1, Non-Patent Document 5).
  • the present inventors established a screening method for lactic acid bacteria compatible with the ABO blood group by using 100 RU as a criterion for bacterial binding under certain conditions.
  • the present inventors conducted the screening method described above for 238 strains of lactic acid bacteria of human intestinal origin isolated from the human intestinal tract, and further conducted a test for judging suitability for yogurt production. Finally, We specifically found strains compatible with blood group A and type 0. That is, the present invention relates to a lactic acid bacterium suitable for blood group compatible yogurt and a method for screening the lactic acid bacterium, and specifically provides the following.
  • Lactobacillus gasseri lactic acid bacteria capable of binding to the human ABO blood group antigen represented by any one of the following formulas (a) to (c)
  • RU value that indicates the ability to bind human ABO blood group antigen of type A is 100RU or more
  • the RU value indicating the ability to bind to human ABO blood group antigens of type B and Z or H is 100RU or less
  • the RU value indicating the ability to bind to human type A intestinal mucin is 100 RU or more
  • the RU value that indicates the ability to bind B-type human ABO blood group antigen is 100RU or more
  • the RU value indicating the ability to bind to human ABO blood group antigens of type A and Z or H is 100RU or less
  • the RU value that indicates the ability to bind human B-type intestinal mucin is 100 RU or more
  • the RU value that indicates the ability to bind H-type human ABO blood group antigen is 100RU or more
  • the RU value indicating the ability to bind human type 0 intestinal mucin must be 100 RU or more.
  • FIG. 1 is a diagram showing the chemical structure of a Pioti-Lui polymer (BP) probe having a human ABO blood group sugar chain antigen site.
  • BP Pioti-Lui polymer
  • FIG. 2 Diagram showing the sugar chain part of the A-type antigen BP-probe (top), the B-type antigen BP-probe sugar chain part (middle), and the type 0 antigen BP-probe sugar chain part (bottom) is there.
  • the present invention comprises (a) [GalNAc a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-], (b) [Gal a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-], (c) An intestinal-binding Lactobacillus gasseri lactic acid bacterium having binding ability to a human ABO blood group antigen represented by any formula of [Fucal-2Ga a] is provided.
  • lactic acid bacteria are a general term for a group of bacteria that produce glucose strength lactic acid in a molar ratio of 50% or more.
  • O Lactobacillus genus, Lactococcus rot, Streptococcus moth, Leuconostoc moth are representative genus of lactic acid bacteria. is there.
  • the genus Bifidobacterium is also included in the lactic acid bacteria in this specification.
  • the genus Lactobacillus is further classified into species. As a typical example of the species of the genus Lactobacillus, Lactobacillus delbruekn suosp. Bulgancus (and bulgaricus), Lactobacillus de lbruekn subsp.
  • Delbruekii (L. Delbruekii), Lactobacillus acidophilus Group ⁇ ⁇ flop lactic acid bacteria (L. acidophilus Gunore 1 ⁇ ⁇ -flops), Lactobacillus casei (L. casei), Lactobacillus plantarum (L plantarum.), Lactobacillus brevis (L. brevis) Lactobacillus buchneri (L. buchneri), Lactobacillus fermentum (L. fermentum), Lactobacillus helveticus (L. helveticus) According to the results of DNA-DNA homology and cell wall composition analysis, L.
  • Lactobacillus acidophilus group lactic acid bacteria are classified into Lactobacillus acidophilus (A-1), Lactobacillus cnspatus (A-2), Lactobacillus amylovorus ( ⁇ -3), Lactobacillus gallinarum ( A-4), L actobacillus gasseri (B-1), and L. johnsonii (B-2).
  • Lactobacillus gasseri (hereinafter abbreviated as "L. gasserij”) lactic acid bacteria of the present invention is an intestinal tract Lactobacillus gasseri characterized by having a binding ability to a human ABO blood group antigen.
  • ABO human blood group antigen is a sugar chain that determines the blood group.
  • type A sugar chain [GalNAc a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal- ]
  • B type sugar chain (B type antigen) [Gal a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-]
  • O type sugar chain in this specification, the sugar that determines blood group 0 type
  • intestinal mucins present on the surface of the intestine have different sugar chains depending on the ABO blood type. The present inventors have L.
  • gasseri lactic acid bacteria that bind to type A sugar chains, which are antigens that determine human blood group A, among lactic acid bacteria that bind to mucins whose human intestinal tract force is also prepared. Make sure . Further, it was confirmed that A-type sugar chain in the mucin is expressed.
  • L. gasseri lactic acid bacteria of the present invention bind to the A-type sugar chain adsorbs to other types of carbohydrate None of the lactic acid bacteria have acquired intestinal connectivity for ABO blood group A humans by binding to type A sugar chains on intestinal mucins.
  • the L. gasseri lactic acid bacterium is considered to stably bind to and proliferate in the intestinal tract of blood group A humans and exert a probiotic function.
  • the L. gasseri lactic acid bacteria can contribute to the health of blood group A humans and is suitable for blood group A humans.
  • the L. gasseri lactic acid bacterium of the present invention that binds to the B-type sugar chain and does not adsorb to other types of sugar chains is compatible with ABO blood group B humans.
  • the L. gasseri lactic acid bacterium of the present invention that binds to the type 0 sugar chain and does not adsorb to other types of sugar chains is suitable for ABO blood group 0 type humans.
  • the L. gasseri lactic acid bacteria of the present invention (hereinafter sometimes referred to as "blood group-specific L. gasseri lactic acid bacteria”) can be separated from human feces. If it is L. gasseri lactic acid bacteria (hereinafter abbreviated as "A-type compatible lactic acid bacteria”) compatible with blood group A humans, it is compatible with humans of blood group B from ABO blood group A human feces L. gasseri lactic acid bacteria (hereinafter abbreviated as “B-type compatible lactic acid bacteria”) from ABO blood type B human feces to L.
  • A-type compatible lactic acid bacteria L. gasseri lactic acid bacteria
  • gasseri lactobacilli compatible with blood type 0 humans (Hereinafter abbreviated as “type 0 compatible lactic acid bacteria”)
  • type 0 compatible lactic acid bacteria the properties of L. gasseri lactic acid bacteria well known to those skilled in the art can be used as a guide.
  • gonococcus, homo-fermentation, aerobic growth, no gas generation, etc. can be used as a guide.
  • any medium suitable for culturing Lactobacillus is generally used.
  • a medium containing a carbon source such as mannose or cellobiose, a nitrogen source such as meat extract, peptone, yeast extract, casein or whey protein, and inorganic nutrients such as magnesium sulfate, iron sulfate or manganese sulfate can be used.
  • a suitable example is Lactobacilli MRS broth (Difco, Ref. No. 288130).
  • the culture conditions are not particularly limited as long as the intestinal lactic acid bacteria can grow. Preferred conditions are, for example, pH 5.0-pH 8.0, temperature 20 ° C-45 ° C, and more preferred conditions are anaerobic, pH 5.0-pH 7.0, temperature 30 ° C-40. ° C.
  • L. gasseri separated and cultured as described above has intestinal tract-binding properties and blood group antigens by blood group is determined by binding to human intestinal mucin or blood group antigens. It can be known by judging the presence or absence of sex.
  • a cell surface protein SLP
  • SLP cell surface protein
  • detection may be performed by a hybridization method after electrophoresis of SLP of a test bacterium using labeled intestinal mucin or labeled blood group antigen.
  • a surface plasmon analyzer for example, BIACORE
  • the surface part of the human intestinal force of a specific blood type is also collected and subjected to gel filtration using a solubilizing agent such as guanidine hydrochloride to reduce protein absorption.
  • Purification can be carried out based on the high neutral sugar content. For example, Purushothaman, b. B. Et al, Adherence of Shigella dysentenae 1 to Human colonic Mucin. Curr. Ic robiol, 42 (6), 381-387 (2001). It is more preferable to confirm that the blood group antigen is expressed in the prepared human intestinal mucin using an anti-blood group antigen antibody. Specific examples include the methods described in the examples.
  • blood group antigens can be synthesized on the basis of the sugar chain sequence shown in the formula below or in FIG. 2 (eg, commercially available sugar chain probes (eg, manufactured by Seikagaku Corporation) or neoglycoprotein 'Blood Group A Trisaccaride- BSA (eg Calbiochem) or neoglycoprotein 'Blood Group B Trisaccaride- BSA (eg Calbiochem) may be used.
  • commercially available sugar chain probes eg, manufactured by Seikagaku Corporation
  • neoglycoprotein 'Blood Group A Trisaccaride- BSA eg Calbiochem
  • neoglycoprotein 'Blood Group B Trisaccaride- BSA eg Calbiochem
  • the lactic acid bacteria specified by the accession number: NITE BP-26 and the accession number: NITE BP-27 are type A compatible lactic acid bacteria
  • the accession number: NITE BP-25 and the accession number: specified by the NITE BP-28 Lactic acid bacteria are type 0 compatible lactic acid bacteria.
  • These strains are lactic acid bacteria that have been confirmed by the present inventors to be compatible with the above-mentioned blood types.
  • Lactobacillus gasseri 2915 strain (Accession number NITE BP-25)
  • Lactobacillus gasseri 2804 strain (Accession number NITE BP-26)
  • Lactobacillus gasseri 2818 strain (Accession number NITE BP-27)
  • Lactobacillus gasseri 2827 strain (Accession number NITE BP-28)
  • the blood group-specific L. gasseri lactic acid bacteria of the present invention can be used for the production of food and drink that are suitable for each blood type.
  • Beverage-type foods made using L. gasseri lactic acid bacteria according to the present invention can be functional foods, specific health foods, health foods, and nursing foods that are not restricted in categories or types. It may be a beverage, a dairy product such as cheese or yogurt, or a seasoning. Solid, liquid, and liquid foods with no restrictions on the shape of food or drink
  • Manufacture of the said food-drinks can be performed by those skilled in the art. In the production of the above food and drink, as long as it does not interfere with the growth of lactic acid bacteria, carbohydrates, proteins, fats, dietary fibers, vitamins, biologically essential trace metals (manganese sulfate, zinc sulfate, magnesium chloride, potassium carbonate, etc.), Perfumes and other blends can also be added.
  • the blood group-specific L. gasseri lactic acid bacteria of the present invention can be used by mixing with general foods and drinks, and in particular, it can be used as a starter for producing dairy products such as yogurt and cheese and fermented milk it can.
  • dairy products such as yogurt and cheese and fermented milk it can.
  • other microorganisms may be mixed as long as it does not hinder the growth of L. gasseri lactic acid bacteria according to the blood type of the present invention or the production of dairy products.
  • Lacto bacillus aelorue ii subsp.bulgancus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus aci dophilus, etc. which are the main strains of lactic acid bacteria for yogurt, and mixed with bacterial species generally used for yogurt and cheese
  • a starter can be a starter.
  • Yogurt production using the above starter can be carried out according to a conventional method. For example, heating, mixing, homogenization, cooling after sterilization If the starter is mixed with the rejected milk or dairy product and fermented and cooled, a plaino dart can be produced.
  • the food / beverage products produced using L. gasseri lactic acid bacteria according to the present invention contain the same bacteria in the food / beverage products.
  • the blood type binding L. gasseri lactic acid bacteria of the present invention in the food or drink bind to and proliferate in the intestinal tract and adjust the intestinal balance.
  • the biotakes function is expected to be demonstrated early. Therefore, the food and drink are useful not only as general food and drink, but also as a functional food for promoting health, “health and nutrition food”, “care food”, and health food.
  • the present invention also provides a method for screening lactic acid bacteria by surface plasmon resonance spectrum.
  • the screening method of the present invention is a method for selecting lactic acid bacteria suitable for each blood group.
  • the screening method of the present invention comprises screening by measuring the binding of lactic acid bacteria to blood type human intestinal mucin and ABO blood group antigens by surface plasmon resonance spectrum, and (i) specific blood (Ii) ABO blood group antigens other than the specific blood group in (i) above and a certain amount or more of adsorbing ability. (Iii) Selection is made using as an index the ability to bind to a specific blood group of human intestinal mucin in (i) above.
  • human type A intestinal mucin refers to type A human intestinal mucin of the ABO blood group.
  • human type B intestinal mucin is a blood group B human-derived intestinal mucin
  • human type 0 intestinal mucin is a blood group 0 human intestinal mucin.
  • BIACORE Biacore Co., Ltd.
  • the preparation method of ABO blood group antigen and human intestinal mucin is as described above.
  • immobilization method use a known immobilization method. I can.
  • the immobilization method may be a physical adsorption method or a covalent bond adsorption.
  • the chip is coated with streptavidin and the probe is piotinated, it can be easily fixed by a piotine-avidin bond. You can also use a commercially available streptavidinized chip (BIACORE)! /.
  • the “binding ability” is represented by a resonance unit (RU). 1RU is in 1 mm 2 substance of lpg represents a bond child.
  • the “binding ability of a certain amount or more” is determined based on “100RU”. That is, it is determined that a certain amount or more of lactic acid bacteria binds to the probe based on a measured value of “100RU” or more. For example, if the measurement result using a blood group A human-derived intestinal mucin as a probe is 100 RU or more, the lactic acid bacterium is a lactobacillus that binds to the intestinal mucin.
  • the RU value can vary depending on the measurement conditions.
  • the sample concentration and flow rate have a large effect on changes in the RU value.
  • 100RU in this method is a numerical value at, for example, “25 ° C, sample concentration: 0.1-0.5 mg / mL, flow rate: 3_10 / ⁇ l / min”. If it is within the above range, the RU value will not change even if the above conditions are changed, so the presence or absence of coupling can be judged by “100 RU”. Furthermore, even when various conditions such as sample concentration are changed outside the above ranges, they are included in “100RU” in this method if they are substantially equivalent to 100RU under the above conditions.
  • a bacterium having a higher RU value means a bacterium having a stronger binding ability with a probe (ligand). Therefore, for the purpose of obtaining a bacterium having a stronger binding force, a bacterium that binds with an RU value higher than 100 may be screened. For example, screening may be performed based on 2000 RU as in the examples described later, which may be 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, or 1000 RU. Conversely, recognition of unintended blood types may be stricter than “100RU or less” and screened based on numerical values. If it is ⁇ , 90,80,70,60,50RU may be used as a standard.
  • blood-type-binding lactic acid bacteria were measured using the ABO blood type probe when the blood type human intestinal mucin was used as a probe according to the screening method of the present invention. Is expected to be lower than the current measured value (RU). This is because the blood group antigen (sugar chain) bound to human intestinal mucin when human intestinal mucin is immobilized on the chip is the chip unit area. In comparison, it is considered that the force is reduced when only the blood group antigen (sugar chain) is immobilized on the chip.
  • the test bacterium may cause bacterial aggregation due to non-specific adsorption, and the RU value may become abnormally high. Therefore, adsorption with human-derived intestinal mucin and ABO blood group antigen is not correctly reflected in the measurement results. Therefore, if the RU value is abnormally high, it is suspected that nonspecific adsorption (bacterial aggregation) has occurred, and the lactic acid bacteria can be excluded from the screening.
  • the subject of the screening method of the present invention is not particularly limited as long as it is a lactic acid bacterium. Despite being listed as an object, Lactobacillus acidopnilus, Lactobacillus crispatus, Lactooaci llus amylovorus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johns onii, Lactobacillus caselus, Lactobacillus caselus Lactobacillus delbruekn subsp.
  • Lactobacillus fermentum Lactobacillus murinus
  • Bifidobacterium animalis Bifi dobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacteriu m longum, Bifidobacterium pseudolongum, Enterococcus faecium, Enterococcus feoclicus
  • a more suitable subject example is the genus Lactobacillus, and the most preferred subject example is the Lactobacillus acidop hilus group lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacteria screened by the method of the present invention is a lactic acid bacterium that easily binds to the human intestinal tract of a specific ABO blood group.
  • the human of the specific blood group can improve health due to the effect of improving the intestinal balance in a short period of time. Therefore, the lactic acid bacteria screened by the method of the present invention can be applied to foods and drinks for specific blood groups, functional foods, foods for specific health use, dairy products, lactic acid bacteria drinks, and the like.
  • lactic acid bacteria used for yogurt production do not produce gas. This is because Japanese laws require that the product be marketed in a sealed container, and also to prevent product defects and rupture due to container expansion associated with gas production. Therefore, a gas production test was conducted for 238 strains.
  • Lactic acid bacteria were activated and cultured twice (37 ° C, 18h) with MRS Broth (DIFCO).
  • a Durham tube and MRS Broth (5 ml) were put together in a test tube with an aluminum cap and sterilized (121 ° C, 15 minutes).
  • the Durham tube has an opening facing down, and bubbles are removed from the Durham tube during sterilization.
  • the sterilized test tube with an aluminum cap was inoculated with 10 ⁇ L of about 10 9 cfo / mL lactic acid bacteria solution, and anaerobically cultured at 37 ° C. for 24 hours. After completion of the culture, the presence or absence of gas accumulated in the Durham tube was visually observed. When clear bubbles were observed, it was judged that there was gas production (+) (Table 1).
  • lactic acid bacteria that recognize and bind to blood group antigens were selected by surface plasmon resonance spectrum measurement.
  • Prepare 238 strains belonging to Lactobacillus acidophilus group (L. gasseri, L. plant arum, L. crispatus, L. amylovorus, L. casei, L. salivarius, L. brevis, L. fermentum, etc.) as test bacteria did.
  • BIACORE1000 was used as the surface plasmon resonance spectrum analyzer.
  • the antigen structure of human ABO blood group substance was used as a probe for selection of bacteria.
  • the following trisaccharide sugar chain polymer probe manufactured by Seikagaku Corporation (hereinafter referred to as “ also referred to as “BP-probe”).
  • a antigen probe [GalNAc a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-]
  • H antigen probe [Fuc a l-2Gal-]
  • FIG. 1 The chemical structure of the BP-probe is shown in FIG. 1 and the sugar chain structure is shown in FIG.
  • the blood antigen BP-probe was prepared to O.lmg / lOml with HBS-EP buffer (pH 7.4).
  • Sensor chip SA is a BIACORE dedicated chip to which streptavidin is fixed.
  • Human colon mucin was prepared as another probe used for selection of bacteria.
  • Human type A intestinal tract (rectum) and human type 0 intestinal tract (rectum) were distributed as specimens by the graduate School of Medicine, Tohoku University.
  • the mucous mucin layer was collected by a method of removing the surface layer from the normal rectal region.
  • the mucin layer was degreased with Folch's solvent and jetyl ether and then dissolved in 4M guanidine hydrochloride.
  • HCM human colonic mucosa
  • Immobilization of the HCM to the BIACORE chip was performed by the amine coupling method.
  • 75.0m for sensor chip CM5 with carboxymethyl dextran group introduced beforehand N / ethyto N,-(3-dimethylaminopropytocarbodiimide hydrochloride (EDC) 50 ⁇ 1 and 11.5 mg / ml N-hydroxysuccinimide (NHS) 50 ⁇ 1 were mixed.
  • the carboxyl group introduced at the end of dextran was activated, and a mixed solution containing HCM-A 30 1 was poured into an acetic acid buffer ( ⁇ ) 4.0) for immobilizing 120 ⁇ l, and an amine cup was added.
  • ⁇ acetic acid buffer
  • Running buffer HBS-EP buffer (pH7.4)
  • Regeneration solution 1M guazine hydrochloride solution 5 ⁇ 1
  • EP 165 504 14.8 + 7957.2 0.0 3.9 3.8 38.0 101.4 1.310 0.003 EP 165 505 0.0-2415.2 0.0 40.2 0.0 0.0 539.6 1.164 0.000
  • Lactic acid bacteria were selected from the results so far. First, selection was performed from the BIACORE measurement result and the gas production test result of Example 1.
  • Blood type A yogurt lactic acid bacteria were selected from the viewpoints of (i) A antigen recognition and (ii) gas production. The selection criteria are
  • a antigen recognizability As measured by BIACORE, the result of A antigen probe was 2000 RU or more (upper 35%)
  • Lactobacillus 238 was selected to 43 strains.
  • yogurt lactic acid bacteria for blood group 0 were selected by (i) H antigen recognition and (ii) gas production. The selection criteria are
  • H antigen recognizability As measured by BIACORE, the result of H antigen probe is 700RU or higher (upper 13%)
  • Lactobacillus 238 strain was narrowed down to 14 strains.
  • B antigen recognition In BIACORE measurement, B antigen probe results are less than 100RU,
  • H antigen recognition 100 RU or less with H antigen probe in BIACORE measurement
  • a antigen recognition / B antigen recognition ratio is 70 or more, A antigen recognition / H antigen recognition ratio is 100 or more
  • yogurt lactic acid bacteria candidates for blood group O were also selected. The selection criteria are
  • a antigen recognition In BIACORE measurement, the result of A antigen probe is 100RU or less.
  • B antigen recognition In BIACORE measurement, B antigen probe results are less than 100RU,
  • H antigen recognition / A antigen recognition ratio is 800 or more
  • H antigen recognition / B antigen recognition ratio is 20 or more
  • strains selected above were further selected based on blood type human colon mucin (HCM) recognition.
  • HCM blood type human colon mucin
  • yogurt lactic acid bacteria candidates for blood group 0 are selected from (i) those that recognize 0-HCM, and (ii) those with relatively high recognition of A-HCM. Was excluded.
  • the selection criteria were (i) O-HCM recognizability of 100RU or higher and (ii) A-HCM recognizability of 1000RU or lower in the BIACORE measurement results by human HCM. From the above selection, 2 strains (L. gasseri OLL 2827, L. gasseri OLL 2915) were selected from 5 strains.
  • the selection criteria vary depending on the type of bacteria. Since the bacterial species selected this time are all Lactobacillus gas seri, they were set to 0.50 or more. Blood type A yogurt lactic acid bacteria (L.gasseri OLL 280 4, L.gasseri OLL 2818), blood type 0 yogurt lactic acid bacteria (L.gasseri OLL 2827, L.ga sseri OLL 2915) Satisfied (Table 1).
  • Lactobacilli MRS broth (DIFCO) 2 times of activation culture (37 ° C, 18 hours) Lactobacilli MRS broth (DIFCO) containing 5% of Lactobacilli MRS broth (DIFCO) Cultured at 37 ° C. After 18 hours of culture, the turbidity (OD) of the medium was measured.
  • Selection criteria vary depending on the type of bacteria. Since the strains selected this time are all Lactobacillus gas seri, they were set to 0.08 or more. Blood type A yogurt lactic acid bacteria (L.gasseri OLL 280 4, L.gasseri OLL 2818), blood type O yogurt lactic acid bacteria (L.gasseri OLL 2827, L.ga sseri OLL 2915) Satisfied (Table 1). Table 2 shows the scientific properties of the above four strains.
  • Neisseria gonorrhoeae Neisseria gonorrhoeae Gram stain Positive Positive Positive Positive Lactic acid fermentation format Homolactic fermentation Homolactic fermentation Homolactic fermentation Homolactic fermentation Aerobic growth + + + + +
  • Lactic acid bacteria selected above (Yogurt lactic acid bacteria for blood group A: L.gasseri OLL 2804, L.ga sseri OLL 2818, yogurt lactic acid bacteria for blood group O: L. gasseri OLL 2827, L. gasseri OL L 2915) were used to produce yogurt.
  • Plain yogurt was prepared using L. gasseri OLL 2804 strain. First, 1% each of L. gasseri OLL2804 strain, L. bulgaricus JCM 1002 T and S. thermophilus ATCC19258 was inoculated into 10% nonfat dry milk medium, and cultured at 37 ° C for 15 hours to prepare a Balta starter .
  • Yogurt mix (SNF: 9.5%, FAT: 3.0%) heated at 95 ° C for 5 minutes, 1% each of L. bulgar icus JCM 1002 ⁇ and S. thermophilus ATCC 19258 starter, L. gasseri OLL 2804 strain starter was inoculated 5% and fermented at 43 ° C for 4 hours.
  • thermophilus ATCC 19258 was 9.60 X 10 7 CFU / mL, 7.50 X 10 7 CFU / mL, 11.0 X 10 7 CFU / mL, and the survival rate of the L. gasseri OLL 2804 strain was 77% on the first day of storage, with a slight decrease in the number of viable bacteria.
  • the preserved product has good flavor and physical properties.
  • Plain yogurt was prepared using L. gasseri OLL 2818 strain. First, 1% each of L. gasseri OLL2818 strain, L. bulgaricus JCM 1002 T and S. thermophilus ATCC19258 was inoculated into 10% nonfat dry milk medium, and cultured at 37 ° C for 15 hours to prepare a Balta starter .
  • Yogurt mix (SNF: 9.5%, FAT: 3.0%) heated at 95 ° C for 5 minutes, 1% each of L. bulga ricus JCM 1002T and S. thermophilus ATCC 19258 starter, L. gasser i OLL 2818 starters were inoculated with 5% and fermented at 43 ° C for 4 hours.
  • the viable cell counts of L. gasseri OLL 2818, L. bulgaricus JCM 1002 T and S. thermophilus ATCC 19258 immediately after cooling were 14.0 X 10 7 CFU / mL, 20.0 X 10 7 CFU / mL, 11.4 X 10 CFU / mL.
  • the flavor and physical properties were both good.
  • the viable count of gasseri OLL 2818, L. bulgaricus JCM1002T and S. thermophilus ATCC 19258 was 11.4 X 10 7 CFU / mL, 7.00 X
  • the survival rate of L. gasseri OLL 2818 was 82% on the first day of storage, and the viable cell count decreased only slightly, 10 7 CFU / mL, 10.0 X 10 7 CFU / mL.
  • the preserved product has good flavor and physical properties.
  • a lactic acid bacterium suitable for human ABO blood group and a screening method thereof are provided.
  • the lactic acid bacteria of the present invention or the lactate strain obtained by the screening method of the present invention is a lactic acid bacterium having a high intestinal binding property for each ABO blood type, and functional yogurts classified by blood type are obtained by applying the lactic acid bacteria to food and beverage production. New probiotic foods and drinks can be provided.

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Abstract

　ヒト腸管ムチンおよび血液型抗原をプローブとする表面プラズモン共鳴スペクトルによる乳酸菌スクリーニング方法を実施した。大規模スクリーニングに適合させるため、上記乳酸菌スクリーニング方法における選抜基準値の設定を試みたところ、一定条件の下において100RUを菌結合の判断基準とすることにより、ABO式血液型に適合する乳酸菌をスクリーニングできることを見出した。乳酸菌238菌株について上記スクリーニング方法を実施し、さらにヨーグルト産生用途の適合性を判断するための試験を実施し、ついに血液型A型とO型に適合する菌株を具体的に見出した。

Description

明 細 書
ヒト ABO式血液型結合性乳酸菌
技術分野
[0001] 本発明は、乳酸菌および乳酸菌のスクリーニングに関する。
背景技術
[0002] ヒト腸管には約 500— 1000種類 · 100兆個の腸内細菌 (腸管定住性微生物）が生息 している。プロバイオテイクスと呼ばれる微生物は、ヒト腸管内で有用菌と有害菌のバ ランスを改善し、宿主の健康に貢献する。最近では、このプロバイオテイクス微生物を 食品に応用する動きが潮流となっている。例えば、プロバイオテイクス機能を有する 乳酸菌を用いて生産された機能性ヨーグルトが、幾つか商品化されている。そのため 、よりすぐれたプロバイオテイクスを選抜するマススクリーニング技術が求められて 、る
[0003] 腸管定住性乳酸菌はヒト腸管に接着し増殖する。そのため、プロバイオテイクス機 能が発揮されるためには、乳酸菌の腸管結合性が非常に重要である。ヒト腸管内で の乳酸菌の結合機構は、いまだ解明されたとはいえない。腸管系乳酸菌に関するこ れまでの研究から、 L. caseiが糖脂質糖鎖との結合性を有すること、 L. reuteriや L. cri spatusがコラーゲンとの結合性を有することが確認されており、さらに上記腸管系乳 酸菌と結合するレクチン様タンパク質が同定されている。しかし、多くの健常者の腸 管上皮では、細胞骨格タンパク質 (コラーゲン)の露出箇所は極めて少なぐ腸管上 皮のレクチン様タンパク質による乳酸菌定着は考えにくい。そこで、腸管定住性乳酸 菌の腸管結合性には腸管ムチンに結合する糖鎖が重要な役割を果たしていると考え られる。多くの腸管定住性乳酸菌の表層タンパク質（surface layer protein , SLP)に は、糖質を認識するタンパク質であるレクチン様タンパク質が存在する。腸管の表面 には腸管ムチンが存在する。腸管ムチンは、 0-グリコシド結合を介してポリペプチド（ コアタンパク質、アポムチン）に結合した無数のムチン型糖鎖を持つ、粘液性の高分 子量糖タンパクである。すなわち腸管定住性乳酸菌は、菌表層のレクチン様タンパク 質を通じて腸管ムチンの糖鎖に結合することにより腸管結合性を獲得し、安定的な増 殖を図って 、ると考えられる。
[0004] 一方、近年になって、ヒト大腸ムチン（human colonic mucin： HCM)を構成する糖鎖 の化学構造は、 ABO式血液型により異なるという興味深い事実が報告された (非特 許文献 1-4)。
[0005] ヒト ABO式血液型は、赤血球表面に発現している抗原物質の種類によって区別さ れる。この ABO式血液型物質の抗原部位は、特定化学構造の糖鎖 (ABO式血液型 抗原)である。 A型抗原と B型抗原はともに 3個の糖からなる分子で、 2個の糖からなる H型抗原と呼ばれる基本構造に特定の結合様式で a -N-ァセチルガラタトサミンが結 合したのが A型抗原であり、 α -ガラクトースが結合したのが B型抗原である。 Α型の血 液のヒトは A型抗原、 B型の血液のヒトは B型抗原、 AB型の血液のヒトは A型抗原およ び B型抗原の両方を赤血球表面に発現している。それに対し、 0型の血液のヒトは基 本構造の H型抗原を発現する。
[0006] 上述の、消化管ムチンの糖鎖構造が血液型により異なるという科学的事実は、消化 管に結合増殖するプロバイオテイクス乳酸菌の種類が血液型により異なることを示唆 している。それぞれの血液型に適合した乳酸菌が見つかれば、個人レベルに対応し た機能性ヨーグルトの開発が実現可能になる。これまでに本発明者らは、この点に着 目し、ヒト腸管結合性乳酸菌を ABO式血液型抗原との吸着力によりスクリーニングす る方法を開発した (特許文献 1)。この方法は、乳酸菌と ABO式血液型抗原との吸着 力を、表面プラズモン共鳴スペクトル (SPR)を利用して検出し、血液型によって適合 する乳酸菌を選択する画期的方法である。具体的には、リガンドとして ABO式血液型 抗原または腸管由来のムチンを用い、チップ上に固定ィ匕したリガンドに乳酸菌を接 触させたときの乳酸菌とリガンドとの結合を、該結合に伴ってセンサーチップ上に生じ る質量変化を表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance = SPR)シグナルとし て検出する方法である。上記質量変化は、 Resonance Unit (=RUレゾナンスユニット） で表され、 lRU= lpg/mm2であり、 1RUは lmm2に物質 lpgが結合したことを表す。本 発明者らは、上記方法を実施し、 Lactobacillus crispatus JCM8778株、 Lactobacillus acidophilus OLL2769株が A型抗原認識性であることを確認している（特許文献 1、非 特許文献 5)。しかし、ヨーグルトをはじめとする、プロバイオテイクス乳酸菌を用いた 食品の需要増が期待されることから、さらに結合性にすぐれた血液型結合性乳酸菌 の獲得が待たれていた。
[0007] 特許文献 1：特開 2004-101249
非特許文献 1 :天野純子、生化学，社団法人日本生化学会， 1999年，第 71卷， p.274 -277
特干文献 2： Holgersson, J., Stromberg, N., and Breimer, M. E., ulyconpids of hu man large intenstine: glycolopid expression related to anatomical localization, epithe lial I non-epithelial tissue and the ABO, Le and Se phenotypes of the donors. Bioch imie, 70, 1565—1574(1988).
特許文献 3 : Holgersson, J., Jovall, P. A., and Breimer, M. E., Glycosphingolipids of human large intenstine: detailed structural characterization with special reference to blood group compounds and bacterial receptor structures. J. Biochem, (Tokyo), 110, 120-131(1991).
非特許文献 4 :Vanak, J., Ehrmann, J., Drimalova, D., Nemec, M., monoclonal antibo dies in the detection of blood group antigens A and B in the mucosa of the large inte stine. Cas Lek Cesk, 18, 364—367(1988).
非特許文献 5 : Uchida, H. et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(5), 1004-1010 (20 04).
特許文献 6 : Holmes, S. D.et al, Studies on the interaction of Staphylococcus aure us and Staphylococcus epidermidis with fibronectin using surface plasmon resonance (BIACORE). J. Microbiological Methods, 28, 77-84 (1997).
非特許文献 7 : Fratamico, P. M.et al, Detection of Escherichia coli 0157:H7 using a surface plasmon resonance biosensor. Biotechnol. Techniques., 7, 571-576 (1998). 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しょうとする課 題は、ヒト ABO式血液型に適合した新規な腸管結合性乳酸菌を見出すことである。 課題を解決するための手段 [0009] 上記課題を解決すベぐ本発明者らは、上述の表面プラズモン共鳴スペクトルによ る乳酸菌スクリーニング方法を実施した。上記方法は既に乳酸菌スクリーニング方法 として確立されているが、大規模スクリーニングにより適合させるため、本発明者らに より上記乳酸菌スクリーニング方法における「選択基準値」を設定する試みが行われ た。これまでに、細菌について表面プラズモン共鳴スペクトルで検討した例として、黄 色ブドウ球菌とフイブロネクチンの結合を表面プラズモン共鳴スペクトルにより測定し た例（非特許文献 6)、 Eschelichia coli 0157を、抗 Eschelichia coli 0157抗体を介して チップ上に固定ィ匕したプロテイン Aまたはプロテイン Gにより検出する例（非特許文献 7)が知られており、これらの論文では、生菌体の結合を示す RU値は約 100から 1000R Uとなっている。しかし、乳酸菌について表面プラズモン共鳴スペクトルで検討した例 は、本発明者らによる報告以外に知られていない (特許文献 1、非特許文献 5)。また 、検体が同じであっても測定諸条件により RU値は変化しうる。そこで本発明者らは、 鋭意努力の結果、一定条件の下において 100RUを菌結合の判断基準とすることによ り、 ABO式血液型に適合する乳酸菌のスクリ一二ング方法を確立した。
[0010] さらに本発明者らは、ヒト腸管より単離したヒト腸起源の乳酸菌 238菌株について上 記スクリーニング方法を実施し、さらにヨーグルト産生用途の適合性を判断するため の試験を実施し、ついに血液型 A型と 0型に適合する菌株を具体的に見出した。す なわち、本発明は血液型適合性ヨーグルトに適した乳酸菌および該乳酸菌のスクリ 一二ング方法に関し、具体的には下記を提供するものである。
(1)下記 (a)から（c)の ヽずれかの式で表されるヒト ABO式血液型抗原に結合能を有 する腸管結合性 Lactobacillus gasseri乳酸菌
(a) [GalNAc a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-]
(b) [Gal a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-]
(c) [Fuc a l- 2Ga卜]、
(2)受託番号： NITE BP-25、受託番号： NITE BP-26、受託番号： NITE BP-27、受託 番号： NITE BP- 28のいずれかで特定される、上記（1)に記載の Lactobacillus gasseri 乳酸菌、
(3)上記（1)または上記（2)に記載の Lactobacillus gasseri乳酸菌を含む、ヒト ABO式 血液型適合性発酵乳および乳製品製造用スターター、
(4)上記（1)または上記（2)に記載の Lactobacillus gasseri乳酸菌を含有する、飲食
P
TO、
(5)上記（1)または上記（2)に記載の Lactobacillus gasseri乳酸菌を含有する、発酵 乳および乳酸菌飲料、
(6)下記条件 (i)カゝら (iii)を満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトル による乳酸菌のスクリーニング方法。
(i) A型のヒト ABO式血液型抗原との結合能を示す RU値が 100RU以上であること
(ii) B型および Zまたは H型のヒト ABO式血液型抗原との結合能を示す RU値が 100R U以下であること
(iii)ヒト A型腸管ムチンとの結合能を示す RU値が 100RU以上であること、
(7)下記条件 (i)カゝら (iii)を満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトル による乳酸菌のスクリーニング方法。
(i) B型のヒト ABO式血液型抗原との結合能を示す RU値が 100RU以上であること
(ii) A型および Zまたは H型のヒト ABO式血液型抗原との結合能を示す RU値が 100R U以下であること
(iii)ヒト B型腸管ムチンとの結合能を示す RU値が 100RU以上であること
(8)下記条件 (i)カゝら (iii)を満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトル による乳酸菌のスクリーニング方法。
(i) H型のヒト ABO式血液型抗原との結合能を示す RU値が 100RU以上であること
(ii) A型および Zまたは B型のヒト ABO式血液型抗原との結合能を示す RU値が 100R U以下であること
(iii)ヒト 0型腸管ムチンとの結合能を示す RU値が 100RU以上であること。
図面の簡単な説明
[図 1]ヒト ABO式血液型の糖鎖抗原部位を有するピオチ-ルイ匕ポリマー（BP)プロ一 ブの化学構造を示す図である。
[図 2]A型抗原 BP-プローブの糖鎖部分 (上）、 B型抗原 BP—プローブの糖鎖部分（中 )、および 0型抗原 BP-プローブの糖鎖部分（下）を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明は、 (a) [GalNAc a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-]、 (b) [Gal a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-] 、 (c) [Fuc a l-2Ga卜]のいずれかの式で表されるヒト ABO式血液型抗原に結合能を 有する腸管結合性 Lactobacillus gasseri乳酸菌を提供する。
[0013] 一般的に、乳酸菌とは、グルコース力 乳酸をモル比換算で 50%以上つくる細菌群 の総称であ o Lactobacillus属、 Lactococcus腐、 Streptococcus厲、 Leuconostoc厲は 、乳酸菌の代表的な属である。また Bifidobacterium属は本明細書における乳酸菌に 含まれる。 Lactobacillus属は、さらに種に分類される。 Lactobacillus属の菌種の代表 例として、 Lactobacillus delbruekn suosp. bulgancus (し bulgaricus)、 Lactobacillus de lbruekn subsp. delbruekii(L. delbruekii)、 Lactobacillus acidophilusグル ~~プ乳酸菌 ( L. acidophilusグノレ1 ~~プ)、 Lactobacillus casei (L. casei)、 Lactobacillus plantarum (L plantarum.)、 Lactobacillus brevis (L. brevis入 Lactobacillus buchneri (L. buchneri) 、 Lactobacillus fermentum (L. fermentum)、 Lactobacillus helveticus (L. helveticus) などを挙げることができる。 L. acidophilusグループ乳酸菌は、 DNA-DNAホモロジ一 および細胞壁組成分析の結果により、 Lactobacillus acidophilus (A- 1)、 Lactobacillus cnspatus (A- 2)、 Lactobacillus amylovorus (Λ- 3)、 Lactobacillus gallinarum (A- 4)、 L actobacillus gasseri (B- 1)、および L. johnsonii (B- 2)の 6菌種に分類される。
[0014] 本発明の Lactobacillus gasseri (以下、場合により「L. gasserijと略す）乳酸菌は、ヒト ABO式血液型抗原に結合能を有することを特徴とする腸管結合性 Lactobacillus gass eriである。本発明において ABO式ヒト血液型抗原とは、血液型を決定する糖鎖であり 、具体的には、 A型糖鎖 (A型抗原）： [GalNAc a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-]、 B型糖鎖 (B 型抗原）： [Gal a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-]、 O型糖鎖 (本明細書にぉ 、て、血液型 0型を 決定する糖鎖を意味し、 H型抗原、 0型抗原ともいう。 )： [Fuc aト 2Gaト]である。上 述の通り、腸管表層に存在する腸管ムチンは ABO式血液型により異なる糖鎖を有す る。本発明者らは、 A型のヒト腸管力も調製されたムチンに結合する乳酸菌のうち、ヒト 血液型 A型を決定する抗原である A型糖鎖に結合する L. gasseri乳酸菌があることを 確認した。また、上記ムチンに A型糖鎖が発現していることも確認した。したがって本 発明の L. gasseri乳酸菌において、上記 A型糖鎖に結合し、他の型の糖鎖に吸着し ない乳酸菌は、腸管ムチン上の A型糖鎖に結合することにより、 ABO式血液型 A型の ヒトについて腸管結合性を獲得している。該 L. gasseri乳酸菌は、血液型 A型のヒトの 腸管に安定的に結合'増殖し、プロバイオテイクス機能を発揮すると考えられる。すな わち、該 L. gasseri乳酸菌は、特に血液型 A型のヒトの健康に貢献することができ、血 液型 A型のヒトに適合しているということができる。同様に、上記 B型糖鎖に結合し、他 の型の糖鎖に吸着しない本発明 L. gasseri乳酸菌は、 ABO式血液型 B型のヒトに適合 する。上記 0型糖鎖に結合し、他の型の糖鎖に吸着しない本発明 L. gasseri乳酸菌 は、 ABO式血液型 0型のヒトに適合する。
[0015] 本発明の L. gasseri乳酸菌（以下、時に「血液型別結合性 L. gasseri乳酸菌」と称す )は、ヒト糞便力 分離することができる。血液型 A型のヒトに適合する L. gasseri乳酸 菌（以下、「A型適合乳酸菌」と略す)であれば、 ABO式血液型 A型のヒトの糞便から、 血液型 B型のヒトに適合する L. gasseri乳酸菌（以下、「B型適合乳酸菌」と略す)であ れば、 ABO式血液型 B型のヒトの糞便から、血液型 0型のヒトに適合する L. gasseri乳 酸菌（以下、「0型適合乳酸菌」と略す)であれば、 ABO式血液型 0型のヒトの糞便か ら、より効率よく分離できる可能性が高い。分離に際しては、当業者に周知の L. gasse ri乳酸菌の性質を目安とすることができる。例えば、桿菌、ホモ発酵、好気性発育あり 、ガス生成無し、等を目安とすることができる。
[0016] 本発明の血液型別結合性 L. gasseri乳酸菌を培養するには、一般的に乳酸桿菌の 培養に適した培地であればよぐグルコース、ラタトース、ガラクトース、フルクトース、 トレノヽロース、スクロース、マンノース、セロビオース等の炭素源、肉エキス、ペプトン、 イーストエキストラタト、カゼイン、ホエータンパク質等の窒素源、硫酸マグネシウム、 硫酸鉄、硫酸マンガン等の無機栄養素を含む培地を用いることができる。好適な例 の一つとして、 Lactobacilli MRS broth (Difco, Ref. No.288130)を挙げることができる。 培養条件は、腸内乳酸菌が生育しうる条件であれば、特に制限はない。好ましい条 件としては、例えば、 pH5.0— pH8.0、温度 20°C— 45°Cであり、より好ましい条件として は、嫌気性、 pH5.0—pH7.0、温度 30°C—40°Cである。
[0017] 上記のようにして分離'培養した L. gasseriが血液型別の腸管結合性および血液型 抗原との結合性を有するかにつ 、ては、ヒト腸管ムチンまたは血液型抗原との結合 性の有無を判断することにより知ることができる。例えば、被験菌の表層より菌体表層 タンパク質 (SLP)を調製し、ピオチン等で標識した SLPと腸管ムチンあるいは血液型 抗原との結合性を検出してもよい。または、標識腸管ムチンあるいは標識血液型抗 原を用いて、被験菌の SLPの電気泳動後にハイブリダィゼーシヨンの手法により検出 してもよい。また後述する実施例のように、表面プラズモン解析装置 (例えば、 BIACO RE)を用いれば、生菌のまま検出することが可能である。
[0018] 血液型別のヒト腸管ムチンを調製するには、特定の血液型のヒト腸管力も表層部分 を採取し、塩酸グァ-ジン等の可溶化剤を用いてゲルろ過を行い、タンパク質吸収と 中性糖含量が高いことを目安にして精製することができる。例えば、 Purushothaman, b. b. et al, Adherence of Shigella dysentenae 1 to Human colonic Mucin. Curr. ic robiol, 42(6), 381-387 (2001).記載の方法を参考に実施することができる。抗血液 型抗原抗体を用いて、調製したヒト腸管ムチンに血液型抗原が発現していることを確 認すると、より好ましい。具体例として、実施例に記載の方法を挙げることができる。 一方、血液型抗原は、後述する式または図 2に記載した糖鎖配列をもとに合成しても よぐ市販の糖鎖プローブ (例：生化学工業製)あるいはネオグリコプロテイン ' Blood Group A Trisaccaride- BSA (例： Calbiochem社）やネオグリコプロテイン ' Blood Group B Trisaccaride- BSA (例： Calbiochem社）などを用いてもょ ヽ。
[0019] 本発明の血液型別結合性 L. gasseri乳酸菌の代表例として、受託番号: NITE BP-2 5、受託番号： NITE BP-26、受託番号： NITE BP-27、受託番号： NITE BP-28で特定 される Lactobacillus gasseriを挙げることができる。これらのうち、受託番号： NITE BP- 26と受託番号: NITE BP-27で特定される乳酸菌は A型適合乳酸菌であり、受託番号 ： NITE BP-25と受託番号: NITE BP-28で特定される乳酸菌は 0型適合乳酸菌である 。これらの菌株は、本発明者らによって、上述した各血液型への適合性が確認された 乳酸菌である。
[0020] 本発明者らは、これら菌株を、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関す るブダペスト条約に基づき、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託 センターに寄託した。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
(ィ)寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター (所在地：日本国千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8 郵便番号 292-0818) (口）原寄託日：平成 16年 (2004年） 10月 8日
国内寄託力 ブダペスト条約に基づく寄託への移管請求日：平成 17年 (2005年 ) 5月 6曰
(ハ)受託番号：
Lactobacillus gasseri 2915株 （受託番号 NITE BP- 25)
Lactobacillus gasseri 2804株 （受託番号 NITE BP- 26)
Lactobacillus gasseri 2818株 （受託番号 NITE BP- 27)
Lactobacillus gasseri 2827株 （受託番号 NITE BP- 28)
[0021] 本発明の血液型別結合性 L. gasseri乳酸菌は、血液型別に適合する飲食品の製 造に用いることができる。本発明の血液型別結合性 L. gasseri乳酸菌を用いて作る飲 食品は、カテゴリーや種類に制限はなぐ機能性食品、特定保健用食品、健康食品 、介護用食品でもよぐまた、菓子、乳酸菌飲料、チーズやヨーグルト等の乳製品、調 味料等であってもよい。飲食品の形状についても制限はなぐ固形、液状、流動食状
、ゼリー状、タブレット状、顆粒状、カプセル状など、通常流通しうるあらゆる飲食品形 状をとることができる。上記飲食品の製造は、当業者の常法によって行うことができる 。上記飲食品の製造においては、乳酸菌生育を妨げない限り、糖質、タンパク質、脂 質、食物繊維、ビタミン類、生体必須微量金属 (硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化マグ ネシゥム、炭酸カリウム、等）、香料やその他の配合物を添加することもできる。
[0022] 本発明の血液型別結合性 L. gasseri乳酸菌は、一般飲食品に混合して用いること ができるほか、特に、ヨーグルトやチーズ等の乳製品'発酵乳の製造用スターターと することができる。スターターとする場合は、本発明の血液型別結合性 L. gasseri乳酸 菌の生息'増殖に支障がない限り、また乳製品製造に支障がない限り、他の微生物 が混合されていてもよい。例えば、ヨーグルト用乳酸菌として主要な菌種である Lacto bacillus aelorue ii subsp. bulgancus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus aci dophilus等と混合してもよぐその他、一般にヨーグルト用やチーズ用として用いられ る菌種と混合してスターターとすることができる。上記スターターによるヨーグルト製造 は、常法にしたがって行うことができる。例えば、加温 ·混合 ·均質化 ·殺菌処理後冷 却した乳または乳製品に、上記スターターを混合し、発酵'冷却すれば、プレーンョ 一ダルトを製造することができる。
[0023] 本発明血液型別結合性 L. gasseri乳酸菌を用いて製造された飲食品は、飲食品中 に同菌を含有する。該飲食品を ABO式血液型の適合したヒトが摂取すると、該飲食 品中の本発明血液型別結合性 L. gasseri乳酸菌が腸管に結合 ·増殖し、腸内バラン スの調整'維持やプロバイオテイクス機能の早期発揮が見込まれる。したがって、該 飲食品は一般の飲食品としてのみならず、健康増進目的の機能性食品'保健栄養 食品'介護用食品'健康食品等として有用である。
[0024] また本発明は、表面プラズモン共鳴スペクトルによる乳酸菌のスクリーニング方法を 提供する。本発明のスクリーニング方法は、血液型別に適合する乳酸菌を選別する ための方法である。本発明のスクリーニング方法は、表面プラズモン共鳴スペクトル により乳酸菌と血液型別ヒト腸管ムチン及び ABO式血液型抗原との結合性を測定す ることによりスクリーニングを行うものであって、（i)特定の血液型の ABO式血液型抗 原と一定量以上の結合能を有すること、（ii)上記 (i)における特定の血液型以外の血 液型の ABO式血液型抗原と一定量以上の吸着能を有しな 、こと、 (iii)上記 (i)にお ける特定の血液型のヒト腸管ムチンと一定量以上の結合能を有すること、を指標とし て選別する。 ABO式血液型抗原との結合能を測定することで、主に血液型を決定す る抗原以外の部分 (例えば、糖鎖の非末端部分の部分構造、シアル酸や硫酸基の 発現部位、ムチンタンパク質部位）に結合する乳酸菌を排除することができ、血液型 特異性の高 、乳酸菌のスクリーニングを可能とする。本発明にお 、てヒト A型腸管ム チンとは、 ABO式血液型の A型のヒト由来の腸管ムチンを指す。同様に、ヒト B型腸管 ムチンとは、血液型 B型ヒト由来腸管ムチンであり、ヒト 0型腸管ムチンとは、血液型 0 型ヒト由来腸管ムチンである。
[0025] 本発明のスクリーニング方法では、 ABO式血液型抗原及びヒト腸管ムチンをプロ一 ブとして表面プラズモン共鳴スペクトル解析を行う。表面プラズモン共鳴スペクトルを 利用した生体分子間相互解析装置としては、例えば BIACORE (ビアコア株式会社） を用いることができる。 ABO式血液型抗原及びヒト腸管ムチンの調製方法については 、上述のとおりである。プローブを固定化する場合は、公知の固定ィ匕方法によって行 うことができる。固定化方法は、物理的吸着による方法または共有結合による吸着で もよい。一例を挙げれば、チップをストレプトアビジンでコートし、プローブをピオチン 化すれば、ピオチン-アビジン結合により、容易に固定ィ匕することができる。あらかじ めストレプトアビジン化した市販のチップ（BIACORE社）を使用してもよ！/、。
[0026] 本発明の方法は表面プラズモン共鳴スペクトルによるものであるため、上記「結合 能」は、レゾナンスユニット（RU)で示される。 1RUは、 1mm2に lpgの物質が結合するこ とを表す。本発明の方法において、上記「一定量以上の結合能」は、「100RU」を基準 として判断する。すなわち、「100RU」以上の測定値によって、乳酸菌がプローブに一 定量以上結合すると判断する。例えば、血液型 A型ヒト由来腸管ムチンをプローブと したときの測定結果が 100RU以上あれば、その乳酸菌は該腸管ムチンに結合する乳 酸菌である。 RU値は、測定条件により変化しうる。特に、サンプル濃度および流速は 、 RU値の変化に対する影響が大きい。本方法における 100RUは、例えば、「25°C、サ ンプル濃度： 0.1— 0.5mg/mL、流速： 3_10 /ζ l/min」における数値である。上記範囲で あれば、上記諸条件を変化させても RU値に変動はないため、結合の有無を「100RU 」で判断できる。さらに、サンプル濃度等の諸条件を上記範囲外に変化させた場合で も、実質的に上記条件における 100RUと同等であれば、本方法における「100RU」に 含まれる。また、より選抜基準を厳しくする目的であれば、「100RU」以外の数値によつ て選別してもよい。本発明の方法においては、 RU値が高い菌ほどプローブ (リガンド） との強い結合能を有する菌であることを意味する。そこで、より強い結合力を有する菌 を求める目的であれば、 100よりも高い RU値で結合する菌をスクリーニングしてもよい 。例えば、 150,200,300,400,500,600,700,800,900,または 1000RUでもよぐ後述の実 施例のように 2000RUを基準としてスクリーニングしてもよい。逆に、 目的としない血液 型に対する認識にっ 、ては、「100RU以下」より厳し 、数値を基準としてスクリーニン グしてちよい。 ί列えば、 90,80,70,60,50RUを基準としてちよい。
[0027] なお、血液型別結合性乳酸菌は、本発明のスクリーニング法にぉ 、て、血液型別ヒ ト腸管ムチンをプローブとしたときの測定値 (RU)が ABO式血液型プローブを用いた ときの測定値 (RU)より低くなると予想される。これは、ヒト腸管ムチンをチップに固定 化した場合のヒト腸管ムチンに結合している血液型抗原 (糖鎖）は、チップ単位面積 あたりで比較すると、血液型抗原 (糖鎖)のみをチップに固定ィ匕した場合に少なくなる 力 と考えられる。
[0028] 表面プラズモン共鳴スペクトル測定の際、被験菌が非特異的吸着により菌凝集を 起こし、 RU値が異常に高くなる場合がある。そのため、ヒト由来腸管ムチンや ABO式 血液型抗原との吸着が測定結果に正しく反映されなくなる。そこで、 RU値が異常に 高い場合は、非特異的吸着 (菌凝集)を起こしていると疑われるとして、該乳酸菌をス クリーニングから除外することができる。
[0029] 本発明のスクリーニング方法の対象は、乳酸菌であれば特に限定はない。あえて対 象 ί列 挙けるとすれは、 Lactobacillus acidopnilus, Lactobacillus crispatus, Lactooaci llus amylovorus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johns onii, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus zeae, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus delbruekn subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbruekn subsp. 1 actis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus murinus, Bifidobacterium animalis, Bifi dobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacteriu m longum, Bifidobacterium pseudolongum, Enterococcus faecium, Enterococcus feca lis, Streptococcus thermophilusについて好適に用いることができる。より好適な対象 例としては、 Lactobacillus属であり、最も好適な対象例としては、 Lactobacillus acidop hilusグループ乳酸菌である。
[0030] 本発明の方法によりスクリーニングされた乳酸菌は、特定の ABO式血液型のヒトの 腸管に結合しやすい乳酸菌である。該特定血液型のヒトが、本発明の方法によりスク リー-ングされた乳酸菌を摂取することにより、短期間での腸内バランスの向上など の効果により、健康増進を図ることができる。そのため、本発明の方法によりスクリー ユングされた乳酸菌は、特定血液型ヒト用の飲食品、機能性食品、特定保健用食品 、乳製品、乳酸菌飲料などに適用できる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0031] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実 施例に限定されるものではない。
[0032] [実施例 1] ガス産生試験
ヨーグルト生産に使用する乳酸菌は、ガスを産生しないことが望ましい。これは、我 が国の法令では密封容器で市販することが義務付けられているためであり、またガス 産生に伴う容器膨張による製品不良や破裂を防ぐためでもある。そこで 238株につい て、ガス産生試験を実施した。
[0033] 乳酸菌を、 MRS Broth (DIFCO)で 2回賦活培養（37°C,18h)した。アルミキャップ付 き試験管にあら力じめダーラム管及び MRS Broth (5ml)を共に入れて滅菌（121°C, 1 5分）した。ダーラム管は開口部を下に向けてあり、滅菌時にダーラム管中から気泡が 除かれる。上記の滅菌したアルミキャップ付き試験管に、約 109cfo/mLの乳酸菌液 10 μ Lを接種し、嫌気的に 37°Cで 24時間培養した。培養終了後、ダーラム管内に蓄積 したガスの有無を目視観察した。明らかな気泡が観察された場合に、ガス産生有り（+ )と判定した (表 1)。
[0034] [実施例 2] 血液型抗原認識性の解析
血液型適合性ヨーグルト用の乳酸菌を取得するため、血液型抗原を認識して結合 する乳酸菌を、表面プラズモン共鳴スペクトル測定により選抜することにした。供試菌 として、乳酸菌 Lactobacillus acidophilusグループに属する 238株（L. gasseri, L. plant arum, L. crispatus, L. amylovorus, L. casei, L. salivarius, L. brevis, L. fermentum等 )を準備した。表面プラズモン共鳴スペクトル解析装置は、 BIACORE1000を用いた。
[0035] 2- (1)アナライトの調製
各菌株は起菌後 MRS培地にて 3回継代し、 12時間培養後 1.5ml容チューブに 500 μ 1分注した。本溶液を遠心分離（6,000rpm, 4°C, lOmin)して得た菌体を PBS (pH7.2)中 で 2回洗浄後、凍結乾燥した。本菌体を HBS- EP buffer (0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% Surfactant P20)を用いて O.lmg/ml濃度に調製し、アナラ イト溶液とした。
[0036] 2- (2)血液抗原プローブおよびチップへの固定ィ匕
菌選抜に用いるプローブとして、ヒト ABO式血液型物質の抗原構造を使用した。具 体的には、下記の 3糖糖鎖ビォチ二ルイ匕ポリマープローブ (生化学工業製）（以下、「 BP-プローブ」とも記載する）を使用した。
A抗原プローブ： [GalNAc a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-]
B抗原プローブ： [Gal a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-]
H抗原プローブ： [Fuc a l-2Gal-]
上記 BP-プローブの化学構造につ 、て図 1に、糖鎖構造につ!、て図 2に示す。
[0037] 上記血液抗原 BP-プローブを、 HBS-EP buffer(pH7.4)で O.lmg/lOmlに調製した。
本溶液をセンサーチップ SAに添カ卩して、ピオチン'アビジン反応により、プローブをセ ンサーチップ表面に固定した。センサーチップ SAとは、ストレプトアビジンが固定ィ匕さ れて 、る BIACORE専用チップである。
[0038] 2- (3)ヒト腸管ムチンの調製およびチップへの固定ィ匕
菌選抜に用いるもう 1つのプローブとして、ヒト大腸ムチンを調製した。ヒト A型腸管（ 直腸)およびヒト 0型腸管 (直腸)は東北大学大学院医学研究科より、標本採取試料 として分譲された。粘液ムチン層は、直腸正常部位カゝら表層搔き取り法で採取した。 ムチン層は、 Folchの溶媒およびジェチルエーテルにより脱脂後、 4M塩酸グァ-ジン に溶解させた。ゲルろ過精製を行い、粗精製のヒト A型または 0型腸管ムチン (human colon mucin： HCM,以下において、時に A型腸管ムチンを A-HCM、 0型腸管ムチン を 0- HCMと略す）として、試験に供した。ゲルろ過精製は、 Purushothaman, S. S. et al, Adherence of Shigella dysentenae 1 to Human colonic Mucin. Curr. Microbiol., 42(6), 381-387 (2001).に記載されたヒト大腸ムチンの精製方法に基づき実施した。 移動層は 4Mグァ-ジン塩酸塩 (GHCL)溶液、カラムは Toyopearl HW-65F (90cm X 2 .6cm, Tosoh. Tokyo. Japan)を用いた。検出に関しては、中性糖をフエノール硫酸法（ 490nm)で、タンパク質を 280nmで測定をした。タンパク質吸収があり、かつ中性糖含 量の最も高いピークを選択し、さらに分子量約 200万以上を目安に分取し、ヒト大腸ム チン (HCM)とした。得られた HCMについて、ヒト血液型基質 A型抗原性を抗体により 確認した。なお、上記試料採取に関しては、医学研究科の倫理委員会を経て実施し 、また患者の同意を得ている。
[0039] HCMの BIACORE用チップへの固定化は、ァミンカップリング法により行った。まず、 予めカルボキシメチルデキストラン基を導入したセンサーチップ CM5に対して、 75.0m g/mlの N- ethyト N，- (3- dimethyl aminopropyト carbodiimide hydrochloride (EDC)を 5 0 μ 1および 11.5mg/mlの N- hydroxysuccinimide (NHS)を 50 μ 1を混合した混合試薬を 流し、デキストラン末端に導入されているカルボキシル基を活性ィ匕させた。そこへ 120 μ 1固定化用酢酸 buffer (ρΗ4.0)に HCM-A 30 1をカ卩えた混合溶液を流し、ァミン' カップリング反応により共有結合させた。ついで、 1M ethanolamine hydorochloride-N aOH pH8.5を用いて、リガンドが結合していない場所の残存活性基のブロッキングを 行った。 Running Bufferには HBS- EP bufferを用いた。
[0040] 2- (4) BIACORE1000による測定
上記の血液型抗原プローブ固定化チップまたは HCM固定化チップを用い、上記ァ ナライトの血液型抗原に対する相互作用を BIACOREにより解析した。 BIACOREの測 定条件を下記に示す。
ランニング緩衝液： HBS-EP buffer(pH7.4)
サンプル添カ卩量：20 1
流速： 3 μ 1/min
温度： 25°C
再生溶液： 1Mグァ-ジン塩酸塩溶液 5 μ 1
[0041] BIACOREによる解析にぉ 、て、アナライトと血液型抗原との相互作用は、レゾナン スユニット（RU)によって表される。 1レゾナンスユニット（RU)とは、 1mm2に物質 lpgが 結合したことを表す。結果を表 1に示す。
[0042] [表 1]
A型適合性乳酸菌の選抜
A抗原認識性/ A抗原認識性/
菌株名 A抗原認識性 ガス産生 B抗原認識性 H抗原認識性 胆汁酸耐性 胄酸耐性
B抗原認識性 H抗原認識性
Figure imgf000017_0001
(RU) (RU) (RU) (RU) (RU) (OD650) (生残率％)
MEP 165501 0.0 - 6.5 0.0 956.6 0.0 0.0 0.0 0.112 0.003 EP 165502 0.0 - 716.7 0.0 997.2 0.0 0.0 48.0 0.135 0.874 EP 165503 0.0 - 0.0 00 931.1 0.0 0.0 87.0 0.224 1.798
L gasseri OLL 2804 2086.3 - 28.6 72.9 5.1 409.1 829.2 0.0 0.119 24.906
L. gasseri OLL 2818 3981.3 - 52.3 76.1 18.7 212.9 598.2 0.0 0.117 6.212
0型適合性乳酸菌の選抜
H抗原認識性/ H抗原認識性/ 0-HC A-HCM
菌株名 H抗原認識性 ガス産生 A抗原認識性 B抗原認識性 胆汁酸耐性 胃酸耐性
A抗原認識性 B抗原認識性 認識性 認識性
(RU) (RU) (RU) (RU) (RU) (OD650) (生残率％) EP 165504 14.8 + 7957.2 0.0 3.9 3.8 38.0 101.4 1.310 0.003 EP 165505 0.0 - 2415.2 0.0 40.2 0.0 0.0 539.6 1.164 0.000
MEP 165506 5.3 - 2336.3 0.0 12.5 0.4 0.0 51.3 0.135 0.851 し gasseri OLL 2827 25761.8 - 32.0 805.1 47.4 543.5 509.0 893.5 0.1 18 0.959
L gasseri OLL 2915 1061.7 - 0.0 00 10.9 97.4 6233.0 665.7 0.086 0.585
?3
[0043] 2- (5)菌の選抜 (その 1)
これまでの結果から、乳酸菌を選抜した。まず、上記 BIACORE測定結果および実 施例 1のガス産生試験結果から、選抜を行った。
[0044] 血液型 A型用ヨーグルト乳酸菌として、（i) A抗原認識性及び (ii)ガス産生の観点か ら選抜した。選抜基準は、
(i) A抗原認識性： BIACOREによる測定にぉ 、て、 A抗原プローブによる結果が 2000 RU以上（上位約 35%)
(ii)ガス産生：ガス産生試験でガス産生が認められな ヽこと (-)
とした。これにより、 Lactobacillus238菌株を 43菌株までに絞った。
[0045] 同様に、血液型 0型用ヨーグルト乳酸菌として、 (i) H抗原認識性及び (ii)ガス産生 で選抜した。選抜基準は、
(i) H抗原認識性： BIACOREによる測定にぉ 、て、 H抗原プローブによる結果が 700R U以上（上位約 13%)
(ii)ガス産生：ガス産生試験でガス産生が認められな ヽこと (-)
とした。これにより、 Lactobacillus238菌株を 14菌株までに絞った。
[0046] 2- (6)菌の選抜 (その 2)
上記のとおり、血液型 A型用ヨーグルト乳酸菌候補として、 A抗原を認識し、かつガ ス産生が認められない菌株 43株を選抜した。さら〖ここれらの中力ら、（i)他血液型抗 原 (B抗原および H抗原)の認識性がな ヽこと (ii) A抗原を特異的に認識すること、の 観点から選抜した。選抜基準は、
(i)他血液型抗原 (B抗原および H抗原)の認識性
B抗原認識性: BIACOREによる測定において、 B抗原プローブによる結果が 100RU以 下、
H抗原認識性： BIACOREによる測定において、 H抗原プローブによる 100RU以下
(ii) A抗原の特異的認識性
A抗原認識性/ B抗原認識性の比が 70以上で、 A抗原認識性/ H抗原認識性の比が 1 00以上
とした。これらにより、 43菌株から 13菌株を選抜した。 [0047] 同様に、血液型 O型用ヨーグルト乳酸菌候補についても、選抜した。選抜基準は、
(i)他血液型抗原 (A抗原および B抗原)の認識性
A抗原認識性： BIACOREによる測定において、 A抗原プローブによる結果が 100RU 以下、
B抗原認識性: BIACOREによる測定において、 B抗原プローブによる結果が 100RU以 下、
(ii) H抗原の特異的認識性
H抗原認識性/ A抗原認識性の比が 800以上で、 H抗原認識性/ B抗原認識性の比が 20以上
とした。これらにより、 14菌株から 5菌株を選抜した。
[0048] 2- (7)菌の選抜 (その 3)
上記で選抜した菌株について、さらに、血液型別ヒト大腸ムチン (HCM)認識性によ り選抜した。
[0049] 血液型 A型用ヨーグルト乳酸菌候補については、（i)A-HCMを認識するものを選抜 し、（ii) O- HCMを認識するものを除いた。すなわち、ヒト HCMによる BIACORE測定結 果において（i)A-HCM認識性が 100RU以上、（ii) O- HCM認識性が 100RU以下であ ることを選抜基準とした。また、 MEP165511株、 MEP165530株は A-HCM認識性が 100 00RU以上であり、菌の凝集が疑われたため除外した。上記選抜により、 13菌株から 2 菌株（L.gasseri OLL 2804, L.gasseri OLL 2818)を選抜した。
[0050] 同様に、血液型 0型用ヨーグルト乳酸菌候補にっ 、ては、（i) 0- HCMを認識するも のを選抜し、（ii)A-HCMの認識性が比較的に高いものを除いた。すなわち、ヒト HCM による BIACORE測定結果において（i) O- HCM認識性が 100RU以上、（ii)A-HCM認 識性が 1000RU以下であることを選抜基準とした。上記選抜により、 5菌株から 2菌株（ L.gasseri OLL 2827, L.gasseri OLL 2915)を選抜した。
[0051] [実施例 3] 胃酸耐性試験および胆汁酸耐性試験
ヨーグルトとして体内に取り込まれた乳酸菌が、その機能を十分に発揮するには、 生きたまま腸管に留まることが望ましい。そのため、胃酸耐性試験および胆汁酸耐性 試験を実施した。 [0052] 3—（1)胃酸耐性試験
ろ過滅菌した PH2の人工胃液 [NaCl(0.2%)、 Pepsin(l : 5000、東京化成工業) (0.35 %) : 1N塩酸で pH2に調整] 9mlに Lactobacilli MRS broth (DIFCO)で 2回賦活培養（37 。C、 18時間）し、生理食塩水で 2回洗浄した乳酸菌の菌体懸濁液を lml添加し、好気 的に 37°Cで 2時間接触後、 lmlを取り 67mMのリン酸緩衝液 (pH6.5) 9mlに添加し、反 応を停止させた。人工胃液に接触前および接触後の生菌数を Lactobacilli MRS Agar (DIFCO)を用いて計測し、生存率 (%)を算出した。
[0053] 選択基準は菌の種類により異なる力 今回選抜された菌種は全て Lactobacillus gas seriであるため、 0.50以上とした。血液型 A型用ヨーグルト乳酸菌（L.gasseri OLL 280 4, L.gasseri OLL 2818)、血液型 0型用ヨーグルト乳酸菌（L.gasseri OLL 2827, L.ga sseri OLL 2915)のいずれも、上記基準を満たした（表 1)。
[0054] 3 - (2)胆汁酸耐性試験
Lactobacilli MRS broth (DIFCO)で 2回賦活培養（37°C、 18時間）した乳酸菌を 0.9 %の Bacto- Oxgall (DIFCO)を含む Lactobacilli MRS broth (DIFCO) 5mlに 10 μ 1接種 し、嫌気的に 37°Cで培養した。培養 18時間後に培地の濁度（OD )を測定した。
650
[0055] 選択基準は菌の種類により異なる力 今回選抜された菌株は全て Lactobacillus gas seriであるため、 0.08以上とした。血液型 A型用ヨーグルト乳酸菌（L.gasseri OLL 280 4, L.gasseri OLL 2818)、血液型 O型用ヨーグルト乳酸菌（L.gasseri OLL 2827, L.ga sseri OLL 2915)のいずれも、上記基準を満たした (表 1)。上記 4菌株の科学的性質 を表 2に示す。
[0056] [表 2]
A型 0型
2804株 2818株 2827株 2915株 培地上の 円形、 円形、 円形、 円形、 コロニー性状 淡黄色、 淡黄色、 淡黄色、 淡黄色、
(Lactobac i l l i MRS smooth型、 smooth型、 smooth型、 smooth型、
Agar, D I FCO) 踊平状 扁平状 届平状 扁平状
菌形態 桿菌 桿菌 桿菌 桿囷 グラム染色 陽性 陽性 陽性 陽性 乳酸発酵形式 ホモ乳酸発酵 ホモ乳酸発酵 ホモ乳酸発酵 ホモ乳酸発酵 好気的発育 + + + +
15°C 一 15°C 一 15°C 一 15°C 一 発育温度
45°C + 45°C + 45°C + 45°C + ァラビノース - - - - キシノース 一 一 - ― ラムノース - - ― リボース - - ―
グルコース + + + + 糖 マンノース + + + +
フルクトース + + + + 類
ガラク卜ース + + + + 発 シュクロース + + + +
セロビオース + + + + 酵
ラク卜ース + + 一 性 トレハロース + + + +
メリビオース + - - ラフイノース - - - - メリチトース ― ― ― マンニトール ― ― - ソルビ 1 ^一ル + ― - ― ガス産生 - - 胃酸耐性 （生残率％) 24 906 6. 212 0. 959 0. 585 胆汁酸耐性 （OD650) 0. 119 0. 117 0. 118 0. 086 施例 4]血液型別結合性乳酸菌によるヨーグルトの製造
上述で選抜した乳酸菌（血液型 A型用ヨーグルト乳酸菌： L.gasseri OLL 2804, L.ga sseri OLL 2818、血液型 O型用ヨーグルト乳酸菌： L.gasseri OLL 2827, L.gasseri OL L 2915)を用いてヨーグルトを製造した。
[0058] 4 （1) L. gasseri OLL 2804を用いたヨーグルトの製造例
L. gasseri OLL 2804株を用いてプレーンヨーグルトの調製を行った。まず、 10%脱 脂粉乳培地に、 L. gasseri OLL2804株、 L. bulgaricus JCM 1002T、 S. thermophilus ATCC19258を各 1%ずつ接種し、 37°Cで 15時間培養してバルタスターターを調製し た。
[0059] 95°Cで 5分間加熱処理したヨーグルトミックス（SNF:9.5%、 FAT:3.0%)に、 L. bulgar icusJCM 1002τ及び S. thermophilus ATCC 19258のスターターを各 1%、 L. gasseri OLL 2804株のスターターを 5%接種して、 43°Cで 4時間発酵させた。
[0060] 発酵'冷却直後の L. gasseri OLL 2804、 L. bulgaricus JCM 1002T、 S. thermophilus ATCC 19258それぞれの生菌数は 12.5 X 10 7 CFU/mL、 14.0 X 10 7 CFU/mL、 11.8 X 10 8 CFU/mLであり、風味、物性はいずれも良好であった。また、上記ヨーグルトを 10°Cで保存したところ、保存 25日目のし gasseri OLL 2804、 L. bulgaricus JCM1002T 、 S. thermophilus ATCC 19258それぞれの生菌数は、 9.60 X 10 7 CFU/mL, 7.50 X 10 7 CFU/mL, 11.0 X 10 7 CFU/mLであり、 L. gasseri OLL 2804株の生残率は保存 1日目の 77%と、その生菌数の低下は僅かであった。保存品の風味、物性も良好で めつに。
[0061] 4- (2) L. gasseri OLL 2818を用いたヨーグルトの製造例
L. gasseri OLL 2818株を用いてプレーンヨーグルトの調製を行った。まず、 10%脱 脂粉乳培地に、 L. gasseri OLL2818株、 L. bulgaricus JCM 1002T、 S. thermophilus ATCC19258を各 1%ずつ接種し、 37°Cで 15時間培養してバルタスターターを調製し た。
[0062] 95°Cで 5分間加熱処理したヨーグルトミックス（SNF:9.5%、 FAT:3.0 %)に、 L. bulga ricusJCM 1002T及び S. thermophilus ATCC 19258のスターターを各 1%、 L. gasser i OLL 2818株のスターターを 5%接種して、 43°Cで 4時間発酵させた。
[0063] 発酵'冷却直後の L. gasseri OLL 2818、 L. bulgaricus JCM 1002T、 S. thermophilus ATCC 19258それぞれの生菌数は 14.0 X 10 7 CFU/mL, 20.0 X 10 7 CFU/mL, 11.4 X 10 CFU/mLであり、風味、物性はいずれも良好であった。また、このヨーグルトを 10°Cで保存したところ、保存 25日目のし gasseri OLL 2818、 L. bulgaricus JCM1002T 、 S. thermophilus ATCC 19258それぞれの生菌数は、 11.4 X 10 7 CFU/mL, 7.00 X 10 7 CFU/mL, 10.0 X 10 7 CFU/mLであり、 L. gasseri OLL 2818株の生残率は保存 1日目の 82%と、その生菌数の低下は僅かであった。保存品の風味、物性も良好で めつに。
産業上の利用可能性
本発明により、ヒト ABO式血液型に適合する乳酸菌およびそのスクリーニング方法 が提供された。本発明の乳酸菌または本発明のスクリーニング方法により得られる乳 酸菌株は、 ABO式血液型別に腸管結合性の高い乳酸菌であり、該乳酸菌を飲食品 製造に応用することにより血液型別機能性ヨーグルトをはじめとする、新しいプロバイ ォテイクス飲食品の提供が可能になる。

Claims

請求の範囲
[1] 下記 (a)から（c)の ヽずれかの式で表されるヒト ABO式血液型抗原に結合能を有する 腸管結合性 Lactobacillus gasseri乳酸菌。
(a) [GalNAc a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-]
(b) [Gal a 1-3 (Fuc a 1-2) Gal-]
(c) [Fuc a l-2Gal-]
[2] 受託番号： NITE BP-25、受託番号： NITE BP-26、受託番号： NITE BP-27、受託番 号： NITE BP- 28のいずれかで特定される、請求項 1に記載の Lactobacillus gasseri乳 酸菌。
[3] 請求項 1または 2に記載の Lactobacillus gasseri乳酸菌を含む、ヒト ABO式血液型適 合性発酵乳および乳製品製造用スターター。
[4] 請求項 1または 2に記載の Lactobacillus gasseri乳酸菌を含有する、飲食品。
[5] 請求項 1または請求項 2に記載の Lactobacillus gasseri乳酸菌を含有する、発酵乳お よび乳酸菌飲料。
[6] 下記条件 (i)力 (iii)を満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトルによ る乳酸菌のスクリーニング方法。
(i) A型のヒト ABO式血液型抗原との結合能を示す RU値が 100RU以上であること
(ii) B型および Zまたは H型のヒト ABO式血液型抗原との結合能を示す RU値が 100R U以下であること
(iii)ヒト A型腸管ムチンとの結合能を示す RU値が 100RU以上であること
[7] 下記条件 ω力 (iii)を満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトルによ る乳酸菌のスクリーニング方法。
(i) B型のヒト ABO式血液型抗原との結合能を示す RU値が 100RU以上であること
(ii) A型および Zまたは H型のヒト ABO式血液型抗原との結合能を示す RU値が 100R U以下であること
(iii)ヒト B型腸管ムチンとの結合能を示す RU値が 100RU以上であること
[8] 下記条件 (i)力 (iii)を満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトルによ る乳酸菌のスクリーニング方法。 (i) H型のヒト ABO式血液型抗原との結合能を示す RU値が 100RU以上であること
(ii) A型および Zまたは B型のヒト ABO式血液型抗原との結合能を示す RU値が 100R U以下であること
(iii)ヒト 0型腸管ムチンとの結合能を示す RU値が 100RU以上であること
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