JP3695648B2 - 抗高血圧性ジペプチドおよびトリペプチドを産生するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ - Google Patents
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Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、新規微生物およびその使用に関する。より正確には、Lactobacillus helveticusの新規株、その生理学上の特徴およびその使用、例えば食品産業および医薬品産業における使用を記載する。
【０００２】
（背景技術）
Sneathらによって編集されたBergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol.2, Williams & Wilkins, Baltimore, London, Los Angeles, Sydney, 1984, Part 14, p.1208 onwardsには、表題「Regular, Nonsporing Gram Positive Rods」として、Lactobacillus属に属する微生物の特徴と分類、さらにLactobacillus helveticus種の特性が記載されている。一般的に、Lactobacillus helveticus株は、発酵乳製品およびチーズなどの乳製品から単離され、従来、それらはチーズ、特にエメンタールおよびグリュイエルタイプのチーズを製造する際に出発微生物として使用されてきた。
【０００３】
Lactobacillus helveticus株の生物学的効果は先行技術で述べられている。例えば、国際特許出願ＷＯ９９／１６８６２、Yamamotoらによって、Lactobacillus helveticusＣＭ４、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６０が大量のトリペプチドＶal-Ｐro−Ｐroおよび／またはＩle−Ｐro−Ｐroを産生することが可能であって、高い細胞外タンパク質分解活性を持つことが記載されている。また、この公開は、上記トリペプチドおよび細菌を含有する発酵乳製品および上記細菌によるトリペプチド配列物を含有する産物を発酵することによるその調製方法が記載されている。
【０００４】
米国特許５,４４９,６６１のNakamuraらによって、トリペプチド配列Ｖal-Ｐro−Ｐroを含有するペプチドの調製と高血圧を抑えるためにそのペプチドを使用することが記載されている。このペプチドは、無脂肪乳とLactobacillus helveticusＪＣＭ １００４株を発酵させ、その後ペプチドをクロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥を行って調製される。
【０００５】
また、Yamamotoらは、微生物Lactobacillus helveticusＣＰ７９０(J. Biochem., 1993, 114:740)由来のプロテイネースの精製および特徴分析を記載している。さらに、Yamamoto1らは、αＳ１およびβカゼインを上記タンパク質加加水分解酵素で加水分解し、その得られたペプチドをＡＣＥに対する阻害効果を試験した研究を報告している（J. Dairy Sci, 1994, 77:917）。試験したペプチドは、全部で２５個であり、その分子サイズと効果は大きく異なっていた。最も有効なペプチドは、βカゼインから得られた３つのペプチドであり、８、１８および２７のアミノ酸を各々含有する。また、その研究は、Lactobacillus helveticusＣＰ７９０株とタンパク質加水分解酵素活性を欠くその変異株ＣＰ７９１を用いて発酵したミルクのＡＣＥ活性を比較した。それによると、前者は自発性高血圧症ＳＨＲラットにおいて有効性が見出されたが通常のラットでは効果はなく、一方、後者は全く活性を示さなかった。
【０００６】
乳酸菌およびそのLactobacillus helveticus種は広く研究され、伝統的な出発物として、および健康増進物質としても使用が推奨されている。および乳業などの食品産業における出発物およびプロバイオティックスとしてさらに自然産物だけでなく、医薬産業においても、有用である新規の有効な微生物を見出そうとする分野での絶えない追求がいまだ存在する。
【０００７】
（発明の詳細）
本発明の目的は、卓越したタンパク質分解性および生理学上の特性を持ち、これによって出発物としてかつ健康増進物質としても使用するのに非常にふわさしいLactobacillus helveticusの新規株を提供することである。
【０００８】
本発明によって、この株は、消費者がそのままで、もしくは食用に適した食品、機能食品または医薬品に使用するために消費者に提供される。
【０００９】
即ち、本発明は、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７に関する。
【００１０】
また、本発明は、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株を含有する細菌調製物に関する。
【００１１】
本発明は、さらに食品産業または医薬品産業におけるLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７の使用に関する。
【００１２】
本発明は、さらに、上記の株を含むか、上記株を用いて調製される栄養素などの食用製品および医薬品に関する。
【００１３】
本発明は、治療用物質として使用するためのLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株にも関する。
【００１４】
本発明は、高血圧症の処置で使用するためのLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株にも関する。
【００１５】
また、本発明は、抗高血圧性製品を調製するためにLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株を使用することに関する。
【００１６】
さらに、本発明は、抗高血圧性製品を調製するための方法に関する。該方法はLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株を用いる。
【００１７】
本発明は、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈの新規株を基にしたもので、１９９９年１１月３日に寄託番号ＤＳＭ１３１３７で受託機関 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)に寄託されており、その株は下記特徴を有する：
・Lactobacillus helveticus株は、グラム陽性であり、桿状形の長い細胞である。細胞増殖温度範囲は約３５〜４５℃であって、至適温度は約３７〜４２℃である。
・Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、３７℃〜４２℃の温度のミルク中で良好に増殖し、乳酸（ＤＬ）を２.５〜２.９％産生する。増殖の至適ｐＨは約４.５〜７である。ｐＨ無調整培養では、ミルク中ｐＨ３.３〜３.６の範囲内に低下する。
・また、この株は、Lactobacilluで通常使用される培地で良好に増殖し、炭素源素としてクエン酸塩を用い得る。
【００１８】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、下記のような炭水化物を発酵する：
【表１】
【表２】
【００１９】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、タンパク分解性について活性である。実施例において下記するように、o-フタルジアルデヒドのタンパク質分解を基にしているＯＰＡ法によって測定すると、この株のタンパク質分解活性は０.３〜０.６の値であった。タンパク質分解活性は、出発物としての使用と生物学的活性物質の調製の両方に利用し得る。
【００２０】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、低いｐＨ値に非常に良好な耐性がある。このことは、保存能および生理学的活性の両観点から重要な特性である。実施例で記載したが、該株は、ｐＨレベル４で良好で、ｐＨレベルが３であっても約４時間は耐性があり、特に乳製品においてその保存性が卓越しており、ｐＨ２のような低いｐＨで４時間まで耐性がある。その結果に基づくと、この株は、胃を通過する消化管で生き延びて、大腸で生存していると予測され得る。
【００２１】
また、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、胆汁への卓越した耐性を示し、胆汁濃度０.５％まで耐性がある。この結果も、胃から消化管および小腸で生きぬき、大腸で生存を維持することを示している。
【００２２】
また、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、酸化窒素を産生する能力をもつことが明らかになった。酸化窒素の産生は、酸化窒素合成酵素の活性化にによって提供された酸化窒素の形成として研究した。この株は、Ｊ７７４マクロファージ細胞系では０.４μＭのＮＯが、Ｔ８４ヒトエンテロサイト細胞系では約２〜６μＭのＮＯが産生する。この特性は非常に重要である：適切量のＮＯ産生の活性化は、例えば炎症応答および血圧調節において有効である。
【００２３】
また、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、生物活性ペプチド産生能を示すことが見出した。フィンランド特許出願９９２３６０の実施例で、抗高血圧性ペプチドを含有する十分保存し得る産物が２工程法によってどのように調製されるかが記載されている。その第１工程で、上記生物活性ペプチドは発酵によって、例えば、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ単独もしくは上記株と別の乳酸菌株との組み合わせで多様な乳製品を発酵することによって産生される。この公開の実施例によれば、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈにより、既知の抗高血圧性トリペプチドＶＰＰ（Ｖal-Ｐro-Ｐro）およびＩＰＰ（Ｉle-Ｐro-Ｐro）各々１３〜１５ｍｇ／ｌおよび６〜８ｍｇ／ｌが産生される。この公開によれば、異なるペプチド混合物は発酵反応中に形成される。発酵持続時間が十分である場合、比較的小さなジおよびトリペプチドが得られる。
【００２４】
上記記載の特徴を基にすると、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、プロバイオテック生物体であると考え得る。
【００２５】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、例えば乳業、例えば発酵乳製品およびチーズの製造業における従来の出発細菌として有用である。チーズ、特にエメンタールチーズにおける使用は、好ましい態様であると考えられる。
【００２６】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、特定製品、例えば発酵乳製品、特に生化学的ペプチドを含有する酸乳およびヨーグルトなどの製造において十分利用し得る。
【００２７】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、食用物質の製造においてそのままで機能物質として、または食用物質中の成分または添加物としてさらに使用し得る。
【００２８】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、例えばＭＲＳブロス、生乳、再構成した粉末乳または超音波処理したミルクなどのミルク中、あるいは一般的にLactobacilliに使用されるＲogosaまたはＭＲＳなどの培地で常法により細菌を培養して生成される。適当な培養条件および他のパラメーター、例えば温度、ｐＨおよび通気などの選択は、当業者には既知である。温度は例えば３０〜４５℃であってよい。ｐＨ調整は必要かもしれない。
【００２９】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈを、単独で培養し、純粋な培養物を形成することも可能である。また、その株は混合培養物として、例えばその分野で既知の別の出発微生物と共に培養してもよい。所望であれば、異なる種類の微生物を別々に培養し、その後に所望の割合で異なる微生物を組み合わせることによって、混合培養物を提供することも可能である。微生物組み合わせ物は、最良の可能な特性が最終産物に提供され、雑菌混入の危険性が排除されるように適切に選択する。
【００３０】
培養後、細胞懸濁液を回収し、そのままで使用するか、例えば濃縮、乾燥または凍結乾燥などの所望の方法で処理する。
【００３１】
当然、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、純粋培養物としてまたは混合培養物として、別々に、もしくは例えば従来的に使用され、市販入手し得る出発物またはプロバイオティクスと一緒に使用し得る。
【００３２】
本発明に関して、凍結乾燥され適当なアジュバンド中でLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７を含有する細菌調製物が好ましい調製物と考える。
【００３３】
本発明の細菌調製物は、上記細菌をそのまま、または他の構成成分、例えば他の微生物と組み合わせて含んでもよい。
【００３４】
本発明に関して、この株は食用製品、特に(機能)食品、自然製品または医薬品の製造で使用し得る。
【００３５】
本発明の食用製品は、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７、またはそれと同じものと（最終）製品の従来成分を含む細菌産物を用いて調製する。この細菌は、その製造過程中の食品または別の製品に添加するか、または最終製品に添加し得る。細菌細胞が全くなく、ただ細菌増殖中に生成した産物、例えば最終製品に残る風味付けや香り付けの物質または生物活性を持つ物質が最終製品に残るような製品の製造に関してこの細菌を使用することは可能である。
【００３６】
本明細書において、食品なる用語は、固体、ゲル化または液体形態で存在し得る全ての食用製品を網羅する意味で、そしてすぐ食べられる製品と本発明の産物が消費と関連して補助食品または製品の構成成分となるものとして添加された産物との両方を網羅する意味で広く使用する。例えば、その食品は、乳業、食肉加工業、食品加工業、飲料産業、製パン業および製菓業の製品であってもよい。通常の製品は、ミルク製品、例えば無脂肪乳、そのままで、または粉末ミルク形態の様々な脂肪含量を有するミルク、酸乳、バターミルク、カードチーズ、ヨーグルト、カードミルク、無熟成チーズおよび熟成チーズ、スナックフィンガーなどの発酵乳製品を包含する。ホエー飲料、果物飲料およびビールなどの飲料は、別の重要なグループを構成する。
【００３７】
本発明との関連において、医薬品産業の製品は、多様な医薬調製物は別として、健康増進自然製品なども包含する。調製物の通常の形態は、例えばカプセル、錠剤および溶液である。
【００３８】
本発明は、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７を十分量で用いて、所望の効果を提供する。使用される量は、用途および効果によって広範囲にわたって変えてもよい。
【００３９】
下記において、本発明は、実施例によって詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を説明することを意図するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４０】
実施例１
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ株の培養
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ株を、貯蔵株をＭＲＳブロスまたはミルクブロスに１％の接種物で２回接種して、３７℃で２０〜２４時間、培養した。また、実際（生産）培養ではＭＲＳを基にしたブロスまたはミルクを基にしたブロス中で、３５℃〜４２℃の培養温度で、２０〜４８時間（ｐＨ調整または未調整）株を増殖させた。
【００４１】
この細胞を培養物からそのまま回収するか、この細胞を既知の技術を用いて濃縮し、細胞濃縮物として使用するか、もしくは濃縮後にそれらを凍結乾燥させ、粉末様産物とすること可能である。
【００４２】
実施例２
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ株のタンパク質分解活性
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈのタンパク質分解活性を、ＯＰＡ法（Church, F.C., Swaisgood, H.E., Porter, D.H., Catigna, G.L., 1983, Spectrophotometric assay using o-Phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins, J Dairy Sci 66:1219-1227）を用いてミルクにより決定した。
【００４３】
上記方法を実施するために、細菌細胞を１０mlチューブのＭＲＳブロス中で培養し、その後その懸濁液を０.９％ＮaＣlで洗浄し、１０mlに懸濁した。細菌細胞を２２℃のミルク(１０ｍｌ)に１％の接種物として接種した。細菌接種物を含まない同じミルク試料を対照として使用した。
【００４４】
試料(２.５ml)、水（０.５ml）および０.７５Ｎトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）(０.５ml)を、Ｖortex装置で十分攪拌し、１０分間継続し、Ｗhatman#２濾過紙によって濾過した。試料(１５０μl）をＴＣＡ濾過物から取り、使い捨てキュベット中でＯＰＡ試薬（３ml）と混合した。この混合物を２分間室温でインキュベートし、その後３４０nmの波長で分光分析器で測定した。対照値を実測値から控除し、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ株のタンパク質分解活性が０.３〜０.６となった。
【００４５】
ＯＰＡ試薬：
１００ｍｍｏｌメタホウ酸ナトリウム塩（２５ml)
２０％（ｗ／ｗ）ＳＤＳ（２.５ml）
メタノール（１ml）中に溶解したＯＰＡ(o-フタルジアルデヒド）（４０mg）
β−メルカプトエタノール（１００μl）
上記物質を組み合わせて、終体積は５０mlとなるように水に溶解した。該試薬を１日暗所に保存した。
【００４６】
実施例３
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ株のｐＨ耐性
ＬＢＫ−１６Ｈを、ＭＲＳブロス中で１７〜１８時間、試験前に２回培養した。その後、該株を、ＭＲＳブロスもしくはミルクブロスのいずれかで試験用に培養した。ｐＨ試験の際に、試験ブロス(ＭＲＳ)のｐＨを、ｐＨ６.５、ｐＨ４およびｐＨ２に調製した（乳酸を用いる）。これらのブロスをＭＲＳまたはミルクブロス培養物で接種し、初期濃度が１０７cfu/mlとなるように、３および４時間３７℃で培養した。その後ＬＢＫ−１６Ｈ株の濃度を、培養物（ＭＲＳ寒天培地上のLactobacilliの測定方法によって）から測定した。その結果を表１に示した。
【表３】
【００４７】
このように、上記株はｐＨレベル４でも非常に良好な耐性を示し、ｐＨ３であっても４時間の耐性を示した。ｐＨ２と同等の低いレベルでの４時間の保存性は、乳製品で接種される場合に水性製品で接種した場合よりも良好であった。
【００４８】
実施例４
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ株の胆汁耐性
ＬＢＫ−１６Ｈを実施例３と同じように培養した。この試験をＭＲＳブロスで行い、胆汁酸に、ウシ胆汁；Ｓigma Ｂ−３８８３を、０.３％および０.５％の量で添加した。ＭＲＳを基にした培養物またはミルクを基にした培養物からの１％の新しい培養物を、胆汁含有ブロスに添加した。初期濃度は２〜５×１０６cfu/mlである。この株を３時間ブロス中で培養し、その後ＭＲＳ寒天上の細胞濃度を測定した。結果を表２に示した。
【００４９】
【表４】
【００５０】
表から明らかなように、ＬＢＫ−１６Ｈは０.５％までの胆汁濃度の耐性があった。
【００５１】
実施例５
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈによる酸化窒素の産生
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈによる酸化窒素の産生を、Korhonenら記載の方法 (Induction of nitric oxide synthesis by probiotic Lactobacillus GG in J774 macrophages and T84 colon epitheal cells, Korhonen, R., Korpela, R., Saxelin, M., Maeki, M.,Kankaanranta, H. and Moilanen, E., Submitted) を用いて試験した。その方法は誘導し得る酸化窒素合成酵素(iＮＯＳ)およびそれから得られる酸化窒素（ＮＯ）の産生の誘導に基づく。２つの異なる細胞系を試験に使用した：Ｊ７７４ネズミのマクロファージ細胞系およびＴ８４ヒトエンテロサイト細胞系。この誘導は、γ−インターフェロンの存在下に、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ細胞を用いてＪ７７４中で行った。これは細菌細胞単独ではＮＯを産生しないためである。この細胞系の細胞と細菌株との比は１：１０であった。
【００５２】
酵素iＮＯＳの発現を、参照としてリポポサッカライド(ＬＰＳ)とリポテイコン酸（ＬＡ）を用いてウエスタンブロティング技術を用いて測定した。
【００５３】
酸化窒素(ＮＯ)の産生を、接種２４時間後の培養培地中の酸化窒素代謝産物亜硝酸塩の量として測定した。亜硝酸塩はGriess 反応（Greeb et al.,1988, Analytical Biiochemistry, vol.126,pp.131 to 138）によって測定した。
【００５４】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、ネズミマクロファージ細胞系で０.４μlの酸化窒素およびヒト上皮細胞系中で５〜６μlの酸化窒素を産生することができる。比較すると、Lactobacillus rhamnosus ＬＣ ７０５, ＤＳＭ ７０６１がＴ８４細胞中で酸化窒素０.７μＭのみを産生することと云える。
【００５５】
実施例６
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈによる生物活性ペプチドの産生
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６ＨＭＲＳ株を、ＭＲＳブロス中で３７℃、２４時間で培養し、接種物を形成するために再構成したミルク（１０％）に接種した。２回の培養ラウンド後、この接種物(１５％)を、９〜１０％無脂肪ミルク粉末を含有し、１１０℃、１０分間で滅菌した発酵用培地に接種した。発酵を、３７℃、２２〜２４時間で十分攪拌しながら実施した。
【００５６】
比較試験を行うために、この発酵を（ａ）数株、即ちL. helveticus ＬＢ１６１、L. helveticus ＬＢＫ−１６ＨおよびL. helveticus ＬＢ２３０の混合物、（ｂ）L. helveticus ＬＢＫ−１６ＨおよびL. rhamnosus ＬＣ７０５，ＤＳＭ ７０６１株の混合物および（ｃ）L. helveticus ＬＢＫ−１６ＨおよびStreptococcus thermophilus Ｔ１０１，ＤＳＭ ４０２２混合物を用いて繰り返した。
【００５７】
用いた培養培地は、１００℃、１５分間で滅菌した９％のミルクであった。接種物を形成するために、L. helveticusおよびL. rhamnosus ＬＣ７０５を２４時間、３７℃でＭＲＳブロス中で培養し、その後１％の接種物をミルクに移した。Str. thermophilus Ｔ１０１を、１８時間３７℃でＬＭ１７ブロス中で培養し、そこから接種物をミルクに移した。
【００５８】
最初の培養をミルク中で全ての株を別々に培養し、３７℃、２４時間でインキュベーションした。２回目の培養については、各混合物の１％の株をピペットでミルクに移し、その後に２４時間３７℃で共培養を継続した。３回目の培養については、５〜１０％の上記の得られた共培養物をミルクにピペットで移し、３７℃２４時間でインキュベーションした。
【００５９】
L. helveticus ＬＢＫ−１６Ｈおよび異なる微生物混合物によって産生されたＶＰＰおよびＩＰＰ量を表３に示した。本発明のL. helveticus ＬＢＫ−１６Ｈは、大量の生物活性ペプチドを産生し得る。異なる混合物の別の微生物は生物活性ペプチドを産生しないが、ＬＢＫ−１６Ｈの活性といずれも干渉しなかった。その混合物およびＬＢＫ−１６Ｈ単独との間で観察される差異はなかった。
【表５】
（技術分野）
本発明は、新規微生物およびその使用に関する。より正確には、Lactobacillus helveticusの新規株、その生理学上の特徴およびその使用、例えば食品産業および医薬品産業における使用を記載する。
【０００２】
（背景技術）
Sneathらによって編集されたBergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol.2, Williams & Wilkins, Baltimore, London, Los Angeles, Sydney, 1984, Part 14, p.1208 onwardsには、表題「Regular, Nonsporing Gram Positive Rods」として、Lactobacillus属に属する微生物の特徴と分類、さらにLactobacillus helveticus種の特性が記載されている。一般的に、Lactobacillus helveticus株は、発酵乳製品およびチーズなどの乳製品から単離され、従来、それらはチーズ、特にエメンタールおよびグリュイエルタイプのチーズを製造する際に出発微生物として使用されてきた。
【０００３】
Lactobacillus helveticus株の生物学的効果は先行技術で述べられている。例えば、国際特許出願ＷＯ９９／１６８６２、Yamamotoらによって、Lactobacillus helveticusＣＭ４、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６０が大量のトリペプチドＶal-Ｐro−Ｐroおよび／またはＩle−Ｐro−Ｐroを産生することが可能であって、高い細胞外タンパク質分解活性を持つことが記載されている。また、この公開は、上記トリペプチドおよび細菌を含有する発酵乳製品および上記細菌によるトリペプチド配列物を含有する産物を発酵することによるその調製方法が記載されている。
【０００４】
米国特許５,４４９,６６１のNakamuraらによって、トリペプチド配列Ｖal-Ｐro−Ｐroを含有するペプチドの調製と高血圧を抑えるためにそのペプチドを使用することが記載されている。このペプチドは、無脂肪乳とLactobacillus helveticusＪＣＭ １００４株を発酵させ、その後ペプチドをクロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥を行って調製される。
【０００５】
また、Yamamotoらは、微生物Lactobacillus helveticusＣＰ７９０(J. Biochem., 1993, 114:740)由来のプロテイネースの精製および特徴分析を記載している。さらに、Yamamoto1らは、αＳ１およびβカゼインを上記タンパク質加加水分解酵素で加水分解し、その得られたペプチドをＡＣＥに対する阻害効果を試験した研究を報告している（J. Dairy Sci, 1994, 77:917）。試験したペプチドは、全部で２５個であり、その分子サイズと効果は大きく異なっていた。最も有効なペプチドは、βカゼインから得られた３つのペプチドであり、８、１８および２７のアミノ酸を各々含有する。また、その研究は、Lactobacillus helveticusＣＰ７９０株とタンパク質加水分解酵素活性を欠くその変異株ＣＰ７９１を用いて発酵したミルクのＡＣＥ活性を比較した。それによると、前者は自発性高血圧症ＳＨＲラットにおいて有効性が見出されたが通常のラットでは効果はなく、一方、後者は全く活性を示さなかった。
【０００６】
乳酸菌およびそのLactobacillus helveticus種は広く研究され、伝統的な出発物として、および健康増進物質としても使用が推奨されている。および乳業などの食品産業における出発物およびプロバイオティックスとしてさらに自然産物だけでなく、医薬産業においても、有用である新規の有効な微生物を見出そうとする分野での絶えない追求がいまだ存在する。
【０００７】
（発明の詳細）
本発明の目的は、卓越したタンパク質分解性および生理学上の特性を持ち、これによって出発物としてかつ健康増進物質としても使用するのに非常にふわさしいLactobacillus helveticusの新規株を提供することである。
【０００８】
本発明によって、この株は、消費者がそのままで、もしくは食用に適した食品、機能食品または医薬品に使用するために消費者に提供される。
【０００９】
即ち、本発明は、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７に関する。
【００１０】
また、本発明は、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株を含有する細菌調製物に関する。
【００１１】
本発明は、さらに食品産業または医薬品産業におけるLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７の使用に関する。
【００１２】
本発明は、さらに、上記の株を含むか、上記株を用いて調製される栄養素などの食用製品および医薬品に関する。
【００１３】
本発明は、治療用物質として使用するためのLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株にも関する。
【００１４】
本発明は、高血圧症の処置で使用するためのLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株にも関する。
【００１５】
また、本発明は、抗高血圧性製品を調製するためにLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株を使用することに関する。
【００１６】
さらに、本発明は、抗高血圧性製品を調製するための方法に関する。該方法はLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株を用いる。
【００１７】
本発明は、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈの新規株を基にしたもので、１９９９年１１月３日に寄託番号ＤＳＭ１３１３７で受託機関 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)に寄託されており、その株は下記特徴を有する：
・Lactobacillus helveticus株は、グラム陽性であり、桿状形の長い細胞である。細胞増殖温度範囲は約３５〜４５℃であって、至適温度は約３７〜４２℃である。
・Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、３７℃〜４２℃の温度のミルク中で良好に増殖し、乳酸（ＤＬ）を２.５〜２.９％産生する。増殖の至適ｐＨは約４.５〜７である。ｐＨ無調整培養では、ミルク中ｐＨ３.３〜３.６の範囲内に低下する。
・また、この株は、Lactobacilluで通常使用される培地で良好に増殖し、炭素源素としてクエン酸塩を用い得る。
【００１８】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、下記のような炭水化物を発酵する：
【表１】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、タンパク分解性について活性である。実施例において下記するように、o-フタルジアルデヒドのタンパク質分解を基にしているＯＰＡ法によって測定すると、この株のタンパク質分解活性は０.３〜０.６の値であった。タンパク質分解活性は、出発物としての使用と生物学的活性物質の調製の両方に利用し得る。
【００２０】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、低いｐＨ値に非常に良好な耐性がある。このことは、保存能および生理学的活性の両観点から重要な特性である。実施例で記載したが、該株は、ｐＨレベル４で良好で、ｐＨレベルが３であっても約４時間は耐性があり、特に乳製品においてその保存性が卓越しており、ｐＨ２のような低いｐＨで４時間まで耐性がある。その結果に基づくと、この株は、胃を通過する消化管で生き延びて、大腸で生存していると予測され得る。
【００２１】
また、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、胆汁への卓越した耐性を示し、胆汁濃度０.５％まで耐性がある。この結果も、胃から消化管および小腸で生きぬき、大腸で生存を維持することを示している。
【００２２】
また、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、酸化窒素を産生する能力をもつことが明らかになった。酸化窒素の産生は、酸化窒素合成酵素の活性化にによって提供された酸化窒素の形成として研究した。この株は、Ｊ７７４マクロファージ細胞系では０.４μＭのＮＯが、Ｔ８４ヒトエンテロサイト細胞系では約２〜６μＭのＮＯが産生する。この特性は非常に重要である：適切量のＮＯ産生の活性化は、例えば炎症応答および血圧調節において有効である。
【００２３】
また、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、生物活性ペプチド産生能を示すことが見出した。フィンランド特許出願９９２３６０の実施例で、抗高血圧性ペプチドを含有する十分保存し得る産物が２工程法によってどのように調製されるかが記載されている。その第１工程で、上記生物活性ペプチドは発酵によって、例えば、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ単独もしくは上記株と別の乳酸菌株との組み合わせで多様な乳製品を発酵することによって産生される。この公開の実施例によれば、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈにより、既知の抗高血圧性トリペプチドＶＰＰ（Ｖal-Ｐro-Ｐro）およびＩＰＰ（Ｉle-Ｐro-Ｐro）各々１３〜１５ｍｇ／ｌおよび６〜８ｍｇ／ｌが産生される。この公開によれば、異なるペプチド混合物は発酵反応中に形成される。発酵持続時間が十分である場合、比較的小さなジおよびトリペプチドが得られる。
【００２４】
上記記載の特徴を基にすると、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、プロバイオテック生物体であると考え得る。
【００２５】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、例えば乳業、例えば発酵乳製品およびチーズの製造業における従来の出発細菌として有用である。チーズ、特にエメンタールチーズにおける使用は、好ましい態様であると考えられる。
【００２６】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、特定製品、例えば発酵乳製品、特に生化学的ペプチドを含有する酸乳およびヨーグルトなどの製造において十分利用し得る。
【００２７】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、食用物質の製造においてそのままで機能物質として、または食用物質中の成分または添加物としてさらに使用し得る。
【００２８】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、例えばＭＲＳブロス、生乳、再構成した粉末乳または超音波処理したミルクなどのミルク中、あるいは一般的にLactobacilliに使用されるＲogosaまたはＭＲＳなどの培地で常法により細菌を培養して生成される。適当な培養条件および他のパラメーター、例えば温度、ｐＨおよび通気などの選択は、当業者には既知である。温度は例えば３０〜４５℃であってよい。ｐＨ調整は必要かもしれない。
【００２９】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈを、単独で培養し、純粋な培養物を形成することも可能である。また、その株は混合培養物として、例えばその分野で既知の別の出発微生物と共に培養してもよい。所望であれば、異なる種類の微生物を別々に培養し、その後に所望の割合で異なる微生物を組み合わせることによって、混合培養物を提供することも可能である。微生物組み合わせ物は、最良の可能な特性が最終産物に提供され、雑菌混入の危険性が排除されるように適切に選択する。
【００３０】
培養後、細胞懸濁液を回収し、そのままで使用するか、例えば濃縮、乾燥または凍結乾燥などの所望の方法で処理する。
【００３１】
当然、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、純粋培養物としてまたは混合培養物として、別々に、もしくは例えば従来的に使用され、市販入手し得る出発物またはプロバイオティクスと一緒に使用し得る。
【００３２】
本発明に関して、凍結乾燥され適当なアジュバンド中でLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７を含有する細菌調製物が好ましい調製物と考える。
【００３３】
本発明の細菌調製物は、上記細菌をそのまま、または他の構成成分、例えば他の微生物と組み合わせて含んでもよい。
【００３４】
本発明に関して、この株は食用製品、特に(機能)食品、自然製品または医薬品の製造で使用し得る。
【００３５】
本発明の食用製品は、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７、またはそれと同じものと（最終）製品の従来成分を含む細菌産物を用いて調製する。この細菌は、その製造過程中の食品または別の製品に添加するか、または最終製品に添加し得る。細菌細胞が全くなく、ただ細菌増殖中に生成した産物、例えば最終製品に残る風味付けや香り付けの物質または生物活性を持つ物質が最終製品に残るような製品の製造に関してこの細菌を使用することは可能である。
【００３６】
本明細書において、食品なる用語は、固体、ゲル化または液体形態で存在し得る全ての食用製品を網羅する意味で、そしてすぐ食べられる製品と本発明の産物が消費と関連して補助食品または製品の構成成分となるものとして添加された産物との両方を網羅する意味で広く使用する。例えば、その食品は、乳業、食肉加工業、食品加工業、飲料産業、製パン業および製菓業の製品であってもよい。通常の製品は、ミルク製品、例えば無脂肪乳、そのままで、または粉末ミルク形態の様々な脂肪含量を有するミルク、酸乳、バターミルク、カードチーズ、ヨーグルト、カードミルク、無熟成チーズおよび熟成チーズ、スナックフィンガーなどの発酵乳製品を包含する。ホエー飲料、果物飲料およびビールなどの飲料は、別の重要なグループを構成する。
【００３７】
本発明との関連において、医薬品産業の製品は、多様な医薬調製物は別として、健康増進自然製品なども包含する。調製物の通常の形態は、例えばカプセル、錠剤および溶液である。
【００３８】
本発明は、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７を十分量で用いて、所望の効果を提供する。使用される量は、用途および効果によって広範囲にわたって変えてもよい。
【００３９】
下記において、本発明は、実施例によって詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を説明することを意図するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４０】
実施例１
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ株の培養
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ株を、貯蔵株をＭＲＳブロスまたはミルクブロスに１％の接種物で２回接種して、３７℃で２０〜２４時間、培養した。また、実際（生産）培養ではＭＲＳを基にしたブロスまたはミルクを基にしたブロス中で、３５℃〜４２℃の培養温度で、２０〜４８時間（ｐＨ調整または未調整）株を増殖させた。
【００４１】
この細胞を培養物からそのまま回収するか、この細胞を既知の技術を用いて濃縮し、細胞濃縮物として使用するか、もしくは濃縮後にそれらを凍結乾燥させ、粉末様産物とすること可能である。
【００４２】
実施例２
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ株のタンパク質分解活性
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈのタンパク質分解活性を、ＯＰＡ法（Church, F.C., Swaisgood, H.E., Porter, D.H., Catigna, G.L., 1983, Spectrophotometric assay using o-Phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins, J Dairy Sci 66:1219-1227）を用いてミルクにより決定した。
【００４３】
上記方法を実施するために、細菌細胞を１０mlチューブのＭＲＳブロス中で培養し、その後その懸濁液を０.９％ＮaＣlで洗浄し、１０mlに懸濁した。細菌細胞を２２℃のミルク(１０ｍｌ)に１％の接種物として接種した。細菌接種物を含まない同じミルク試料を対照として使用した。
【００４４】
試料(２.５ml)、水（０.５ml）および０.７５Ｎトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）(０.５ml)を、Ｖortex装置で十分攪拌し、１０分間継続し、Ｗhatman#２濾過紙によって濾過した。試料(１５０μl）をＴＣＡ濾過物から取り、使い捨てキュベット中でＯＰＡ試薬（３ml）と混合した。この混合物を２分間室温でインキュベートし、その後３４０nmの波長で分光分析器で測定した。対照値を実測値から控除し、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ株のタンパク質分解活性が０.３〜０.６となった。
【００４５】
ＯＰＡ試薬：
１００ｍｍｏｌメタホウ酸ナトリウム塩（２５ml)
２０％（ｗ／ｗ）ＳＤＳ（２.５ml）
メタノール（１ml）中に溶解したＯＰＡ(o-フタルジアルデヒド）（４０mg）
β−メルカプトエタノール（１００μl）
上記物質を組み合わせて、終体積は５０mlとなるように水に溶解した。該試薬を１日暗所に保存した。
【００４６】
実施例３
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ株のｐＨ耐性
ＬＢＫ−１６Ｈを、ＭＲＳブロス中で１７〜１８時間、試験前に２回培養した。その後、該株を、ＭＲＳブロスもしくはミルクブロスのいずれかで試験用に培養した。ｐＨ試験の際に、試験ブロス(ＭＲＳ)のｐＨを、ｐＨ６.５、ｐＨ４およびｐＨ２に調製した（乳酸を用いる）。これらのブロスをＭＲＳまたはミルクブロス培養物で接種し、初期濃度が１０７cfu/mlとなるように、３および４時間３７℃で培養した。その後ＬＢＫ−１６Ｈ株の濃度を、培養物（ＭＲＳ寒天培地上のLactobacilliの測定方法によって）から測定した。その結果を表１に示した。
【表３】
このように、上記株はｐＨレベル４でも非常に良好な耐性を示し、ｐＨ３であっても４時間の耐性を示した。ｐＨ２と同等の低いレベルでの４時間の保存性は、乳製品で接種される場合に水性製品で接種した場合よりも良好であった。
【００４８】
実施例４
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ株の胆汁耐性
ＬＢＫ−１６Ｈを実施例３と同じように培養した。この試験をＭＲＳブロスで行い、胆汁酸に、ウシ胆汁；Ｓigma Ｂ−３８８３を、０.３％および０.５％の量で添加した。ＭＲＳを基にした培養物またはミルクを基にした培養物からの１％の新しい培養物を、胆汁含有ブロスに添加した。初期濃度は２〜５×１０６cfu/mlである。この株を３時間ブロス中で培養し、その後ＭＲＳ寒天上の細胞濃度を測定した。結果を表２に示した。
【００４９】
【表４】
表から明らかなように、ＬＢＫ−１６Ｈは０.５％までの胆汁濃度の耐性があった。
【００５１】
実施例５
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈによる酸化窒素の産生
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈによる酸化窒素の産生を、Korhonenら記載の方法 (Induction of nitric oxide synthesis by probiotic Lactobacillus GG in J774 macrophages and T84 colon epitheal cells, Korhonen, R., Korpela, R., Saxelin, M., Maeki, M.,Kankaanranta, H. and Moilanen, E., Submitted) を用いて試験した。その方法は誘導し得る酸化窒素合成酵素(iＮＯＳ)およびそれから得られる酸化窒素（ＮＯ）の産生の誘導に基づく。２つの異なる細胞系を試験に使用した：Ｊ７７４ネズミのマクロファージ細胞系およびＴ８４ヒトエンテロサイト細胞系。この誘導は、γ−インターフェロンの存在下に、Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ細胞を用いてＪ７７４中で行った。これは細菌細胞単独ではＮＯを産生しないためである。この細胞系の細胞と細菌株との比は１：１０であった。
【００５２】
酵素iＮＯＳの発現を、参照としてリポポサッカライド(ＬＰＳ)とリポテイコン酸（ＬＡ）を用いてウエスタンブロティング技術を用いて測定した。
【００５３】
酸化窒素(ＮＯ)の産生を、接種２４時間後の培養培地中の酸化窒素代謝産物亜硝酸塩の量として測定した。亜硝酸塩はGriess 反応（Greeb et al.,1988, Analytical Biiochemistry, vol.126,pp.131 to 138）によって測定した。
【００５４】
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈは、ネズミマクロファージ細胞系で０.４μlの酸化窒素およびヒト上皮細胞系中で５〜６μlの酸化窒素を産生することができる。比較すると、Lactobacillus rhamnosus ＬＣ ７０５, ＤＳＭ ７０６１がＴ８４細胞中で酸化窒素０.７μＭのみを産生することと云える。
【００５５】
実施例６
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈによる生物活性ペプチドの産生
Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６ＨＭＲＳ株を、ＭＲＳブロス中で３７℃、２４時間で培養し、接種物を形成するために再構成したミルク（１０％）に接種した。２回の培養ラウンド後、この接種物(１５％)を、９〜１０％無脂肪ミルク粉末を含有し、１１０℃、１０分間で滅菌した発酵用培地に接種した。発酵を、３７℃、２２〜２４時間で十分攪拌しながら実施した。
【００５６】
比較試験を行うために、この発酵を（ａ）数株、即ちL. helveticus ＬＢ１６１、L. helveticus ＬＢＫ−１６ＨおよびL. helveticus ＬＢ２３０の混合物、（ｂ）L. helveticus ＬＢＫ−１６ＨおよびL. rhamnosus ＬＣ７０５，ＤＳＭ ７０６１株の混合物および（ｃ）L. helveticus ＬＢＫ−１６ＨおよびStreptococcus thermophilus Ｔ１０１，ＤＳＭ ４０２２混合物を用いて繰り返した。
【００５７】
用いた培養培地は、１００℃、１５分間で滅菌した９％のミルクであった。接種物を形成するために、L. helveticusおよびL. rhamnosus ＬＣ７０５を２４時間、３７℃でＭＲＳブロス中で培養し、その後１％の接種物をミルクに移した。Str. thermophilus Ｔ１０１を、１８時間３７℃でＬＭ１７ブロス中で培養し、そこから接種物をミルクに移した。
【００５８】
最初の培養をミルク中で全ての株を別々に培養し、３７℃、２４時間でインキュベーションした。２回目の培養については、各混合物の１％の株をピペットでミルクに移し、その後に２４時間３７℃で共培養を継続した。３回目の培養については、５〜１０％の上記の得られた共培養物をミルクにピペットで移し、３７℃２４時間でインキュベーションした。
【００５９】
L. helveticus ＬＢＫ−１６Ｈおよび異なる微生物混合物によって産生されたＶＰＰおよびＩＰＰ量を表３に示した。本発明のL. helveticus ＬＢＫ−１６Ｈは、大量の生物活性ペプチドを産生し得る。異なる混合物の別の微生物は生物活性ペプチドを産生しないが、ＬＢＫ−１６Ｈの活性といずれも干渉しなかった。その混合物およびＬＢＫ−１６Ｈ単独との間で観察される差異はなかった。
【表５】
Claims (14)
- Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７。
- Lactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株を含有する細菌調製物。
- 他の微生物をさらに含有することを特徴とする、請求項２記載の細菌調製物。
- 凍結乾燥粉末またはカプセルの形態で存在することを特徴とする、請求項２または３記載の細菌調製物。
- 食品産業におけるLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株の使用。
- 乳業または飲料産業の製品を調製することを特徴とする、請求項５記載の使用。
- 請求項１記載の微生物または請求項２〜４いずれか記載の微生物調製物を含有すること、また同物質を用いて調製することを特徴とする、食用製品。
- 乳製品であることを特徴とする、請求項７記載の食用製品。
- 飲料品、好ましくはホエー飲料、果物飲料またはビールであることを特徴とする、請求項７記載の食用製品。
- 治療用物質として使用するためのLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株。
- 高血圧の処置で使用するためのLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株。
- 抗高血圧性製品の調製で使用するためのLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株。
- 抗高血圧性製品が抗高血圧性ジペプチドおよびトリペプチドを含有することを特徴とする、請求項１２記載の抗高血圧製品の調製に使用するためのLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株。
- 抗高血圧製品が高濃度のトリペプチド、特にＩle−Ｐro−Ｐroおよび／またはＶal−Ｐro−Ｐroを持つことを特徴とする、請求項１２記載の抗高血圧製品の調製物に使用するためのLactobacillus helveticusＬＢＫ−１６Ｈ、ＤＳＭ１３１３７株。
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