TWI713972B - 改善呼吸道健康之益生菌株及其組合物與用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種改善呼吸道健康之益生菌株及其組合物與用途，該益生菌係為一種新穎的瑞士乳桿菌(編號為BCRC910846)，其本身以及其代謝產物具有抑制細菌生長、提升肺臟上皮細胞之修復、以及促進巨噬細胞之吞噬的能力，而能夠有效減少呼吸道之感染機率、提升呼吸道之修復能力、以及促進排除人體內PM2.5，並能移除呼吸道之異物。其中本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物中具有1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸之效性成分。

Description

改善呼吸道健康之益生菌株及其組合物與用途
本發明係關於一改善呼吸道健康之益生菌株及其組合物與用途，尤其是一種瑞士乳桿菌以及其代謝產物用於製備抑制細菌生長、提升肺臟上皮細胞之修復能力、促進巨噬細胞的吞噬能力之組合物的用途，其中該瑞士乳桿菌的代謝產物含有一1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)之效性成分。
工業活動的發達，及現代生活對能源重度需求，而能量的取得過程中卻造成了嚴重的空氣汙染。哈佛大學針對亞洲與東南亞地區的空氣污染問題研究結果指出，燃煤電廠除了直接排放PM2.5，還會排放硫化物(SO2)、氮氧化物(NOX)、煤煙與粉塵等會間接促進PM2.5形成之物質。PM2.5粒子很小，為可呼吸性(Respirable)微粒，能輕易突破人體鼻腔絨毛及氣管纖毛黏液等呼吸道防禦機制，進入支氣管以及肺泡，而對健康造成嚴重影響，包括引發呼吸道疾病、慢性支氣管炎、肺癌和心血管疾病，對於孕婦更可能造成新生兒早產和影響認知系統的發展，及誘發慢性病的發病率，嚴重者將導致死亡。
然而，目前僅能透過消極的方法減緩吸入PM2.5，來預防或減緩PM2.5對人體造成之傷害。其中，大氣環境的PM2.5可藉由減少戶外活動時間及 配帶個人防護用具如口罩等以降低暴露風險，但是PM2.5會經由通風空調系統、門窗及建築物隙縫處滲入室內環境，增加室內空氣污染及暴露風險。且許多研究發現大部分情況下室內環境中會因為烹飪油煙、打掃的揚塵、以及生物性來源包括飛沫中的病毒及細菌、黴菌孢子和塵蹣的排泄物等原因，而使其PM2.5濃度遠比室外來的高。因此對於大環境的問題，除了大家攜手改善能源使用習慣、乾淨能源的開發外，在問題尚未得到緩解之際則必須對自身的呼吸道進行保護，以避免空氣汙染對人體產生之傷害。另外，除了人為的汙染之外，空氣中還有會對人體產生威脅生物性因子，例如細菌或病毒等病原體對呼吸道造成的感染。
綜合上面所述，為了能有效達到減緩PM2.5對人體肺臟的傷害，開發一種能有效促進巨噬細胞的吞噬能力，以增加人體排除PM2.5之能力，並同時能有效抑制肺臟細菌生長、及提升肺臟上皮細胞之修復能力的組合物，著實有其必要性。
緣此，本發明之一目的在提供一種用於改善呼吸道健康之益生菌株，其中該益生菌株係為一瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)，其寄存編號係BCRC910846。
本發明之又一目的在提供一種如前所述之益生菌株用於製備一改善呼吸道健康之組合物的用途。
本發明之又一目的在提供一種如前所述之益生菌株的代謝產物用於製備一改善呼吸道健康之組合物的用途。
本發明之又一目的在提供一種1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸用於製備一改善呼吸道健康之組合物的用途，其中該1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸具有下列化學式(I)：
Figure 108101394-A0101-12-0003-3
本發明之另一目的在提供一種用於改善呼吸道健康之組合物，包含選自如申請專利範圍第1項所述之益生菌株、該益生菌株的代謝產物、及1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸中任一項或其任意之組合。
在本發明之一實施例中，該益生菌株之濃度至少為1x108cfu/mL。
在本發明之又一實施例中，該益生菌的代謝產物之濃度至少為1ppm，且該益生菌株的代謝產物係為該益生菌株之分泌物，包含培養該益生菌的培養液。
在本發明之又一實施例中，該益生菌株的代謝產物中包含1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)，且該1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸具有下列化學式(I)：
Figure 108101394-A0101-12-0003-2
在本發明之又一實施例中，該1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸之濃度至少為1ppm。
在本發明之另一實施例中，該改善呼吸道健康係抑制細菌生長、提升肺臟細胞之修復能力及/或提升巨噬細胞之吞噬能力。
本發明之瑞士乳桿菌以及其代謝產物能有效抑制細菌生長、有效提升肺臟上皮細胞之修復能力、以及有效促進巨噬細胞的吞噬能力，而能夠減少呼吸道之感染機率、提升呼吸道之修復能力、以及促進排除人體內PM2.5，並能移除呼吸道之異物。其中本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物中具有1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)之效性成分，經功效再驗證能有效提升肺臟上皮細胞之修復能力。因此，本發明之瑞士乳桿菌、其代謝產物、以及純化自其代謝產物之1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸可用於製備改善呼吸道健康之組合物的用途，該組合物該組合物是一醫藥品、或一食品，可藉由口服等方式給予一個體。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物抑制細菌生長之照片。
圖2A係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物促進肺臟上皮細胞修復之照片。
圖2B係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物促進肺臟上皮細胞修復之長條圖。**p值<0.01。
圖3係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物促進巨噬細胞吞噬PM2.5之長條圖與照片。
圖4係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物之乙酸乙酯層萃取物、正丁醇層萃取物、及水層萃取物促進肺臟上皮細胞修復之長條圖。**p值<0.01；***p值<0.001。
圖5係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物中所純化TCI-TCI357-01的核磁共振氫光譜圖。
圖6係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物中所純化TCI-TCI357-01的核磁共振碳光譜圖。
圖7係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物中所純化TCI-TCI357-01的核磁共振二維COSY光譜圖。
圖8係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物中所純化TCI-TCI357-01的核磁共振二維HSQC光譜圖。
圖9係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物中所純化TCI-TCI357-01的核磁共振二維HMBC光譜圖。
圖10係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物中所純化TCI-TCI357-01的質譜圖。
圖11係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物中所純化TCI-TCI357-02的質譜圖。
圖12係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物中所純化TCI-TCI357-02的核磁共振氫光譜圖。
圖13係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物中所純化TCI-TCI357-02的核磁共振碳光譜圖。
圖14係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物中所純化TCI-TCI357-02的核磁共振二維COSY光譜圖。
圖15係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物中所純化TCI-TCI357-02的核磁共振二維HSQC光譜圖。
圖16係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌代謝產物中所純化TCI-TCI357-02的核磁共振二維HMBC光譜圖。
圖17係為本發明之一實施例的瑞士乳桿菌之代謝產物TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02的HPLC指紋圖譜。
圖18係為本發明實施例之瑞士乳桿菌代謝產物中活性成分TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02促進肺臟上皮細胞修復之長條圖。**p值<0.01。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，個組之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)分析。
定義
本發明之瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)是一種能改善呼吸道健康的益生菌株(Probiotic bacteria)。本發明係一新穎之瑞士乳桿菌，於民國107年8月15日寄存於食品工業發展研究所，寄存編號BCRC910846，本發明經由體外實驗證實本發明之瑞士乳桿菌以及其代謝產物可抑制細菌生長，以達到減少呼吸道之感染機率；經由細胞實驗證實本發明之瑞士乳桿菌以及其代謝產物可提升肺臟上皮細胞之修復能力、促進巨噬細胞的吞噬能力，以提升呼吸道之修復能力、促進排除人體內PM2.5，並移除呼吸道異物之功效。顯示本發明 之瑞士乳桿菌以及其代謝產物可用於製備改善呼吸道健康之組合物的用途，且該組合物係一醫藥品、或一食品，可藉由口服等方式給予一個體。
益生菌株(probiotic或probiotic bacteria)係為一微生物，其菌體、混合菌株、萃取物或代謝產物對於宿主本身係具有正面影響，通常源自於人體內、有益於腸道健康的活菌，亦可指外來補充、對身體可能有益的某些微生物，其中該益生菌株的代謝產物係為該益生菌株之分泌物，包含培養該菌的培養液。
依據本發明，以管柱層析法(Column chromatography)及薄層層析法(Thin layer chromatography,TLC)自本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物中，所純化出之二種化合物1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)、以及Flazin，將於本文分別命名為TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02。
依據本發明，有關細菌培養的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
如本文中所使用的，用語「代謝產物」意為培養細菌時，經該細菌代謝後所分泌至細菌培養液中之物質，包含培養該菌的培養液。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或局部地(topically)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。
依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液 (buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。
依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。
依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的醫藥品與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。
依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普®974P(carbopol®974P)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣咔吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。
化學分析材料
正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、正丁醇(n-butanol)、乙腈(acetonitrile)、氯仿-d 1 (氘化程度99.5%)、甲醇-d 6 (氘化程度99.5%)、重水(deuterium oxide，氘化程度大於 99.8%)、及二甲基亞碸-d 6 (dimethyl sulfoxide-d 6 ，氘化程度>99.9%)購自台灣默克公司。
化學分析儀器
化合物的分離係利用管柱層析法(Column chromatography)及薄層層析法(Thin layer chromatography,TLC)。中壓液相層析(Medium pressure liquid chromatography,MPLC)系統係為CombiFlash® Rf+(Teledyne ISCO)；管柱係選用自Sephadex LH-20(Amersham Biosciences)、Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical)、Merck Kieselgel 60(40-63μm,Art.9385)、及Merck LiChroprep®RP-18(40-63um,Art.0250)。高效液相層析(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)系統裝配Hitachi L-2310系列幫浦、Hitachi L-2420 UV-VIS偵測器(偵測波長為200nm至380nm)、及D-2000 Elite資料處理軟體；管柱係選用自分析級Discovery® HS C18(250×4.6mm,5μm；SUPELCO)與Mightysil RP-18 GP 250(250×4.6mm,5μm；Kanto Chemical)，以及半製備級Discovery® HS C18(250×10.0mm,5μm；SUPELCO)與製備級Discovery® HS C18(250×21.0mm,5μm；SUPELCO)。層析系統配備紫外燈UVP UVGL-25(波長為254nm及365nm)。薄層層析片係塗覆矽膠60 F254(0.25mm；Merck)或RP-18 F254S(0.25mm；Merck)之鋁片。
化合物的化學結構係以質譜法(Mass spectrometry,MS)及核磁共振光譜法(Nuclear magnetic resonance spectrometry,NMR)進行分析。具體而言，使用二維離子阱串聯傅立葉轉換質譜(Bruker amaZon SL system)及電噴灑離子化串聯質譜(ESI-MS/MS,Thermo Scientific Orbitrap Elite system)；並使用400MHz Varian 400 FT-NMR取得一維與二維NMR光譜，以δ表示化學位移(Chemical shift)，其中單位為ppm；以四甲基矽烷(Tetramethylsilane,TMS)作為內部標準品；偶合常數(J)以Hz為單位，並以s表單峰(Singlet)，d表二重峰 (Doublet)，d表三重峰(Triplet)，q表四重峰(Quarret)，p表五重峰，m表多重峰(Multiplet)，brs則表寬峰。
依據本發明，有關混合物之化學分離及化學結構分析的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
本發明提供一種瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、其代謝產物或純化自其代謝產物之1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸用於製備改善呼吸道健康之組合物的用途，本發明瑞士乳桿菌代謝產物係取該瑞士乳桿菌之培養液所獲得，其中含有活性成分1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)，該瑞士乳桿菌、其代謝產物、及純化自其代謝產物之1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸可用於抑制細菌生長、提升肺臟上皮細胞之修復能力、以及促進巨噬細胞的吞噬能力。
同時，本發明用於改善呼吸道健康之組合物，亦可包含一有效量之本發明之瑞士乳桿菌、其代謝產物、或純化自其代謝產物之1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸，以及一醫藥上可接受之載體，該組合物係一醫藥品、或一食品。
以下將詳細說明本發明之瑞士乳桿菌代謝產物之詳細製備方法，與該瑞士乳桿菌於抑制細菌生長之功效測試、於修復肺臟上皮細胞之功效測試、於提升巨噬細胞吞噬能力之功效測試、從本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物中分離出活性物質1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸之詳細方法、驗證1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸為本發明之瑞士乳桿菌之代謝產物、以及再驗證1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸具有修復肺臟上皮細胞之功效測試。以證實本發明之瑞士乳桿菌、其代謝產物、以及純化自其代謝產物之1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸具有抑制細菌生長、提升肺臟上皮細胞之修復能力、以及促進巨噬細胞的吞噬之能力，而能用於製備改善呼吸道健康之組合物。
實施例1 本發明之瑞士乳桿菌代謝產物的製備方法
在本發明實施例中，將本發明之瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)之冷凍菌種保存管經一次培養以活化後，以百分之一的殖菌量培養在MRS(de Man,Rogosa and Sharpe,BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth)培養基中，優選為於10mL之MRS中加入0.1mL之經活化菌種，於37℃培養16-18小時後，將該培養菌液以5000rpm離心10-20分鐘後，蒐集該上清液即為本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物。
實施例2 本發明之瑞士乳桿菌代謝產物於抑制細菌生長之功效
本發明之一實施例為了測試本發明之瑞士乳桿菌代謝產物於抑制細菌生長之功效，使用抑菌圈法試驗其抑菌功效，其中抑菌圈法又稱擴散法，是利用待測物在洋菜膠中擴散使其周圍的細菌生長受到抑製而形成透明圈，即抑菌圈，並根據抑菌圈之大小以判定待測物之抑菌效用的方法，常用於抗生素產生菌的分離篩選。首先，將本發明之瑞士乳桿菌培養於MRS培養基中，於37℃培養16小時後，將菌液以5000rpm離心10分鐘後，取上清液作為試驗樣品。接著，將1x108cfu/mL之大腸桿菌(E.coli)培養於5mL之LB(Lysogeny broth)培養液中，作用於37℃下8小時後，取100μL該培養液塗滿至LB agar(LA)上，並挖洞預備後，取本發明之瑞士乳桿菌之50μL代謝產物於已塗滿E.coil之LA洞中，培養於37℃下24小時後，觀察是否產生抑菌圈。
本發明之瑞士乳桿菌代謝產物抑制細菌生長之實驗結果如圖1所示。在含有本發明之瑞士乳桿菌7代謝產物之LA洞周圍形成一明顯之抑菌圈，此結果顯示本發明之瑞士乳桿菌可產生抑制細菌生長之物質，能有效抑制細菌生長，以減少呼吸道之感染機率。
實施例3 本發明之瑞士乳桿菌及其代謝產物於修復肺臟上皮細胞之功效
本發明之一實施例以人類支氣管上皮細胞BEAS-2b(購自美國典型培養物保藏中心，編號CRL-9609)藉由細胞劃痕損傷修復實驗，測試本發明 之瑞士乳桿菌及其代謝產物於修復肺臟上皮細胞之功效。該細胞係培養於Bronchial epithelial cell basal Medium(BEBM，購自Lonza，瑞士)，其中，細胞劃痕損傷修復實驗係通過觀察細胞重新填滿一人為所製造出劃痕，以得知細胞之癒合能力。首先，將1.5x105個BEAS-2b細胞培養於24孔培養盤之每孔中，於37℃培養16-18小時使細胞平鋪一層於培養盤孔底，接著使用一200μL之微量吸量管於該單層細胞上輕劃一道以製造一傷痕，並移除培養液後以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline,PBS)清洗後，將細胞分成以下二組(n=3)混入不含血清(Serum-free)之上述培養液中，且最終體積為1mL：(1)MRS、及(2)1%本發明之瑞士乳桿菌或其代謝產物，並以僅加入不含血清之培養液的細胞作為空白控制組。接著以顯微鏡觀察並拍照做紀錄，以此時間點之傷痕大小作為基準點，並於37℃、含有5%之CO2的培養箱中作用16小時後，移除培養液並加入同體積的不含血清之培養液，於37℃培養24小時後，以同樣手法以顯微鏡觀察傷痕並拍照記錄，最後以Image J軟體分析各組圖像，再利用Excel軟體進行Student t-test以決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異。
本發明之瑞士乳桿菌及其代謝產物促進肺臟上皮細胞修復實驗結果如圖2A及圖2B所示，其中以空白控制組作為100%。經本發明之瑞士乳桿菌或其代謝產物作用後，能使肺臟上皮細胞之劃痕損傷修復218.2%，分別顯著高於空白控制組及MRS組，其中MRS組則僅有115.7%之話痕損傷修復。此結果顯示本發明之瑞士乳桿菌及其代謝產物能有效提升肺臟上皮細胞之修復能力，能提升呼吸道之修復能力。
實施例4 本發明之瑞士乳桿菌及其代謝產物提升巨噬細胞吞噬能力之功效
本發明之一實施例將人類單核球細胞THP-1(購自美國典型培養物保藏中心，編號TIB202)分化成巨噬細胞，並藉由觀察巨噬細胞吞噬與PM2.5大小相同之螢光顆粒的能力，測試本發明之瑞士乳桿菌及其代謝產物於促進人 體排除細懸浮微粒PM2.5之功效，其中人體肺臟中具有巨噬細胞，其可參與肺臟中吞噬和清除外來之塵粒或病原體。該THP-1細胞培養於RPMI-1640細胞培養液中(購自Gibco，美國)，其中含有10%之胎牛血清(Fetal Bovine Serum)、0.05mM之2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)、100units/mL之青黴素和100μg/mL之鏈黴素。首先，將1.5x105個THP-1細胞培養於6孔培養盤之每孔中，每孔細胞之培養液中皆加入500nM之佛波醇-12-十四烷醯-13-乙酸酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA，購自Sigma，編號P8139)，並於37℃、含有5%之CO2的培養箱中作用48小時後，替換成新鮮的細胞培養液，並在監控下繼續培養48小時，以將THP-1細胞分化為巨噬細胞，接著將細胞分成以下兩組：(1)加入1%本發明之瑞士乳桿菌或其代謝產物的實驗組、及(2)僅加入細胞培養液之空白控制組，分別反應24小時後，加入0.5%之螢光顆粒(Fluorescent particles,yellow high intensity,1% w/w,1.7-2.2μm，購自Spherotech，美國，編號FH-2052-2)作用4小時，接著將培養液移除後使用1xPBS清洗細胞三次後，以顯微鏡觀察並拍照做紀錄，並以流式細胞儀通過FL1光電倍增管(發射波長為515-545nm)檢測來自巨噬細胞的螢光訊號，其中以細胞培養液(空培液)的螢光訊號作為背景讀值。再利用Excel軟體進行Student t-test以決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異。
本發明之瑞士乳桿菌及其代謝產物促進巨噬細胞吞噬細懸浮微粒PM2.5之實驗結果如圖3所示。經本發明之瑞士乳桿菌或其代謝產物作用後，能明顯觀察到巨噬細胞吞噬的螢光顆粒數量多於控制組，且螢光訊號也較控制組高3.5%。此結果顯示本發明之瑞士乳桿菌及其代謝產物能有效促進巨噬細胞的吞噬能力，使促進排除人體內PM2.5，並幫助呼吸道異物之清除。
實施例5 分析本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物中活性成分
本發明之一實施例為分析本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物中之活性成分。首先，取5L本發明之瑞士乳桿菌代謝產物，將其與乙酸乙酯(Ethyl acetate)以1：1等比例與水混合，分成3次進行液相分配萃取，將3次之乙酸乙酯層萃取液混合後並經減壓濃縮乾燥，得到乙酸乙酯層萃取物共8.28g。其餘水層萃取液則繼續以正丁醇與水等比例1：1的液相分配萃取方式共萃取3次，合併萃取液經減壓濃縮乾燥，得到正丁醇層萃取物共18.20g、及水層萃取物共255.0g。接著，分別將乙酸乙酯層萃取物、正丁醇層萃取物、及水層萃取物初步地進行修復肺臟上皮細胞損傷之功效測試。
接著，以人類支氣管上皮細胞BEAS-2b(購自美國典型培養物保藏中心，編號CRL-9609)藉由細胞劃痕損傷修復實驗，進行該上述三種萃取物於修復肺臟上皮細胞之功效分析。該細胞係培養於Bronchial epithelial cell basal Medium(BEBM，購自Lonza，瑞士)中。首先，將1.5x105個BEAS-2b細胞培養於24孔培養盤之每孔中，於37℃培養16-18小時使細胞平鋪一層於培養盤孔底，接著使用一200μL之微量吸量管於該單層細胞上輕劃一道以製造一傷痕，並移除培養液後以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline,PBS)清洗後，將細胞分成以下四組(n=3)混入不含血清(Serum-free)之上述培養液中，且最終體積為1mL：(1)1%本發明之瑞士乳桿菌代謝產物原液、(2)1%之乙酸乙酯層萃取物、(3)1%之正丁醇層萃取物、及(4)1%之水層萃取物，並以僅加入不含血清之培養液的細胞作為空白控制組。接著以顯微鏡觀察並拍照做紀錄，以此時間點之傷痕大小作為基準點，並於37℃、含有5%之CO2的培養箱中作用16小時後，移除培養液並加入同體積的不含血清之培養液，於37℃培養24小時後，以同樣手法以顯微鏡觀察傷痕並拍照記錄，最後以Image J軟體分析各組圖像，再 利用Excel軟體進行Student t-test以決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異。
本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物之乙酸乙酯層萃取物、正丁醇層萃取物、及水層萃取物結果如圖4所示。其中該瑞士乳桿菌的代謝產物原液顯著地較空白控制組高出179.2%倍，顯示本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物確實具有良好的修復肺臟上皮細胞之功效，其中乙酸乙酯層萃取物較空白控制組高出22%、正丁醇層萃取物則為116.7%、水層萃取物則為20.3%。此些結果顯示本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物原液、乙酸乙酯層萃取物、正丁醇層萃取物、及水層萃取物皆具有良好地修復肺臟上皮細胞之功效，特別是正丁醇層萃取物表現出修復肺臟上皮細胞的最佳功效。因此，進一步自正丁醇萃取物中分離出具有改善呼吸道健康的成分。
接著，依據生物活性導引分離方法(Bioassay guided fractionation)追蹤正丁醇萃取物中的活性成分。首先，將正丁醇層萃取物共18.2g以Diaion HP-20(購自Mitsubishi Chemical，日本)為層析材料，以3：2比例混合之水與甲醇作為沖提液，經管柱層析後共分離得到3個劃分層(F1-F3)。再將第二個劃分層(F2)以9：1比例混合之二氯甲烷與甲醇作為沖提液，經矽膠管柱進行管柱層析後，共分離後得到7個次劃分層(F2-1-F2-7)。再將該次劃分層F2-7以4：1比例混合之二氯甲烷與甲醇作為沖提液，經矽膠管柱進行管柱層析後，共分離得到共20.0mg之TCI-TCI357-01。另外，將第三個劃分層(F3)以二氯甲烷與甲醇漸增極性梯度為沖提液，經矽膠管柱進行管柱層析後，共分離得到7個次劃分層(F3-1-F3-7)，將F3-5以高效能液相層析儀(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)進行純化，其中以3：7比例混合之水與甲醇作為沖提液，分離得到共5.2mg之TCI-TCI357-02。
TCI-TCI357-01為一個白色粉末化合物，其核磁共振氫光譜圖如圖5所示，由該分析可知此化合物具有一組ABCD系統的芳香環質子吸收訊號δ H 7.40(1H,d,J=8.0Hz)、δ H 7.30(1H,d,J=8.0Hz)、δ H 7.03(1H,t,J=8.0Hz)、δ H 6.95(1H,t,J=8.0Hz)、以及與異原子相接的CH2吸收訊號δ H 4.15(2H,d,J=15.6Hz)。而核磁共振碳光譜圖如圖6所示，由該分析可知此化合物具有12個碳訊號，其中包含1個羰基的吸收訊號。為了確認此化合物構造，以核磁共振進行分析，其二維光譜圖COSY如圖7所示、HSQC如圖8所示、及HMBC如圖9所示，另外其質譜圖如圖10所示，由該些結果可確認此化合物為1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)，其構造式如下表1所示，並命名為TCI-TCI357-01。
TCI-TCI357-02為一個黃色粉末化合物，其質譜圖如圖11所示，其中可發現一分子離子峰為331[M+Na]+，推測此化合物分子量為308。另外，其核磁共振氫光譜圖如圖12所示，由該分析可知此化合物具有一組ABCD芳香環質子吸收訊號δ H 8.40(1H,d,J=8.0Hz)、δ H 7.78(1H,d,J=8.0Hz)、δ H 7.62(1H,t,J=8.0Hz)、及δ H 7.32(1H,t,J=8.0Hz)、一組芳香環質子互相耦合訊號δ H 7.39(1H,d,J=3.2Hz)、δ H 6.59(1H,d,J=3.2Hz)、一組芳香環單峰質子吸收訊號δ H 8.81(1H,s)、以及一組與異原子相接的單峰質子CH2吸收訊號δ H 4.65(1H,s)。而其核磁共振碳光譜圖如圖13所示，由該分析可知此化合物共有17個碳，包含一個羰基吸收訊號。為了確認此化合物構造，以核磁共振進行分析，其二維光譜圖COSY如圖14所示、HSQC如圖15所示、及HMBC如圖16所示，由該些結果連接出此化合物結構式，並與文獻比對後，確認此化合物為Flazin，其結構如下表1所示，並命名為TCI-TCI357-02。
藉由質譜儀與核磁共振光譜儀等分析確定化合物TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02的化學結構，其名稱及結構式如下表1所示。
Figure 108101394-A0101-12-0018-4
實施例6 TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02係本發明瑞士乳桿菌之代謝產物
本發明之一實施例為驗證化合物TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02為本發明瑞士乳桿菌所產生之代謝產物，比較細菌培養基空白液以及本發明之瑞士乳桿菌之培養液中成分。首先，分別取20μL之50mg/mL本發明之瑞士乳桿菌上清液之正丁醇層萃取物、以及20μL之50mg/mL細菌培養基空白液之正丁醇層萃取物進行HPLC指紋圖譜分析，其中使用十八烷基矽烷(Octadecylsilyl,Mightysil RP-18 GP 250)日本關東化學公司管柱(內徑(I.D.)為10mm、長度(L)為250mm、顆粒大小為5μm，流速為1.0mL/min)，且流動相組成為甲醇(Methanol)與水之混合溶液，沖提條件如下表2所示，並偵測波長280nm之訊號。
Figure 108101394-A0101-12-0019-5
本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物的正丁醇層萃取物與培養基空白液的正丁醇層萃取物之HPLC指紋圖譜如圖17所示，其中可見空白培養液中皆無TCI-TCI357-01與TCI-TCI357-02化合物存在，此二化合物僅出現在有接種本發明瑞士乳桿菌的培養液中，此結果證明此二化合物確實為本發明瑞士乳桿菌所產生的代謝產物，為需透過培養該瑞士乳桿菌後才會生成之代謝物。
實施例7 本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物中活性成分於修復肺臟上皮細胞之功效
本發明之一實施例為再驗證從本發明瑞士乳桿菌的代謝產物中分離出之TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02具有修復肺臟上皮細胞功效之效性成分，以人類支氣管上皮細胞BEAS-2b進行細胞劃痕損傷修復實驗。首先，將1.5x105個BEAS-2b細胞培養於24孔培養盤之每孔中，於37℃培養16-18小時使細胞平鋪一層於培養盤孔底，接著使用一200μL之微量吸量管於該單層細胞上輕劃一道以製造一傷痕，並移除培養液後以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline,PBS)清洗後，將細胞分成以下二組(n=3)混入不含血清(Serum-free)之上述培養液中，且最終體積為1mL：(1)1%之TCI-TCI357-01及(2)1%之TCI-TCI357-02，並以僅加入不含血清之培養液的細胞作為空白控制組。接著以 顯微鏡觀察並拍照做紀錄，以此時間點之傷痕大小作為基準點，並於37℃、含有5%之CO2的培養箱中作用16小時後，移除培養液並加入同體積的不含血清之培養液，於37℃培養24小時後，以同樣手法以顯微鏡觀察傷痕並拍照記錄，最後以Image J軟體分析各組圖像，再利用Excel軟體進行Student t-test以決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異。
從本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物中分離出之化合物TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02促進肺臟上皮細胞修復能力之實驗結果如圖18所示。經化合物TCI-TCI357-01作用後，相較於空白控制組能顯著地使肺臟上皮細胞之劃痕損傷修復率提升38%，而經化合物TCI-TCI357-02作用後，與控制組相比其肺臟細胞之劃痕損傷修復並無顯著差異性。此結果顯示本發明之瑞士乳桿菌代謝產物中含有護肺功效之化合物為正丁醇層中之TCI-TCI357-01(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)。
綜上所述，本發明之瑞士乳桿菌以及其代謝產物能有效抑制細菌生長、有效提升肺臟上皮細胞之修復能力、以及有效促進巨噬細胞的吞噬能力，而能夠減少呼吸道之感染機率、提升呼吸道之修復能力、以及促進排除人體內PM2.5，並能移除呼吸道之異物。其中本發明之瑞士乳桿菌的代謝產物中具有1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)之效性成分，經功效再驗證能有效提升肺臟上皮細胞之修復能力。因此，本發明之瑞士乳桿菌、其代謝產物、以及純化自其代謝產物之1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸可用於製備改善呼吸道健康之組合物的用途，該組合物該組合物是一醫藥品、或一食品，可藉由口服等方式給予一個體。
【生物材料寄存】
食品工業發展研究所(台灣)；民國107年8月15日；編號BCRC910846。

Claims (4)

  1. 一種1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸用於製備一肺臟上皮細胞修復之組合物的用途，其中該1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸具有下列化學式(I)：
    Figure 108101394-A0305-02-0024-1
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸之濃度至少為1ppm。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸係分離自一益生菌株之分泌物，包含培養該益生菌的培養液。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該益生菌株為瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)，寄存編號係BCRC910846。
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