TWI711450B - 化合物用於提升肺部修復活性之用途 - Google Patents

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李姿儀
林煥祐
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Abstract

本發明提供一種化合物用於提升肺部修復活性之用途，其中該化合物是選自於由下列所組成之群組：綠原酸、β-雄果素，及其任意組合。

Description

化合物用於提升肺部修復活性之用途
本發明是有關於一種化合物用於提升肺部修復活性之用途。
肺是呼吸器官也是過濾器官。肺部平時會分泌黏液以形成保護層，阻止吸入空氣中的病原(如病毒、細菌、真菌)或懸浮微粒吸附至肺臟。但是，肺的異物清除能力有限，部分異物可能穿透此保護層而感染或損傷肺部，進而引起肺部發炎。此外，肺挫傷、敗血症、出血性休克等會引起嚴重肺部發炎。多種參與發炎反應的免疫細胞(如巨噬細胞、嗜中性球)及被刺激分泌之促發炎細胞激素(如介白素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α))可能造成肺部再次損傷，包括肺泡損傷、微血管通透性增加、微血栓，嚴重時甚至引發肺水腫、急性呼吸窘迫症等。前述造成肺組織損傷的因子可能連同發炎反應一起造成特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)，症狀包含乾咳與漸進性呼吸困難，最終可能導致呼吸衰竭及死亡。
為維持肺臟正常功能，應盡可能減少接觸空氣污染物與病原的機會以避免肺部細胞發炎、肺組織損傷及肺纖維化發生。可行方法包括避免吸菸、戴口罩、使用空氣淨化裝置。另外，若肺組織損傷已經形成，應服用能夠促進損傷癒合或抑制發炎的藥物。然而，目前已知可有效提升肺部修復活性的藥物有限，且這些藥物未必能提升肺部修復活性。因此，開發一種能有效提升肺部修復活性的新穎醫藥品，實有其必要。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種組成物用於製備一提升肺部修復活性的醫藥品之用途，其中該組成物包含一有效濃度之選自於由下列所組成之群組中的化合物：綠原酸(Chlorogenic acid)、β-雄果素(β-Arbutin)，及其任意組合，以及一醫藥上可接受之載體。
在本發明之一實施例中，該化合物的有效濃度為至少20μg/mL。
本發明之另一目的為提供一種綠原酸(Chlorogenic acid)用於製備一提升肺部修復活性的醫藥品之用途。
在本發明之一實施例中，該綠原酸的有效濃度為至少20μg/mL。
本發明之另一目的為提供一種β-雄果素(β-Arbutin)用於製備一提升肺部修復活性的醫藥品之用途。
在本發明之一實施例中，該β-雄果素的有效濃度為至少20μg/mL。
在本發明之一實施例中，該提升肺部修復活性包括促進一肺上皮細胞之創傷修復力。
在本發明之一實施例中，該醫藥品具有粉末、顆粒、溶液、膠體、或膏體之劑型。
綜上所述，本發明化合物之功效在於：可藉由促進肺上皮細胞之生長及創傷修復力，達到提升肺部修復活性的功效。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1是青梨幼果萃取物的HPLC指紋圖譜。
圖2是化合物TCI-PN-01及TCI-PN-02在提升肺部修復活性上的效用之數據圖，其中**表示與對照組比較，p<0.01；***表示與對照組比較，p<0.001。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
依據本發明，使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，個此之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)分析。
依據本發明，綠原酸(Chlorogenic acid)，本文代號為TCI-PN-01，具有下列化學式(I)：
Figure 108148718-A0305-02-0005-2
依據本發明，β-雄果素(β-Arbutin)，本文代號為TCI-PN-02，具有下列化學式(II)：
Figure 108148718-A0305-02-0005-3
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或口服地(orally)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉 末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
依據本發明的醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)以及靜脈內注射(intravenous injection)。
依據本發明的醫藥品可包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受之載體。例如，該醫藥上可接受之載體可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該醫藥上可接受之載體包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。
實施例1. 化合物TCI-PN-01及TCI-PN-02的純化
本實施例所純化的化合物是得自於青梨幼果(green pear fruitlet)，其品種可為雪梨(P.nivalis)、鴨梨(P.bretschneideri)、鳥梨(P.lindleyi Rehder)、或橫山梨(P.pyrifolia Nakai)，但不以此為限，其中較佳為雪梨、鴨梨、或鳥梨。
如本文中所使用的，用語「青梨幼果(green pear fruitlet)」意指雪梨、鴨梨、鳥梨、或橫山梨於開花後90天內所結之青梨果實，其中較佳為30~90天內之青梨果實。
梨為梨屬(Pyrus)植物的通稱，通常是一種落葉喬木或灌木，極少數品種為常綠，屬於薔薇目薔薇科蘋果族。葉片多呈卵形，大小因品種不同而各異。花為白色，或略帶黃色、粉紅色，有五瓣。果實形狀有圓形的，也有基部較細尾部較粗的，即俗稱的「梨形」；不同品種的果皮顏色大相逕庭，有黃色、綠色、黃中帶綠、綠中帶黃、黃褐色、綠褐色、紅褐色、褐色，個別品種亦有紫紅色；野生梨的果徑較小，在1~4公分之間，而人工培植的品種果徑可達8公分，長度可達18公分。
梨的果實通常用來食用，不僅味美汁多，甜中帶酸，而且營養豐富，含有多種維生素和纖維素，不同種類的梨味道和質感都完全不同。梨既可生食，也可蒸煮後食用。在醫療功效上，梨可以通便秘，利消化，對心血管也有好處。加熱的梨汁含有大量的抗癌物質多酚，除了作為水果食用以外，梨還可以作觀賞之用。
在本發明一實施例中，將青梨幼果整顆清洗，取洗淨後之青梨幼果整顆與水、醇、或醇水混合物之萃取溶劑，萃取溶劑較佳為水，該萃取溶劑與該青梨幼果混合之重量比範圍為10~20：1~5，均質後在萃取溶劑中以50~100℃進行萃取0.5~3小時後。萃取後冷卻至室溫，將粗萃取物經由400目(mesh)之濾網過濾以獲得濾液。最後，將該濾液於45~70℃進行減壓濃縮，得到一青梨幼果萃取物，其高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)指紋圖譜顯示於圖1。
接著，取10L之青梨幼果萃取物，以乙酸乙酯與正丁醇溶劑，進行液相-液相分配萃取，得到12.1g的乙酸乙酯可溶部(ethyl acetate fraction,EAF)(5.8%)、37.1g的正丁醇可溶部(n-butanol fraction,BUF)(17.8%)，及158.9g的水可溶部(water fraction,WF)(76.4%)。
接著，依據生物活性導引分離方法(bioassay guided fractionation)，將青梨幼果萃取物的正丁醇可溶部以純水、50%甲醇水溶液、與100%甲醇作為沖提液，大孔樹脂Dianion HP-20管柱層析方法(column chromatography)(填充材料包括Sephadex LH-20(Pharmacia,Piscataway,NJ, USA)、Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical Co.，日本)、40~63μm Merck Kieselgel 60(Art.9385)、及Merck LiChroprep® RP-18(40~63μm)(Art.0250))，得到3個分離部(BUF1~BUF3)。
接著，將BUF1分離部經中壓液相層析法(medium pressure liquid chromatography,MPLC)(CombiFlash ® Rf+,Teledyne ISCO,Lincoln,NE)進行分離，沖提梯度由純水(0分鐘)至100%甲醇(50分鐘)線性梯度，偵測波長280nm，得到3個次分離部(BUF1-1~BUF1-3)。接著，由BUF1-1次分離部，經逆相高效能液相層析法(high performance liquid chromatography,HPLC)(幫浦系統：Hitachi L-2310 series pump；偵測器：Hitachi L-2420 UV-VIS detector，偵測波長為200~380nm；資料處理軟體：D-2000 Elite軟體；分析管柱：Mightysil RP-18GP 250(Kanto,250 x 4.6mm,5μm)；半製備管柱：Discovery® HS C18(SUPELCO,250 x 10.0mm,5μm)；製備級管柱：Discovery® HS C18(SUPELCO,250 x 21.0mm,5μm))進行純化(甲醇/水=1/9)，藉此得到化合物TCI-PN-02。
另外，將BUF2分離部經中壓液相層析法(CombiFlash ® Rf+,Teledyne ISCO,Lincoln,NE)進行分離，沖提梯度由純水(0分鐘)至100%甲醇(80分鐘)線性梯度，偵測波長280nm，得到8個次次分離部(BUF2-1~BUF2-8)。接著，由BUF2-4次次分離部進行逆相高效能液相層析法純化(甲醇/水=3/7)，藉此得到化合物TCI-PN-01。
之後，TCI-PN-01經氫-核磁共振光譜(1H-NMR)(1D與2D光譜使用400MHz Varian 400 FT-NMR；以δ表示化學位移(chemical shift)，單位為ppm；以四甲基矽烷(tetramethylsilane,TMS；δ=0)作為內部標準品，偶合常數(J)以Hz為單位，並以s表單峰(singlet)，d表二重峰(doublet)，t表三重峰(triplet)，q表四重峰(quartet)，p表五重峰，m表多重峰(multiplet)，brs表寬峰)與電噴灑離子化質譜(ESIMS)(串聯質譜-二維離子阱串聯傅立葉轉換質譜及ESI-MS/MS：使用Bruker amaZon SL system and Thermo Orbitrap Elite system測定，單位為m/z)分析其化學結構後，確認其為綠原酸(Chlorogenic acid)具有式(I)結構式。
TCI-PN-02經1H-NMR與ESIMS分析其化學結構後，確認其為β-雄果素(β-Arbutin)具有式(II)結構式。
圖1是青梨幼果萃取物的HPLC指紋圖譜，使用溶劑為甲醇(A)與水(B)，並額外添加0.1%甲酸，流速為1mL/分鐘，沖提條件：0分鐘時A：B=2：98；10分鐘時A：B=2：98；40分鐘時A：B=70：30；50分鐘時A：B=100：0；60分鐘時A：B=100：0。定量分析結果發現TCI-PN-01為含量最多的化合物，其含量為1358ppm。
實施例2. 化合物TCI-PN-01及TCI-PN-02在提升肺部修復活性上的效用評估
本實施例使用購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)之人類正常肺上皮細胞株BEAS-2b(ATCC CRL-9609)。該細胞培養於支氣管上皮基礎培養基(LonzaTM Bronchial epithelial cell basal medium；Thermo Fisher Scientific)，簡稱BEBM培養基。
為研究化合物TCI-PN-01及TCI-PN-02是否影響肺組織的創傷修復能力，本實施例利用顯微鏡觀察人類肺上皮細胞株BEAS-2b之細胞單層經化合物TCI-PN-01或TCI-PN-02處理後的傷口癒合狀況變化。簡言之，將細胞依1.5×105個細胞/孔接種於含有BEBM培養基的24孔盤(GeneDireX)，在37℃隔夜培養以形成一細胞單層。其後，於該細胞單層中形成一傷口，移除培養基並以PBS溶液(Gibco)清洗細胞。之後，將BEAS-2b細胞分成4組，其中包括2個實驗組(亦即實驗組1及實驗組2)、1個EGF組以及1個對照組。將2μg/mL表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)添加至EGF組的細胞中，將20μg/mL化合物TCI-PN-01添加至實驗組1的細胞中，及將20μg/mL化合物TCI-PN-02添加至實驗組2的細胞中，至於對照組的細胞僅被添加BEBM培養基。細胞單層(三重複試驗)於傷口形成後(0小時)及於37℃培養16小時後用顯微鏡(ZEISS)觀察及拍攝照片。本實施例的結果顯示於圖2及表1。
圖2是化合物TCI-PN-01及TCI-PN-02在提升肺部修復活性上的效用之數據圖。由圖2可見，與對照組及EGF組相較之下，實驗組1及實驗組2的傷口癒合能力相對倍數有顯著的提升。其中，與對照組比較，實驗組1的傷 口癒合能力相對倍數提升達5.42倍，實驗組2的傷口癒合能力相對倍數提升達3.05倍。而表1顯示化合物TCI-PN-01及TCI-PN-02在促進人類肺部上皮細胞生長上的功效之量化數據。
Figure 108148718-A0305-02-0010-6
本實施例的結果顯示，化合物TCI-PN-01及TCI-PN-02能夠促進人類肺部上皮細胞生長，達到提升肺部修復活性的功效。
綜上所述，本發明化合物TCI-PN-01及TCI-PN-02可藉由促進肺上皮細胞之創傷修復力，達到提升肺部修復活性的功效。
Figure 108148718-A0305-02-0002-1

Claims (4)

  1. 一種綠原酸(Chlorogenic acid)用於製備一提升肺部傷口癒合能力的醫藥品之用途。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該提升肺部傷口癒合能力包括促進一肺上皮細胞之創傷修復力。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該綠原酸的有效濃度為至少20μg/mL。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥品更包括一醫藥上可接受之載體。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101732302A (zh) * 2009-12-28 2010-06-16 北京师范大学 绿原酸在制备治疗肺纤维化的药中的应用

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Title
Arbutin attenuates LPS-induced lung injury via Sirt1/ Nrf2/ NF-κBp65 pathway, Pulmonary Pharmacology & Therapeutics，Vol.54,p.53-59,2019 *
Arbutin attenuates LPS-induced lung injury via Sirt1/ Nrf2/ NF-κBp65 pathway, Pulmonary Pharmacology & Therapeutics，Vol.54,p.53-59,2019。

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