KR101891417B1 - 마갑자 추출물 및 그 제조방법과 용도 - Google Patents

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Abstract

마갑자 및 마갑자 추출물의 신규 용도는 항섬유화 작용, 항진균 작용, 항종양 작용, 양방향 면역 조절 작용을 지니고, 구강 및 소화관 염증 또는(및) 궤양을 치료하는 약물을 제조하는데 있어서의 용도를 포함한다.

Description

마갑자 추출물 및 그 제조방법과 용도{PALIURUS RAMOSISSIMUS(LOUR.)POIR EXTRACT AND PREPARATION METHOD AND USES THEREOF}
본 발명은 의약분야에 속하며, 구체적으로는 마갑자 추출물 및 그 제조방법과 용도에 관한 것이다.
마갑자(Paliurus ramosissimus(Lour.)Poir)는 낙엽관목이며, 흔히 볼 수 있는 약용 식물의 일종으로서, 가지, 잎, 뿌리, 꽃, 열매 모두 약용 가능하다. 성미는 쓰고, 평하며, 무독하고, 거한활혈, 해열, 부기 가라앉고, 타박상 및 심복통 치료의 효능이 있으며, 《중약대사전》및 약간의 지방약물지에 수록되어 있다.
본 발명의 발명자는 연구 과정에서 마갑자 및 그 추출물이 양호한 항섬유화, 항진균활성, 항종양활성을 지니고, 구강 및 소화관의 염증 또는(및) 궤양 관련 질병을 치료할 수 있으며, 또한 양방향 면역 조절작용이 있음을 발견하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 기술문제는 마갑자의 신규 용도를 제공하고자 하는데 있다.
응용 시, 마갑자는 마갑자 전초 식물 또는 그 중의 어느 한 부위를 이용하며; 그 중, 약용 부위는 근(뿌리), 경(줄기), 엽(잎), 화(꽃), 과(열매) 중의 어느 한 부위 또는 이들의 혼합일 수 있다.
구체적으로, 마갑자의 신규한 약물 용도는 항섬유화, 항진균활성, 항종양활성을 지니고, 구강 및 소화관의 염증 또는(및) 궤양 관련 질병을 치료하며, 양방향 면역 조절작용이 있는 약물을 제조하는데 있어서의 용도이다.
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 기술문제는 신규한 마갑자 추출물을 제공하고자 하는데 있다. 약재의 수집기간과 보존의 편리성을 감안하여, 임상적으로 약물을 사용하기 편리하도록 마갑자를 추출물로 제조한 후 응용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 마갑자 추출물은 마갑자 전초 식물 또는 그 중 어느 하나의 부위를 원료약으로 하고, 통상적인 추출 방법을 이용하여 제조된다. 본 발명으로 획득되는 마갑자 추출물의 주요 성분은 플라보노이드류, 테르페노이드류, 알칼로이드류, 쿠마린류를 포함하고; 또한 상기 플라보노이드, 테르페노이드, 알칼로이드, 쿠마린의 배당체 및 그 모노머 성분을 더 포함하며; 다당류와 셀룰로오스를 더 포함한다.
본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 기술문제는 본 발명의 마갑자 추출물의 이하 제조방법을 제공하고자 하는데 있다.
방법 1.
A. 마갑자 전초 식물 또는 그 중 어느 하나의 부위를 원료약으로 하는 단계;
B. 용제로 추출, 건조하여 획득하는 단계.
상기 기술방안 중, 단계 A에서 원료약으로서의 상기 마갑자는 신선품, 냉동건조품, 유기용매 전처리품을 이용한다.
상기 기술방안 중, 단계 B의 상기 용제는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 에틸아세테이트 또는 석유에테르이고, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올이다.
상기 기술방안 중, 단계 B의 상기 추출은 침지, 환류 또는 삼출 추출을 이용한다.
상기 기술방안 중, 단계 B의 상기 건조는 감압건조, 냉동건조, 분무건조 또는 마이크로파 건조이다.
방법 2.
A. 마갑자 전초 식물 또는 그 중 어느 하나의 부위를 원료약으로 하는 단계;
B. 용제 a로 추출하고 여과액을 농축하여 농축액을 수득하는 단계;
C. 단계 B에서 얻은 여과액을 용제 b로 추출하여 액상을 수득하고, 건조시켜 획득하는 단계;
또는 단계 B에서 수득한 여과액을 농축 또는 건조시켜 추출물 1을 수득하고, 용제 b로 추출한 후, 추출액을 건조시켜 획득하는 단계.
상기 기술방안 중, 단계 A에서 원료약으로서의 상기 마갑자는 신선품, 냉동건조품, 유기용매 전처리품을 이용한다.
상기 기술방안 중, 단계 B의 상기 용제 a는 메탄올 또는 에탄올, 이소프로판올이며; 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올이다.
상기 기술방안 중, 단계 C의 상기 용제 b는 에틸아세테이트 또는 석유에테르이다.
상기 기술방안 중, 단계 B 및 단계 C의 상기 추출은 침지법, 환류법, 삼출법 또는 추출법을 이용한다.
상기 기술방안 중, 단계 B 및 단계 C의 상기 건조는 감압건조, 냉동건조, 분무건조 또는 마이크로파 건조이다.
상기 방법을 이용하여 제조되는 추출물은, 방법 1에 따라 제조되는 경우, 즉 단계 B에 사용되는 용제로 대응되는 추출물을 명명하며, 예를 들어 마갑자 에탄올 추출물, 마갑자 메탄올 추출물, 마갑자 이소프로판올 추출물, 마갑자 에틸아세테이트 추출물, 마갑자 석유에테르 추출물과 같이 명명한다. 방법 2에 따라 제조되는 경우, 즉 단계 C에서 사용되는 용제 b로 대응되는 추출물을 명명하며, 예를 들어 마갑자 석유에테르 추출물, 마갑자 에틸아세테이트 추출물과 같이 명명한다. 방법 2의 단계 C로 획득되는 추출물 1은 즉 방법 2의 단계 B에서 사용되는 용제 a로 대응되는 추출물을 명명하며, 예를 들어 마갑자 에탄올 추출물, 마갑자 메탄올 추출물, 마갑자 이소프로판올 추출물과 같이 명명한다.
상기 기술방안 중, 방법 1의 단계 B에서 사용되는 용제와 마갑자의 용량 관계는, 용제의 첨가량이 마갑자 질량의 1-20배이고; 바람직하게는 용제의 첨가량이 마갑자 질량의 5-15배이며; 더욱 바람직하게는, 용제의 첨가량이 마갑자 질량의 8-10배이다.
상기 기술방안 중, 방법 2의 단계 B에서 사용되는 용제 a와 마갑자의 용량 관계는, 용제 a의 첨가량이 마갑자 질량의 1-20배이고; 바람직하게는, 용제 a의 첨가량이 마갑자 질량의 5-15배이며; 더욱 바람직하게는, 용제 a의 첨가량이 마갑자 질량의 8-10배이다.
바람직하게는, 용제 또는 용제 a로 메탄올 또는 에탄올을 사용 시, 메탄올 또는 에탄올 첨가량은 마갑자 질량의 1-20배이고; 바람직하게는, 메탄올, 또는 에탄올 첨가량이 마갑자 질량의 5-15배이며; 더욱 바람직하게는, 메탄올 또는 에탄올 첨가량이 마갑자 질량의 8-10배이다.
그 중, 상기 에탄올의 농도는 10-95%이며, 에탄올 농도가 50-95%인 것이 바람직하고, 에탄올 농도가 95%인 것이 가장 바람직하다.
상기 기술방안 중, 원료 마갑자는 유기용매를 사용하여 처리하기 전 반드시 신선품 또는 냉동건조품이어야 한다. 이유는 발명자기 연구 과정에서 마갑자를 햇볕에 건조시키거나 또는 건조기로 건조시킨 건조품은 상응하는 활성이 없음을 발견하였기 때문이며, 따라서 마갑자 신선품을 원료로 선택한다. 그러나 신선품은 보관, 운송에 불리하므로, 발명자는 연구 결과, 냉동건조와 유기용매로 마갑자 신선품을 전처리하면 약물의 활성성분을 보존하기에 유리하고, 효과는 신선품과 맞먹어, 본 발명의 마갑자 추출물의 신규 용도를 만족시킬 수 있고, 보존과 운송에 유리하다는 것을 발견하였다.
구체적으로, 유기용매를 이용한 처리방식은 마갑자를 유기용매에 침지시키고, 건조시키면 된다.
그 중, 상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, 석유에테르, 이소프로판올 등이고; 메탄올 또는 에탄올인 것이 바람직하다.
본 발명의 추출물은 경구(협내 또는 설하 포함), 경비, 국부(협내, 설하 또는 경피 포함), 장관외(피하, 피내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병소내, 정맥내 또는 피내주사 또는 수액) 경로로 투여된다. 이러한 제제는 약제학 기술 중 공지된 임의의 방법, 예를 들어 활성성분과 담체 또는 부형제를 결합시키는 방식을 통해 제조될 수 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 네 번째 기술문제는 본 발명의 마갑자 추출물로 제조되는 약물 제제를 제공하고자 하는데 있으며, 즉 본 발명의 마갑자 추출물에 약학적으로 허용 가능한 보조제를 첨가하여 다양한 경로로 투여되는 약물제제를 제조할 수 있다. 응용의 편의를 위하여, 본 발명의 추출물은 통상적인 방법을 이용하여 통상적인 경구투여 제제, 주사제제 및 외용 제제로 제조될 수 있다. 예를 들어 경구(협내 또는 설하 포함), 경비, 국부(협내, 설하 또는 경피 포함), 장관외(피하, 피내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병소내, 정맥내 또는 피내주사 또는 수액) 경로로 투여된다. 이러한 제제는 약제학 기술 중 공지된 임의의 방법, 예를 들어 활성성분과 담체 또는 부형제를 결합시키는 방식을 통해, 예를 들어 정제, 캡슐제, 과립제, 펠렛, 마이크로스피어, 적환, 방출제어형 제제, 서방형 제제 또는 주사제로 제조될 수 있다.
경구투여에 적합한 약물제제는 캡슐, 정제, 분말 또는 과립과 같은 독립단위; 수성 또는 비수성 액체 중의 용액, 현탁액, 수중유형 액체 유액 또는 유중수형 유액으로 나타날 수 있다. 단위용량 형식으로 용액, 시럽 또는 엘릭시르제와 같은 경구용 액체를 제조할 수 있으며, 시럽은 화합물을 적당히 조미된 수용액에 용해시켜 제조할 수 있고, 엘릭시르제는 무독성 담체(vehicle)를 사용하여 제조된다. 증용제와 유화제(예를 들어 에톡시화 이소스테아릴 알코올 및 폴리옥시에틸렌 솔비톨 에테르), 방부제, 조미 첨가제(예를 들어 박하유 또는 천연감미제, 또는 사카린 또는 기타 인공 감미제) 및 유사물을 더 첨가할 수 있다. 적당 시, 경구투여를 위한 용량단위 제제는 마이크로캡슐화된 것이거나, 중합체, 왁스 또는 유사물에 과립물질을 코팅하거나 또는 포매하는 방식을 통해 제제를 제조하여 방출을 연장 또는 지속시킬 수도 있다. 또한 지질체 투여시스템(예를 들어 스몰 단일 라멜라 소포체(小單層脂質體), 라지 단일 라멜라 소포체(大單層脂質體), 멀티 라멜라 소포체(多層脂質體)의 형식으로 투여할 수도 있으며, 지질체는 각종 인지질, 예를 들어 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린으로 형성될 수 있다.
경피투여에 적합한 약물제제는 피투여자의 표피와 비교적 장시간 동안 밀착 접촉을 유지하고자 하는 독립된 패치 형식으로 나타낼 수 있다. 국부 투여에 적합한 약물제제는 연고제, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 젤, 분무제, 에어로졸, 리니먼트제 또는 오일제제 등으로 제조할 수 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 다섯 번째 기술문제는 본 발명의 마갑자 추출물의 약용 신규 용도를 제공하고자 하는데 있다.
본 발명의 마갑자 추출물은 마갑자 메탄올 추출물, 마갑자 에탄올 추출물, 마갑자 에틸아세테이트 추출물, 마갑자 석유에테르 추출물을 포함하며, 모두 항섬유화, 항진균활성, 항종양활성을 지니고, 구강 및 소화관의 염증 또는(및) 궤양 관련 질병을 치료하며, 또한 양방향 면역 조절작용을 구비한 약물을 제조하는데 있어서의 제약의 신규 용도에 응용될 수 있다. 단독으로 마갑자 추출물을 사용하거나, 또는 마갑자 추출물을 주요활성 성분으로 하는 약물 조합물을 사용하것도 상기 제약의 신규 용도에 포함한다.
그 중,
본 발명의 마갑자 추출물은 항종양 활성 약물의 제조에 응용 시, 기타 종양 치료 작용이 있는 중약, 양약을 결합 사용할 수 있다. 방사선 치료, 면역요법, DNA 손상의 화학치료제, 세포복제를 간섭하는 화학치료제와 면역조절약물을 포함하며, 구체적으로는 토포이소머라아제 I 억제제, 토포이소머라아제 II 억제제, 알킬화제, DNA 융합제, DNA 삽입제와 래디컬 생성제, 세포 복제를 간섭하는 화학치료제, 단백질 티로신 키나제 억제제, 프로테아제 억제제, 암증 중 과발현된 단백질과 결합하여 세포 복제를 감소시키는 항체, 단백질 또는 효소 억제제가 있다. 기타 종양 치료 기능을 갖는 중약, 양약은 이리노테칸, 토포테칸, 캄포테신 및 이들의 유사물질 또는 대사물질, 독소루비신, 에토포시드, 테니포시드, 다우노루비신, 멜파란, 클로람부실, 부설판, 티오테파, 이포스파미드, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조톡신, 디카바진, 메토트렉세이트, 미토마이신 C, 시클로포스파미드, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 블레오마이신, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 젬시타빈, 플루다라빈, 시타라빈, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴, 하이드록시우레아, 파클리탁셀, 도세탁셀 및 그의 관련 유사물질, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 관련 유사물질, 탈리도마이드 및 관련 유사물질, 이마티닙 메탄설포네이트, 제피티닙, 보르테조밉, 트라스투주맙, 리툭시맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 시노부포탈린, 아가리쿠스 버섯, 소르바리아 에틸아세테이트 추출물, 리치씨 추출액, 셀라스트롤, 그리폴라 폴리사카라이드, 카르복시메틸파키마란, 알리졸 추출 농축액, 감초 다당, 당귀 총 다당, 소랄렌, 오미자 다당으로부터 선택할 수 있다.
본 발명의 마갑자 추출물은 항섬유화 약물의 제조에 응용 시, 기타 섬유화 치료 작용이 있는 중약, 양약을 결합 사용할 수 있다. 기타 섬유화 치료 작용이 있는 중약, 양약은 삼칠 사포닌, 리구스트라진, 단삼, 자오가 주사액, 리구스트라진 주사액, 홍화 주사액, 징코플라본 글리코사이드, 생맥, 단삼 주사액, 쌍황련, 향단 주사액, 익기활혈 과립, 캉시엔(抗纖) 과립(Kangxian Granules), 페이캉(肺康) 과립(Feikang Granules), 백합고금환(百合固金丸), 충초합개산합양삼환(忠草蛤介散合洋參丸), 황기, 사프란, 생지황, 삼칠, 교고람, 강황, 황촉규, 아미그달린, 테트란드린, 에모딘, 엔테카비르, 라미부딘, β-카로틴, 비타민 E, 포스파티딜콜린, S- 아데노실메티오닌, 알프로스타딜, 디노프로스톤, 콜히친, 에스트로겐, 안지오텐신Ⅱ 수용체 길항제, 교감신경계통 억제제, 인터페론, 프롤릴-4-하이드록실라제 억제제, 헤파린, 실리마린, 우르소데옥시콜린산으로부터 선택된다. 상기 섬유화는 폐 섬유화, 신장 섬유화, 간 섬유화, 심근 섬유화를 포함한다.
본 발명의 마갑자 추출물을 양방향 면역 조절 작용을 지닌 약물의 제조에 응용 시, 구체적으로 면역기능 저하 또는(및) 자기 면역성 질병, 특히 면역기능 이상으로 인한 면역기능 저하 또는(및) 자기 면역성 질병 치료 약물 제조에의 응용을 말한다. 그 중, 상기 면역기능 이상으로 인한 면역기능 저하로는 감기에 잘 걸림, 신체 허약, 종양, 에이즈 등을 포함한다. 상기 면역기능 이상으로 인한 자기 면역성 질병으로는 류마티스 관절염, 루푸스, 피부경화증, 갑상선기능항진증, 청소년 당뇨병, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 자기면역성 용혈성 빈혈, 궤양성 대장염, 만성 간질환 등을 포함한다.
상기 기술방안 중, 마갑자 추출물을 항종양 활성 약물에 응용 시, 마갑자 전 초 식물 또는 그 중 어느 한 부위를 원료약으로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 엽을 원료약으로 사용한다.
근, 경, 엽 전부를 포함하는 마갑자 전초 또는 그 중 어느 한 부위를 원료로 사용하는 경우, 마갑자 추출물은 이하 방법으로 제조될 수 있다. 근, 경, 엽 전부를 포함하는 마갑자 전초 또는 그 중 어느 한 부위의 신선품 또는 냉동건조품을 취하여, 유기용매로 마갑자 신선품 또는 냉동건조품을 전처리한 후 준비해 두고, 제조 시 상기 전처리된 마갑자 신선품 또는 냉동건조품을 유기용매로 추출하거나, 또는 마갑자 신선품 또는 냉동건조품을 직접 유기용매로 추출하여 마갑자 추출물을 수득하며, 유기용매로 추출하는 방법은 침지법, 환류법, 삼출법 등 본 분야의 통상적인 추출방법을 포함하되, 단 이에 한정되지 않는다.
상기 마갑자는 유기용매로 처리하기 전 신선품 또는 냉동건조품인 것이 바람직하다.
상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 에틸아세테이트와 석유에테르 등에서 선택하며, 50~95%의 에탄올인 것이 바람직하고, 95%의 에탄올인 것이 더욱 바람직하다.
마갑자 추출물은 이하 방법으로 제조되는 것이 바람직하다. 신선한 마갑자 전초를 취하여, 8-10배 중량부의 95% 에탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 후, 마갑자를 분쇄하고, 6-10배 중량부의 95% 에탄올을 더 투입하여 2-3일 동안 침지 추출한 다음, 추출액을 수집하고, 용제를 감압 회수하여 추출물 농축액을 수득한 후, 건조시켜 마갑자 에탄올 추출물을 획득하며, 그 중 건조방법은 감압건조, 냉동건조, 분무건조, 마이크로파 건조를 포함하되, 단 이에 한정되지 않는다.
더욱 바람직하게는 신선한 마갑자 경엽을 취하여, 8배 중량부의 95% 에탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 다음, 마갑자를 분쇄하고, 10배 중량부의 95% 에탄올을 더 투입하여 추출하고, 환류 추출하여 추출액을 수집한 후, 60℃에서 에탄올을 알코올 냄새가 없어질 때까지 감압 회수하고, 획득된 추출물 농축액을 건조시켜 마갑자 에탄올 추출물을 획득한다.
더욱 바람직하게는 신선한 마갑자 경엽을 취하여, 8배 중량부의 메탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 다음, 마갑자를 분쇄하고, 10배 중량부의 메탄올을 더 투입하여 추출하고, 환류 추출하여 추출액을 수집한 후, 60℃에서 메탄올을 감압 회수하여, 수득된 추출물 농축액을 건조시킨 후 마갑자 메탄올 추출물을 획득한다.
또한, 마갑자 에탄올 추출물을 물로 분산시킨 후, 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트로 추출하고, 농축한 후 건조시켜 석유에테르 추출물 또는 에틸아세테이트 추출물을 획득할 수도 있다.
또한, 상기 알코올 추출의 구체적인 단계는 다음과 같다.
(1) 마갑자엽을 취하여, 5-15배량의 50~95% 에탄올에 투입하여 침지하는 단계;
(2) 엽편을 분쇄한 다음, 5-15배량의 50%~95% 에탄올에 투입하여 침지하고, 알코올용성 성분을 추출하는 단계;
(3) 추출액을 수집하고, 30~70℃에서 에탄올을 알코올 냄새가 없어질 때까지 감압회수하여 추출물을 획득하는 단계;
(4) 추출물 농축액을 더 냉동건조시켜 마갑자엽 알코올 추출물을 획득하는 단계.
또한, 상기 중약 추출물은 석유에테르 또는 에틸아세테이트를 통해 추출 처리한다. 상기 중약 추출물은 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트, n-부탄올로 추출한 후, 용제를 회수하고 냉동건조시켜 3개의 극성 부위 추출물을 수득한 다음, 이소프로판올로 용해시키고, 종양세포에 대한 억제 효과를 테스트하였다. 그 결과, 상기 중약 추출물의 석유에테르 부위와 에틸아세테이트 부위는 매우 우수한 항종양 활성이 있고, n-부탄올 추출부위는 항종양 활성이 없는 것으로 나타났으며, 에틸아세테이트 부위는 더욱 우수한 항종양 활성을 나타내었다.
또한, 상기 마갑자 추출물의 주요 성분은 트리테르페노이드류, 플라보노이드류, 알칼로이드류와 쿠마린류를 포함한다.
상기 기술방안 중, 마갑자 추출물을 항섬유화 약물 제조에 응용 시, 마갑자 전초 식물 또는 그 중 어느 한 부위를 원료약으로 사용하며, 바람직하게는 엽을 원 료약으로 사용한다.
근, 경, 엽 전부를 포함하는 마갑자 전초 또는 그 중 어느 한 부위를 원료로 할 경우, 마갑자 추출물은 이하 방법으로 제조될 수 있다. 근, 경, 엽 전부를 포함하는 마갑자 전초 또는 그 중 어느 한 부위의 신선품 또는 냉동건조품을 취하여, 유기용매로 마갑자 신선품 또는 냉동건조품을 전처리한 후 준비해 두고, 제조 시 상기 전처리된 마갑자 신선품 또는 냉동건조품을 유기용매로 추출한다. 또는 마갑자 신선품 또는 냉동건조품을 직접 유기용매로 추출하여 마갑자 추출물을 수득하며, 유기용매 추출 방법은 침지법, 환류법, 삼출법 등 본 분야의 통상적인 추출방법을 포함하되, 단 이에 한정되지 않는다.
상기 마갑자는 유기용매로 처리하기 전 신선품 또는 냉동건조품인 것이 바람직하다.
상기 유기용매는 메탄올, 10-100%의 에탄올로부터 선택하며, 95%의 에탄올인 것이 바람직하다.
마갑자 추출물은 이하 방법으로 제조되는 것이 바람직하다. 신선한 마갑자 전초를 취하여, 8-10배 중량부의 95% 에탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 후, 마갑자를 분쇄하고, 6-10배 중량부의 95% 에탄올을 더 투입하여 2-3일 동안 침지 추출하고, 추출액을 수집한 후, 용제를 감압 회수하여, 추출물 농축액을 수득한 다음, 건조시켜 마갑자 에탄올 추출물을 획득하며, 그 중 건조방법은 감압건조, 냉동건조, 분무건조, 마이크로파 건조를 포함하되, 단 이에 한정되지 않는다.
더욱 바람직하게는 신선한 마갑자 경엽을 취하여, 8배 중량부의 95% 에탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 후, 마갑자를 분쇄하고, 10배 중량부의 95% 에탄올을 더 투입하여 추출하고, 환류 추출하여 추출액을 수집한 후, 60℃에서 알코올 냄새가 없어질 때까지 에탄올을 감압 회수하여, 수득된 추출물 농축액을 건조시켜 마갑자 에탄올 추출물을 획득한다.
더욱 바람직하게는 신선한 마갑자 경엽을 취하여, 8배 중량부의 메탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 다음, 마갑자를 분쇄하고, 10배 중량부의 메탄올을 더 투입하여 추출하며, 환류 추출하여 추출액을 수집한 후, 60℃로 메탄올을 감압 회수하여, 수득된 추출물 농축액을 건조시킨 후 마갑자 메탄올 추출물을 획득한다.
또한, 마갑자 에탄올 추출물을 물로 분산시킨 후, 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트로 추출하고, 농축한 후 건조시켜 석유에테르 추출물 또는 에틸아세테이트 추출물을 획득할 수도 있다.
상기 기술방안 중, 마갑자 추출물을 항진균 약물의 제조에 응용 시, 마갑자 전초 식물 또는 그 중 어느 한 부위를 원료약으로 사용하며, 바람직하게는 엽을 원료약으로 사용한다.
마갑자 추출물의 제조방법은 다음과 같다. 마갑자 전초 식물 또는 그 중의 어느 한 부위를 취하여, 마갑자 부피의 1-20배의 메탄올 또는 에탄올에 투입하여 추출하거나, 또는 메탄올 또는 에탄올 추출물을 에틸아세테이트 또는 석유에테르로 더 추출하고; 추출액을 농축 후 건조시켜 마갑자 추출물을 제조한다.
상기 마갑자는 신선품, 냉동건조품 또는 메탄올이나 에탄올로 처리한 샘플인 것이 바람직하며; 상기 추출 방법은 침지, 환류 또는 삼출법이고; 상기 건조방법은 감압건조, 냉동건조, 분무건조 또는 마이크로파 건조이다.
상기와 같이 제조된 마갑자 추출물은 테르페노이드류, 플라보노이드류, 알칼로이드류와 쿠마린류 및 테르페노이드류, 플라보노이드류, 알칼로이드류, 쿠마린류의 배당체류 및 모노머를 포함한다.
상기 마갑자 추출물의 각종 제제는 마갑자 추출물 정제, 과립제, 연고제, 겔제, Plastics(塗膜劑), 리니먼트제, 로션제 및 분무제를 포함한다.
본 발명은 항진균 활성을 지닌 마갑자 추출물 및 각종 제제의 항진균 활성에의 응용을 제공한다. 상기 마갑자 추출물은 마갑자 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 석유에테르 또는 유사 용매 추출물이다. 마갑자 신선품, 냉동건조품, 메탄올(에탄올) 또는 기타 유기용매 전처리 샘플을 원료로 하여, 유효성분의 안정성을 보장한다.
상기 기술방안 중, 마갑자 추출물을 면역기능 저하 또는(및) 자기면역성 질병 치료 약물에 응용 시, 마갑자 전초 식물 또는 그 중의 어느 한 부위를 원료약으 로 사용하며, 바람직하게는 엽을 원료약으로 사용한다.
마갑자 추출물의 제조방법은 다음과 같다. 마갑자 전초 식물 또는 그 중의 어느 한 부위를 취하여, 마갑자 부피의 1-20배의 메탄올 또는 에탄올에 투입하여 추출하거나, 또는 메탄올 또는 에탄올 추출물을 에틸아세테이트 또는 석유에테르로 더 추출하고; 추출액을 농축 후 건조시켜 마갑자 추출물을 제조한다.
상기 마갑자추출물은 마갑자 신선품, 냉동건조품 또는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등으로 전처리한 샘플인 것이 바람직하고; 상기 추출 방법은 침지, 환류 또는 삼출법을 포함하며; 상기 건조방법은 감압건조, 냉동건조, 분무건조 또는 마이크로파 건조를 포함한다.
상기와 같이 제조된 마갑자 추출물의 성분은 테르페노이드류, 플라보노이드류, 알칼로이드류와 쿠마린류, 다당류, 셀룰로오스류 및 테르페노이드류, 플라보노이드류, 알칼로이드류, 쿠마린류의 배당체류 및 모노머를 포함한다.
상기 마갑자 추출물의 각종 제제는 마갑자 추출물 정제, 캡슐제, 접착연고제, 과립제, 주사제, 좌제, 연고제, 겔제, Plastics(塗膜劑), 리니먼트제, 로션제 및 분무제를 포함한다.
상기 마갑자 추출물의 응용은, 면역기능 저하와 관련된 질병 또는(및) 자기면역성 질병 치료에 응용되는 약물의 제조에 응용되며, 마갑자 추출물을 단독으로 사용하거나 또는 마갑자 추출물을 주요 활성성분으로 하는 약물 조성물의 면역기능 저하와 관련된 질병 또는(및) 자기면역성 질병을 치료하는 약물 제조에 있어서의 용도를 포함한다.
상기 기술방안 중, 마갑자 추출물을 구강 및 소화관 염증 또는(및) 궤양을 치료하는 약물의 제조에 응용 시, 마갑자 전초 식물 또는 그 중의 어느 한 부위를 원료약으로 사용하며, 바람직하게는 엽을 원료약으로 사용한다.
마갑자 추출물의 제조방법은 다음과 같다. 마갑자엽, 마갑자 경엽 또는 마갑자 전초 식물의 신선품을 취하여, 마갑자 질량의 1-20배의 메탄올 또는 에탄올에 투입하여 추출하거나; 또는 메탄올 또는 에탄올 추출물을 에틸아세테이트 또는 석유에테르로 더 추출하고; 추출액을 농축 후 건조시켜 마갑자 추출물을 제조하며; 성분은 테르페노이드류, 플라보노이드류, 알칼로이드류와 쿠마린류, 다당류, 셀룰로오스류 및 테르페노이드, 플라보노이드, 알칼로이드, 쿠마린의 배당체류 및 모노머를 포함한다.
상기 마갑자 추출물은, 마갑자 신선품 또는 냉동건조품을 직접 유기용매로 추출하거나, 또는 마갑자 신선품을 유기용매로 전처리 후 재추출하며; 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 에틸아세테이트, 석유에테르를 포함하고; 상기 추출 방법은 침지, 환류 또는 삼출법을 포함하며; 상기 건조방법은 감압건조, 냉동건조, 분무건조 또는 마이크로파 건조를 포함한다.
상기 마갑자 추출물의 제제는 정제, 캡슐제, 접착연고제, 과립제, 주사제, 좌제, 연고제, 겔제, Plastics(塗膜劑), 리니먼트제, 로션제 및 분무제를 포함한다.
마갑자 추출물의 응용은 마갑자 추출물을 단독으로 사용하거나 또는 마갑자 추출물을 주요 활성성분으로 하는 약물 조성물의 구강 및 소화기관 염증 또는/및 궤양을 치료하는 약물 제조에 있어서의 용도를 포함한다.
이하 실시예 형식의 구체적인 실시예를 통해, 본 발명의 상기 내용에 대해 더욱 상세히 설명하겠으나, 단 설명은 본 발명을 제한하지 않는다.
이하는 본 발명의 마갑자 추출물의 성분 연구이다.
샘플 시액의 제조: 추출물 샘플 1g을 취하여, 25ml의 무수에탄올에 용해시키고 원심분리한 다음, 상청액 2ml를 취하여, 무수에탄올로 5배 희석하여 최종 농도가 0.008g/ml에 이르도록 한다.
(1) 트리테르페노이드류 성분의 검정
A. L-B 반응
샘플을 아세트산무수물에 용해시키고, 진한 황산-아세트산무수물(1:20) 몇 방울을 적가하면, 황색→적색→자색→청색 등 색상 변화가 일어날 수 있으며, 마지막으로 퇴색하면, 트리테르페노이드류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
B. Kahlenberg 반응
샘플의 클로로포름 또는 알코올 용액을 여과지에 점 찍고, 20%의 오염화안티몬의 클로로포름 용액(또는 삼염화안티몬 포화된 클로로포름 용액)을 분사하여, 건조시킨 후 60-70℃로 가열하여 청색이 나타나면, 트리테르페노이드류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
C. R-H 반응
샘플 시액을 여과지에 적하하고, 25%의 삼염화아세트산 에탄올 용액을 분사하여, 100℃까지 가열한 후, 적색이 나타나다가 점차 자색으로 변하면, 트리테르페노이드류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
D. Salkowki 반응
샘플을 클로로포름에 용해시키고, 진한 황산을 투입한 후, 황산층에 적색 또는 청색이 나타나고, 클로로포름층에 녹색 형광이 나타나면, 트리테르페노이드류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
E. Tschugaeff 반응
샘플을 빙초산에 용해시키고, 염화아세틸 몇 방울 및 염화아연 결정 다수 입자를 첨가한 후 약간 가열하여, 담적색 또는 자적색이 나타나면, 트리테르페노이드류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
(2) 플라보노이드류 성분의 검정
A. 염산-마그네슘 분말 환원 반응(환원반응 발색)
소량의 샘플을 취하여 1mL의 에탄올에 용해시키고, 약간의 마그네슘 분말 및 진한 염산을 투입하여 잠시 진탕한 후 반응 색상을 관찰하여 자적색을 띠면 플라보노이드류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
B. 삼염화알루미늄 반응(금속이온의 복합반응 발색)
유리막대로 샘플 시액을 찍어 여과지에 도포하고, 블로우 건조시킨 후, 1%의 삼염화알루미늄 에탄올 용액을 분사하고 블로우 건조하여 현상을 관찰한다. 자외선 램프 아래에서 밝은 황색이 나타나면, 플라보노이드류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
C. 삼염화철 반응(금속이온의 복합반응 발색)
유리막대로 샘플 시액을 찍어 여과지에 도포하고, 블로우 건조시킨 후, 3%의 삼염화철 에탄올 용액을 분사하여 암청색 형광 반점이 나타난 다음, 다시 암모니아 훈증을 거쳐 갈색 형광 반점으로 변하면 플라보노이드류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
D. 알칼리성 시약의 발색
유리막대로 샘플 시액을 찍어 여과지에 도포하고, 건조시킨 후, 수산화나트륨 수용액을 분사하거나 또는 암모니아 증기에 노출시킨다. 형광등 아래에서 관찰 하여, 암모니아 증기가 샘플의 발색점을 밝은 황색으로 변화시키면, 플라보노이드류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
(3) 알칼로이드류 성분의 검정
A. 개량 요오드화비스무트칼륨(Dragendorff)법
① 차질산 비스무트 0.85g을 10ml의 빙초산과 40ml의 물에 용해시키고, ② 요오드화칼륨 8g을 20ml의 물에 용해시킨다. 시액 ①과 시액 ②를 등량으로 혼합하여 갈색병 내에 담아 저장 용액으로써 보관한다. 사용 전 1ml의 저장용액, 4ml의 빙초산을 12ml의 물과 혼합한다. 샘플 시액을 상기 시약에 투입하여 적갈색 용액이 나타나면, 증류수를 첨가하고 흔들어 침전이 발생하면 알칼로이드 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
B. 요오드-요오드화칼륨(Wagner)법
요오드 1g과 요오드화칼륨 10g을 50ml의 물에 용해시킨 후, 2ml의 아세트산을 첨가하고, 물을 100ml까지 첨가한다. 상기 시약 적량을 취하여, 1ml의 샘플 시액에 투입하여 진갈색이 발현되면, 알칼로이드류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
C. 규텅스텐산(Bertrand)법
5g의 규텅스텐산을 100ml의 물에 용해시키고, 진한 염산 소량을 첨가하여 pH=2 정도로 조절한다. 상기 시약 적량을 취하여, 1ml의 샘플 시액에 투입하여 진갈색이 발현되면, 알칼로이드류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
(4) 쿠마린류 성분의 검정
A. 하이드록삼산철 반응
① a. 염산 하이드록실아민 20g을 50ml의 물에 용해시키고, 에탄올로 200ml까지 희석시킨 다음 서늘한 곳에 보관한다. b. 수산화칼륨 50g을 소량의 물에 용해시키고, 500ml의 에탄올을 투입한다. ② 염화철(FeCl3ㆍ6H2O) 10g을 20ml의 36% 염산용액에 용해시키고, 에테르 200ml를 첨가하여 고르게 흔들어준 후, 밀폐용기 내에 담아 보관한다. 사용 시 시액 ① a.와 ① b.를 1:2로 혼합하고, 침전물을 여과한 후, 여과액을 냉장고에 넣어 보관한다. 유리막대로 샘플 시액을 찍어 여과지에 도포하고, 먼저 ab 혼합시액을 분사하여 약간 마른 다음, 다시 시액 ②를 분사하여 적색이 발현되면, 쿠마린류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
B. 디아조화 시약 반응
① 파라니트릴로아민 0.35g을 진한 염산 5ml에 용해시키고, 50ml까지 물을 첨가한다. ② 아질산나트륨 5g을 투입하고, 물 50ml를 투입한다. ①, ② 용액을 등량으로 취하여 빙수욕에서 혼합한 후 사용한다. 소량의 샘플 시액을 취하여 디아조화 시약을 적가하면 주홍색이 발현되며, 이는 쿠마린류 화합물이 함유되어 있음을 나타낸다.
상기 연구를 통해, 본 발명인 마갑자 추출물의 주요 성분은 플라보노이드류, 테르페노이드류, 알칼로이드류, 쿠마린류, 및 상기 플라보노이드, 테르페노이드, 알칼로이드, 쿠마린의 배당체 및 그 모노머 성분을 포함하고, 다당류와 셀룰로오스를 더 포함한다는 것을 확인하였다.
一. 마갑자엽 추출물의 항종양활성
1. 마갑자 엽편 추출
(1) 마갑자의 선엽(생잎) 1kg을 취하여, 8-10배량의 95% 에탄올에 투입하고 1-2일 동안 침지한 후(작용: 1. 선엽 중의 활성효소계를 불활성화하여, 유효성분에 대한 파괴를 방지한다. 2. 선엽의 경도가 증가하여 다음 단계의 분쇄 과정에 더욱 유리하다), 선엽을 분쇄하고, 10배량의 95% 에탄올(60~100% 에탄올 추출)로 3일 동안 침지하여 알코올용성 성분을 추출한다. 추출액을 수집하고, 30~40℃에서 에탄올을 알코올 냄새가 없어질 때까지 가압 회수하여, 수득된 추출물 농축액을 냉동 건조시켜 마갑자 선엽 알코올 추출물을 수득한다.
(2) 추출 찌꺼기를 그늘에 건조시키고, 8~10배량의 물을 투입하여 3일 동안 침지하여 수용성 성분을 추출하고, 추출액을 수집한 후, 냉동건조시켜 마갑자 선엽수 추출물을 수득한다.
(3) 마갑자엽 건조품(실온에서 자연 건조)을 상기 방법에 따라 추출하여 마갑자엽 건조품 알코올 추출물 및 수 추출물(水提物)을 수득한다.
(4) 마갑자 선엽편을 에탄올로 침지한 후, 그늘진 곳에서 건조시켜 건엽편을 획득한 후, 에탄올 침지와 건조를 거친 마갑자 엽편을 상기 방법에 따라 추출하여 알코올 추출물 및 수 추출물을 획득한다.
2. 항종양 활성
마갑자 엽편 추출물의 항종양 활성 비교 연구를 실시하였다. 대수생장기에 처한 각종 종양세포(사용된 종양세포주는 이하 몇 종류가 있다. 자궁경부암 세포주 Hela; 인간 간암세포주 SMMC-7721; 인간 폐암세포주 A549; 인간 대장암 세포주 Caco-2; 백혈병 세포주 K562; 위암 세포주 MGC-803)를 취하여, 2000rpm으로 5min 동안 원심분리하고, 10%의 소태아혈청을 함유한 상응하는 배양액을 이용하여 침전 세포 농도를 1×105개/ml의 세포 현탁액으로 조절한 후, 세포를 96웰 플레이트에 접종하였다. 각 웰마다 세포 현탁액을 200㎕씩 주입한 다음, 각각 일정 농도의 무균 추출물 용액을 투입하여, 각 웰 내의 추출물 종농도(終濃度)가 0.02, 0.1, 0.2, 0.4, 0.5, 0.8, 1.0, 2.0mg/ml에 이르도록 하고, 고르게 혼합한 후 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 담아 24h 동안 배양한 후, 배양액을 석출하여 PBS로 2회 세척한 다음, 각 웰에 5mg/ml의 MTT 인산 완충액 20㎕ 및 150㎕의 배지를 투입하고, 동일한 조건에서 계속 4h 동안 배양한 후 배양을 중지하였다. 2000rpm으로 5min 동안 원심분리한 후, 배양 플레이트 웰 내의 배양액을 제거하고, 각 웰마다 150㎕의 DMSO를 투입하여 10min 동안 진탕하여 형성된 포르마잔 과립을 충분히 용해시킨 후, 마이크로플레이트 리더로 흡광치를 검측하였다. 선택한 측정 파장은 570nm이며, 추출물의 종양세포에 대한 IC50을 계산하였다. 결과는 표 1을 참조한다.
마갑자 추출물의 각기 다른 종양세포에 대한 억제작용
세포주 Hela SMMC-7721 A549 Caco-2 MGC-803
마갑자 선엽
알코올 추출물
0.0473mg/ml
0.1957mg/ml
0.0126 mg/ml
0.1174mg/ml
0.2367mg/ml
마갑자 선엽
수 추출물		 ― ― ― ― ―
마갑자엽 건조품
알코올 추출물		 ― ― ― ― ―
마갑자엽 건조품
수 추출물		 ― ― ― ― ―
마갑자가 에탄올 침지와 건조를 거친 엽편 알코올 추출물
0.0442mg/ml
0.2038mg/ml
0.0175 mg/ml
0.1060mg/ml
0.2512mg/ml
마갑자가 에탄올 침지와 건조를 거친 엽편 수 추출물 ― ― ― ― ―
결과를 통해, 마갑자 선엽 알코올 추출물 및 에탄올 침지와 건조를 거친 마갑자 엽편 알코올 추출물은 양호한 종양 억제 효과가 있고, 기타 몇 종류의 추출물은 항종양 활성을 지니지 않는다는 것을 알 수 있으며, 원인을 분석해보면 활성 추출물의 용해성 및 안정성과 관련이 있을 가능성이 있다.
3. 마갑자 엽편 알코올 추출물의 성분 함량 측정
(1) 트리테르페노이드류 성분 함량 측정
본 제품의 조분말 약 0.1g, 각각 3부씩을 취하여 10ml 용량의 플라스크 내에 담고, 아세트산에틸을 눈금까지 투입한 후, 그 중에서 4ml의 용액을 정밀하게 흡취하여 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고, 용제를 휘발 건조시킨 후, 5%의 과염소바닐린-빙초산 0.4ml, 과염소산 1.6ml를 투입하여 고르게 혼합하고, 아세트산에틸을 눈금까지 희석시킨 후, 70℃의 항온 수욕에 담아 15min 동안 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음, 10ml 용량의 플라스크로 옮겨 담아 아세트산에틸을 눈금까지 희석시킨 후, 고르게 흔들어, 540nm 파장 부위에서 흡수도를 측정하고, 시약 용액 중 총 트리테르페노이드 함량(트리테르페노이드 함량은 ceanothic acid美洲茶酸로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 알코올 추출물 중 트리테르페노이드류는 0.052±0.010g을 함유한다.
(2) 플라보노이드류 성분 함량 측정
본 제품의 조분말 약 0.1g, 각 3부씩(2g의 생약에 해당)을 취하여, 정밀하게 계량한 후, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔들어준 다음, 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 물을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔들고, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 플라보노이드 함량(플라보노이드 함량은 루틴으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 알코올 추출물 중 총 플라보노이드는 0.325±0.043g을 함유한다.
(3) 알칼로이드류 성분 함량 측정
샘플 분말 약 1g, 각 3부씩을 정밀하게 계량하여, 마개 달린 삼각플라스크에 담고, 18%의 암모니아수 2ml로 1h 동안 적신 후, 에테르 2 클로로포름 2 에탄올(25:8:2.5) 혼합 용제 30ml를 투입하여 초음파로 20min 동안 추출하고, 상청액을 작은 삼각 플라스크로 따라 붓고, 상기 혼합 용제 30ml를 더 투입한 다음, 30분간 냉침해 두고, 다시 20min 동안 초음파로 진탕하여 추출하고, 여과한 후, 동일한 용제 15ml로 3회로 나누어 찌꺼기와 여과지를 세척하고, 여과액을 삼각 플라스크에 합병한 후, 60℃ 수욕에서 증발건조시키고, 10ml의 클로로포름을 정확하게 투입하여 전부 용해시키고, 다시 5mL를 정확하게 흡취하여 작은 분액 깔때기에 옮겨 담은 후, 6mL의 클로로포름과 2ml의 완충액(pH=5.0, 0.2M의 프탈산수소칼륨 완충액)을 투입하고, 1mmolㆍL-1의 브로모티몰블루 용액으로 적정하여, 부단히 진탕하였다. 종점에 가까워졌을 때 클로로포름층을 분리하고, 신선한 클로로포름 5ml를 다시 투입한 후, 계속 적정하고 부단히 진탕한 다음 정치하여 층을 분리하고, 물층에 황색이 약간 나타나면 즉 종점이며, 총 알칼로이드(알칼로이드 함량은 paliurine B로 산출)를 계산하였다. 계산 결과, 1g의 알코올 추출물 중 알칼로이드류의 함량은 0.028±0.007g이다.
(4) 쿠마린류 성분 함량 측정
측정을 거친 쿠마린류 성분 함량은 1%~10%이다.
4. 마갑자 엽편 알코올 추출물의 3종 극성 부위의 항종양활성 연구
마갑자 엽편 알코올 추출물을 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트, n-부탄올로 추출한 후, 용제를 회수하고 동결건조시켜 3개의 극성 부위를 지닌 추출물을 수득하고, 모두 이소프로판올로 용해시킨 후, 대수생장기에 처한 각종 종양세포(사용된 종양세포주는 이하 몇 종류가 있다: 자궁경부암 세포주 Hela; 인간 간암세포주 SMMC-7721; 인간 폐암세포주 A549; 인간 대장암 세포주 Caco-2; 백혈병 세포주 K562; 위암 세포주 MGC-803)를 취하여, 2000rpm으로 5min 동안 원심분리하고, 10%의 소태아혈청을 함유한 상응하는 배양액을 이용하여 침전 세포 농도를 1×105개/ml의 세포 현탁액으로 조절한 후, 세포를 96웰 플레이트에 접종하였다. 각 웰마다 세포 현탁액을 200㎕씩 주입한 다음, 각각 일정 농도의 무균 추출물 용액을 투입하여, 각 웰 내의 추출물 종농도가 0.002, 0.01, 0.02, 0.04, 0.05, 0.08, 0.1, 0.2mg/ml에 이르도록 하고, 고르게 혼합한 후 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 담아 24h 동안 배양하고, 배양액을 석출하여 PBS로 2회 세척한 다음, 각 웰에 5mg/ml의 MTT 인산 완충액 20㎕ 및 150㎕의 배지를 투입하고, 동일한 조건에서 계속 4h 동안 배양한 후 배양을 중지하였다. 2000rpm으로 5min 동안 원심분리한 후, 배양 플레이트 웰 내의 배양액을 제거하고, 각 웰마다 150㎕의 DMSO를 투입하여 10min 동안 진탕하여 형성된 포르마잔 과립을 충분히 용해시킨 후, 마이크로플레이트 리더로 흡광치를 검측하였다. 선택된 측정 파장은 570nm이며, 추출물의 종양세포에 대한 IC50을 계산하였다. 결과는 표 2를 참조한다. 결과를 통하여, 마갑자 엽편 알코올 추출물의 석유에테르 부위와 에틸아세테이트 부위는 매우 우수한 항종양활성을 지니고, 특히 에틸아세테이트 부위가 더욱 우수한 활성을 나타내었으며, n-부탄올 추출 부위는 시험 농도 범위 내에서 IC50을 계산할 수 없다는 것을 알 수 있다. 따라서 에틸아세테이트 부위에 대하여 좀 더 연구해보고자 한다.
마갑자 엽편 알코올 추출물의 상이한 극성부위의 종양세포에 대한 억제작용
세포주 석유에테르 부위 에틸아세테이트 n-부탄올 추출 부위
Hela 0.0492mg/ml 0.0139 mg/ml ――
SMMC-7721 0.0993mg/ml 0.0365 mg/ml ――
A549 0.0142 mg/ml 0.0075 mg/ml ――
Caco-2 0.0545 mg/ml 0.0778 mg/ml ――
MGC-803 0.0702 mg/ml 0.0305 mg/ml ――
5. 에틸아세테이트 극성 부위의 엘리히 복수암종 마우스에 대한 작용 효과 연구
마우스의 이식종양 S180에 대한 억제작용
쿤밍종의 마우스를 취하여, 우측 앞겨드랑이 피하에 통상적인 방법으로 S180 현탁액 0.2ml(약 1×106개의 종양세포)를 접종하였다. 접종한지 24h 후, 마우스를 무작위로 그룹을 분류하여 번호를 매기고, 대조군의 수는 10마리로, 실험군은 그룹당 10마리씩 각각 고용량군, 중간용량군, 저용량군의 총 3그룹으로 분류하여, 각 그룹마다 매일 1회씩 총 14회 약물을 경구 투여하였다. 양성 대조군은 매일 시클로포스파미드(85mg/kg)를 경구 투여하였으며, 투여량, 횟수, 시간은 실험군과 같다. 마지막 회 투약 24h 이후, 동물을 사망시켜 체중을 잰 후 종양 덩어리를 완전히 박리하여 무게를 재고, 종양억제율을 계산하였다. 결과는 표 3을 참조한다.
에틸아세테이트 극성 부위의 엘리히 복수암종 마우스에 대한 작용
그룹별 대조군 에틸아세테이트 극성 부위
(저용량)
 에틸아세테이트 극성부위
（중간용량）		 에틸아세테이트극성부위
（고용량）
종양억제율 38.45±3.62% 13.85±4.59% 40.76±5.40% 76.13±8.32%*
*: 대조군과 비하면, P＜0.05이고, 차이는 통계학적 의미를 가진다.
二. 마갑자 전초 추출물의 항종양활성
실시예 1
마갑자 전초 1kg을 취하여, 8배량의 95% 에탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 다음, 분쇄하고, 10배량의 95% 에탄올을 더 투입하여 2일 동안 침지하여 추출한 후, 추출액을 수집하고, 50℃에서 에탄올을 알코올 냄새가 없어질 때까지 감압 회수하여 건조시키면, 마갑자 에탄올 추출물이 수득된다.
실시예 2
마갑자 경엽 1kg을 취하여, 10배량의 95% 에탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 다음, 분쇄하고, 10배량의 95% 에탄올을 더 투입하여 환류 추출한 후, 추출액을 수집하고, 60℃에서 에탄올을 알코올 냄새가 없어질 때까지 감압 회수하여 건조시키면, 마갑자 에탄올 추출물이 수득된다. 마갑자 에탄올 추출물을 가수분해한 후, 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트로 추출하여 마갑자 석유에테르 추출물과 에틸아세테이트 추출물을 수득한다.
실시예 3
마갑자 전초 1kg을 취하여, 10배량의 메탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 다음, 분쇄하고, 8배량의 메탄올을 더 투입하여 2일 동안 침지한 후 추출액을 수집하고, 40℃에서 메탄올을 감압 회수하여 건조시키면, 마갑자 메탄올 추출물이 수득된다. 마갑자 메탄올 추출물을 가수분해한 후, 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트로 추출하여 마갑자 석유에테르 추출물과 에틸아세테이트 추출물을 수득한다.
실시예 4
실시예 2의 마갑자 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 취하여, 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고, 에틸아세테이트를 눈금까지 투입한 다음, 그 중에서 4ml의 용액을 정밀하게 흡취하여 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고 용제를 휘발 건조시킨 후, 5%의 바닐린-빙초산 0.4ml, 과염소산 1.6ml를 첨가하여 고르게 혼합하고, 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 70℃의 항온 수욕에서 15min 동안 가열하고, 실온으로 냉각시킨 다음, 10ml 용량의 플라스크로 옮겨 담고 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 고르게 흔들어, 540nm 파장 부위에서 흡수도를 측정하고, 시약 용액 중의 총 트리테르페노이드 함량(트리테르페노이드 함량은 ceanothic acid로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 트리테르페노이드류의 성분은 23mg을 함유한다.
실시예 2의 마갑자 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든 다음, 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 물을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔들고, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 510nm파장에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 플라보노이드 함량(플라보노이드 함량은 루틴으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 플라보노이드는 103mg을 함유한다.
실시예 2의 마갑자 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 마개 달린 삼각플라스크에 담고, 18%의 암모니아수 2ml로 1h 동안 적신 후, 에테르 2 클로로포름 2 에탄올(25:8:2.5) 혼합 용제 30ml를 투입하여 초음파로 20min 동안 추출하고, 상청액을 작은 삼각 플라스크에 따라 부은 후, 상기 혼합 용제 30ml를 더 투입하여 30분간 냉침해 두고, 다시 20min 동안 초음파로 진탕하여 추출하고, 여과하여, 동일한 용제 15ml로 3회로 나누어 찌꺼기와 여과지를 세척하고, 여과액을 삼각 플라스크에 합병한 후, 60℃ 수욕에서 증발건조시키고, 10ml의 클로로포름을 정확하게 투입하여 전부 용해시킨 다음, 다시 5mL를 정확하게 흡취하여 작은 분액 깔때기에 옮겨 담은 후, 6mL의 클로로포름과 2ml의 완충액(pH=5.0, 0.2M의 프탈산수소칼륨 완충액)을 투입한다. 1mmolㆍL-1의 브로모티몰블루 용액으로 적정하여, 부단히 진탕하고; 종점에 가까워졌을 때 클로로포름층을 분리하고, 신선한 클로로포름 5ml를 다시 투입한 후, 계속 적정하고 부단히 진탕한 다음 정치하여 층을 분리하고, 물층에 황색이 나타나면 즉 종점이며, 총 알칼로이드(알칼로이드 함량은 paliurine B로 계산)를 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 알칼로이드는 21mg을 함유한다.
실시예 2의 마갑자 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든다. 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 70%의 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든 다음, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 340nm 파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 쿠마린 함량(쿠마린 함량은 움벨리페론으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 쿠마린은 10.2mg을 함유한다.
실시예 5
실시예 2의 마갑자 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 취하여, 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고, 에틸아세테이트를 눈금까지 투입한 다음, 4ml의 용액을 정밀하게 흡취하여 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고 용제를 휘발 건조시킨 후, 5%의 바닐린-빙초산 0.4ml, 과염소산 1.6ml를 첨가하여 고르게 혼합하고, 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 70℃의 항온 수욕에서 15min 동안 가열하고, 실온으로 냉각시킨 다음 10ml 용량의 플라스크로 옮겨 담고 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 고르게 흔들고, 540nm 파장 부위에서 흡수도를 측정하고, 시약 용액 중의 총 트리테르페노이드 함량(트리테르페노이드 함량은 ceanothic acid로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 트리테르페노이드류의 성분은 108mg을 함유한다.
실시예 2의 마갑자 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든다. 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 물을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔든 다음, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 510nm 파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 플라보노이드 함량(플라보노이드 함량은 루틴으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 플라보노이드는 497mg을 함유한다.
실시예 2의 마갑자 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 마개 달린 삼각플라스크에 담고, 18%의 암모니아수 2ml로 1h 동안 적신 후, 에테르 2 클로로포름 2 에탄올(25:8:2.5) 혼합 용제 30ml를 투입하여 초음파로 20min 동안 추출하고, 상청액을 작은 삼각 플라스크에 따라 부은 후, 상기 혼합 용제 30ml를 더 투입하여 30분간 냉침해 두고, 다시 20min 동안 초음파로 진탕하여 추출하고, 여과하여, 동일한 용제 15ml로 3회로 나누어 찌꺼기와 여과지를 세척하고, 여과액을 삼각 플라스크에 합병한 후, 60℃ 수욕에서 증발건조시키고, 10ml의 클로로포름을 정확하게 투입하여 전부 용해시킨 다음, 다시 5mL를 정확하게 흡취하여 작은 분액 깔때기에 옮겨 담은 후, 6mL의 클로로포름과 2ml의 완충액(pH=5.0, 0.2M의 프탈산수소칼륨 완충액)을 투입한다. 1mmolㆍL-1의 브로모티몰블루 용액으로 적정하여, 부단히 진탕하고, 종점에 가까워졌을 때 클로로포름층을 분리하고, 신선한 클로로포름 5ml를 다시 투입한 후, 계속 적정하고 부단히 진탕한 다음 정치하여 층을 분리하고, 물층에 황색이 나타나면 즉 종점이며, 총 알칼로이드(알칼로이드 함량은 paliurine B로 계산)를 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 알칼로이드는 107mg을 함유한다.
실시예 2의 마갑자 에틸아세테이트 추출물 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든다. 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 70% 에탄올을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔든 다음, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 340nm 파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 쿠마린 함량(쿠마린 함량은 움벨리페론으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 쿠마린은 186mg을 함유한다.
1. 마갑자 에탄올 추출물의 체외 항종양활성 연구
대수생장기에 처한 각종 종양세포(사용된 종양세포주는 이하 몇 종류가 있다. 자궁경부암 세포주 Hela; 인간 간암세포주 SMMC-7721; 인간 폐암세포주 A549; 인간 대장암 세포주 Caco-2; 백혈병 세포주 K562; 위암 세포주 MGC-803)를 취하여, 2000rpm으로 5min 동안 원심분리하고, 10%의 소태아혈청을 함유한 상응하는 배양액을 이용하여 침전 세포 농도를 1×105개/ml의 세포 현탁액으로 조절한 후, 세포를 96웰 플레이트에 접종하였다. 각 웰마다 세포 현탁액을 200㎕씩 주입한 다음, 각각 일정 농도의 무균 추출물 용액을 투입하여, 각 웰 내의 추출물 종농도가 0.02, 0.1, 0.2, 0.4, 0.5, 0.8, 1.0, 2.0mg/ml에 이르도록 하고, 고르게 혼합한 후 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 담아 24h 동안 배양하고, 배양액을 석출하여 PBS로 2회 세척한 다음, 각 웰에 5mg/ml의 MTT 인산 완충액 20㎕ 및 150㎕의 배지를 투입하고, 동일한 조건에서 계속 4h 동안 배양한 후 배양을 중지하였다. 2000rpm으로 5min 동안 원심분리한 후, 배양 플레이트 웰 내의 배양액을 제거하고, 각 웰마다 150㎕의 DMSO를 투입하여 10min 동안 진탕하여 형성된 포르마잔 과립을 충분히 용해시킨 후, 570nm인 측정 파장을 선택하여 마이크로플레이트 리더로 흡광치를 검측하였다. 실시예 1의 마갑자 에탄올 추출물의 종양 세포에 대한 IC50을 계산한 결과는 표 4를 참조한다. 결과를 통해 마갑자 전초 추출물이 양호한 종양 억제효과가 있음을 알 수 있다.
마갑자 에탄올 추출물의 상이한 종양 세포에 대한 억제작용
세포주 마갑자 에탄올 추출물
Hela 0.0216 mg/ml
SMMC-7721 0.1452 mg/ml
A549 0.0101 mg/ml
Caco-2 0.0875 mg/ml
MGC-803 0.1862 mg/ml
2. 실시예 2의 마갑자 3종 추출물의 체외 항종양활성 연구
실시예 1의 마갑자 에탄올 추출물을 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트, n-부탄올로 추출하고, 용제를 회수하고 건조시켜 마갑자 석유에테르, 에틸아세테이트, n-부탄올 추출물을 획득한 후, 모두 이소프로판올로 용해시킨다. 대수생장기에 처한 각종 종양세포(사용된 종양세포주는 이하 몇 종류가 있다. 자궁경부암 세포주 Hela; 인간 간암세포주 SMMC-7721; 인간 폐암세포주 A549; 인간 대장암 세포주 Caco-2; 백혈병 세포주 K562; 위암 세포주 MGC-803)를 취하여, 2000rpm으로 5min 동안 원심분리하고, 10%의 소태아혈청을 함유한 상응하는 배양액을 이용하여 침전 세포 농도를 1×105개/ml의 세포 현탁액으로 조절한 후, 세포를 96웰 플레이트에 접종하였다. 각 웰마다 세포 현탁액을 200㎕씩 주입한 다음, 각각 일정 농도의 무균 추출물 용액을 투입하여, 각 웰 내의 추출물 종농도가 0.002, 0.01, 0.02, 0.04, 0.05, 0.08, 0.1, 0.2mg/ml에 이르도록 하고, 고르게 혼합한 후 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 담아 24h 동안 배양하고, 배양액을 석출하여 PBS로 2회 세척한 다음, 각 웰에 5mg/ml의 MTT 인산 완충액 20㎕ 및 150㎕의 배지를 투입하고, 동일한 조건에서 계속 4h 동안 배양한 후 배양을 중지하였다. 2000rpm으로 5min 동안 원심분리한 후, 배양 플레이트 웰 내의 배양액을 제거하고, 각 웰마다 150㎕의 DMSO를 투입하여 10min 동안 진탕하여 형성된 포르마잔 과립을 충분히 용해시킨 후, 측정 파장이 570nm인 부위를 선택하여 마이크로플레이트 리더로 흡광치를 검측하였다. 추출물의 종양세포에 대한 IC50을 산출한 결과는 표 5를 참조한다. 결과를 통하여, 마갑자 석유에테르 추출물과 에틸아세테이트 추출물은 매우 우수한 항종양 활성을 지니고, 특히 에틸아세테이트 부위가 더욱 우수한 활성을 나타내었으며, n-부탄올 추출 부위는 시험 농도 범위 내에서 IC50을 계산할 수 없었음을 알 수 있다.
마갑자의 각기 다른 추출물의 종양세포에 대한 억제작용
세포주 석유에테르 추출물 에틸아세테이트 추출물 n-부탄올 추출물
Hela 0.0357 mg/ml 0.0102 mg/ml -
SMMC-7721 0.1242 mg/ml 0.0357 mg/ml -
A549 0.0156 mg/ml 0.0064 mg/ml -
Caco-2 0.0915 mg/ml 0.0623 mg/ml -
MGC-803 0.0812 mg/ml 0.0487 mg/ml -
"-": 실험 농도 범위 내에서 IC50을 계산할 수 없음을 나타낸다.
3. 마갑자 에탄올, 메탄올, 석유에테르 및 에틸아세테이트 추출물이 S180 육종 마우스(작은 쥐) 에 미치는 영향
접종 8일째(8d) 건강이 양호한 S180 종양원 마우스를 취하여, 복부 피부를 소독한 후 복수를 추출하여 무균 생리식염수를 1:4(복수 부피: 생리식염수부피) 비율로 현탁하여 준비해둔다. 18~20g의 수컷 쿤밍종 마우스 82마리를 체중에 따라 층별 무작위로 각각 모델 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 양성 대조군(시클로포스파미드, CTX), 에틸아세테이트 추출물 저용량군, 에틸아세테이트 추출물 고용량군, 에탄올 추출물군, 메탄올 추출물군, 석유에테르 추출물군의 7그룹으로 분류하고, 모두 우측 겨드랑이부위의 피하에 0.2ml의 전술한 현탁액을 접종하였다. 2h 이후 매일 1회, 연속 14일 동안 모델 대조군과 약물 그룹에 각각 피시험물 또는 현탁제를 경구 투여하고, 양성 대조군은 이틀에 한 번, 총 7회 CTX를 복강경 주사하였다. 마지막 회차에 투여한지 24h 이후 경추를 탈구시켜 마우스를 사망시키고, 종양 덩어리를 박리하여 무게를 달아 종양 억제율을 계산하였다((1-실험그룹의 평균 종양 무게/모델 대조군의 평균 종양 무게)*100%). 결과는 표 6을 참조한다.
마갑자 전초 추출물이 S180 육종 마우스에 미치는 영향(
Figure 112016051232790-pct00001
±s)
그룹별 동물수(마리) 용량 종양 무게（g） 종양억제율（%）
모델 대조군 11 ―― 1.20±0.45 ――
양성 대조군（CTX） 9 40mg/kg 0.35±0.58** 70.8
에틸아세테이트 추출물
저용량군		 12 0.4g/kg 1.14±0.46 5.0
에틸아세테이트 추출물
고용량군		 12 1.6g/kg 0.34±0.43** 71.7
메탄올 추출물군 12 4.8g/kg 0.57±0.45** 52.5
석유에테르 추출물군 12 4.8g/kg 0.39±0.23** 67.5
에탄올 추출물군 12 4.8g/kg 0.44±0.29** 63.3
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이다.
실험 결과에서, 마갑자 전초 추출물인 에틸아세테이트 추출물 1.6g/kg을 경구 투여한 경우, S180이 마우스의 체내에서 생장하는 것을 현저히 억제할 수 있고, 또한 1.6g/kg 용량의 작용 강도가 시클로포스파미드 40mg/kg을 격일로 복강 투여한 경우와 유사하였으며; 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 4.8g/kg 역시 종양의 무게를 효과적으로 감소시킬 수 있고, 종양 억제율이 모두 50%를 초과한 것으로 나타나, 상기 4종 추출물 모두 비교적 양호한 항종양 활성이 있음을 보여준다.
4. 마갑자 에탄올, 메탄올, 석유에테르 및 에틸아세테이트 추출물이 엘리히 복수종양 마우스에 미치는 영향
접종 8일째(8d)의 건강이 양호한 엘리히 복수종양 종양원 마우스를 취하여, 복부 피부를 소독한 후 복수를 추출하여 무균 생리식염수로 4×106/ml를 현탁하여 준비해둔다. 18~20g의 수컷 쿤밍종 마우스 82마리를 체중에 따라 층별 무작위로 각각 모델 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 양성 대조군(시클로포스파미드, CTX), 에틸아세테이트 추출물 저용량군, 에틸아세테이트 추출물 고용량군, 에탄올 추출물군, 메탄올 추출물군, 석유에테르 추출물군의 7그룹으로 분류하고, 모두 복강 내에 0.2ml의 전술한 현탁액을 접종하였다. 2h 이후 매일 1회, 동물이 사망에 이를 때까지 지속적으로 모델 대조군과 약물 그룹에 각각 피시험물 또는 현탁제를 위장관 투여하고, 양성 대조군은 이틀에 한 번, 총 7회 CTX를 복강경 주사하였다. 동물이 거의 사망에 이르면 경추를 탈구시켜 마우스를 사망시키고, 사망 시간을 생존일수로 계산하였다. 사망시킨 후 체중을 재고, 이어서 복수를 완전히 배출시킨 다음 다시 체중을 재어, 그 차이값을 복수의 중량으로 계산하였으며, 결과는 표 7을 참조한다.
마갑자 전초 추출물이 엘리히 복수종 마우스에 미치는 영향(
Figure 112016051232790-pct00002
±s)
그룹별 용량 동물수(마리) ?생존일수(일) 복수량（g）
모델 대조군 ―― 12 16.3±2.5 21.4±1.8
양성 대조군（CTX） 40mg/kg 12 17.2±2.3 15.9±1.5**
에틸아세테이트 추출물
저용량군		 0.4g/kg 12 19.9±3.9* 17.3±1.8**
에틸아세테이트 추출물
고용량군		 1.6g/kg 12 20.5±2.7** 14.2±2.0**
메탄올 추출물군 4.8g/kg 12 19.0±3.1* 16.9±2.5**
석유에테르 추출물군 4.8g/kg 12 19.6±2.2** 15.5±1.1**
에탄올 추출물군 4.8g/kg 12 20.1±2.9** 17.2±2.2**
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이다.
실험 결과, 마갑자 전초 추출물인 에틸아세테이트 추출물 0.4g/kg 및 그 이상의 용량을 경구 투여한 경우, 엘리히 복수종양이 작은 쥐의 체내에서 생장하는 것을 현저히 억제하고, 동물의 생존 시간을 연장할 수 있으며, 또한 1.6g/kg 용량의 복수량 억제 작용 강도는 시클로포스파미드와 유사하나, 단 후자는 동물의 생존시간을 연장시킬 수 없어, 어느 정도의 독특한 우세를 나타내었으며; 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 4.8g/kg 역시 생존시간을 효과적으로 연장시키고, 복수의 생성을 억제할 수 있는 것으로 나타나, 상기 4종 추출물 모두 비교적 양호한 항종양활성이 있음을 보여준다.
5. 마갑자 에틸아세테이트 추출물과 파클리탁셀 및 시노부포탈린의 병용투여가 S180 육종 마우스에 미치는 영향
접종 제8일째(8d)의 건강이 양호한 S180 종양원 마우스를 취하여, 복부 피부를 소독한 후 복수를 추출하여 무균 생리식염수를 1:4(복수 부피: 생리식염수부피) 비율로 현탁하여 준비해둔다. 18~20g의 수컷 쿤밍종 마우스 82마리를 체중에 따라 층별 무작위로 각각 모델 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 양성 대조군(시클로포스파미드, CTX), 에틸아세테이트 추출물군, 파클리탁셀군, 시노부포탈린군, 파클리탁셀과의 병용투여군, 시노부포탈린과의 병용투여군의 7그룹으로 분류하고, 모두 우측 겨드랑이부위의 피하에 0.2ml의 전술한 현탁액을 접종하였다. 2h 이후 매일 1회, 연속 14일 동안 모델 대조군과 약물 그룹에 각각 피시험물 또는 현탁제를 경구 투여하고, 양성 대조군은 이틀에 한 번, 총 7회 CTX를 복강경 주사하였다. 마지막 회에 투약 24h 이후 경추를 탈구시켜 마우스를 사망시키고, 종양 덩어리를 박리하여 무게를 달아 종양 억제율을 계산하였다((1-실험그룹의 평균 종양 무게/모델 대조군의 평균 종양 무게)*100%). 결과는 표 8을 참조한다.
마갑자 전초 에틸아세테이트 추출물과 파클리탁셀 및 시노부포탈린의 병용투여가 S180 육종 마우스에 미치는 영향(
Figure 112016051232790-pct00003
±s)
그룹별 동물수
(마리)		 용량 종양무게
（g）		 종양억제율（%）
모델 대조군 11 ―― 1.30±0.55 ――
양성대조군
（CTX）		 12 40mg/kg 0.48±0.41** 63.1
에틸아세테이트 추출물군 12 0.4g/kg 1.04±0.40 20.0
파클리탁셀군 12 5mg/kg 0.85±0.38* 34.6
파클리탁셀과의병용투여군 12 에틸아세테이트0.4 g/kg+파클리탁셀5mg/kg 0.52±0.26**＠ 60.0
시노부포탈린군 12 1ml/kg 0.73±0.42* 43.8
시노부포탈린과의 병용투여군 12 에틸아세테이트0.4 g/kg+시노부포탈린1ml/kg 0.37±0.18**# 71.5
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이고, 파클리탁셀군과 비교하여, @P<0.05이며; 시노부포탈린 그룹과 비교하여, #P<0.05이다.
실험 결과, 마갑자 전초 에틸아세테이트 추출물 0.4g/kg을 경구 투여한 경우, S180이 작은 쥐의 체내 생장에 대해 뚜렷한 억제 작용이 없었고, 파클리탁셀 5mg/kg, 시노부포탈린 1ml/kg은 즉 어느 정도의 효과를 보이는 것으로 나타났다. 그러나 동일한 용량의 마갑자 전초 에틸아세테이트 추출물을 각각 파클리탁셀 5mg/kg, 시노부포탈린 1ml/kg과 함께 사용한 결과, 모두 파클리탁셀의 종양억제율을 현저하게 높일 수 있는 것으로 나타나, 이는 마갑자 전초 추출물과 기타 항종양 약물을 병용투여하면 이러한 약물의 항종양 약효를 향상시킬 수 있음을 보여준다.
三. 마갑자 추출물의 항섬유화활성
실시예 1
마갑자 전초 1kg을 취하여, 8배량의 95% 에탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 다음, 분쇄하고, 10배량의 95% 에탄올을 더 투입하여 2일 동안 침지하여 추출한 후, 추출액을 수집하고, 50℃에서 에탄올을 알코올 냄새가 없어질 때까지 감압 회수하여 건조시키면, 마갑자 에탄올 추출물이 수득된다.
실시예 2
마갑자 경엽 1kg을 취하여, 10배량의 95% 에탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 다음, 분쇄하고, 10배량의 95% 에탄올을 더 투입하여 환류 추출한 후, 추출액을 수집하고, 60℃에서 에탄올을 알코올 냄새가 없어질 때까지 감압 회수하여 건조시키면, 마갑자 에탄올 추출물이 수득된다. 마갑자 에탄올 추출물을 가수분해한 후, 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트로 추출하여 마갑자 석유에테르 추출물과 에틸아세테이트 추출물을 수득한다.
실시예 3
마갑자 전초 1kg을 취하여, 10배량의 메탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 다음, 분쇄하고, 8배량의 메탄올을 더 투입하여 2일 동안 침지한 후 추출액을 수집하고, 40℃에서 메탄올을 감압 회수하여 건조시키면, 마갑자 메탄올 추출물이 수득된다. 마갑자 메탄올 추출물을 가수분해한 후, 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트로 추출하여 마갑자 석유에테르 추출물과 에틸아세테이트 추출물을 수득한다.
실시예 4
실시예 2의 마갑자 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 취하여, 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고, 에틸아세테이트를 눈금까지 투입한 다음, 그 중에서 4ml의 용액을 정밀하게 흡취하여 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고 용제를 휘발 건조시킨 후, 5%의 바닐린-빙초산 0.4ml, 과염소산 1.6ml를 첨가하여 고르게 혼합하고, 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 70℃의 항온 수욕에서 15min 동안 가열하고, 실온으로 냉각시킨 다음, 10ml 용량의 플라스크로 옮겨 담고 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 고르게 흔들어, 540nm 파장 부위에서 흡수도를 측정하고, 시약 용액 중의 총 트리테르페노이드 함량(트리테르페노이드 함량은 ceanothic acid로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 트리테르페노이드류의 성분은 23mg을 함유한다.
실시예 2의 마갑자 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든 다음, 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 물을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔들고, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 510nm의 파장부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 플라보노이드 함량(플라보노이드 함량은 루틴으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 플라보노이드는 103mg을 함유한다.
실시예 2의 마갑자 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 마개 달린 삼각플라스크에 담고, 18%의 암모니아수 2ml로 1h 동안 적신 후, 에테르 2 클로로포름 2 에탄올(25:8:2.5) 혼합 용제 30ml를 투입하여 초음파로 20min 동안 추출하고, 상청액을 작은 삼각 플라스크에 따라 부은 후, 상기 혼합 용제 30ml를 더 투입하여 30분간 냉침해 두고, 다시 20min 동안 초음파로 진탕하여 추출하고, 여과하여, 동일한 용제 15ml로 3회로 나누어 찌꺼기와 여과지를 세척하고, 여과액을 삼각 플라스크에 합병한 후, 60℃ 수욕에서 증발건조시키고, 10ml의 클로로포름을 정확하게 투입하여 전부 용해시킨 다음, 다시 5mL를 정확하게 흡취하여 작은 분액 깔때기에 옮겨 담은 후, 6mL의 클로로포름과 2ml의 완충액(pH=5.0, 0.2M의 프탈산수소칼륨 완충액)을 투입한다. 1mmolㆍL-1의 브로모티몰블루 용액으로 적정하여, 부단히 진탕하고, 종점에 가까워졌을 때 클로로포름층을 분리하고, 신선한 클로로포름 5ml를 다시 투입한 후, 계속 적정하고 부단히 진탕한 다음 정치하여 층을 분리하고, 물층에 황색이 나타나면 즉 종점이며, 총 알칼로이드(알칼로이드 함량은 paliurine B로 계산)를 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 알칼로이드는 21mg을 함유한다.
실시예 2의 마갑자 석유에테르 추출물 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든다. 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 70%의 에탄올을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔든 다음, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 340nm 파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 쿠마린 함량(쿠마린 함량은 움벨리페론으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 쿠마린은 10.2mg을 함유한다.
실시예 5
실시예 2의 마갑자 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 취하여, 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고, 에틸아세테이트를 눈금까지 투입한 다음, 4ml의 용액을 정밀하게 흡취하여 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고 용제를 휘발 건조시킨 후, 5%의 바닐린-빙초산 0.4ml, 과염소산 1.6ml를 첨가하여 고르게 혼합하고, 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 70℃의 항온 수욕에서 15min 동안 가열하고, 실온으로 냉각시킨 다음 10ml 용량의 플라스크로 옮겨 담고 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 고르게 흔들고, 540nm 파장 부위에서 흡수도를 측정하고, 시약 용액 중의 총 트리테르페노이드 함량(트리테르페노이드 함량은 ceanothic acid로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 트리테르페노이드류의 성분은 108mg을 함유한다.
실시예 2의 마갑자 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든다. 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 물을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔든 다음, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 510nm 파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 플라보노이드 함량(플라보노이드 함량은 루틴으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 플라보노이드는 497mg을 함유한다.
실시예 2의 마갑자 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 마개 달린 삼각플라스크에 담고, 18%의 암모니아수 2ml로 1h 동안 적신 후, 에테르 2 클로로포름 2 에탄올(25:8:2.5) 혼합 용제 30ml를 투입하여 초음파로 20min 동안 추출하고, 상청액을 작은 삼각 플라스크에 따라 부은 후, 상기 혼합 용제 30ml를 더 투입하여 30분간 냉침해 두고, 다시 20min 동안 초음파로 진탕하여 추출하고, 여과하여, 동일한 용제 15ml로 3회로 나누어 찌꺼기와 여과지를 세척하고, 여과액을 삼각 플라스크에 합병한 후, 60℃ 수욕에서 증발건조시키고, 10ml의 클로로포름을 정확하게 투입하여 전부 용해시킨 다음, 다시 5mL를 정확하게 흡취하여 작은 분액 깔때기에 옮겨 담은 후, 6mL의 클로로포름과 2ml의 완충액(pH=5.0, 0.2M의 프탈산수소칼륨 완충액)을 투입한다. 1mmolㆍL-1의 브로모티몰블루 용액으로 적정하여, 부단히 진탕하고, 종점에 가까워졌을 때 클로로포름층을 분리하고, 신선한 클로로포름 5ml를 다시 투입한 후, 계속 적정하고 부단히 진탕한 다음 정치하여 층을 분리하고, 물층에 황색이 나타나면 즉 종점이며, 총 알칼로이드(알칼로이드 함량은 paliurine B로 계산)를 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 알칼로이드는 107mg을 함유한다.
실시예 2의 마갑자 에틸아세테이트 추출물 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든다. 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 70%의 에탄올을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔든 다음, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 340nm 파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 쿠마린 함량(쿠마린 함량은 움벨리페론으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 쿠마린은 186mg을 함유한다.
1. 래트(큰 쥐)의 간섬유화에 미치는 영향
SD 래트 60마리(200-240g, 수컷)를 체중에 따라 층별 무작위로 블랭크 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 모델 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 양성 대조군(덱사메타손, 1mg/kg), 마갑자 추출물(실시예 1의 방법에 따라 제조된) 저용량군(0.4g/kg), 중간용량군(0.8g/kg), 고용량군(1.6g/kg)으로 나누고, 블랭크 대조군을 제외하고 모두 1ml/kg 비율에 따라 40%의 사염화탄소 식물유 용액을 매주 2회, 연속 3개월 동안 피하주사하고, 이와 동시에 고지방 사료 및 5%의 에탄올 수용액을 급여하였다. 피시험물을 매일 1회, 연속 3개월 동안 경구투여하고, 투여 종료 후 이튿날 복부의 주동맥에서 채혈하여 혈장을 분리하고, 알라닌아미노기전달효소(ALT), Ⅲ형 프로콜라겐(PC-Ⅲ), 히알루론산(HA)과 라미닌(LH) 수준을 측정하였다. 이어서 동물을 사망시키고 간장을 적출하여 병리학 검사를 실시하였다. 혈청 생화학 검사의 측정 결과는 표 9와 같다.
마갑자 추출물이 실험적 간섬유화 래트의 간장 및 혈액의 생화학 지표에 미치는 영향(n=10,
Figure 112016051232790-pct00004
±s)
그룹별 ALT(U/L) PC-Ⅲ(㎍/L) HA(㎍/L) LN(㎍/L)
정상 대조군 43±4** 9.5±1.7** 131±29** 12±2**
모델 대조군 678±123 32.2±6.9 319±71 86±19
양성 대조군 456±98** 20.8±3.1** 280±54 62±20*
마갑자추출물（0.4g/kg） 617±107 30.5±6.2 289±62 80±23
마갑자추출물（0.8g/kg） 412±126** 25.1±4.2* 263±69 59±17*
마갑자추출물（1.6g/kg） 335±138** 18.5±4.8** 217±58** 41±9**
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이다.
결과에서, 모델군과 비교하여, 마갑자 추출물이 0.8g/kg 및 1.6g/kg일 때, 사염화탄소로 인한 실험성 간섬유화 래트의 간손상에 대해 어느 정도의 보호작용이 있고, 특히 고용량일 때 각 지표가 뚜렷하게 개선되는 것으로 나타났다.
병리학적 검사에서, 모델군 래트는 간세포 수종변성이 뚜렷하고, 뚜렷한 간세포 괴사와 지방변성이 있어 유의적인 간 섬유화로 표현되었으며; 마갑자 추출물의 고용량 및 중간 용량군은 간세포 수종변성과 지방변성 정도가 모델군에 비해 뚜렷하게 저하된 것으로 나타나, 간 섬유화에 대해 양호한 억제작용이 있음을 보여준다.
2. 래트의 폐 섬유화에 미치는 영향
SD 래트(200-240g, 수컷) 60마리를 체중에 따라 층별 무작위로 가짜 수술(假手術) 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 모델 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 양성 대조군(덱사메타손, 1mg/kg), 마갑자 추출물(실시예 1의 방법에 따라 제조된) 저용량군(0.4g/kg), 중간용량군(0.8g/kg), 고용량군(1.6g/kg)으로 나누고, 모든 동물에게 10%의 클로랄수화물(350mg/kg)을 복강주사하여 마취시키고 기관을 분리하였다. 가짜 수술 대조군을 제외하고, 모두 5mg/kg의 비율에 따라 블레오마이신 생리식염수 용액 0.4mL를 주입하고, 가짜 수술 대조군은 생리식염수만 주입하였다. 수술 후 이튿날 피시험물을 매일 1회, 연속 30일 동안 투여하였다. 경추를 탈구시켜 동물을 사망시키고, 폐를 적출하여 일부 장기를 호모게네이트(漿)한 후 하이드록시프롤린 함량을 측정하고, 일부는 병리학적 관찰을 실시하였다. 폐 조직 중 하이드록시프롤린 함량의 측정 결과는 표 10에 나타난 바와 같다.
각 군별 래트의 폐의 하이드록시프롤린 함량 변화(n=10,
Figure 112016051232790-pct00005
±s)
그룹별 하이드록시프롤린 함량（mg/gpro）
가짜 수술 대조군 10.3±3.8**
모델 대조군 18.4±5.0
양성 대조군 13.6±3.3*
마갑자추출물（0.4g/kg） 16.5±4.7
마갑자추출물（0.8g/kg） 14.1±6.2*
마갑자추출물（1.6g/kg） 12.3±3.7*
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이다.
결과에서, 모델군과 비교하여, 마갑자 추출물이 0.8g/kg 및 1.6g/kg일 때, 모델 래트 폐조직 중 하이드록시프롤린 함량을 효과적으로 저하시킬 수 있는 것으로 나타나, 폐 섬유화에 대해 양호한 억제작용이 있음을 보여준다.
병리학적 검사 결과, 모델군의 래트에 유의적인 폐섬유화 병변이 출현하여 폐간질의 대량 섬유아세포, 대형 섬유결체조직 침착, 폐포구조 손상, 일부 폐포강 소실로 나타났으며; 모델군과 비교하여, 마갑자 추출물의 각 용량군의 래트는 섬유결체조직의 침착이 비교적 적고, 폐간질 섬유아세포 역시 비교적 적으며, 또한 고용량 그룹에서 더욱 뚜렷하게 나타나, 상기 추출물이 잠재적인 폐 섬유화 치료 약물임을 보여준다.
3. 마갑자 추출물과 폴리엔 포스파티딜콜린의 병용투여가 래트의 간 섬유화에 미치는 영향
SD 래트 60마리(200-240g, 수컷)를 체중에 따라 층별 무작위로 블랭크 대조군, 모델 대조군, 양성 대조군(덱사메타손, 1mg/kg), 마갑자 추출물군(실시예 1의 방법에 따라 제조된 것, 0.8g/kg), 폴리엔 포스파티딜콜린군(1ml/kg), 병용투여군(마갑자 추출물 0.8g/kg+폴리엔 포스파티딜콜린 1ml/kg)으로 나누고, 블랭크 대조군을 제외하고 모두 1ml/kg로 40%의 사염화탄소 식물유 용액을 매주 2회, 연속 3개월 동안 피하주사하고, 이와 동시에 고지방 사료 및 5%의 에탄올 수용액을 급여하였다. 피시험물을 매일 1회, 연속 3개월 동안 경구투여 또는 주사하고, 투여 종료 후 이튿날 복부의 주동맥에서 채혈하여 혈장을 분리하고, 알라닌아미노기전달효소(ALT), Ⅲ형 프로콜라겐(PC-Ⅲ), 히알루론산(HA)과 라미닌(LH) 수준을 측정하였다. 이어서 동물을 사망시켜 간장을 적출하여 병리학 검사를 실시하였다. 혈청 생화학 검사의 측정 결과는 표 11과 같다.
병용투여가 실험성 간섬유화 래트의 간장 및 혈액의 생화학 지표에 미치는 영향(n=10,
Figure 112016051232790-pct00006
±s)
그룹별 ALT(U/L) PC-Ⅲ(㎍/L) HA(㎍/L) LN(㎍/L)
정상 대조군 42±3** 9.7±1.9** 129±32** 11±4**
모델 대조군 684±114 31.7±8.0 310±63 87±21
양성 대조군 478±90** 20.6±3.8** 285±57 65±23*
마갑자 추출물군 423±98** 24.5±3.9* 271±60 60±18**
폴리엔 포스파티딜콜린군 443±130** 27.0±4.8 284±78 63±18*
병용투여군 315±102**# 18.6±5.1**## 186±67**## 47±11**#
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이고; 폴리엔 포스파티딜콜린군과 비교하여, #P<0.05, ##P<0.01이다.
4. 마갑자 추출물과 리구스트라진의 병용투여가 래트의 폐 섬유화에 미치는 영향
SD 래트(200-240g, 수컷) 60마리를 체중에 따라 층별 무작위로 가짜 수술 대조군, 모델 대조군, 양성 대조군(덱사메타손, 1mg/kg), 마갑자 추출물군(실시예 1의 방법에 따라 제조되며, 0.8g/kg, op), 리구스트라진군(40mg/kg, ip), 병용투여군(마갑자 추출물 0.8g/kg, op; 리구스트라진 주사액 40mg/kg, ip)으로 나누고, 모든 동물에게 10%의 클로랄수화물(350mg/kg)을 복강주사하여 마취시키고 기관을 분리하였다. 가짜 수술 대조군을 제외하고, 모두 5mg/kg의 비율에 따라 블레오마이신 생리식염수 용액 0.4mL를 주입하고, 가짜 수술 대조군은 생리식염수만 주입하였다. 수술 후 이튿날 피시험물을 매일 1회, 연속 30일 동안 경구투여 또는 주사하였다. 경추를 탈구시켜 동물을 사망시키고, 폐를 적출하여 일부 장기를 호모게네이트 한 후 하이드록시프롤린 함량을 측정하고, 일부는 병리학적 관찰을 실시하였다. 폐 조직 중 하이드록시프롤린 함량의 측정 결과는 표 12에 나타난 바와 같다.
병용투여가 래트의 폐의 하이드록시프롤린에 미치는 영향(n=10,
Figure 112016051232790-pct00007
±s)
그룹별 하이드록시프롤린（mg/gpro）
가짜수술 대조군 10.1±3.4**
모델대조군 17.9±4.3
양성대조군 13.4±3.7*
마갑자추출물군 12.9±4.9*
리구스트라진군 14.6±5.7
병용투여군 9.8±2.9**#
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이고; 리구스트리진군과 비교하여, #P<0.05이다.
결과는 리구스트라진 40mg/kg을 단독으로 응용한 경우 실험성 폐 섬유화에 대해 뚜렷한 약효가 없고, 병용투여한 경우 모델 래트의 폐조직 중 하이드록시프롤린 함량을 효과적으로 낮출 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 리구스트라진 40mg/kg과 비교하여 현저한 차이가 있어, 마갑자 추출물이 기타 폐 섬유 치료약물의 치료효과를 효과적으로 높일 수 있음을 보여준다.
四. 마갑자 추출물의 항진균활성
(一) 실시예 마갑자 추출물의 제조
1. 마갑자 에탄올 추출물의 제조
(1) 마갑자 전초 식물 신선품 1kg을 취하여, 마갑자 부피의 8배의 95%(부피농도) 에탄올에 투입하고 1-2일 동안 침지한 후, 잎, 뿌리 및 줄기를 분쇄하여, 다시 마갑자 부피의 12배의 95% 에탄올로 3일 동안 추출 침지하고, 추출액을 수집하여 에탄올을 감압 회수하고, 농축액을 냉동건조시키면 마갑자 에탄올 추출물이 수득된다.
(2) 마갑자 전초 식물 신선품(또는 그 중 어느 한 부위) 1kg을 분쇄하고, 마갑자 부피의 8배의 95% 에탄올에 투입하여 3회 환류 추출한 후, 추출액을 수집하여 에탄올을 감압 회수하고, 농축액을 냉동건조시키면 마갑자 에탄올 추출물이 수득된다.
(3) 마갑자 전초 식물 신선품(근, 경, 엽 등) 1kg을 냉동 건조시킨 후 분쇄하여(분쇄 후 냉동 건조해도 된다), 마갑자 부피의 10배의 95% 에탄올을 투입하고 3회 환류 추출한 다음, 추출액을 수집하여 에탄올을 감압 회수하고, 농축액을 냉동 건조시키면 마갑자 에탄올 추출물이 수득된다.
2. 마갑자 메탄올 추출물의 제조
마갑자 전초 식물 신선품 1kg을 취하여 분쇄하고, 마갑자 부피의 6배의 메탄올을 투입하여 3회 환류 추출한 다음, 추출액을 수집하여 메탄올을 감압 회수하고, 농축액을 냉동 건조시키면 마갑자 에탄올 추출물이 수득된다.
3. 마갑자 석유에테르 추출물의 제조
(1) 마갑자 에탄올 추출물의 농축용액을 석유에테르로 추출한 후, 석유에테르를 회수하여 건조시킨다.
(2) 마갑자 메탄올 추출물 건조 샘플에 10배의 물을 투입하여 혼합 현탁하고, 석유에테르로 추출한 다음, 석유에테르를 회수하여 건조시킨다.
(3) 마갑자 에탄올 추출물 건조 샘플을 10배의 석유에테르로 환류 추출한 후, 석유에테르를 회수하여 건조시킨다.
4. 마갑자 에틸아세테이트 추출물의 제조
(1) 마갑자 에탄올 추출물의 농축 용액을 10배의 석유에테르로 추출한 다음 10배의 에틸아세테이트로 추출하고, 에틸아세테이트를 회수한 후 건조시킨다.
(2) 마갑자 메탄올 추출물 건조 샘플에 10배의 물을 투입하여 혼합 현탁하고, 10배의 석유에테르로 추출한 다음 10배의 에틸아세테이트로 추출한다. 에틸아세테이트를 회수하여 건조시킨다.
(3) 마갑자 에탄올 추출물 건조 샘플을 6배의 에틸아세테이트로 2회 환류 추출하고, 에틸아세테이트를 회수한 후 건조시킨다.
5. 마갑자 에틸아세테이트 추출물 정제의 제조
300g의 마갑자 에틸아세테이트 추출물을 취하여, 분쇄한 후, 40메쉬의 체에 거르고, 100g의 미결정 셀룰로오스, 57.5g의 락토오스, 20g의 가교 카르복시메틸 셀루로오스 나트륨을 투입하여 고르게 혼합한 후, 부피 농도가 95%인 에탄올 용액 적량을 균일하게 분사하여 습식 압출 조립하고, 24메쉬의 체에 걸러 50℃에서 건조시킨 다음, 20g의 가교 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨과 2.5g의 마그네슘 스테아레이트를 투입하고 충분히 고르게 혼합한 후, 압착하여 마갑자 에틸아세테이트 추출물 정제를 획득한다.
6. 마갑자 에탄올 추출물 과립제의 제조
1000g의 마갑자 에탄올 추출물을 취하여, 분쇄한 후, 40메쉬의 체에 거르고, 4000g의 설탕분말을 투입하여 고르게 혼합한 후, 부피 농도가 95%인 에탄올 용액 적량을 균일하게 분사하여 습식 압출 조립하고, 24메쉬의 체에 걸러 50℃에서 건조시킨 다음, 과립화하여 마갑자 에탄올 추출물 과립제를 획득한다.
7. 마갑자 메탄올 추출물 연고제의 제조
115g의 옥타데칸올, 115g의 백색 바셀린, 70g의 글리세릴 모노스테아레이트를 가열 융화시켜 유상(oil phase)을 획득하고, 40g의 마갑자 메탄올 추출물을 투입한다. 별도로 100g의 글리세롤, 15g의 도데실황산나트륨, 0.01g의 시스테인 하이드로클로라이드에 650ml의 물을 투입하여 용해시켜 수상(water phase)을 획득한다. 각각 75℃~80℃까지 가열하고 교반하는 상태에서 수상을 서서히 유상에 투입한 다음, 계속 15분 동안 교반하여 마갑자 메탄올 추출물 연고제를 획득한다.
8. 마갑자 에탄올 추출물 겔제의 제조
10g의 카보머를 420ml의 정제수에 살포하고, 교반하여 팽윤시킨 후, 100ml의 프로필렌 글리콜을 투입하여 용해시키고, 교반하는 상태에서 18g의 트리에탄올아민을 적가하여 겔 기질을 제조한다. 별도로 100g의 마갑자 에탄올 추출물과 2g의 에틸파라벤을 350ml의 에탄올에 용해시키고, 교반하는 상태에서 겔 기질을 투입하고 고르게 교반하여 획득한다.
9. 마갑자 에탄올 추출물 Plastics(塗膜劑)의 제조
40g의 폴리비닐알코올124를 400ml의 정제수에 팽윤시키고; 별도로 100g의 마갑자 에탄올 추출물을 400ml의 에탄올에 용해시킨 다음, 100ml의 글리세롤을 투입하고, 고르게 교반한 후 폴리비닐알코올 용액에 서서히 투입한 다음, 교반 후 여과하고, 다시 필터에 에탄올을 1000ml까지 투입하여 획득한다.
10. 마갑자 석유에테르 추출물 리니먼트제의 제조
100g의 마갑자 석유에테르 추출물 미세분말을 막자사발에 담고, 500ml의 땅콩유를 투입하여 고르게 연마한 후, 포화 수산화칼슘 수용액을 1000ml까지 서서히 투입하고, 연마하여 균질의 백색 유액상물(乳狀物)을 획득한다.
11. 마갑자 에탄올 추출물 로션제의 제조
100g의 마갑자 에탄올 추출물 미세분말을 막자사발에 담고, 50ml의 글리세롤과 적량의 정제수를 투입하여 페이스트상으로 연마하고, 점차 정제수를 전량이 고르게 혼합될 때까지 투입하여 획득한다.
(二) 마갑자 추출물의 항진균활성 연구
실시예 1(1)에서 제조된 마갑자 에탄올 추출물 1g을 취하여, 5%의 이소프로판올 용액으로 용해시켜 10ml로 제조하고, 0.22㎛의 멤브레인필터로 여과하여 세균을 제거한다. 1ml의 상기 제균 용액을 취하여, 용융 후 약 50℃로 냉각된 9ml의 PDA 배지에 투입하고, 충분히 고르게 흔든 후 직경이 6cm인 페트리 접시에 신속하게 따라 붓고 정치하여, 10ml/ml 마갑자 추출물을 함유한 PDA 배양 플레이트를 제조한다. 동일한 부피의 5% 이소프로판올 용액으로 블랭크 대조 PDA 배양 플레이트를 제조한다.
잘라낸 세균 덩어리 접종체를 상기 약물 함유 PDA 배양 플레이트에 이입하고, 25℃의 항온에서 배양하여, 대조군의 균락이 페트리 접시 가장자리에 가까워졌을 때, 십자교차법(十字交叉法)으로 모든 배양 플레이트상의 균락 직경을 측정하고, 교정 후 세균 억제율을 계산하였다.
결과는 표 13과 같이, 마갑자 추출물이 각종 피실험 진균에 대해 유의미한 억제작용을 지니는 것으로 나타났다. 피실험 진균은 모두 흔한 발병 진균이므로, 유의적인 대표성을 띠며, 상기 결과는 마갑자 추출물이 비교적 강한 항진균활성을 지녀 항진균류 약물의 제조에 응용될 전망이 있음을 보여준다.
마갑자 알코올 추출물의 각종 진균에 대한 억제 효과(n=3,
Figure 112016051232790-pct00008
±s)
균종 균억제율（%）
백색 칸디다균 87.53±8.36
적색 백선균 80.46±10.24
모창 백선균 72.69±11.53
자색 백선균 90.16±14.36
?trichophyton tonsurans(斷髮毛癬菌) 54.39±8.67
흔상 백선균 42.63±12.81
돼지 소포자균 60.54±10.33
개 소포자균 61.32±7.65
?Sporothrix schenckii 76.87±15.69
Phialophora compactum(緊密着色매균) 66.63±17.65
exophiala dermatitidis 62.65±8.87
Fonsecaea pedrosoi 53.13±10.08
五. 마갑자엽 추출물의 면역기능 저하 또는(및) 자기면역성 질병 치료
(一) 마갑자 추출물의 제조
1. 전초 에탄올 추출물의 제조
마갑자 전초 1kg을 취하여, 8배량의 95% 에탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 후, 분쇄하고, 10배량의 95% 에탄올을 더 투입하여 2일 동안 침지한 후 추출하여, 추출액을 수집하고, 50℃에서 에탄올을 알코올 냄새가 없어질 때까지 감압 회수하여 건조시키면, 마갑자 에탄올 추출물이 수득된다.
2. 경엽 에탄올, 석유에테르와 에틸아세테이트 추출물의 제조
마갑자 경엽 1kg을 취하여, 10배량의 95% 에탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 후, 분쇄하고, 10배량의 95% 에탄올을 더 투입하여 환류 추출한 다음, 추출액을 수집하고, 60℃에서 에탄올을 알코올 냄새가 없어질 때까지 감압 회수하여 건조시키면, 마갑자 에탄올 추출물이 수득된다. 마갑자 에탄올 추출물을 가수분해한 후, 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트로 추출하여 마갑자 석유에테르 추출물과 에틸아세테이트 추출물을 수득한다.
3. 전초 석유에테르와 에틸아세테이트 추출물의 제조
마갑자 전초 1kg을 취하여, 10배량의 메탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 후, 분쇄하고, 8배량의 메탄올을 더 투입하여 2일 동안 침지한 후 추출액을 수집하고, 40℃에서 메탄올을 감압 회수하여 건조시키면, 마갑자 메탄올 추출물이 수득된다. 마갑자 메탄올 추출물을 가수분해한 후, 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트로 추출하여 마갑자 석유에테르 추출물과 에틸아세테이트 추출물을 수득한다.
4. 성분 정량분석
마갑자 경엽 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 취하여, 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고, 에틸아세테이트를 눈금까지 투입한 다음, 그 중에서 4ml의 용액을 정밀하게 흡취하여 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고 용제를 휘발 건조시킨 후, 5%의 바닐린-빙초산 0.4ml, 과염소산 1.6ml를 첨가하여 고르게 혼합하고, 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 70℃의 항온 수욕에서 15min 동안 가열하고, 실온으로 냉각시킨 다음, 10ml 용량의 플라스크로 옮겨 담고 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 고르게 흔들어, 540nm 파장 부위에서 흡수도를 측정하고, 시약 용액 중의 총 트리테르페노이드 함량(트리테르페노이드 함량은 ceanothic acid로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 트리테르페노이드류의 성분은 23mg을 함유한다.
마갑자 경엽 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든 다음, 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 물을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔들고, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 510nm파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 플라보노이드 함량(플라보노이드 함량은 루틴으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 플라보노이드는 103mg을 함유한다.
마갑자 경엽 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 마개 달린 삼각플라스크에 담고, 18%의 암모니아수 2ml로 1h 동안 적신 후, 에테르 2 클로로포름 2 에탄올(25:8:2.5) 혼합 용제 30ml를 투입하여 초음파로 20min 동안 추출하고, 상청액을 작은 삼각 플라스크에 따라 부은 후, 상기 혼합 용제 30ml를 더 투입하여 30분간 냉침해 두고, 다시 20min 동안 초음파로 진탕하여 추출하고, 여과하여, 동일한 용제 15ml로 3회로 나누어 찌꺼기와 여과지를 세척하고, 여과액을 삼각 플라스크에 합병한 후, 60℃ 수욕에서 증발건조시키고, 10ml의 클로로포름을 정확하게 투입하여 전부 용해시킨 다음, 다시 5mL를 정확하게 흡취하여 작은 분액 깔때기에 옮겨 담은 후, 6mL의 클로로포름과 2ml의 완충액(pH=5.0, 0.2M의 프탈산수소칼륨 완충액)을 투입한다. 1mmolㆍL-1의 브로모티몰블루 용액으로 적정하여, 부단히 진탕하고; 종점에 가까워졌을 때 클로로포름층을 분리하고, 신선한 클로로포름 5ml를 다시 투입한 후, 계속 적정하고 부단히 진탕한 다음 정치하여 층을 분리하고, 물층에 황색이 나타나면 즉 종점이며, 총 알칼로이드(알칼로이드 함량은 paliurine B로 계산)를 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 알칼로이드는 21mg을 함유한다.
마갑자 경엽 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든다. 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 70% 에탄올을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔든 다음, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 340nm 파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 쿠마린 함량(쿠마린 함량은 움벨리페론으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 쿠마린은 10.2mg을 함유한다.
마갑자 경엽 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 취하여, 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고, 에틸아세테이트를 눈금까지 투입한 다음, 4ml의 용액을 정밀하게 흡취하여 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고 용제를 휘발 건조시킨 후, 5%의 바닐린-빙초산 0.4ml, 과염소산 1.6ml를 첨가하여 고르게 혼합하고, 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 70℃의 항온 수욕에서 15min 동안 가열하고, 실온으로 냉각시킨 다음 10ml 용량의 플라스크로 옮겨 담고 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 고르게 흔들고, 540nm 파장 부위에서 흡수도를 측정하고, 시약 용액 중의 총 트리테르페노이드 함량(트리테르페노이드 함량은 ceanothic acid로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 트리테르페노이드류의 성분은 108mg을 함유한다.
마갑자 경엽 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든다. 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 물을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔든 다음, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 510nm파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 플라보노이드 함량(플라보노이드 함량은 루틴으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 플라보노이드는 497mg을 함유한다.
마갑자 전초 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 마개 달린 삼각플라스크에 담고, 18%의 암모니아수 2ml로 1h 동안 적신 후, 에테르 2 클로로포름 2 에탄올(25:8:2.5) 혼합 용제 30ml를 투입하여 초음파로 20min 동안 추출하고, 상청액을 작은 삼각 플라스크에 따라 부은 후, 상기 혼합 용제 30ml를 더 투입하여 30분간 냉침해 두고, 다시 20min 동안 초음파로 진탕하여 추출하고, 여과하여, 동일한 용제 15ml로 3회로 나누어 찌꺼기와 여과지를 세척하고, 여과액을 삼각 플라스크에 합병한 후, 60℃ 수욕에서 증발건조시키고, 10ml의 클로로포름을 정확하게 투입하여 전부 용해시킨 다음, 다시 5mL를 정확하게 흡취하여 작은 분액 깔때기에 옮겨 담은 후, 6mL의 클로로포름과 2ml의 완충액(pH=5.0, 0.2M의 프탈산수소칼륨 완충액)을 투입한다. 1mmolㆍL-1의 브로모티몰블루 용액으로 적정하여, 부단히 진탕하고; 종점에 가까워졌을 때 클로로포름층을 분리하고, 신선한 클로로포름 5ml를 다시 투입한 후, 계속 적정하고 부단히 진탕한 다음 정치하여 층을 분리하고, 물층에 황색이 나타나면 즉 종점이며, 총 알칼로이드(알칼로이드 함량은 paliurine B로 계산)를 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 알칼로이드는 107mg을 함유한다.
마갑자 전초 에틸아세테이트 추출물 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든다. 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 70%의 에탄올을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔든 다음, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 340nm 파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 쿠마린 함량(쿠마린 함량은 움벨리페론으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 쿠마린은 186mg을 함유한다.
(二) 마갑자 제제의 제조
1. 정제의 제조
마갑자 전초 에탄올 추출물 300g을 취하여 적당한 보조제, 예를 들어 100g의 미결정 셀룰로오스, 57.5g의 락토오스, 20g의 가교 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 등을 첨가하고, 압착하여 정제로 제조한다.
2. 캡슐제의 제조
마갑자 경엽 에틸아세테이트 추출물을 취하여 적당한 보조제, 예를 들어 락토오스, 압축성 전분, 카르복시메틸 전분, 미결정 셀룰로오스 등을 첨가하여 캡슐제로 제조한다.
3. 과립제의 제조
마갑자 전초 메탄올 추출물을 취하여 적당한 보조제, 예를 들어 락토오스, 전분, 메틸셀룰로오스, 하이드록시메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 에어로실 등을 첨가하여 과립제로 제조한다.
4. 연고제의 제조
마갑자 경엽 석유에테르 추출물을 취하여, 적당한 보조제, 예를 들어 옥타데칸올, 글리세롤 모노스테아레이트, 글리세린, 스테아르산 등을 첨가하여 연고제로 제조한다.
5. 좌제의 제조
마갑자 전초 에탄올 추출물을 취하여 적당한 보조제, 예를 들어 혼합지방산 글리세라이드, PEG, 밀랍 등을 첨가하여 좌제로 제조한다.
(三) 체외세포학 연구
1. 마갑자 추출물이 마우스(작은 쥐)의 비장 임파세포 체외증식에 미치는 영향
1.1 마우스 비장 임파세포의 제조
쿤밍 마우스의 비장을 무균 상태로 적출하여, 적량의 RPMI1640 배지가 담긴 페트리 접시에 놓고 결체조직을 제거한 후, 주사기 바늘 중심으로 연마하고, 200메쉬의 체에 여과시킨 다음, 원심분리관으로 옮겨 RPMI1640으로 세척 후, 세포를 수집하고, 1ml의 적혈구 용해액에 투입하였다. 4℃에서 5-10min 동안 방치한 후, 1500r/min으로 5min 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하여, RPMI1640 배지로 2회 세척한 다음, 마지막으로 세포를 1ml의 RPMI1640 완전 배지에 현탁시킨 후, 트리판 블루 염색을 거쳐 생존율을 측정한 결과, 비장세포의 생존률이 95% 이상인 것으로 나타났다. 상기 비장 세포 현탁액 적량을 희석하여 세포 밀도를 2×106개/ml로 준비해둔다.
1.2 마갑자 추출물이 마우스 비장 임파세포의 체외 증식에 미치는 영향
2×106개/ml의 비장 세포 현탁액을 각 웰당 100㎕씩 96웰 플레이트에 투입하고, 블랭크군, 대조군 및 마갑자 추출물군을 설치하였다. 대조군의 각 웰마다 100㎕의 RPMI1640 완전 배지를 더 투입하고; 마갑자 추출물군에는 각 웰마다 각기 다른 농도의 마갑자 추출물이 함유된 RPMI1640 완전 배지 용액 100㎕을 더 투입하며; 배지만 함유한 블랭크 그룹을 별도로 설치하였다. 상기 96웰 플레이트를 5%의 CO2, 37℃의 인큐베이터에 담아 60h 동안 배양한 후, 세포판을 취출하여 웰 내의 액체를 흡출하고, PBS로 3회 세척한 후, 100㎕의 배지와 20㎕의 MTT액(5mgㆍml-1)을 투입한 다음, 37℃, 체적비가 5% CO2인 습도 환경에서 4h 동안 배양한 후, 세포 배양 플레이트를 취출하여 상청액을 조심스럽게 흡출하고, 150㎕의 디메틸설폭사이드를 투입하여, 배양 플레이트를 마이크로플레이트 진탕기에 놓고 10min 동안 진탕하여 결정물인 포르마잔을 충분히 용해시킨 후, 효소결합면역분석기 중 490nm에서 비색을 측정하여 결과를 기록하고, 공식(1)에 따라 마갑자 추출물의 마우스 비장 세포에 대한 체외 평균 생존율을 계산하였다.
Figure 112016051232790-pct00009
결과에서, 마갑자 추출물 농도가 0.004mg/ml, 0.02mg/ml, 0.2mg/ml일 때, 마우스의 비장 세포의 평균 생존률이 117.85%, 107.21% 및 77.46%인 것으로 나타났다. 결과는 저농도의 마갑자 추출물이 마우스의 비장 세포 체외 증식을 촉진시킬 수 있고, 고농도의 마갑자 추출물은 비장 세포의 증식에 대해 억제 작용을 지님을 나타낸다.
2. 마갑자 추출물이 ConA 유도된 비장 세포 체외 증식에 미치는 영향
2×106개/ml의 비장 세포 현탁액을 각 웰당 100㎕씩 96웰 플레이트에 투입하고, 블랭크군, 대조군, ConA군 및 마갑자 추출물군을 설치하였다. 대조군은 각 웰마다 100㎕의 RPMI1640 완전 배지를 더 투입하고; ConA군은 각 웰마다 25㎍/ml의 ConA를 함유한 RPMI1640 완전 배지 용액 100㎕을 더 투입하며; 마갑자 추출물군에는, 각 웰마다 각기 다른 농도의 마갑자 추출물이 함유된 RPMI1640 완전 배지 용액 100㎕을 더 투입하고(용액 중 25㎍/ml의 ConA를 동시에 함유한다); 배지만 함유한 블랭크 그룹을 별도로 설치하였다. 상기 96웰 플레이트를 5%의 CO2, 37℃의 인큐베이터에 담아 60h 동안 배양한 후, 세포판을 취출하고, 웰 내의 액체를 흡출하여, PBS로 3회 세척한 후, 100㎕의 배지와 20㎕의 MTT액(5mgㆍml-1)을 투입한 다음, 다시 37℃, 체적비가 5% CO2인 습도 환경에서 4h 동안 배양하고, 세포 배양 플레이트를 취출하여 상청액을 조심스럽게 흡출하고, 150㎕의 디메틸설폭사이드를 투입하여, 배양 플레이트를 마이크로플레이트 진탕기에 놓고 10min 동안 진탕하여 결정물인 포르마잔을 충분히 용해시킨 후, 효소결합면역분석기 중 490nm에서 비색을 측정하여 결과를 기록하고, 공식(1)에 따라 ConA군과 마갑자 추출물군의 마우스 비장 세포에 대한 체외 평균 생존율을 계산하고; 다시 공식(2)에 따라 마갑자 추출물의 ConA 유도된 마우스의 비장 세포 체외 증식에 대한 증식률을 계산하였다.
Figure 112016051232790-pct00010
결과에서, 마갑자 추출물 농도가 0.004mg/ml, 0.02mg/ml, 0.2mg/ml일 때, ConA군에 대한 상대증식률이 각각 15.11%, 5.69%와 -14.35%로 나타났으며, 이는 마갑자 추출물이 저농도일 경우 ConA 유도된 마우스 비장 세포의 체외 증식에 대해 촉진 작용이 있고, 고농도일 경우 억제 작용이 있음을 설명한다.
3. 마갑자 추출물이 LPS 유도된 비장 세포 체외증식에 미치는 영향
2×106개/ml의 비장 세포 현탁액을 각 웰당 100㎕씩 96웰 플레이트에 투입하고, 블랭크군, 대조군, LPS군 및 마갑자 추출물군을 설치하였다. 대조군의 각 웰마다 100㎕의 RPMI1640 완전 배지를 더 투입하고; LPS군의 각 웰마다 25㎍/ml의 LPS를 함유한 RPMI1640 완전 배지 용액 100㎕을 더 투입하며; 마갑자 추출물군에는 각 웰마다 각기 다른 농도의 마갑자 추출물이 함유된 RPMI1640 완전 배지 용액 100㎕을 더 투입하고(용액 중 25㎍/ml의 LPS를 동시에 함유한다); 배지만 함유한 블랭크 그룹을 별도로 설치하였다. 상기 96웰 플레이트를 5%의 CO2, 37℃의 인큐베이터에 담아 60h 동안 배양한 후, 세포판을 취출하고, 웰 내의 액체를 흡출하여, PBS로 3회 세척한 후, 100㎕의 배지와 20㎕의 MTT액(5mgㆍml-1)을 투입한 다음, 다시 37℃, 체적비가 5% CO2인 습도 환경에서 4h 동안 배양한 후, 세포 배양 플레이트를 취출하여 상청액을 조심스럽게 흡출하고, 150㎕의 디메틸설폭사이드를 투입하여, 배양 플레이트를 마이크로플레이트 진탕기에 놓고 10min 동안 진탕하여 결정물인 포르마잔을 충분히 용해시킨 후, 효소결합면역분석기 중 490nm에서 비색을 측정하여 결과를 기록하고, 공식(1)에 따라 LPS군과 마갑자 추출물군의 마우스 비장 세포에 대한 체외 평균 생존율을 계산하고; 다시 공식(2)에 따라 마갑자 추출물의 LPS 유도된 마우스의 비장 세포 체외 증식에 대한 증식률을 계산하였다.
결과에서, 마갑자 추출물 농도가 0.004mg/ml, 0.02mg/ml, 0.2mg/ml일 때, LPS군에 대한 상대증식률이 각각 34.37%, 20.48%와 -15.60%로 나타나, 마갑자 추출물이 저농도일 경우 LPS 유도된 마우스 비장 세포의 체외 증식에 대해 촉진 작용이 있고, 고농도일 경우 억제 작용이 있음을 설명하며, 이는 상기 마갑자 추출물이 ConA 유도된 비장 세포 체외 증식에 대해 양방향 면역 조절을 갖는다는 결론과 일치하다.
(四) 약리학 검증
1. 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 및 에틸아세테이트 추출물이 면역저하 마우스의 비특이성 면역 기능에 미치는 영향(복강 대식세포 식작용)
KM 마우스 80마리를 체중에 따라 층별 무작위로 각각 현탁제 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 모델 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 양성 대조군(운지 다당), 에틸아세테이트 추출물 저용량군, 에틸아세테이트 추출물 고용량군, 에탄올 추출물군, 메탄올 추출물군, 석유에테르 추출물군의 8그룹으로 분류하여, 실험 약물 또는 현탁제를 매일 1회, 연속 14일(14d) 동안 경구투여하였다. 현탁제 대조군을 제외하고, 투여한지 제8, 10, 12일째에 25mg/kg의 비율에 따라 시클로포스파미드 생리식염수 용액을 복강 주사하여 면역 저하를 초래하였다. 제13일, 14일째에 각각 6%의 전분 용액을 복강 주사하고; 제14일째에 마지막 회 투약 1h 후, 5%의 닭적혈구 생리식염수 현탁액 1ml를 복강주사하고, 30min 후 경추를 탈구시켜 동물을 사망시키고, 생리식염수 2ml를 복강 주입한 다음 복부를 가볍게 문질러 주었다. 1min 이후 복부를 절개하고 복강세척액 1ml를 흡취하여, 2장의 슬라이드 글래스에 평균적으로 나누어 적하하고, 습식박스 내에 담아 37℃에서 30min 동안 인큐베이팅한 후, 생리식염수로 헹구고 건조시킨 다음, 1:1 아세톤-메탄올 용액으로 고정시키고, 3min 동안 4%(v/v) Giemsa-PBS 염색 후, 증류수로 헹구고 건조시킨 다음, 현미경으로 검사하고, 탐식 백분율을 계산하였다.
마갑자 추출물이 면역저하 마우스 복강 대식세포의 탐식 기능에 미치는 영향(n=10,
Figure 112016051232790-pct00011
±s)
그룹별 용량 식세포작용 백분율
현탁제 대조군 ―― 0.40±0.09**
모델 대조군 ―― 0.17±0.07
양성 대조군(운지다당) 0.4g/kg 0.36±0.11**
에틸아세테이트 추출물 소용량군 0.1g/kg 0.26±0.08**
에틸아세테이트 추출물 대용량군 0.4g/kg 0.32±0.10**
메탄올 추출물군 1.2g/kg 0.32±0.11**
석유에테르 추출물군 1.2g/kg 0.31±0.07**
에탄올 추출물군 1.2g/kg 0.36±0.11**
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이다.
결과는 표 14와 같이, 마갑자 에틸아세테이트 추출물을 0.1g/kg 및 그 이상의 용량으로 14일간 경구투여할 경우, 면역억제 마우스의 복강 대식세포의 탐식 능력을 현저하게 향상시킬 수 있고, 또한 0.4g/kg 용량 그룹의 작용 강도가 운지다당(云芝多糖) 그룹과 뚜렷한 차이가 없는 것으로 나타났고; 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 1.2g/kg 역시 면역 저하 마우스의 복강 대식세포의 탐식 능력을 효과적으로 강화시킬 수 있는 것으로 나타나, 상기 4종의 추출물이 면역저하 동물에 대해 모두 비교적 양호한 면역 강화 작용을 지님을 보여준다.
2. 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 및 에틸아세테이트 추출물이 면역저하 마우스의 특이성 면역기능에 미치는 영향(2,4-디니트로플루오로벤젠에 의한 귀부종법)
KM 마우스 80마리를 체중에 따라 층별 무작위로 각각 현탁제 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 모델 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 양성 대조군(운지다당), 에틸아세테이트 추출물 저용량군, 에틸아세테이트 추출물 고용량군, 에탄올 추출물군, 메탄올 추출물군, 석유에테르 추출물군의 8그룹으로 분류하여, 실험 약물 또는 현탁제를 매일 1회, 연속 14일 동안 경구투여하였다. 현탁제 대조군을 제외하고, 투여한지 제8, 10, 12일째에 25mg/kg의 비율에 따라 시클로포스파미드 생리식염수 용액을 복강 주사하여 면역 저하를 초래하였다. 투약 제9일째에 1%의 2,4-디니트로플루오로벤젠(DNFB) 용액(100mg의 DNFB를 1:1 비율의 아세톤-식물유 혼합물에 투입하여 고르게 혼합하고, 10ml로 용량을 맞춘 것) 25㎕을 마우스의 복부에 도말하고, 제13일째에 투약 1h 후, 10㎕의 1% DNFB 용액을 마우스의 좌측 귀에 도말하고; 도말한지 24h 후, 즉 마지막 회 투약 1h 후, 경추를 탈구시켜 동물을 사망시키고, 귀의 중량을 재어 귀부종 정도를 계산하였다.
마갑자 추출물이 면역저하 마우스의 DNFB로 인한 귀부종에 미치는 영향(n=10,
Figure 112016051232790-pct00012
±s)
그룹별 용량 귀부종 정도（mg）
현탁제 대조군 ―― 11.05±1.72**
모델 대조군 ―― 6.06±0.63
양성 대조군(운지다당) 0.4g/kg 7.11±1.73**
에틸아세테이트 추출물 저용량군 0.1g/kg 7.20±1.32*
에틸아세테이트 추출물 고용량군 0.4g/kg 8.04±1.55**
메탄올 추출물군 1.2g/kg 8.31±1.45**
석유에테르 추출물군 1.2g/kg 7.31±1.56*
에탄올 추출물군 1.2g/kg 7.09±1.06*
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이다.
결과는 표 15와 같이, 마갑자 에틸아세테이트 추출물이 면역저하 마우스의 DNFB로 인한 귀부종 정도를 향상시킬 수 있는 것으로 나타나, 면역저하 동물의 세포 면역기능에 대해 강화 작용이 있음을 보여준다. 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 1.2g/kg은 에틸아세테이트 추출물의 작용과 유사한 것으로 나타나, 상기 4종 추출물 모두 비교적 양호한 면역저하 동물 특이성 면역을 강화시키는 작용이 있음을 보여준다.
3. 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 및 에틸아세테이트 추출물이 정상적인 마우스의 비특이성 면역기능에 미치는 영향(복강 대식세포 탐식법)
KM 마우스 80마리를 체중에 따라 층별 무작위로 각각 현탁제 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 강화작용 양성 대조군(운지다당), 억제작용 양성 대조군(시클로포스파미드), 에틸아세테이트 추출물 저용량군, 에틸아세테이트 추출물 고용량군, 에탄올 추출물군, 메탄올 추출물군, 석유에테르 추출물군의 8그룹으로 분류하여, 억제작용 양성 대조군에게 제13일째에 1회성으로 피하주사 투여하는 이외에, 나머지 각 그룹은 실험 약물 또는 현탁제를 매일 1회, 연속 14일 동안 경구투여하였다. 제13일, 14일째에 각각 6%의 전분 용액을 복강 주사하고; 제14일째에 마지막 회 투약 1h 후, 5%의 닭적혈구 생리식염수 현탁액 1ml를 복강주사하고, 30min 후 경추를 탈구시켜 동물을 사망시키고, 생리식염수 2ml를 복강 주입한 다음 복부를 가볍게 문질러 주었다. 1min 이후 복부를 절개하고 복강세척액 1ml를 흡취하여, 2장의 슬라이드 글래스에 평균적으로 나누어 적하하고, 습식박스 내에 담아 37℃에서 30min 동안 인큐베이팅한 후, 생리식염수로 헹구고 건조시킨 다음, 1:1 아세톤-메탄올 용액으로 고정시키고, 3min 동안 4%(v/v) Giemsa-PBS 염색 후, 증류수로 헹구고 건조시킨 후, 현미경으로 검사하고, 탐식 백분율을 계산하였다.
마갑자 추출물이 정상적인 마우스 복강 대식세포의 탐식 기능에 미치는 영향(n=10,
Figure 112016051232790-pct00013
±s)
그룹별 용량 탐식률
블랭크 대조군 ―― 0.49±0.11
강화작용 양성 대조군(운지다당) 0.4g/kg 0.47±0.19
억제작용 양성 대조군(시클로포스파미드) 0.1g/kg 0.12±0.03**
에틸아세테이트 추출물 저용량군 0.1g/kg 0.41±0.13
에틸아세테이트 추출물 고용량군 0.4g/kg 0.37±0.08*
메탄올 추출물군 1.2g/kg 0.33±0.07**
석유에테르 추출물군 1.2g/kg 0.36±0.12*
에탄올 추출물군 1.2g/kg 0.36±0.10**
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이다.
결과는 표 16과 같이, 마갑자 에틸아세테이트 추출물을 0.4g/kg의 용량으로 14일간 경구투여할 경우, 정상적인 마우스의 복강 대식세포의 탐식 능력을 어느 정도 억제시킬 수 있고, 또한 0.1g/kg 용량은 유의미한 작용이 관찰되지 않았으며; 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 1.2g/kg 역시 각기 다른 정도의 억제 효과를 나타내어, 상기 4종의 추출물이 정상적인 동물에 대해 모두 경도의 면역 억제 작용을 지님을 보여준다.
4. 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 및 에틸아세테이트 추출물이 정상적인 마우스의 특이성 면역기능에 미치는 영향(2,4-디니트로플루오로벤젠에 의한 귀부종법)
KM 마우스 80마리를 체중에 따라 층별 무작위로 각각 현탁제 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 강화작용 양성 대조군(운지다당), 억제작용 양성 대조군(시클로포스파미드), 에틸아세테이트 추출물 저용량군, 에틸아세테이트 추출물 고용량군, 에탄올 추출물군, 메탄올 추출물군, 석유에테르 추출물군의 8그룹으로 분류하여, 억제작용 양성 대조군에게 제13일째에 1회성으로 피하주사 투여하는 이외에, 나머지 각 그룹은 실험 약물 또는 현탁제를 매일 1회, 연속 14일 동안 경구투여 하였다. 투약 제9일째에 1%의 2,4-디니트로플루오로벤젠(DNFB) 용액(100mg의 DNFB를 1:1 비율의 아세톤-식물유 혼합물에 투입하여 고르게 혼합하고, 10ml로 용량을 맞춘 것) 25㎕를 마우스의 복부에 도말하였다. 제13일째에 투약 1h 후, 10㎕의 1% DNFB 용액을 마우스의 좌측 귀에 도말하고; 도말한지 24h 후, 즉 마지막 회 투약 1h 이후, 경추를 탈구시켜 동물을 사망시키고, 귀의 중량을 재어 귀부종 정도를 계산하였다.
마갑자 추출물이 정상적인 마우스의 DNFB로 인한 귀부종에 미치는 영향(n=10,
Figure 112016051232790-pct00014
±s)
그룹별 용량 귀부종 정도（mg）
현탁제 대조군 ―― 10.78±1.19
강화작용 양성 대조군(운지다당) 0.4g/kg 10.59±1.33
억제작용 양성 대조군(시클로포스파미드) 0.1g/kg 5.66±0.72**
에틸아세테이트 추출물 저용량군 0.1g/kg 9.54±1.21*
에틸아세테이트 추출물 고용량군 0.4g/kg 7.28±0.98**
메탄올 추출물군 1.2g/kg 7.15±1.17**
석유에테르 추출물군 1.2g/kg 9.12±1.34**
에탄올 추출물군 1.2g/kg 8.52±1.63**
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01
결과는 표 17과 같이, 마갑자 에틸아세테이트 추출물 0.1g/kg은 정상적인 마우스의 DNFB로 인한 귀부종 정도를 억제시킬 수 있는 것으로 나타나, 정상적인 동물에 대해 어느 정도의 세포 면역 기능 억제 작용이 있음을 보이고; 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 1.2g/kg은 에틸아세테이트 추출물의 작용과 유사하여, 상기 4종 추출물 모두 어느 정도의 특이성 면역 억제 작용이 있음을 보여준다.
5. 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 및 에틸아세테이트 추출물의 마우스의 실험적 홍반낭창에 대한 치료작용 및 세포 면역에 미치는 영향
KM 마우스 80마리를 체중에 따라 층별 무작위로 각각 현탁제 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 모델 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 양성 대조군(트립테리지움 글리코사이드), 에틸아세테이트 추출물 저용량군, 에틸아세테이트 추출물 고용량군, 에탄올 추출물군, 메탄올 추출물군, 석유에테르 추출물군의 8그룹으로 분류하여, 현탁제 대조군을 제외하고, 모두 0.5ml/마리의 비율에 따라 프리스탄(pristane)을 복강 주사하고, 약물 또는 현탁제를 매일 1회, 연속 30일 동안 경구투여하고, 마지막 회 투약 24h 이후 눈언저리에 채혈하여, 4℃에서 냉동 원심분리하여 혈청을 분리하고, ELISA로 혈청 중 항dsDNA 항체 수준을 측정하였다.
별도로 동물들을 마찬가지로 그룹을 나누고 모델을 복제하여, pristane을 주사한 후 제24일째에, 현탁제 대조군을 제외하고, 각 그룹의 동물에 5%의 닭적혈구 생리식염수 현탁액 0.2ml/마리를 복강 주사하고, pristane을 주사한 후 제30일째까지 지속적으로 약물을 계속 투여하였다. 마지막 회 투약 24h 후 눈언저리에서 20㎕의 혈액을 채취하여, 1ml의 생리식염수에 투입하고, 이어서 각각 4%의 닭적혈구 생리식염수 현탁액 0.5ml와 10%의 기니피그 혈청 0.5ml를 투입하여 고르게 혼합한 후 37℃에서 0.5h 동안 인큐베이팅하고, 3000rpm으로 10min 동안 원심분리한 후, 상청액 1ml를 3ml의 Drabkin's reagent(都氏液)에 투입하고 540nm에서 비색을 측정하였다.
마갑자 추출물이 실험적 홍반낭창(紅斑狼瘡) 마우스에 미치는 영향(n=10,
Figure 112016051232790-pct00015
±s)
그룹별 용량 혈청dsDNA함량（OD） 용혈소 수준（OD×10-1）
현탁제 대조군 ―― 0.26±0.028** 1.70±0.19**
모델 대조군 0.4g/kg 2.56±0.381 2.52±0.29
양성 대조군(트립테리지움 글리코사이드) 0.03g/kg 1.63±0.101** 0.82±0.17**
에틸아세테이트 추출물
저용량군		 0.1g/kg 2.23±0.285 2.09±0.31*
에틸아세테이트 추출물
고용량군		 0.4g/kg 2.08±0.452* 1.82±0.26**
메탄올 추출물군 1.2g/kg 2.25±0.309 2.00±0.24**
석유에테르 추출물군 1.2g/kg 2.10±0.347* 2.12±0.25*
에탄올 추출물군 1.2g/kg 2.11±0.251* 2.04±0.30**
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이다.
결과는 표 18과 같이, 마갑자 에틸아세테이트 추출물 0.4g/kg은 실험적 홍반낭창 마우스의 혈청 중 dsDNA 항체 수준을 효과적으로 저하시킬 수 있는 것으로 나타나, 홍반낭창의 치료에 응용할 수 있음을 보이고; 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 1.2g/kg은 에틸아세테이트 추출물의 작용과 유사하여, 상기 4종 추출물 모두 어느 정도의 홍반낭창에 대한 작용이 있음을 보여준다. 홍반낭창은 체액의 면역이 비정상적으로 상승하는 것으로 표현될 수 있으며, 본 실험에서 모델 동물의 용혈소 수준은 정상적인 동물보다 현저히 높은 것으로 나타났으며, 마갑자 에틸아세테이트 추출물 0.1g/kg은 이와 같이 비정상적으로 높아진 용혈소 수준을 효과적으로 저하시킬 수 있고, 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 1.2g/kg은 에틸아세테이트 추출물의 작용과 유사하여, 상기 4종 추출물 모두 비정상적인 면역 기능항진에 대해 유의미한 억제작용이 있음을 보여준다.
六. 마갑자 추출물의 구강 및 소화기 염증 또는 궤양 치료
(一) 마갑자 추출물의 제조
1. 전초 에탄올 추출물의 제조
마갑자 전초 1kg을 취하여, 8배량의 95% 에탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 후, 분쇄하고, 10배량의 95% 에탄올을 더 투입하여 2일 동안 침지한 후 추출하여, 추출액을 수집하고, 50℃에서 에탄올을 알코올 냄새가 없어질 때까지 감압 회수하여 건조시키면, 마갑자 에탄올 추출물이 수득된다.
2. 경엽 에탄올, 석유에테르와 에틸아세테이트 추출물의 제조
마갑자 경엽 1kg을 취하여, 10배량의 95% 에탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 후, 분쇄하고, 10배량의 95% 에탄올을 더 투입하여 환류 추출한 다음, 추출액을 수집하고, 60℃에서 에탄올을 알코올 냄새가 없어질 때까지 감압 회수하여 건조시키면, 마갑자 에탄올 추출물이 수득된다. 마갑자 에탄올 추출물을 가수분해한 후, 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트로 추출하여 마갑자 석유에테르 추출물과 에틸아세테이트 추출물을 수득한다.
3. 전초 석유에테르와 에틸아세테이트 추출물의 제조
마갑자 전초 1kg을 취하여, 10배량의 메탄올에 투입하고 1일 동안 침지한 후, 분쇄하고, 8배량의 메탄올을 더 투입하여 2일 동안 침지한 후 추출액을 수집하고, 40℃에서 메탄올을 감압 회수하여 건조시키면, 마갑자 메탄올 추출물이 수득된다. 마갑자 메탄올 추출물을 가수분해한 후, 순차적으로 석유에테르, 에틸아세테이트로 추출하여 마갑자 석유에테르 추출물과 에틸아세테이트 추출물을 수득한다.
4. 성분 정량분석
마갑자 경엽 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 취하여, 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고, 에틸아세테이트를 눈금까지 투입한 다음, 그 중에서 4ml의 용액을 정밀하게 흡취하여 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고 용제를 휘발 건조시킨 후, 5%의 바닐린-빙초산 0.4ml, 과염소산 1.6ml를 첨가하여 고르게 혼합하고, 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 70℃의 항온 수욕에서 15min 동안 가열하고, 실온으로 냉각시킨 다음, 10ml 용량의 플라스크로 옮겨 담고 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 고르게 흔들어, 540nm 파장 부위에서 흡수도를 측정하고, 시약 용액 중의 총 트리테르페노이드 함량(트리테르페노이드 함량은 ceanothic acid로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 트리테르페노이드류의 성분은 23mg을 함유한다.
마갑자 경엽 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든 다음, 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 물을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔들고, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 510nm의 파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 플라보노이드 함량(플라보노이드 함량은 루틴으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 플라보노이드는 103mg을 함유한다.
마갑자 경엽 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 마개 달린 삼각플라스크에 담고, 18%의 암모니아수 2ml로 1h 동안 적신 후, 에테르 2 클로로포름 2 에탄올(25:8:2.5) 혼합 용제 30ml를 투입하여 초음파로 20min 동안 추출하고, 상청액을 작은 삼각 플라스크에 따라 부은 후, 상기 혼합 용제 30ml를 더 투입하여 30분간 냉침해 두고, 다시 20min 동안 초음파로 진탕하여 추출하고, 여과하여, 동일한 용제 15ml로 3회로 나누어 찌꺼기와 여과지를 세척하고, 여과액을 삼각 플라스크에 합병한 후, 60℃ 수욕에서 증발건조시키고, 10ml의 클로로포름을 정확하게 투입하여 전부 용해시킨 다음, 다시 5mL를 정확하게 흡취하여 작은 분액 깔때기에 옮겨 담은 후, 6mL의 클로로포름과 2ml의 완충액(pH=5.0, 0.2M의 프탈산수소칼륨 완충액)을 투입한다. 1mmolㆍL-1의 브로모티몰블루 용액으로 적정하여, 부단히 진탕하고; 종점에 가까워졌을 때 클로로포름층을 분리하고, 신선한 클로로포름 5ml를 다시 투입한 후, 계속 적정하고 부단히 진탕한 다음 정치하여 층을 분리하고, 물층에 황색이 나타나면 즉 종점이며, 총 알칼로이드(알칼로이드 함량은 paliurine B로 계산)를 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 알칼로이드는 21mg을 함유한다.
마갑자 경엽 석유에테르 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든다. 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 70%의 에탄올을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔든 다음, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 340nm 파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 쿠마린 함량(쿠마린 함량은 움벨리페론으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 쿠마린은 10.2mg을 함유한다.
마갑자 경엽 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 취하여, 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고, 에틸아세테이트를 눈금까지 투입한 다음, 4ml의 용액을 정밀하게 흡취하여 10ml 용량의 플라스크 내에 투입하고 용제를 휘발 건조시킨 후, 5%의 바닐린-빙초산 0.4ml, 과염소산 1.6ml를 첨가하여 고르게 혼합하고, 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 70℃의 항온 수욕에서 15min 동안 가열하고, 실온으로 냉각시킨 다음 10ml 용량의 플라스크로 옮겨 담고 에틸아세테이트로 눈금까지 희석시킨 후, 고르게 흔들고, 540nm 파장 부위에서 흡수도를 측정하고, 시약 용액 중의 총 트리테르페노이드 함량(트리테르페노이드 함량은 ceanothic acid로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 트리테르페노이드류의 성분은 108mg을 함유한다.
마갑자 경엽 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든다. 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 물을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔든 다음, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 510nm의 파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 플라보노이드 함량(플라보노이드 함량은 루틴으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 플라보노이드는 497mg을 함유한다.
마갑자 전초 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 마개 달린 삼각플라스크에 담고, 18%의 암모니아수 2ml로 1h 동안 적신 후, 에테르 2 클로로포름 2 에탄올(25:8:2.5) 혼합 용제 30ml를 투입하여 초음파로 20min 동안 추출하고, 상청액을 작은 삼각 플라스크에 따라 부은 후, 상기 혼합 용제 30ml를 더 투입하여 30분간 냉침해 두고, 다시 20min 동안 초음파로 진탕하여 추출하고, 여과하여, 동일한 용제 15ml로 3회로 나누어 찌꺼기와 여과지를 세척하고, 여과액을 삼각 플라스크에 합병한 후, 60℃ 수욕에서 증발건조시키고, 10ml의 클로로포름을 정확하게 투입하여 전부 용해시킨 다음, 다시 5mL를 정확하게 흡취하여 작은 분액 깔때기에 옮겨 담은 후, 6mL의 클로로포름과 2ml의 완충액(pH=5.0, 0.2M의 프탈산수소칼륨 완충액)을 투입한다. 1mmolㆍL-1의 브로모티몰블루 용액으로 적정하여, 부단히 진탕하고; 종점에 가까워졌을 때 클로로포름층을 분리하고, 신선한 클로로포름 5ml를 다시 투입한 후, 계속 적정하고 부단히 진탕한 다음 정치하여 층을 분리하고, 물층에 황색이 나타나면 즉 종점이며, 총 알칼로이드(알칼로이드 함량은 paliurine B로 계산)를 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 알칼로이드는 107mg을 함유한다.
마갑자 전초 에틸아세테이트 추출물 0.1g, 3부를 정밀하게 계량하여, 50ml 용량의 플라스크에 담고, 에탄올 적량을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 차게 두었다가 에탄올을 눈금까지 첨가하고 고르게 흔든다. 정밀하게 1ml를 계량하여 10ml 용량의 플라스크에 담고, 70%의 에탄올을 눈금까지 투입한 후 고르게 흔든 다음, 정밀하게 3ml를 계량하여 25ml 용량의 플라스크에 담은 후, 340nm 파장 부위에서 흡광도를 측정하고, 시약 용액 중 총 쿠마린 함량(쿠마린 함량은 움벨리페론으로 계산)을 계산하였다. 계산 결과, 1g의 마갑자 추출물 중 총 쿠마린은 186mg을 함유한다.
(二) 마갑자 제제의 제조
1. 정제의 제조
마갑자 전초 에탄올 추출물 300g을 취하여 적당한 보조제, 예를 들어 100g의 미결정 셀룰로오스, 57.5g의 락토오스, 20g의 가교 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 등을 첨가하고, 압착하여 정제로 제조한다.
2. 캡슐제의 제조
마갑자 경엽 에틸아세테이트 추출물을 취하여 적당한 보조제, 예를 들어 락토오스, 압축성 전분, 카르복시메틸 전분, 미결정 셀룰로오스 등을 첨가하여 캡슐제로 제조한다.
3. 과립제의 제조
마갑자 전초 메탄올 추출물을 취하여 적당한 보조제, 예를 들어 락토오스, 전분, 메틸셀룰로오스, 하이드록시메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 에어로실 등을 첨가하여 과립제로 제조한다.
4. 연고제의 제조
마갑자 경엽 석유에테르 추출물을 취하여, 적당한 보조제, 예를 들어 옥타데칸올, 글리세롤 모노스테아레이트, 글리세린, 스테아르산 등을 첨가하여 연고제로 제조한다.
5. 좌제의 제조
마갑자 전초 에탄올 추출물을 취하여 적당한 보조제, 예를 들어 혼합지방산 글리세라이드, PEG, 밀랍 등을 첨가하여 좌제로 제조한다.
(三) 마갑자 추출물 용도의 약리학 검증
1. 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 및 에틸아세테이트 추출물이 유문결찰(幽門結紮)로 인한 래트의 실험적 위궤양에 미치는 영향
SD 래트 80마리를 체중에 따라 층별 무작위로 각각 모델 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 양성 대조군(라니티딘), 에틸아세테이트 추출물 저용량군, 에틸아세테이트 추출물 중간용량군, 에틸아세테이트 추출물 저용량군, 에탄올 추출물군, 메탄올 추출물군, 석유에테르 추출물군의 8개의 그룹으로 나누고, 피시험물을 매일 1회, 연속 3일 동안 경구투여하였다. 마지막 회 투약 1h 후 유문결찰 수술을 시행하고, 수술 15h 이후 경추를 탈구시켜 동물을 사망시킨 다음, 위를 적출하여 1%의 포름알데히드로 20min 동안 고정시키고, 절개하여 실체현미경으로 점막 손상 정도를 관찰하고, 궤양지수와 궤양 억제율을 계산하였다.
마갑자 추출물이 유문결찰로 인한 래트의 위궤양에 미치는 영향(n=10,
Figure 112016051232790-pct00016
±s)
그룹별 용량 궤양지수 억제율（%）
모델대조군 ―― 4.7±1.7 ――
양성대조군(라니티딘) 60mg/kg 1.5±0.4** 68.1
에틸아세테이트 추출물
저용량군		 0.1g/kg 3.7±1.4 21.3
에틸아세테이트 추출물
중간용량군		 0.2g/kg 2.8±0.7* 40.4
에틸아세테이트 추출물
고용량군		 0.4g/kg 2.0±1.0** 57.4
메탄올 추출물군 1.2g/kg 1.9±0.6** 59.6
석유에테르 추출물군 1.2g/kg 2.0±0.6** 57.4
에탄올 추출물군 1.2g/kg 2.2±0.8** 53.2
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이다.
결과는 표 19와 같이, 마갑자 에틸아세테이트 추출물 0.2g/kg 및 그 이상의 용량으로 3회 경구 투여할 경우, 유문결찰로 인한 래트의 위궤양 정도를 현저하게 억제할 수 있으며, 또한 0.4g/kg 용량그룹의 작용강도는 라니티딘 60mg/kg 그룹과 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났고; 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 1.2g/kg 역시 위궤양 정도를 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 나타나, 상기 4종 추출물 모두 비교적 양호한 항위궤양 작용이 있음을 보여준다.
2. 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 및 에틸아세테이트 추출물이 2,4,6-트리니트로톨루엔 술폰산(TNBS)으로 인한 래트의 실험적 대장염에 미치는 영향
SD 래트 90마리를 체중에 따라 층별 무작위로 각각 가짜 수술 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 모델 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 양성 대조군(덱사메타손), 에틸아세테이트 추출물 저용량군, 에틸아세테이트 추출물 중간용량군, 에틸아세테이트 추출물 고용량군, 에탄올 추출물군, 메탄올 추출물군, 석유에테르 추출물군의 9그룹으로 나누고, 동물을 24h 동안 금식시킨 후 펜토바르비탈로 마취시켰다. 가짜 수술 대조군을 제외하고, TNBS와 40%의 에탄올로 관장하여 실험적 대장염 모델을 복제하였다. 모델 복제 6h 후, 피시험물을 투여하고, 투약 제5일째에 꼬리정맥에서 채혈하여 백혈구를 계수하였다. 제6일째에 우레탄으로 마취시키고, 복부대동맥에서 채혈 후 경추를 탈구시켜 동물을 사망시키고, 항문으로부터 상부로 대장을 9cm 절취하여, 빙욕에서 장간막의 가장자리를 따라 창자 루멘을 절개하고, 내용물을 헹군 후 궤양의 면적을 측정하고, 궤양 면적의 백분율을 계산하였다. 대장의 무게를 잰 후 대장 점막을 절취하여 ELISA로 종양괴사인자(TNF-α) 농도를 측정하였다.
마갑자 추출물이 TNBS로 인한 래트의 실험적 대장염에 미치는 영향(n=10,
Figure 112016051232790-pct00017
±s)
그룹별 용량 백혈구 수
（109/L）		 궤양 면적비
（%）		 TNF-α
（ng/gpro）
가짜 수술 대조군 ―― 17.5±1.2** 5.0±2.3** 28.1±5.0**
모델 대조군 ―― 22.9±1.1 42.3±13.8 234.9±67.3
양성대조군(덱사메타손) 2mg/kg 8.4±0.9** 28.6±10.5* 73.2±19.6**
에틸아세테이트 추출물
저용량군		 0.1g/kg 21.5±1.9 32.7±12.1 189.6±52.7
에틸아세테이트 추출물
중간용량군		 0.2g/kg 18.6±1.1** 27.9±15.3* 137.3±45.9**
에틸아세테이트 추출물
고용량군		 0.4g/kg 18.2±0.8** 20.4±9.3** 102.8±37.5**
메탄올 추출물군 1.2g/kg 18.6±0.6** 18.8±8.0** 132.7±39.9**
석유에테르 추출물군 1.2g/kg 18.0±0.9** 25.3±6.8** 169.0±78.3*
에탄올 추출물군 1.2g/kg 18.5±0.12** 23.8±10.6** 121.6±44.0**
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이다.
결과는 표 20과 같이, TNBS로 인한 래트의 실험적 대장염은 염증성 세포 증가, 염증성 세포인자 수준의 상승 및 대장 표면의 궤양이 나타날 수 있다. 마갑자 에틸아세테이트 추출물 0.2g/kg 및 그 이상의 용량은 백혈구 및 중요한 염증 유발인자인 TNF-α의 상승을 억제하고, 궤양면의 형성을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났고; 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 1.2g/kg은 에틸아세테이트 추출물의 작용과 유사한 것으로 나타나, 상기 4종 추출물 모두 비교적 양호한 항대장염 작용이 있음을 보여준다.
3. 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 및 에틸아세테이트 추출물이 암모니아수로 인한 래트의 실험적 만성위염에 미치는 영향
SD 래트 120마리를 체중에 따라 층별 무작위로 각각 정상 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 모델 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 양성 대조군(삼구위태(三九胃泰) 과립), 에틸아세테이트 추출물 저용량군, 에틸아세테이트 추출물 중간용량군, 에틸아세테이트 추출물 고용량군, 에탄올 추출물군, 메탄올 추출물군, 석유에테르 추출물군의 10그룹으로 나누고, 모든 동물에게 0.02%의 암모니아수를 매일 1회, 연속 90일 동안 경구투여하고, 피시험물을 매일 1회 연속 90일 동안 동시에 경구투여하였다. 마지막 회 투약 후 이튿날 경추를 탈구시켜 사망시키고, 위장의 소만 위벽을 적출하여, 10%의 포르말린으로 고정시키고, 파라핀으로 포매, 절편하여, HE 및 PAS 염색하였다. HE 염색 절편으로 염증 반응 상황을 관찰함과 아울러 점수를 계산하고, 위체의 점막 두께를 측정하였으며; PAS 염색 절편으로 양성층 두께를 측정하여 점액층 두께를 특정지었다.
마갑자 추출물이 암모니아수로 인한 래트의 실험적 만성위염에 미치는 영향(n=12,
Figure 112016051232790-pct00018
±s)
그룹별 용량 염증 점수 점막층 두께
（mm×10-1）		 점액층 두께
（mm×10-2）
정상 대조군 ―― 0.20±0.12** 5.13±0.62** 9.60±2.56**
모델 대조군 ―― 3.23±1.04 3.18±0.54 3.28±0.69
양성 대조군(삼구위태 과립) 0.5g/kg 1.56±0.75** 3.51±0.48 6.72±1.93**
에틸아세테이트 추출물 저용량군 0.1g/kg 2.07±1.12* 3.29±0.47 6.08±1.71**
에틸아세테이트 추출물 중간용량군 0.2g/kg 1.62±0.63** 3.72±0.83 7.29±2.05**
에틸아세테이트 추출물 고용량군 0.4g/kg 1.08±0.55** 4.67±1.04** 7.38±1.36**
병용투여군 에틸아세테이트0.2g/kg+삼구위태0.5g/kg 1.45±0.69** 4.28±0.61**# 7.33±1.59**
메탄올 추출물군 1.2g/kg 1.58±0.69** 4.75±1.00** 7.12±1.15**
석유에테르 추출물군 1.2g/kg 1.39±0.47** 4.44±0.86** 6.33±0.92**
에탄올 추출물군 1.2g/kg 1.28±0.48** 4.38±0.96** 7.05±1.14**
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이고; 양성 대조군(삼구위태 과립)과 비교하여, #P<0.05이다.
결과는 표 21과 같이, 마갑자 에틸아세테이트 추출물이 암모니아수로 인한 실험적 만성위염에 대해 염증 정도를 억제하고, 위점막 및 점액 두께를 증가시키는 작용을 지니며, 특히 염증 억제 및 점액층 두께를 증가시키는 방면의 약효가 더욱 뚜렷한 것으로 나타났고; 에탄올, 메탄올, 석유에테르 추출물 1.2g/kg은 에틸아세테이트 추출물의 작용과 유사한 것으로 나타나, 상기 4종 추출물 모두 비교적 양호한 항만성위염 작용이 있음을 보여준다.
4. 에틸아세테이트 추출물과 삼구위태의 병용투여가 유문결찰로 인한 래트의 실험적 위궤양에 미치는 영향
SD 래트 50마리를 체중에 따라 층별 무작위로 각각 모델 대조군(0.5%의 트래거캔스검), 양성 대조군(라니티딘), 에틸아세테이트 추출물군, 삼구위태군, 병용투여군의 5그룹으로 나누어, 피시험물을 매일 1회, 연속 3일 동안 경구투여하였다. 마지막 회에 투약 1h 후 유문결찰술을 시행하고, 수술한지 15h 후 경추를 탈구시켜 동물을 사망시키고, 위를 적출하여 1%의 포름알데하이드로 20min 동안 고정시킨 후 절개하여 실체현미경으로 점막 손상 정도를 관찰하고, 궤양 지수와 궤양 억제율을 계산하였다.
마갑자 에틸아세테이트 추출물과 삼구위태 결합 응용이 유문결찰로 인한 래트의 위궤양에 미치는 영향(n=10,
Figure 112016051232790-pct00019
±s)
그룹별 용량 궤양지수 억제율（%）
모델대조군 ―― 4.5±1.3 ――
양성대조군(라니티딘) 60mg/kg 1.8±0.6** 60.0
에틸아세테이트추출물군 0.2g/kg 3.0±0.9* 33.3
삼구위태군 1g/kg 4.2±1.7 6.7
병용투여군 에틸아세테이트0.2g/kg+삼구위태1g/kg 2.7±1.1**## 40.0
모델 대조군과 비교하여, *P<0.05, **P<0.01이고; 양성 대조군(삼구위태 과립)과 비교하여, #P<0.05, ##P<0.01이다.
결과는 표 22와 같이, 마갑자 에틸아세테이트 추출물 0.2g/kg을 3회 경구투여한 경우, 유문결찰로 인한 래트의 위궤양 정도를 현저하게 억제할 수 있고; 삼구위태를 단독으로 응용한 경우 상기 모델에 대해 유의적인 영향이 없었으나, 본 발명의 추출물과 병용투여한 경우 위궤양 약효를 현저하게 증강시키는 것으로 나타나, 항위궤양 약물 또는 복합 처방을 병용투여할 경우 시너지 작용이 있음을 보여준다.
5. 에틸아세테이트 추출물과 삼구위태의 병용투여가 암모니아수로 인한 래트의 실험적 만성위염에 미치는 영향
본 실험은 약효학 실험 2와 동시에 진행하였고, 연구 결과는 표 21을 참조한다. 정상대조군 및 모델대조군을 함께 사용하였다. 결과에서, 삼구위태는 점액층 두께를 현저하게 증가시키고, 염증을 감소시킬 수 있으나, 점막층 두께에 대해서는 유의미한 영향이 없는 것으로 나타났다. 본 발명의 추출물과 병용투여 후, 어느 정도 삼구위태의 기존 작용을 강화시킬 수 있는 이외에, 점막층 두께를 효과적으로 증가시킬 수 있는 것으로 나타나, 기타 만성 위염을 치료하는 약물 또는 복합 처방과 시너지 작용이 있음을 보여준다.
결론적으로, 본 발명의 마갑자 추출물 또는 그 원형 약재인 마갑자는 현저한 항종양 활성, 항진균 활성, 항섬유화, 및 양방향 면역조절 작용을 지니며, 구강 및 소화관 염증 및/또는 궤양을 치료하는 효과가 있다.

Claims (36)

  1. 단일 종양치료 활성성분으로 마갑자를 포함하는 종양 치료용 약물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 마갑자는 마갑자 전초 식물 또는 그의 근(뿌리), 경(줄기), 엽(잎), 화(꽃), 과(열매) 중의 어느 한 부위 또는 이들의 혼합인 종양 치료용 약물.
  4. 단일 종양치료 활성성분으로 마갑자 추출물을 포함하는 항종양 약물.
  5. 삭제
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 마갑자 추출물은 마갑자 전초 식물 또는 그의 근(뿌리), 경(줄기), 엽(잎), 화(꽃), 과(열매) 중의 어느 한 부위 또는 그 혼합물을 원료로 하여, 상기 원료를 유기용제로 추출한 것인 항종양 약물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 유기용제는 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, 석유에테르, 또는 이소프로판올인 항종양 약물.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 마갑자 추출물은 플라보노이드류 성분, 테르페노이드류 성분, 알칼로이드류 성분, 및 쿠마린류 성분을 포함하는 항종양 약물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 단일 종양치료 활성성분인 마갑자 또는 마갑자 추출물; 및
    약학적으로 허용 가능한 보조제;를 포함하는 종양 치료용 약물.
  15. 삭제
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 마갑자 추출물은 마갑자 전초 식물 또는 그의 근(뿌리), 경(줄기), 엽(잎), 화(꽃), 과(열매) 중의 어느 한 부위 또는 그 혼합물을 원료로 하여, 상기 원료를 유기용제로 추출한 것인 종양 치료용 약물.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 유기용제는 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, 석유에테르, 또는 이소프로판올인 종양 치료용 약물.




  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
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  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
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