JP2015503551A - ミチノクフクジュソウ抽出物またはその有効物質を用いた抗癌剤組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
癌は、開始(initiation)、促進(promotion)および進行(progression)の3つの段階を経て発生するが、環境または飲食物中に含まれた発癌物質により細胞に突然変異が起こり、これらの細胞が発癌物質の継続的な刺激を受けながら異常に増殖し続けて癌組織を形成するものと知られている。
癌を治療するための抗癌剤の研究方法には、癌細胞に対する直接的な細胞毒性物質を探索する方法や、生体の免疫能力を調節する物質を探索する方法、癌細胞の転移を抑制する物質を探索する方法、最近注目されている血管新生を抑制する物質を探索する方法などがある。
このような化学合成抗癌剤の副作用を最小化し且つ治療効果を高めるために、植物抽出物を用いた抗癌剤の開発が持続的に行われている。
抗癌活性を有する植物抽出物が多く報告されている(Pujol M, Gavilondo J, Ayala M, Rodriguez M,Gonzalez EM, Perez L. 2007 Trends Biotechnol 25(10):455−459)。例えば、トウキ(Angelica gigas)抽出物は、結腸癌(KanWL, Cho CH, Rudd JA, Lin G. 2008. 120(1): 36−43)、大腸癌(Lu J. Kim SH Jiang C, Lee H Guo J. 2007. Acta Pharmacol Sin. 28(9):1365−1372)、脳癌(Tasi NM, Chen YL, Lee CC, Lin PC, Cheng YL, Chang WL, LIn SZ, Ham HJ. 2006. J Neurochem 99(4):1251−1262)などの各種癌に対して抗癌効果を有することが報告されており、また、例えばカンゾウ(Glycyrrhiza glabra)の根抽出物が前立腺癌 (Kanazawa M, Satomi Y, Mizutani Y, Ukimura O, Kawauchi A, Sakai T, Baba M, Okuyama T, Nishino H, Miki T. 2003. Eur Urol 43(5) :580−586)または乳癌(Jo EH, Lim SH, Ra JC, Kim SR, Cho SD, Jung JW, Yang SR, Park JS, Hwang JW, Aruoma OI, Kim TY, Lee YS, Kang Ks. 2005. Cancer Lett. 230(2): 239−247)に対して抗癌効果を有することが知られている。
本発明の他の目的や具体的な目的は、以下に提示される。
本発明者は、前記酢酸エチル画分から有効物質を分離し、その物質を同定した結果、下記化学式1の化合物であって、新規化合物であることを確認した。
本明細書において、「抗癌」とは、癌細胞の死滅、癌細胞の増殖抑制、癌細胞の転移抑制、癌が有する病理的症状の改善・治療、またはその病理的症状の発病抑制/遅延を含む意味である。
また、本明細書において、「有効成分」とは、単独で目的する活性を示し、或いはそれ自体は活性のない担体と共に活性を示すことが可能な成分を意味する。
また、本明細書において、「ミチノクフクジュソウ抽出物」は、抽出方法を問わず、抽出対象であるアドニス・ムレチフローラの全草、葉、茎、花、根またはこれらの組み合わせをメタノール、エタノール、ブタノールなどの炭素数1〜4の低級アルコール、アセトン、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、水またはこれらの混合溶媒で抽出して得られた抽出物と、その抽出物を前記列挙された溶媒の少なくとも一つで分画して得られた抽出物とを含む意味として理解される。抽出方法を問わないので、抽出対象であるアドニス・ムレチフローラの葉、茎、花、根またはこれらの組み合わせを抽出溶媒に浸漬させる段階によって抽出される限り、抽出方法は冷浸、還流、加温、超音波放射などの任意の方式がいずれも適用できるものと理解されるべきである。それにも拘らず、前記「ミチノクフクジュソウ抽出物」は、好ましくは、抽出対象たるアドニス・ムレチフローラの葉、茎、花、根またはこれらの組み合わせを水、エタノールまたはこれらの混合溶媒で抽出して得られたものであって、抽出溶媒が除去された濃縮液状の抽出物または固形状の抽出物、その固形状の抽出物を水とヘキサン、水とジクロロメタン、水と酢酸エチル、または水とブタノールで分画して得られたいずれか一つの分画溶媒層の抽出物、またはその固形状の抽出物を水に懸濁した後、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチルおよびブタノールを用いて順次分画して得られた抽出物を意味する。ここで、「順次分画する」とは、水層の画分を分画した後にも使用し続けて、前記列挙された順序の溶媒で分画することを意味する。
また、本発明の[化学式1]の化合物は、塩基を用いて、薬学的に許容される金属塩を作ることができる。アルカリ金属またはアルカリ土金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土金属水酸化物溶液中に溶解し、非溶解化合物塩を濾過し、濾液を蒸発、乾燥させて得る。この際、金属塩としては、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが製薬上適する。また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土金属塩を適切な銀塩(例えば、硝酸銀)と反応させて得る。
また、本発明の前記[化学式1]の化合物は、その薬学的に許容される塩だけでなく、これから製造できる溶媒和物、水和物、立体異性体などの形でも使用できる。
本発明の抗癌剤組成物は、その有効成分を剤形、配合目的などによって、意図する抗癌活性を示しうる限り、任意の量(有効量)で含むことができるが、通常の有効量は、組成物の全体重量に対して0.001重量%〜15重量%の範囲内で決定される。ここで、「有効量」とは、その適用対象である哺乳動物、好ましくはヒトに対して、癌細胞の死滅、癌細胞の増殖抑制、癌細胞の転移抑制、癌が有する病理的症状の改善・治療、またはその病理的症状の発病抑制/遅延を誘導することが可能な有効成分の量をいう。このような有効量は当業者における通常の能力範囲内で実験的に決定できる。本発明の抗癌剤組成物が適用(処方)できる対象は、哺乳動物およびヒトであり、特にヒトの場合が好ましい。
本発明の抗癌剤組成物は、具体的な様態においては薬学的組成物として利用できる。
本発明の薬学的組成物は、有効物質以外に、薬学的に許容される担体、賦形剤などを含んで、経口用剤形(錠剤、懸濁剤、顆粒、エマルジョン、カプセル、シロップなど)、非経口用剤形(滅菌注射用水性または油性懸濁液)、局所用剤形(溶液、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、パッチ)などに製造できる。
上記において、「薬学的に許容される」とは、有効成分の活性を抑制することなく適用(処方)対象が適応可能な以上の毒性(十分に低い毒性)を有しないことを意味する。
薬学的に許容される担体の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、澱粉(例えば、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉など)、セルロース、その誘導体(例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースなど)、麦芽、ゼラチン、タルク、固体潤滑剤(例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなど)、硫酸カルシウム、植物性油(例えば、ピーナッツ油、綿実油、胡麻油、オリーブ油など)、ポリオール(例えば、プロピレングリコール、グリセリンなど)、アルギン酸、乳化剤(例えば、TWEENS)、湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)、着色剤、風味剤、錠剤化剤、安定化剤、抗酸化剤、保存剤、水、食塩水、リン酸塩緩衝溶液などを挙げることができる。このような担体は、本発明の薬学的組成物の剤形に応じて適したものを少なくとも1種選択して使用することができる。
賦形剤も、本発明の薬学的組成物の剤形に応じて適したものを選択して使用することができるが、例えば、本発明の薬学的組成物が水性懸濁剤に製造される場合、適切な賦形剤としては、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどの懸濁剤や分散剤などを挙げることができる。注射液に製造される場合、適切な賦形剤としてはリンガー液、等張塩化ナトリウムなどを挙げることができる。
本発明の薬学的組成物は、その1日投与量が通常0.001〜150mg/kg体重の範囲であり、1回または数回に分けて投与することができる。ところが、本発明の薬学的組成物の投与量は投与経路、患者の年齢、性別、体重、患者の重症度などの様々な関連因子に鑑みて決定されるものなので、前記投与量はいずれの観点でも、本発明の範囲を制限するものと理解されてはならない。
他の具体的な様態において、本発明は食品組成物と把握できる。
本発明の食品組成物には、その有効成分以外に、甘味剤、風味剤、生理活性成分、ミネラルなどが含まれ得る。
甘味剤は、食品に適当な甘みをつける量で使用でき、天然のものでも合成のものでもよい。好ましくは天然甘味剤を使用する。天然甘味剤としては、トウモロコシシロップ固形物、蜂蜜、スクロース、フルクトース、ラクトース、マルトースなどの糖甘味剤を挙げることができる。
風味剤は、味または香を良くするために使用できるが、天然のものでも合成のものでもよい。好ましくは天然のものを使用する。天然のものを使用する場合、風味の他にも、栄養強化の目的も併行することができる。天然風味剤としては、リンゴ、レモン、ミカン、ブドウ、イチゴ、モモなどから得られたものであってもよく、緑茶の葉、アマドコロ、竹の葉、桂皮、菊の葉、ジャスミンなどから得られたものであってもよい。また、高麗人参(紅参)、タケノコ、アロエベラ、イチョウなどから得られたものを使用することができる。天然風味剤は液状の濃縮液または固形状の抽出物である。場合によっては合成風味剤が使用できるが、合成風味剤はエステル、アルコール、アルデヒド、テルペンなどが使用できる。
生理活性物質としては、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンなどのカテキン類や、レチノール、アスコルビン酸、トコフェロール、カルシフェロール、チアミン、リボフラビンなどのビタミン類などが使用できる。
ミネラルとしては、カルシウム、マグネシウム、クロム、コバルト、銅、フッ素化物、ゲルマニウム、ヨード、鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、セレニウム、ケイ素、ナトリウム、硫黄、バナジウム、亜鉛などが使用できる。
このような保存剤や乳化剤などは、それが添加される用途を達成することができる限りは、極微量で添加されて使用されることが好ましい。極微量とは、数値的に表現するとき、食品組成物の全体重量に対して0.0005重量%〜約0.5重量%の範囲を意味する。
使用できる保存剤としては、ナトリウムソルビン酸カルシウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸カルシウム、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)などを挙げることができる。
使用できる乳化剤としては、アカシアガム、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、ペクチンなどを挙げることができる。
使用できる酸味料としては、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、リン酸、グルコン酸、酒石酸、アスコルビン酸、酢酸、リン酸などを挙げることができる。このような酸味料は、味を増進させる目的の他にも、微生物の増殖を抑制する目的で、食品組成物が適正の酸度となるように添加できる。
使用できる粘増剤としては、懸濁化剤、沈降剤、ゲル形成剤、膨化剤などを挙げることができる。
また、香味または嗜好性を向上させ、他の機能性(例えば、骨粗しょう症の予防など)を加えるために、様々な漢方薬材が本発明の食品組成物に追加できるが、追加できる漢方薬材としては、杜仲(トチュウ)抽出物、続断(ゾクダン)抽出物、鹿茸抽出物、紅花の種抽出物、菟絲子(トシシ)抽出物、熟地黄(ジュクジオウ)抽出物、鼈甲(ベッコウ)抽出物、山茱萸(サンシュユ)抽出物、枸杞子(クコシ)抽出物、甘草抽出物、当帰(トウキ)抽出物、葛根抽出物、降真香抽出物、合歓皮(ゴウカンヒ)抽出物、山豆根(サンズコン)抽出物、槐(エンジュ)の花抽出物 、苦参(クララ)抽出物などが例示できる。
細切りしたミチノクフクジュソウ(全草)1kgを80%エタノールに入れ、48時間浸漬させて3回繰り返し抽出した後、濾過して得られた抽出液を減圧濃縮し、溶媒を除去した後、凍結乾燥させて粉末状の抽出物を得た。
得られたエタノール抽出物を10重量の蒸留水に懸濁および溶解させた後、ヘキサン(nn−hexane)、ジクロロメタン(CH2Cl2)、酢酸エチル(EtOAc)およびブタノール(BuOH)で順次分画し、ヘキサン層、ジクロロメタン層、酢酸エチル層、ブタノール層および残余物層の画分を順次得た。
<実施例>ミチノクフクジュソウ抽出物および画分の製造とその有効物質の分離
<実施例1>ミチノクフクジュソウ抽出物および画分の製造
細切りしたミチノクフクジュソウ(全草)1kgを80%エタノールに入れ、48時間浸漬させて3回繰り返し抽出した後、濾過して得られた抽出液を減圧濃縮して溶媒を除去し、凍結乾燥させて粉末状の抽出物を得た。
得られたエタノール抽出物を10重量の蒸留水に懸濁および溶解させた後、ヘキサン、ジクロロメタン(CH2Cl2)、酢酸エチル(EtOAc)およびブタノール(BuOH)で順次分画し、ヘキサン層、ジクロロメタン層、酢酸エチル層、ブタノール層および残余物層の画分を順次得た。
前記酢酸エチル画分8gを採取してセライト545と混合し、減圧濃縮して混合物を作った後、オープンカラムクロマトグラフィーを行った。n−Hex.、MC(methylene chloride)、DE(Diethyl ether)、EA(Ethyl acetate)、メタノール(MeOH)を移動相として用いて総5個の小画分を得た。その中でもDE(800mg)画分に対してシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行った。クロロホルム/MeOH(9/2)を移動相として、分当たり2.5mLの流速で流して総18個の小画分を得た。その中で、14番(DE−14)画分に対して簡単な精製を行って単一化合物(Compound1)を確保した。
分離された物質の構造を分析するために、単一化合物10mgをメタノール−dに溶かしてNMRスペクトルを測定した。1H NMRスペクトル(図1および図3)から3つのメチル基を確認したが、この3つのメチル基はいずれも、シングルレットであって、4次炭素と結合していると予想したとともに、4ppmシグナルからみて1つ以上のベンゼン環があると予想した。さらに、3.7〜3.3ppm付近の複雑なシグナルからみて、1つ以上の糖が結合していると予想した。13C NMR(図2および図3)およびDEPT NMR(図4)スペクトルから、総21個以上の炭素が在ることを予測したとともに、105.8ppmでアノマー炭素を確認した。
<実験例1>MTT方法による癌細胞増殖抑制活性実験
<1>実験方法
5種の癌細胞(肺癌:A549、胃癌:AGS、大腸癌:HCT−15、乳癌:MDA−MB−231、肝癌:SK−Hep1)に対する実施例のミチノクフクジュソウ80%エタノール抽出物と各画分の細胞増殖抑制効果は、MTT方法を用いて評価した。このために、癌細胞別に3〜5×104/mLの濃度に細胞数を調整して96ウェルプレートの各ウェルに入れ、24時間付着させた。24時間後に試料を処理して3日間培養した後、MTT試薬を添加して4時間さらに培養した。プレートを1,000rpmで10分間遠心分離し、注意深く培地を除去した後、DMSOを加え、540nmで吸光度を測定した。
<2>実験結果
実験結果を図8、表1および表2に示す。
A549、AGS、HCT−15、MDA−MB−231およびSK−Hep1を用いた癌細胞増殖抑制効果を確認した結果、図1から分かるように、100μg/mLのミチノクフクジュソウ80%エタノール抽出物はA549とSK−Hep1に対して80%以上の抑制効果を示した。前記A549とSK−Hep1に対してミチノクフクジュソウ抽出物の各画分を濃度別に処理したとき、表1および表2から分かるように、A549およびSK−Hep1に対して濃度依存的に細胞増殖抑制効果を示した。
このような実験結果に基づいて、最も優れた効果を示すEtOAc画分(AAM−EA)を用いて動物実験を行った。
<1>実験方法
<1−1>投与方法および投与回数
試験物質は、経口胃ゾンデを取り付けた使い捨て注射器を用いて、1HF移植の後、日1回ずつ7日間胃内強制投与した。
<1−2>群構成および投与用量
<1−2−1>群構成
群構成は、下記表3のとおりである。
試験物質の投与用量は25、50および100mg/kgと設定し、陰性対照群は賦形剤たる注射用水を投与した。陰性対照群および試験物質投与群の投与液量は10mL/kgと設定し、個体別投与液量は最近週1回測定された体重を基準として算出した。
<1−3>観察および体重測定
<1−3−1>一般症状の観察
投与全期間にわたって1日1回投与直後の一般症状を観察した。一般症状の観察は死亡有無、症状の種類および程度、発現日を個体別に記録した。
<1−3−2>体重測定
全動物に対して受入時、群分け時、投与開始時、および投与期間中毎週1回測定した。
<1−4>HFアッセイ
<1−4−1>細胞培養
試験物質を用いて5種の細胞株に対する細胞毒性試験を施した後(supplementary data)、選別してHFアッセイに使用されたヒト由来癌細胞株は、次のとおりである;A549(肺癌)、AGS(胃癌)、SK−Hep1(肝癌)。
A549とAGSはRPMI1640培地に、SK−Hep1はDMEM培地に重炭酸ナトリウム(sodium bicarbonate)、L−グルタミン(L−glutamine)、ペニシリン/ストレプトマイシン(penicillin/streptomycin)を添加した後、最終濃度が10%となるようにFBSを添加してhumidified CO2 incubatorで培養した。十分成長した細胞株をトリプシン(trypsin)で分離し、HF(Cellmax implant membrane、Spectrum)で1×106cells/mLの濃度でロードした後、humidified CO2 incubatorで24時間培養した。
<1−4−2>移植(Implantation)
ヌードマウスをゾレチル(zoletil)とロンパン(rompun)を用いて麻酔した後、腹壁を若干切開し、24時間培養したHFを移植し、移植3日後から試験物質の投与を開始した。
<1−4−3>HF摘出および癌細胞増殖抑制程度の測定
試験終了後、マウスを頚椎脱骨で犠牲させた後、移植していたfiberを摘出して表面の異物を除去し、しかる後に、予め37℃に温めておいた培地に入れて30分humidified CO2 incubatorで安定化させた後、MTT(final conc.1mg/mL)を処理し、4時間培養した。
培養終了後、2.5%硫酸プロタミン(protamine sulfate)で洗浄(washing)し、新しい2.5%硫酸プロタミンにfiberを浸漬した後、4℃でO/Nした。さらに新しい2.5%硫酸プロタミンを入れた、4時間反応させた後、fiberを縦に切ってO/N乾燥させた。fiberが完全に乾燥したことを確認し、DMSOを入れて室温で4時間振とう(shaking)しながらホルマザン(formazan)塩を溶解させた後、ELISAリーダーを用いて吸光度を測定した。
<1−5>資料の統計処理
得た資料に対する賦形剤対照群と試験物質投与群間の比較は、一般にStudent−tテストを用いて検定した。浮腫率と抑制率の表記は一般に百分率で表した。統計方法は、商用として広く使われている統計パッケージたるSPSS12.1Kプログラムを利用した。
<実験結果>
結果を表4に示した。
表4から分かるように、A549、AGSおよびSK−Hep1を用いたHFアッセイの結果、全投与群で有意な細胞増殖抑制効果を示し、特にSK−Hep1の場合は最も高い水準の癌細胞増殖抑制を示した。
<1>実験方法
<1−1>投与方法および投与回数
試験物質は、経口胃ゾンデを取り付けた使い捨て注射器を用いて1日1回、4週間、総28回胃内に強制投与した。
陽性対照物質は、使い捨て注射器(26G、1mL、Doowon meditec.Corp.、韓国)を用いて週2回、4週間、総8回腹腔に投与した。
<1−2>群構成および投与用量
<1−2−1>群構成
群構成は下記表5のとおりである。
試験物質の投与用量は50、200および500mg/kgに設定し、陽性対照物質(Cis−Diamine platinum(II) dichloride)の投与用量は2mg/kgに設定した。陰性対照群は賦形剤たる注射用水を投与した。陰性対照群、試験物質投与群および陽性対照群の投与液量は10mL/kgに設定し、個体別投与液量は投与日近くに測定された体重を基準として算出した。
<1−3>観察および体重測定
<1−3−1>一般症状の観察
観察期間中に毎日1回外観、行動および排泄物などの一般症状を観察し、死亡動物を確認した。
<1−3−2>体重測定
体重は投与開始日から週2回(火曜日、金曜日)、投与前に測定した。
<1−4>腫瘍の移植
「Attachment. Succeeding generations on transplanted tumor in nude mice((株)バイオトクステック)、Study No.:B10999」で形成された腫瘍塊を約3×3×3mm3の切片に作った。動物をイソフルラン(Isoflurane)で吸入麻酔させた後、動物の左側後肢の前側方部位を約4mm程度切開し、套管針(trocar)の先端に腫瘍切片をのせた後、套管針を左側後肢の切開部位に貫通させて左側前肢近くの背部位まで押し込んだ。その後、套管針を速く360°回転させながら抜き出し、皮膚表面を観察して腫瘍の位置を確認した後、動物の左側後肢の切開部位を約1週間ポビドンヨード液(Lot No.: 1005, Dongin−dang Pharm Co., Ltd., Korea)で消毒した。
<1−5>腫瘍の成長抑制評価
<1−5−1>腫瘍容積の測定
観察期間中に週2回(火曜日、金曜日)、カリパス(caliper)を用いて腫瘍の長軸(maximum length、L)と短軸(perpendicular width、W)を測定し、次の計算式に代入して腫瘍容積(tumor volume、TV)を計算した。
TV(mm3)=L(mm)×W2(mm2)×1/2
各個体の投与前の腫瘍の容積は群分けの際に測定された値に設定した。
<1−5−2>腫瘍の摘出および重量測定
観察期間終了日に動物をイソフルラン(ASJ9AE、Choongwae Pharma Corp.、韓国)で吸入麻酔させた後、個体別に腫瘍を摘出して腫瘍を測定した。
<1−6>資料の統計処理
実験で得られた体重、腫瘍容積、腫瘍重量はSAS(Version 9.2、SAS Institute Inc.、米国)を用いて検定した。
バートレット検定(Bartlett’s test)によって等分散性を検定した(有意水準:0.05)。等分散性の場合には、ANOVA(One−way analysis of variance)を行い(有意水準:0.05)、有意性が観察されると、陰性対照群に対する各試験群の有意性を確認するためにDunnett’s t−testの多重検定を行い(有意水準:短軸0.05および0.01)、等分散性が棄却された場合には、Kruskal−wallis testを行い(有意水準:0.05)、有意性が観察されると、陰性対照群に対する各試験群の有意性を確認するためにSteel’s testの多重検定を行った。
結果を図9〜図11に示した。
体重測定の結果、50mg/kg用量の試験物質投与群は、陰性対照群と比較して統計学的に有意な差が示されなかった。200および500mg/kg用量の試験物質投与群は、投与後28日目に陰性対照群と比較して統計学的に有意に増加した。2mg/kg用量の陽性対照群は、陰性対照群と比較して統計学的に有意な差は示されなかったが、減少する傾向を示した。
腫瘍容積の測定結果、50、200および500mg/kg用量の試験物質投与群および2mg/kg用量の陽性対照群は、投与後7〜28日目に陰性対照群と比較して統計学的に有意に抑制された。
腫瘍重量の測定結果、50、200および500mg/kg用量の試験物質投与群および2mg/kg用量の陽性対照群は、陰性対照群と比較して有意に小さく示された。
組織病理学的検査の結果において、50、200および500mg/kg用量の試験物質投与群は、腫瘍が生着している個体の腫瘍の壊死(necrosis)程度が陰性対照群と比較して類似することが観察されたが、大部分の個体で腫瘍が消失してしまい、全体的な評価は行うことができなかった。アポトーシスも、腫瘍が大部分消失してしまったうえ、摘出された腫瘍においても壊死が発生してしまい、陰性対照群と比較評価することができなかった。
結論的にヌードマウスに移植された人体由来の肝癌細胞株たるSK−HEP−1に対する抗癌試験において、試験物質AAM−EAは50、200および500mg/kg用量で腫瘍の成長を抑制する効果が明らかであると判断される。
<1>実験方法
<1−1>投与方法および投与回数
試験物質は、経口胃ゾンデを取り付けた使い捨て注射器を用いて1日1回、4週間、総28回胃内に強制投与した。
陽性対照物質は、使い捨て注射器(26G、1mL、Doowon meditec.Corp.、韓国)を用いて週2回、4週間、総8回腹腔に投与した。
<1−2>群構成および投与用量
群構成は、下記表6のとおりである。
試験物質の投与用量は20、80および200mg/kgに設定し、陽性対照物質の投与用量は2mg/kgに設定した。陰性対照群は賦形剤たる注射用水を投与した。陰性対照群、試験物質投与群および陽性対照群の投与液量は10mL/kgに設定し、個体別投与液量は投与日近くに測定された体重を基準として算出した。
<1−3>観察および体重測定
<1−3−1>一般症状の観察
観察期間中に毎日1回外観、行動および排泄物などの一般症状を観察し、死亡動物を確認した。
<1−3−2>体重測定
体重は、投与開始日から週2回(火曜日、金曜日)、投与前に測定した。
<1−4>腫瘍の移植
「Attachment. Succeeding generations on transplanted tumor in nude mice((株)バイオトクステック)、Study No.:B10999」で形成された腫瘍塊を約3×3×3mm3の切片に作った。動物をイソフルランで吸入麻酔させた後、動物の左側後肢の前側方部位を約4mm程度切開し、套管針(trocar)の先端に腫瘍切片をのせた後、套管針 を左側後肢の切開部位に貫通させて左側前肢近くの背部位まで押し込んだ。その後、套管針を速く360°回転させながら抜き出し、皮膚表面を観察して腫瘍の位置を確認した後、動物の左側後肢の切開部位を約1週間ポビドンヨード液(Lot No.: 1005, Dongin−dang Pharm Co., Ltd., Korea)で消毒した。
<1−5>腫瘍の成長抑制評価
<1−5−1>腫瘍容積の測定
観察期間中に週2回(火曜日、金曜日)、カリパス(caliper)を用いて腫瘍の長軸(maximum length、L)と短軸(perpendicular width、W)を測定し、次の計算式に代入して腫瘍容積(tumor volume、TV)を計算した。
TV(mm3)=L(mm)×W2(mm2)×1/2
各個体の投与前の腫瘍の容積は群分けの際に測定された値に設定した。
<1−5−2>腫瘍の摘出および重量測定
観察期間終了日に動物をイソフルラン(ASJ9AE、Choongwae Pharma Corp.、韓国)で吸入麻酔させた後、個体別に腫瘍を摘出して腫瘍を測定した。
<1−6>資料の統計処理
実験で得られた体重、腫瘍容積、腫瘍重量はSAS(Version 9.2、SAS Institute Inc.、米国)を用いて検定した。
バートレット検定(Bartlett’s test)を行って等分散性を検定した(有意水準:0.05)。等分散性の場合には、ANOVA(One−way analysis of variance)を行い(有意水準:0.05)、有意性が観察されると、陰性対照群に対する各試験群の有意性を確認するためにDunnett’s t−testの多重検定を行い(有意水準:短軸0.05および0.01)、等分散性が棄却された場合には、Kruskal−wallis testを行い(有意水準:0.05)、有意性が観察されると、陰性対照群に対する各試験群の有意性を確認するためにSteel’s testの多重検定を行った。
<2>実験結果
結果を図12〜図14に示した。
体重測定の結果、20および80mg/kg用量の試験物質投与群は、陰性対照群と比較して有意な差が示されなかった。200mg/kg用量の試験物質投与群は、投与群14〜21日目に陰性対照群と比較して有意に増加した。2mg/kg用量の陽性対照群は、投与後18〜28日目に陰性対照群と比較して有意に減少した。
腫瘍容積の測定結果、20mg/kg用量の試験物質投与群は投与後11および18〜25日目に、80および200mg/kg用量の試験物質投与群および2mg/kg用量の陽性対照群は投与後11〜28日目に陰性対照群と比較して有意に抑制された。
腫瘍重量の測定結果、20mg/kg用量の試験物質投与群は陰性対照群と比較して有意な差が示されなかったが、80および200mg/kg用量の試験物質投与群および2mg/kg用量の陽性対照群は陰性対照群と比較して有意に小さく示された。
組織病理学的検査の結果において、20、80および200mg/kg用量の試験物質投与群および2mg/kg用量の陽性対照群は、腫瘍の壊死(necrosis)、アポトシース(apoptosis)の程度、およびアポトーシスを計数した結果が陰性対照群と比較して類似する傾向を示した。
結論的にヌードマウスに移植された人体由来の肝癌細胞株たるHepG2に対する抗癌試験において、試験物質AAM−EAは80および200mg/kg用量で腫瘍の成長を抑制する効果が明らかであると判断される。
前記<実験例1>と同様の方法で、ミチノクフクジュソウから分離した有効物質のSK−Hep−1細胞に対する増殖抑制活性を評価した。
実験結果を図15に示したが、ミチノクフクジュソウから分離した有効物質は濃度依存的にSK−Hep−1細胞の増殖を抑制することを示す。
Claims (9)
- ミチノクフクジュソウ抽出物、下記[化学式1]の化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、抗癌剤組成物。
[化学式1]
- 前記ミチノクフクジュソウ抽出物は、ミチノクフクジュソウを水、エタノール、または水とエタノールの混合溶媒に浸漬させて得られた抽出物であることを特徴とする、請求項1に記載の抗癌剤組成物。
- 前記ミチノクフクジュソウ抽出物は、ミチノクフクジュソウを水、エタノール、または水とエタノールの混合溶媒に浸漬させて得られた抽出物を水に懸濁させ、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチルおよびブタノールで順次分画したときに得られるジクロロメタン層の分画抽出物、酢酸エチル層の分画抽出物またはブタノール層の分画抽出物であることを特徴とする、請求項1に記載の抗癌剤組成物。
- 前記ミチノクフクジュソウ抽出物は、ミチノクフクジュソウを水、エタノール、および水とエタノールの混合溶媒に浸漬させて得られた抽出物を水に懸濁させ、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチルおよびブタノールで順次分画したときに得られる酢酸エチル層の分画抽出物であることを特徴とする、請求項1に記載の抗癌剤組成物。
- 前記抗癌活性は肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌または肝癌に対する抗癌活性であることを特徴とする、請求項1に記載の抗癌剤組成物。
- 前記抗癌活性は肝癌に対する抗癌活性であることを特徴とうる、請求項1に記載の抗癌剤組成物。
- 前記組成物は薬学的組成物であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗癌剤組成物。
- 前記組成物は食品組成物であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗癌剤組成物。
- 下記[化学式1]の化合物またはその薬学的に許容される塩。
[化学式1]
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