KR101068990B1 - 개느삼 추출물, 개느삼 분획물, 이로부터 분리한 개느사논 ｈ 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개느삼(Echinosophora koreensis) 추출물, 개느삼 분획물, 이로부터 분리한 개느사논 H(kenusanone H) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 특히 개느삼 추출물로부터 분리한 단일 화합물인 개느사논 H는 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 실험에서 암세포의 성장을 억제하므로 본 발명에 따른 조성물은 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

개느삼, 개느삼 추출물, 개느삼 분획물, 개느사논 H, 항암제, 종양 억제

Description

개느삼 추출물, 개느삼 분획물, 이로부터 분리한 개느사논 Ｈ 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions for treatment of cancer containing Echinosophora koreensis extracts，fractions，the isolated Kenusanone H therefrom or the pharmaceutically acceptable salts as an active ingredient}

본 발명은 개느삼 추출물, 개느삼 분획물, 이로부터 분리한 개느사논 H 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

항암제 개발은 생명과학관련 기술개발연구의 가장 핵심을 차지하고 있으며, 암은 우리나라 뿐 아니라 미국, 일본 등에서도 사망원인 1-2 위를 다투고 있으며 특히 대형병원 사망률의 과반수이상을 차지하고 있다(생명과학동향, 생명공학 연구소, 3: 55, 1995; 학미강, 서조장광, 암 화학적 요법, 서광서림, 351, 1991). 이러한 암을 정복하기 위한 노력의 일환으로 여러 가지 암의 조기 발견을 위한 진단 법에 많은 발전이 있었으며, 암 치료법에 있어서도 수술, 방사선 요법, 항암제의 개발, 생물학적 방법 등이 발달해 왔다. 그 중 항암제의 경우 다양한 종류의 암세포를 이용한 시도가 많았지만, 현재까지 진정한 의미의 치료제로서의 항암제는 없는 상태이고 단지 보조치료제 내지는 단기간의 생명연장을 돕는 정도의 약제밖에는 개발되지 못한 상태이다.

종래 주로 임상에서 사용되고 있는 항암제제들은 대부분 5-플루오로우라실, 시트라라빈 등과 같은 핵산의 합성 저해제들 또는 알킬화 약품, 미토마이신, 시스플라틴, 프로카바진 등과 같은 핵산과 반응하여 세포독성을 나타내는 물질로 분류할 수 있다. 그러나 이러한 항암제들은 다양한 부작용을 나타내기 때문에 많은 문제점들을 안고 있으며 이러한 문제점을 해결한 새로운 암 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

최근 화학적 치료요법의 국제적인 동향을 살펴보면, 항암요법제 개발방법론에 있어서, 기존의 전통적인 접근방법으로써 DNA 생합성, DNA 결합체, 토포이소머라제, 방추사, 호르몬 등을 표적으로 그들의 억제제 혹은, 대체 가능한 화합물들을 찾는 것이었으나 최근에는 신호전달(EGF), 혈관생성억제(MMPI's), 세포주기(CDK's), 세포사멸(bcl2), 면역요법, 유전자치료, 모노클로널 항체 등으로 그 표적이 옮겨져 왔음을 알 수 있다.

또한, 새로운 항암제 개발방법으로는 천연 및 유기합성법을 주로 이용해 왔다. 여러 암 세포주 및 동물 종양 모델을 이용한 효능 평가를 통해 계속 천연물로부터 항암 효과를 가진 성분을 분리하려는 시도가 계속되고 있었으며, 그 최근의 예로 탁솔과 캄포테신의 개발을 들 수 있다.

탁솔은 항방추사 활성을 통한 암세포독성을 나타내는 독특한 작용기전으로 유방암과 난소암에 강력한 효과를 나타낸다(P.B. Schiff et al. J. Supramolec. Struct. 8: 328, 1978; E.K. Rowinsky et al. Cancer Res. 48: 4093, 1988; N. Kumar, J. Biol. Chem. 256: 10435, 1981; F.A. Holmes et al. J. Natl. Cancer Invest. 83: 1797, 1991). 또한 캄포테신은 토포이소머라제 I의 억제제로 실험적인 종양에서는 매우 강한 효과를 나타내었으나 임상에서 심한 방광염을 나타내었다(M.E. Wall et al. J. Am. Chem. Soc. 88: 3888, 1966). 그러나 캄포테신을 선도물질로 하여 CPT-11, SN38과 같은 많은 유도체들이 개발되어 상기 부작용들을 해결하였다(T. Kunimoto et al. Cancer Res. 47: 5944, 1987; N. Kaneda et al. Cancer Res. 50: 1721, 1990; S. Negoro et al. J. Natl. Cancer Inst. 83: 1164, 1991). CPT-11의 경우 현재 2상 임상 시험이 진행 중에 있으며 폐암(M. Fukuoka et al. J. Clin. Oncol. 110: 16, 1992), 백혈병 및 임파종(R. Ohno et al. J. Clin. Oncol. 8: 1907, 1990; M.R. Boyd et al. Agent Chemother. 31: 1238, 1987)에 효과가 좋은 것으로 알려져 있다. 하지만, 단일의 항암제가 모든 암에 대하여 항암활성을 나타내는 것은 아니고, 각각의 암에 대한 항암활성이 다른 바 새로운 항암제의 개발이 지속적으로 필요한 상황이다.

한편, 개느삼(Echinosophora koreensis)은 콩과 식물인 개느삼의 전초로서 개미풀, 개고삼, 느삼 나무, 도둑놈의 지팡이라고도 불린다. 개느삼은 강원도 양 구 이북지방, 평안남도, 함경남도 등지에 분포하며, 산록이나 길가에 나는 낙엽 관목으로, 땅속줄기가 발달되었으며, 키는 1 m이다. 상기 식물은 땅속줄기로 번식하고 가지는 어두운 갈색이며 털이 난다. 겨울눈은 털로 덮여 있어 보이지 않는다. 잎은 깃꼴겹잎, 작은 잎은 13-25장이고, 잎 표면은 흰색이며, 털이 나고, 긴 타원형 모양에, 털끝이 뭉뚝하고, 가장자리는 밋밋하다. 턱잎은 가시 모양으로 떨어지지 않는다. 5월에 노란색 꽃이 총상꽃 차례로 핀다. 꽃차례는 길이 3-5 cm이며 새 가지 끝에서 나와 지름 15 mm 정도의 꽃이 달린다. 작은 포는 바소꼴이고 검은빛이 돌며 털이 있다. 꽃받침은 5개로 갈라지고 뒤쪽의 2개가 약간 작다. 알칼로이드(alkaloid)와 플라보노이드(flavonoid) 성분들을 함유하고 있다.

본 발명자들은 숙취해소 및 항산화 활성을 갖는 개느삼 추출물로 등록받은 바 있으며(대한민국 특허등록 제768830호), 현재까지 개느삼의 항균 효과(H.-Y. Sohn et al., Phytomedicine. 11: 666, 2004) 및 MRSA에 대한 항균효과(T. Hironori et al., J. Ethnopharmacol. 5027, 1996)가 알려져 있고, 개느사논 H 화합물이 개느삼(Iinuma et al. Phytochemistry 33: 1241, 1993) 및 소포라 토멘토사(Sophora tomentosa, Tanaka et al. Phytochemistry 46: 1431, 1997)에 함유되어 있다고 보고된 바 있으나, 개느삼 추출물, 개느삼 분획물 및 이에 함유된 개느사논 H의 항암 활성은 전혀 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 개느삼 추출물 또는 이로부터 분리한 단일 화합물인 개 느사논 H가 위암, 유방암, 대장암, 폐암 및 전립선암 억제 활성을 가질 뿐만 아니라 마우스의 전립선 암 성장 억제 효과를 가짐을 확인하여, 이의 항암제로서의 용도를 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항암제용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암 치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개느삼(Echinosophora koreensis) 추출물, 개느삼 분획물, 이로부터 분리한 개느사논 H(kenusanone H) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 개느삼 추출물, 개느삼 분획물, 이로부터 분리한 개느사논 H 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 개느삼 추출물, 개느삼 분획물, 이로부터 분리한 개느사논 H 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 개느삼 추출물, 개느삼 분획물, 이로부터 분리한 개느사논 H 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 개느삼(Echinosophora koreensis) 추출물, 개느삼 분획물, 이로부터 분리한 개느사논 H(kenusanone H) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물은 생체 내외 실험에서 암세포주에 대하여 우수한 세포 독성 및 성장 억제 활성을 나타냄으로써 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 개느삼(Echinosophora koreensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 개느삼 추출물은 개느삼 잎, 줄기, 뿌리 및 전초의 건조물로부터 추출하여 얻어질 수 있으며, 개느삼 뿌리줄기 건조물로부터 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 개느삼은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 개느삼 추출물을 제조하는 방법은 초음파 추출법, 여과법 및 환류추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 개느삼 건조물을 물, C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 C₁~C₄의 저급 알코올로 추출한 추출물일 수 있고, 가장 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올로 추출한 추출물일 수 있다. 일례로 개느삼 뿌리 건조물을 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 넣고 용액을 끓이며 환류 추출한 후, 일정시간 방치한 다음 거름종이 등으로 여과하여 알코올 추출물을 얻을 수 있다. 이때 알코올 용매의 부피는 분쇄한 시료 부피의 2 내지 5배인 것이 바람직하다. 추출 시간은 2 내지 12 시간인 것이 바람직하며, 3 시간인 것이 가장 바람직하다. 이후에 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 개느삼 추출물을 암세포의 성장을 억제할 정도의 양으로 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 성장 저해방법을 제공한다. 이 때, 암세포의 성장을 억제할 정도의 양이란 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 0.1 내지 500 mg/kg 더욱 바람직하게는 1 내지 100 mg/kg이다. 상기 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명은 개느삼 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다.

바람직하게는 상기 개느삼 분획물은 상기 개느삼 추출물을 물에 현탁시킨 후 헥산, 클로로포름 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은 것일 수 있으며, 개느삼 추출물을 물에 현탁시킨 후 헥산, 클로로포름 또는 부탄올로 분획하여 얻은 것일 수 있다. 본 발명의 개느삼 분획물은 더욱 바람직하게는 부탄올 분획물이다.

다른 양태로, 본 발명은 상기 개느삼 분획물을 암세포의 성장을 억제할 정도의 투여량으로 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 성장 저해 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 개느사논 H(kenusanone H) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 [화학식 1]의 개느사논 H는 개느삼 추출물 또는 개느삼 분획물로부터 분리하거나, 유기화학적 합성법으로 합성하여 사용할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 개느사논 H를 암세포의 성장을 억제할 수 있 는 정도의 투여량으로 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 성장 저해방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 개느사논 H를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 화합물은 개느삼에 존재하는 대표적인 활성성분으로, 상기 화합물을 분리하기 위한 방법은 하기와 같이 수행될 수 있다.

본 발명은 개느삼 전초, 잎, 줄기 또는 뿌리 건조물을 물, C₁~C₄의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 개느삼 추출물을 얻는 단계(단계 1); 상기 단계 1에서 얻은 개느삼 추출물을 헥산, 클로로포름 또는 부탄올로 분획하거나 헥산, 클로로포름 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 개느삼 부탄올 분획물을 얻는 단계(단계 2); 상기 단계 2에서 얻은 개느삼 부탄올 분획물을 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 상기 개느사논 H를 주성분으로 하는 분획물을 얻는 단계(단계 3); 및 상기 단계 3에서 얻은 분획물을 컬럼 크로마토그래피를 재수행하여 개느사논 H를 분리하는 단계(단계 4)를 포함하여 분리되는 상기 개느사논 H의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 단계 1)은 개느삼 전초, 잎, 줄기 또는 뿌리 건조물을 물, C₁~C₄의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 개느삼 추출물을 얻는 단계이다. 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급 알코올을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올이고, 가장 바람직하게는 메탄올이다.

본 발명에 따른 단계 1)에 있어서, 상기 알코올 추출물을 얻는 방법은 건조된 개느삼 전초, 잎, 줄기 또는 뿌리를 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 적당한 양의 알코올을 첨가하여 가열하여 추출액을 얻는다. 개느삼의 추출 효율을 높이기 위하여 상기 과정을 수회 이상 반복 수행할 수 있다. 상기 추출액을 여과하고, 감압 농축하여 개느삼의 알코올 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 단계 2)는 상기 단계 1)에서 얻은 개느삼 추출물을 헥산, 클로로포름 또는 부탄올로 분획하거나 헥산, 클로로포름 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 개느삼 분획물을 얻는 단계이다.

가장 바람직하게는 헥산, 클로로포름 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은 개느삼의 부탄올 분획물이다.

본 발명에 따른 단계 3)은 상기 단계 2)에서 얻은 개느삼 분획물을 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 개느사논 H를 주성분으로 하는 분획물을 얻는 단계이다.

상기 단계는 메탄올과 물의 혼합용매를 용리액으로 사용하여 1시간 동안 메탄올과 물의 혼합비율이 50 : 50에서 100 : 0이 되도록 농도구배하여 C18 역상 크로마토그래피를 수행할 수 있으며, 이 때 용출속도는 분당 50 ~ 100 mL의 속도로 수행하는 것이 바람직하다.

또한, 바람직하게는 메탄올 100%를 용리액으로 하여 용출된 분획물을 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 단계 4)는 단계 3)에서 얻은 분획물을 컬럼 크로마토 그래피를 재수행하여 개느사논 H를 분리하는 단계이다.

상기 단계는 단계 3)의 100% 메탄올 용출 분획물을 0.02% 트리플루오르아세트산을 함유한 아세토니트릴 및 물의 혼합용매를 용리액으로 사용하여 1시간 동안 상기 아세토니트릴과 물의 혼합비율이 10 : 90에서 100 : 0이 되도록 농도구배하여 C18 역상 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 이때 용출속도는 분당 4 ~ 12 mL의 속도로 수행하는 것이 바람직하다.

상기 단계를 거쳐 분리된 상기 [화학식 1]로 표시되는 개느사논 H는 분자식이 C₂₅H₂₈O₆이고 분자량은 424인 미황색의 반고형성 물질이다.

본 발명에 따른 개느삼 추출물의 암세포주에 대한 시험관내(in vitro) 세포독성 활성을 확인하기 위하여 MTT 분석을 수행한 결과 본 발명의 개느삼 추출물은 전립선암 및 대장암에 세포독성 활성을 나타내었고, 개느사논 H는 위암, 전립선암, 대장암, 폐암 및 유방암에 대한 세포독성 활성을 나타내었다(표 1 참조).

또한, 본 발명에 따른 개느사논 H의 생체내(in vivo) 항암활성을 확인하기 위하여 종양 유발 마우스를 대상으로 상기 개느사논 H의 투여에 의한 종양 크기를 분석한 결과, 개느사논 H 투여에 의하여 대조군에 비해 38.4%(10mg/kg 투여군) 및 43.2%(20mg/kg 투여군)의 종양 성장 억제 효과를 나타내었다(도 1 참조)

따라서, 본 발명의 개느삼 추출물, 개느삼 분획물 또는 이로부터 분리한 개느사논 H는 종양 억제 활성을 나타내므로, 항암제용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 암은 위암, 전립선암, 대장암, 폐암 또는 유방암을 그 대상으로 하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 개느사논 H 및 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.

본 발명의 [화학식 1]의 개느사논 H는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이 드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 [화학식 1]의 유도체를 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.

동량의 상기 [화학식 1]의 유도체 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산 화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속 염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기 조성물은 약학적 조성물로 사용할 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1 ~ 500 ㎎, 바람직하게는 1 ~ 100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 암의 개선을 목적으로 개느삼 추출물, 개느삼 분획물, 이로부터 분리한 개느사논 H 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 식품, 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다. 이 경우, 개느삼 추출물, 이로부터 분리한 개느사논 H 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 식품 첨가물로 사용시에 원료에 대하여 0.01 ~ 20 중량%, 바람직하게는 0.1 ~ 5 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 추출물, 상기 추출물의 분획물 또는 이로부터 분리한 개느사논 H 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 보조 첨가제는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스 등과 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 솔비톨, 에르트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 조성물 100 중량부당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 중량부, 바람직하게는 0.02 ~ 0.03 중량부이다.

상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 따른 조성물은 천연 과일쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명에 따른 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예, 실험예 및 제조예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 개느삼 추출물의 제조

건조된 개느삼의 뿌리줄기(대한민국 강원도 산지에서 채집)를 세절한 후, 1.4 kg을 추출 용기에 넣고 100% 메탄올 5배에 침지하여 3시간 동안 환류 추출하고 상온으로 식힌 후 여과지로 여과하였다. 상기 추출액을 농축기를 사용하여 용액이 완전히 증발할 때까지 50℃에서 감압 농축함으로써, 메탄올 추출물(120g)을 얻었다.

실시예 2: 개느삼 분획물의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 120 g (메탄올층) 추출물을 물에 현탁시킨 후 헥산, 클로로포름 및 부탄올로 차례로 용매 분획하여 분획물을 각각 12.5 g(헥산층), 36.4 g(클로로포름층) 및 30.5 g(부탄올층)을 얻었으며, 남은 물 분획물을 23.0 g 얻었다.

이후, 부탄올 분획 28 g에 대하여 메탄올 및 물 혼합용액을 이용하여 메탄올과 물의 비율을 1시간 동안 50:50 부피비 ~ 100:0 부피비로 변화시키면서 C18 역상 크로마토그래피를 수행하였다. 이때 100% 메탄올을 용리액으로 할 때 용출된 용출액이 개느사논 H를 주성분으로 함유하고 있었다.

실시예 3: 개느사논 H의 분리 및 구조 동정

상기 실시예 2에서 얻은 100% 메탄올 용출액을 감압 농축한 후, 그 농축물에 대하여 0.02%의 트리플루오르아세트산을 함유한 아세토니트릴 및 물의 혼합용액을 용리액으로 사용하여 10% 아세토니트릴/물로부터 100% 아세토니트릴까지 1시간 동안 아세토니트릴의 조성을 높이는 농도구배로 C18 역상 컬럼을 사용한 고속액체크로마토그래피 분리법을 통하여 79%의 아세토니트릴 조성의 유출용매로부터 187 mg의 [화학식 1]로 표시되는 개느사논 H를 수득하였다.

상기 개느사논 H의 구조 분석을 위하여, 하기한 바와 같이 NMR 분석 및 질량 분석을 실시하였다. 분자량 및 분자식은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 424로 결정하였으며, 핵자기공명기(Varian 500 ㎒ NMR)를 이용한 ¹H, ¹³C-NMR 스펙트럼(spectrum) 분석을 통하여 그 구조를 하기 [화학식 1]과 같이 동정하였다(M. Iinuma et al. Phytochemistry 33: 1241, 1993). 분석 결과는 다음과 같다:

[화학식 1]

미황색 반고형성 물질；

분자식 C₂₅H₂₈O_6； ESI-MS : m/z 425 [M+H]^+；

¹H NMR (500 MHz, CD₃CN) : δ 1.60, 1.65, 1.75 (3H each s, Me-5", Me-9" and Me-10"), 2.10-2.20(4H, m, H-4" and H-6"), 3.22 (2H, br d, J = 6.5 Hz, H-1"), 4.18 (1H, dd, J = 10.5, 5.5 Hz, H-3), 4.48 (1H, m, H-2), 4.58 (1H, t, J = 11.0 Hz, H-2), 5.10 및 5.18 (each 1H, t-like m, H-2" and H-7"), 6.00 (1H, s, H-6), 6.34 (1H, dd, J = 7.5, 6.0 Hz, H-5'), 6.37 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-3'), 6.96 (1H, dd, J = 8.5, 3.5 Hz, H-6'), 7.42 (1H, br s, OH), 12.21 (1H, s, 5-OH)； ¹³C NMR (500MHz, CD₃CN) : δ 15.3 (C-1"), 17.0 (C-10"), 22.7 (C-5"), 25.0 (C-6"), 26.5 (C-9"), 39.5 (C-4"), 46.4 (C-3), 70.1 (C-2), 95.7 (C-6), 102.8 (C-4a), 107.3 (C-8), 107.3 (C-5'), 113.8 (C-8'), 122.7 (C-1'), 123.3 (C-2"), 124.4 (C-7"), 131.2 (C-2'), 134.5 (C-8"), 134.7 (C-3"), 156.0 (C-5), 157.7 (C-4'), 160.2 (C-6'), 162.4 (C-8a), 164.0 (C-7), 198.4 (C-4).

실험예 1: 개느삼 추출물 및 개느사논 H의 암세포독성 측정

본 발명에 따른 개느삼 추출물 및 개느사논 H의 암세포에 대한 in-vitro 세포독성을 평가하기 위하여, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-diphenyl trazdium bromide) 분석법을 이용하여 생존 암세포의 양을 측정하는 실험을 수행하였다. 개느삼 추출물 및 개느사논 H의 암세포독성은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection； ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 분양받은 AGS(위암, ATCC 세포코드- CRL-1739^TM), DU145(전립선암, HTB-81^TM), HCT116(대장암, CCL-247^TM), A549(폐암, CCL-185^TM), MCF7(유방암, HTB-22^TM) 암세포주를 사용하여 평가하였다.

96-웰 플레이트(well plate)에 위암(AGS), 전립선암(DU-145), 대장암(HCT-116), 폐암(A549) 및 유방암(MCF7) 세포주를 각각 1× 10⁴ 세포만큼 100 μL씩 가하고 37℃에서 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 위암(AGS),폐암(A549) 세포주는 RPMI1640 배지에, 전립선암(DU-145), 대장암(HCT-116) 세포주는 MEM 배지에, 유방암(MCF7) 세포주는 1% sodium pyruvate가 들어간 배지에 각각 길렀다. 모든 배지에는 기본적으로 10% FBS와 1% penincillin-streptomycin을 첨가하여 사용하였다.

이후 기존의 배지를 제거한 후, 시험 시료와 혼합한 새로운 배지로 교체하고 37℃에서 배양하였다. 24시간 후, MTT 용액을 10 μL씩 넣어 37℃에서 1시간 배양한 후 생존 세포 내에서 환원 효소에 의하여 형성된 포르마잔 양을 450nm에서 흡광도로 측정하였다.

개느삼 추출물 및 개느사논 H의 암세포에 대한 세포독성 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

암세포주에 대한 개느삼 추출물, 분획물 및 개느사논 H의 세포독성 측정 결과

	IC50 값
암세포주	개느삼 메탄올추출물 (㎍/mL)	개느삼 헥산 분획물 (㎍/mL)	개느삼 클로로포름 분획물 (㎍/mL)	개느삼 부탄올 분획물 (㎍/mL)	개느사논 H (uM)	Paclitaxel(대조구) (nM)
AGS	-	-	-	-	0.09 ± 0.05	100
DU-145	18.83±0.97	8.22±2.67	8.45±2.50	10.23±5.48	0.20 ± 0.00	20
HCT-116	13.75±2.25	7.79±1.20	4.1±1.55	12.57±2.54	0.66 ± 0.15	100
A549	-	-	-	-	0.33 ± 0.41	20
MCF-7	-	-	-	-	0.37 ± 0.15	150

상기 [표 1]에 나타낸 바와 같이, 개느삼 추출물 및 분획물의 경우 대장암 및 전립선암에 세포 독성 효과를 보였고, 개느사논 H는 상기 5종의 암세포주에 대하여 높은 세포 독성 효과를 나타내었다. 또한, 개느사논 H의 활성이 개느삼 추출물에 비하여 월등함을 알 수 있었고, 이로부터 개느삼 추출물 내의 유효성분이 개느사논 H임을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 개느사논 H의 in vivo 항암 활성 측정

본 발명에 따른 개느사논 H의 in vivo 종양 성장 억제 활성을 평가 하기 위하여 무게 18-22g 의 BALB/c 누드 마우스를 사용하였으며, 고형 시료와 수돗물을 자유 섭취케 하여 1주간 예비사육 후 실험을 수행하였다. 각 쥐에 DU145(전립선 암세포) 세포주를 9× 10⁶ 세포씩 오른쪽 어깨에 주사한 후 종양의 크기가 100mm³ 정도가 될 때 무작위로 5마리 이상씩 음성 대조군, 실험군 1(개느사논 H 10 mg/kg) 및 실험군 2(개느사논 H 20 mg/kg)의 세 그룹으로 분류하였다. 이후 일주일에 2회씩 3주에 걸쳐 일정 농도의 시료를 0.01M 인산 나트륨(pH 8.23) 용액에 조제하여 경구 투여 하였다. 시료를 투약할 때마다 종양의 크기를 측정하였다.

종양의 크기는 (넓이)²× 길이/2로 계산 하였으며 넓이는 종양의 짧은 직경, 길이는 긴 직경을 사용하였다.

측정결과는 도 1에 나타내었으며, 도 1에서 알 수 있는 바와 같이 33일내에 음성 대조군에 비하여 실험군 1(개느사논 H 10 mg/kg)에서 38.4%, 실험군 2(20 mg/kg)에서 43.2%의 종양 성장 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

따라서, 개느삼에서 분리한 개느사논 H 화합물은 종양 성장을 효과적으로 억제하는 바, 유용한 항암제용 조성물로 이용될 수 있을 것이다.

이하, 개느삼 추출물, 개느삼 분획물, 개느사논 H 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유한 약학적 제제 또는 건강식품의 예를 설명한다.

제제예 1: 약학적 제제의 제조

1-1. 산제의 제조

개느삼 추출물, 분획물, 개느사논 H 또는 염 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

1-2. 정제의 제조

개느삼 추출물, 분획물, 개느사논 H 또는 염 100 ㎎

옥수수 전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

1-3. 캡슐제의 제조

개느삼 추출물, 분획물, 개느사논 H 또는 염 100 ㎎

옥수수 전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

1-4. 주사액제의 제조

개느삼 추출물, 분획물, 개느사논 H 또는 염 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 개느삼 추출물 또는 이로부터 분리한 개느사논 H를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

제조예 2: 건강기능식품의 제조

건강기능식품은 상기 제조예 1-1 내지 1-3의 방법으로 각각 산제, 정제, 캡슐제로 제조될 수 있으며, 통상의 제형화 방법으로, 과립제, 액제, 드링크제, 현탁액 등으로 제조될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 개느삼 추출물, 분획물 또는 개느사논 H는 각종 식품에 기능성 식품첨가물의 형태로 첨가될 수 있다.

도 1은 누드마우스에 이식한 DU-145 전립선암세포에 대한 개느사논 H의 암세포 성장 억제 효과를 나타낸 도면이다.

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 하기 [화학식 1]로 표시되는 개느사논 H(kenusanone H) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물:

   [화학식 1]

   
6. 제 5항에 있어서, 상기 개느사논 H는 개느삼 추출물 또는 상기 개느삼 추출물의 유기용매 분획물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
7. 제 5항에 있어서, 상기 개느사논 H는

   1) 개느삼 뿌리 건조물을 물, C₁~C₄의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 개느삼 추출물을 얻는 단계;

   2) 상기 단계 1)에서 얻은 개느삼 추출물을 헥산, 클로로포름 또는 부탄올로 분획하거나 헥산, 클로로포름 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 개느삼 부탄올 분획물을 얻는 단계;

   3) 상기 단계 2)에서 얻은 개느삼 부탄올 분획물을 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 상기 개느사논 H를 포함하는 분획물을 얻는 단계; 및

   4) 상기 단계 3)에서 얻은 분획물을 컬럼 크로마토그래피를 재수행하여 개느사논 H를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개느사논 H 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 단계 1)의 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
9. 제 7항에 있어서, 상기 단계 3)의 컬럼 크로마토그래피는 메탄올과 물의 혼합용매를 용리액으로 사용하여 1시간 동안 메탄올과 물의 혼합비율이 부피비로 50:50에서 100:0이 되도록 농도구배하여 C18 역상크로마토그래피를 수행하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
10. 제 7항에 있어서, 상기 단계 4)는 상기 단계 3)으로부터 얻은 메탄올 분획물을 0.02 중량%의 트리플루오르아세트산을 함유한 아세토니트릴과 물의 혼합용매를 용리액으로 사용하여 1시간 동안 상기 아세토니트릴과 물의 혼합비율이 부피비로 10:90에서 100:0이 되도록 농도구배하여 C18 역상 크로마토그래피를 수행하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
11. 제 5항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 위암, 전립선암, 대장암, 폐암 및 유방암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.

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