JP2018184432A - ハマナツメの使用方法、ハマナツメ抽出物の使用方法及び薬物混合物の使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ハマナツメ及びその抽出物の新しい用途の提供。【解決手段】ハマナツメ及びその抽出物の、抗繊維化、抗真菌活性、抗腫瘍活性、口腔及び張垣炎症或いは／及び潰瘍関連疾患を治療することができ、双方向免疫調節作用の薬物的用途。ハマナツメはハマナツメ全体或いはその一部を使うことができ、薬用部分として根、茎、葉、花、果実のいかなる一部分或いはそれらの混合物が好ましい。薬剤の採取期間と保存の利便性を鑑み、臨床で使用しやすい方法で、ハマナツメを抽出物として使用する。【選択図】なし

Description

本発明は医薬分野に属し、具体的にハマナツメ抽出物及びその精製方法と用途に関するものである。

ハマナツメ（Ｐａｌｉｕｒｕｓｒａｍｏｓｉｓｓｉｍｕｓ （Ｌｏｕｒ．）Ｐｏｉｒ）は落葉潅木で、一般的な薬用植物である。研究によれば、枝、葉、花、果実すべてが薬用であることが報告されている。性質と味は苦く、平坦で、無毒である。除寒活血、解熱、腫れを抑え、打撲傷を治し、心腹の痛みを抑えるという。中薬大辞典及び地方薬物誌に収められている。

本発明の発明者は研究過程において、ハマナツメとその抽出物には抗繊維化、抗真菌活性、抗腫瘍活性があり、口腔及び消化器炎症及び、潰瘍関連疾患を治療し、免疫機能の双方向調整作用があることを発見した。

本発明が第一に解決した技術的問題は、ハマナツメの新しい用途に関するものである。

応用において、ハマナツメはハマナツメ全体或いはその一部を使うことである。薬用部分として根、茎、葉、花、果実のいかなる一部分或いはそれらの混合物がある。

具体的にはハマナツメとその抽出物には抗繊維化、抗真菌活性、抗腫瘍活性があり、口腔及び消化器炎症及び、潰瘍関連疾患を治療し、免疫機能の双方向調整作用がある。

本発明が第二に解決した技術的問題は、新しいハマナツメ抽出物を提供できることである。薬剤の採取期間と保存の利便性を鑑み、臨床で使用しやすい方法で、ハマナツメを抽出物として使用することである。

具体的には、本発明におけるハマナツメ抽出物はハマナツメ全体或いはその一部を一般的な採取方法で薬剤の原料にすることができる。本発明で得られるハマナツメ抽出物の主な成分にはフラボン類、テルペノイド類、アルカロイド類、クマリン類が含まれている。さらにはフラボン、テルペノイド、アルカロイド、クマリンのグリコシド及び単体成分が含まれており、多糖類とセルロースも含まれている。

本発明が解決する三つ目の技術的問題として、本発明のハマナツメ抽出物の精製方法は以下の通りである。
方法一：
Ａ．ハマナツメ植物全体或いはその一部を薬剤の原料とする。
Ｂ．溶剤で抽出し、乾燥させることで得られる。

上記技術プロトコルにおいて、ステップＡで述べているハマナツメは新鮮なもの、冷凍乾燥品、有機溶媒処理済み品を薬剤の原料として用いている。

上記技術プロトコルにおいて、メタノール、エタノール、イソアルコール、酢酸エチル或いはベンジンを溶剤として使用しているが、メタノールとエタノールを優先的に使用する。

上記技術プロトコルのステップＢで述べた抽出方法は浸漬、回流或いは濾過抽出である。

上記技術プロトコルのステップＢで述べた乾燥とは減圧乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥或いはマイクロウェイブ乾燥を指す。

方法二：
Ａ．ハマナツメ植物全体或いはその一部を薬剤の原料とする。
Ｂ．溶剤ａで抽出し、濾液を濃縮し、濃縮液を得る。
Ｃ．溶剤ｂを使用してステップＢで得た濃縮液をさらに抽出し、液体を得て、乾燥させる。或いはステップＢで得た濾液を濃集或いは乾燥させた抽出物１を溶剤ｂで抽出し、抽出液を乾燥させる。

上記技術プロトコル内のステップＡで述べたハマナツメは新鮮なもの、冷凍乾燥品、有機溶媒処理済み品を薬剤の原料として用いている。

上記技術プロトコルのステップＢで述べた溶剤ａは、メタノール、エタノール、イソアルコールだが、メタノールとエタノールを優先的に使用する。

上記技術プロトコルのステップＣで述べた溶剤ｂは酢酸エチル或いはベンジンである。

上記技術プロトコルのステップＢ及びステップＣで述べた抽出法は浸漬法、回流法、濾過法或いは精製法を指す。

上記技術プロトコルのステップＢ及びステップＣで述べた乾燥方法とは減圧乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥或いはマイクロウェイブ乾燥を指す。

上記方法を採用して製造した抽出物は、例えば方法一で製造して取得した場合、ステップＢで使用した溶剤に応じて抽出物を命名する。例えばハマナツメエタノール抽出物、ハマナツメメタノール抽出物、ハマナツメイソアルコール抽出物、ハマナツメ酢酸エチル抽出物、ハマナツメベンジン抽出物である。もし方法二に基づいて得られた場合、ステップＣで使用された溶剤ｂに基づいて抽出物を命名する。例えばハマナツメベンジン抽出物、ハマナツメ酢酸エチル抽出物である。もし方法二のステップＣに基づいて得られた場合、抽出物１は方法二のステップＢで使用した溶剤ａに基づいて命名する。例えばハマナツメエタノール抽出物、ハマナツメメタノール抽出物、ハマナツメイソアルコール抽出物である。

上記技術プロトコル内において、方法一のステップＢで使用する溶剤とハマナツメの使用量の関係は、溶剤添加量はハマナツメの質量の１−２０倍である。優先的な溶剤添加量はハマナツメの質量の５−１５倍である。さらに好ましくは、溶剤添加量の８−１０倍である。

上記技術プロトコル内において、方法二のステップＢで使用する溶剤ａとハマナツメの使用量の関係は、溶剤ａ添加量はハマナツメの質量の１−２０倍である。優先的な溶剤ａ添加量はハマナツメの質量の５−１５倍である。さらに好ましくは、溶剤ａ添加量の８−１０倍である。

優先的に溶剤或いは溶剤ａでメタノール或いはエタノールを使用する場合、メタノール或いはエタノール添加量はハマナツメの質量の１−２０倍である。優先的にメタノール或いはエタノールの添加量はハマナツメの質量の５−１５倍である。さらに好ましくは、優先的にメタノール或いはエタノールの添加量はハマナツメ質量の８−１０倍である。

このうち、上記のエタノールの濃度は１０−９５％であり、優先的に５０−９５％のエタノールを使用する。最優先なのは９５％のエタノールである。

上記技術プロトコルにおいて、有機溶媒処理を行う原料のハマナツメは新鮮品或いは冷凍乾燥品である必要がある。この理由として、発明者は研究過程において、ハマナツメの干したもの、加熱乾燥品などの乾燥品には相応の活性がないことを発見したため、ハマナツメの新鮮品を原料とした。しかし新鮮品は保存、運送に適さないことから、発明者は研究の過程で冷凍乾燥品と有機溶媒処理したハマナツメの新鮮品とを採用することで、薬物活性成分を保存することができ、効果が新鮮品と同等であることを発見し、本発明のハマナツメ抽出物の新用途を満たすことができる上に、保存と運送に適していることを結論づけた。

具体的な有機溶媒処理の方法は、ハマナツメを有機溶剤に浸漬し、乾燥させることである。

有機溶媒にはエタノール、メタノール、酢酸エチル、ベンジン、イソアルコール等が使用されるが、優先的にメタノール或いはエタノールを使用する。

本発明の抽出物は内服（口内、舌下を含む）、経鼻、局部（頬内、舌下、経皮を含む）、消化器外（皮下、皮内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病巣内、静脈内或いは皮下注射や輸液を含む）ルートの投薬が可能である。これらの製剤は薬剤学技術の既知のいかなる方法を通して、例えば活性成分と媒体或いは賦形剤と合わせて製造することができる。

本発明が解決する第四の技術的問題は、本発明のハマナツメ抽出物の薬物製剤の製造を提供することである。本発明のハマナツメ抽出物は、薬物学上使用可能な補材を利用して、多ルート投薬ができる薬物製剤を製造することができる。より利便性を高めるため、本発明の抽出物は一般的な内服製剤、注射製剤或いは外用製剤に製造することができる。例えば内服（頬内或いは舌下を含む）、経鼻、局部（頬内、舌下、経皮を含む）、消化器外（皮下、皮内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病巣内、静脈内或いは皮下注射や輸液を含む）ルートから投薬することができる。この製剤は薬剤学の既知のいかなる方法を通して、例えば活性成分と媒体或いは賦形剤と合わせて製造することができる。例えば、タブレット、カプセル剤、顆粒剤、微丸剤、微球剤、滴丸、経時希釈剤、希釈製剤或いは注射剤などである。

この製剤は、内服に適した投薬薬物製剤として独立したユニットと成り得る。例えば、カプセル、片剤、粉末或いは顆粒など、或いは水性或いは非水溶性液体の溶剤、ソリキッド、水包油型液体乳液或いは油包水型乳液などである。ユニット剤量形式で内服液、例えば溶液、シロップやそのエレキレル剤にすることが可能である。シロップは化合物を適切に調味した水溶液に溶解させることで製造できる。エレキレル剤は無毒ビークルを使用して製造することができる。溶剤や乳化剤（例えばＥｔｈｙｌ ＩＳＯ ｅｉｇｈｔｅｅｎ ａｌｃｏｈｏｌやＰｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｅｔｈｅｒ）、防腐剤、調味添加剤（例えば薄荷油或いは天然甘味剤、或いはサッカリン或いはその他人工甘味剤）及び類似品を添加することができる。適切であれば、内服薬の剤量単位製剤を微カプセル化或いは湿布或いは顆粒を内含した集合物、蝋或いは類似物で製造し、希釈時間を延長、持続させることもできる。また、脂質体の投薬システム（ＳＵＶ、ＬＵＶ或いはＭＬＶ）の形式で投薬しても良い。脂質体は様々なリン脂質、例えばコロステロール、ステアリンラミネ或いはホスファチジルコリンで形成される。

経皮投薬に適した薬物製剤は、投薬対象の表皮と緊密に長時間接触する独立貼片形剤として製造できる。局部投薬に適した薬物製剤として、軟膏剤、乳剤、ソリキッド、洗剤、粉末、溶剤、のり剤、半固形剤、噴霧剤、気化剤、湿布薬或いは油剤として製造できる。

本発明が解決する第五の技術的問題は、本発明のハマナツメ抽出物の薬用新用途である。

ハマナツメメタノール抽出物、ハマナツメエタノール抽出物、ハマナツメ酢酸エチル抽出物、ハマナツメベンジン抽出物を含む本発明のハマナツメ抽出物は抗繊維化、抗真菌活性、抗腫瘍活性を持っており、口腔及び消化器炎症及び／或いは潰瘍関連疾患の治療、及び双方向免疫調整作用を持っている。ハマナツメ抽出物は単独で或いはハマナツメ抽出物を主な活性成分とした薬物化合物で上記製薬の新しい用途として使える。

そのうち：
本発明のハマナツメ抽出物を抗腫瘍活性の薬物に応用する場合、その他の腫瘍治療性中医薬、西洋医療薬を混合使用することができる。例えば放射線治療、免疫療法、ＤＮＡ化学治療剤、細胞複製阻害の化学治療剤及び免疫調整薬物が含まれる。具体的にはＴｏｐｏI抑制剤、ＴｏｐｏII抑制剤、ＤＮＡキメラ薬とフリーラジカル発生剤、干渉細胞複製の化学治療剤、ＴＫ抑制剤、プロテアーゼ抑制剤と癌の表現タンパクと結合し細胞複製を減少させる抗体、タンパク或いは酵素抑制剤が含まれる。その他腫瘍を治療する中医薬、西洋医薬からイリノテカン、トポテカン、カンプトテシン及び類似物或いは代謝物、ドキソルビシン、エトポサイドグリコシド、テニポサイドグリコシド、ダウノルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、メトトレキサート、ミトマイシンC、シクロホスファミド、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ベロマイシン、5-フルオロウラシル、カペシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シトシンアラビノシドグリコシド、メルカプトプリン、チオグアニンヌクレオチド、ペントスタチン、ヒドロキシカルバミド、パクリタキセル、パクリタテルペノイド及び関連類似物、イマニチブミスレイト、ビンクリスチン、ビンかアルカロイド及び関連類似物、サリドマイド及び関連類似物、メシル酸イマチニブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、シノブホタリン、姫松茸、珍珠梅酢酸エチル抽出物、ライチ核水抽出物、当雷公藤紅素、ＰｏｌｙｐｏｒｕｓｕｓＢｅｌｌａｔｕｓ、ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐａｃｈｙｍａｎ、Ａｌｉｓｏｌ抽出濃縮液、甘草ペプチド、当帰総多糖、ソラレン、五味子多糖が含まれる。

本発明のハマナツメ抽出物を抗線維化薬物製造に応用する場合、その他線維化治療の中医薬、西洋医薬を同時に使用することができる。これらの抗線維化中医薬、西洋医薬には三七人参サポニン、リグストラジン、丹参、刺五加注射液、リグストラジン注射液、紅花注射液、銀杏フラボングリコシド、生脈、丹参注射液、双黄連、香丹注射液、益気活血顆粒、抗繊顆粒、肺康顆粒、百合固金丸、ｐｏｗｄｅｒ ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｇｅｃｋｏ ｇｉｎｓｅｎｇ ｐｉｌｌｓ、ゲンゲ、西紅花、生地黄、三七、アマチャヅル、姜黄、黄葵、アミグダリン、テトランドリン、大黄素、エンテカビル、ラミブジン、β-カロテン、ビタミンＥ、ホスファチジルコリン、Ｓ-腺グリコシドメチオニン、プロスタグランジン、プロスタグランジンＥ２、コルヒチン、エストロゲン、アンギオテンシンＩＩレセプター阻害剤、交感神経抑制剤、インターフェロン、プロリル-４-ヒドロキシラーゼ抑制剤、ヘパリン、シルビニン、ウルソデオキシコール酸が含まれる。上記の線維化には肺線維化、腎線維化、肝線維化、心線維化が含まれる。

本発明のハマナツメ抽出物が双方向免疫調節作用を持つ薬物に応用される場合、具体的に免疫機能低下及び／或いは自己免疫性疾患薬物への応用時、特に免疫機能異常による免疫機能低下及び／或いは自己免疫疾患の薬物の製造に応用される。上記の免疫機能異常による免疫機能低下には感冒、体のだるさ、腫瘍、エイズ等が含まれる。上記の免疫機能以外の自己免疫疾患にはリウマチ性関節炎、エリテマトーデス、硬皮症、甲状腺機能亢進、青少年糖尿病、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、潰瘍性結腸炎、慢性肝疾患等が含まれる。

上記の技術プロトコルのうち、ハマナツメ抽出物が抗腫瘍活性物として製薬される場合、ハマナツメ全体或いはそのうちの一部を薬剤の原料として使用でき、優先的に葉を原材料として使用する。

根、茎、葉全部或いはいかなる部分を含むハマナツメ全体を原料とする場合、ハマナツメ抽出物は以下の方法で得ることができる。新鮮品、或いは冷凍乾燥品のハマナツメの根、茎、葉全部或いはハマナツメ全体のいかなる部分を採取し、使用に備える。製造時に前記の処理済みハマナツメ新鮮品或いは冷凍乾燥品を有機溶媒で抽出する。或いはハマナツメ新鮮品或いは冷凍乾燥品を直接有機溶媒で抽出し、ハマナツメ抽出物を得る。有機溶媒を用いて抽出する方法は浸漬法、回流法、濾過法等の本分野で一般的な抽出方法を使用する。

上記のハマナツメは有機溶剤で処理する前に優先的に新鮮品或いは冷凍乾燥品を選択する。

上記の有機溶剤はメタノール、エタノール、イソアルコール、酢酸エチル、ベンジン等で、優先的に５０−９５％のエタノールを選択し、最優先に９５％のエタノールを使用する。

ハマナツメ抽出物は優先的に以下の方法で製造する：
新鮮なハマナツメ全体を採取し、８−１０倍量の９５％エタノールに１日浸漬し、その後ハマナツメを粉砕し、さらに６−１０倍量の９５％エタノールに２−３日浸漬する。抽出液を収集し、減圧して溶液を回収する。得られた抽出物濃縮液を乾燥させることでハマナツメエタノール抽出物を得る。そのうち、乾燥方法は減圧乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥、マイクロウェイブ乾燥に限定されない。

更に優先的には新鮮なハマナツメ茎葉を選択し、８倍量の９５％エタノールに１日浸漬させ、ハマナツメを粉砕する。さらに１０倍量の９５％エタノールで抽出し、回流抽出し、抽出液を回収する。６０℃下で減圧し、エタノールを回収し、抽出物の濃縮液を得る。乾燥後、ハマナツメメタノール抽出物を得ることができる。

さらに、ハマナツメエタノール抽出物を水に分散させた後、ベンジン、酢酸エチルを順に使って抽出し、濃縮後に乾燥させることでベンジン抽出物或いは酢酸エチル抽出物を得ることができる。

詳細なエタノール抽出物のステップとして、
（１）ハマナツメ葉片を採取し、５−１５倍量の５０％−９５％エタノールに浸漬する。
（２）葉片を粉砕し、５−１５倍量の５０％−９５％のエタノールに浸漬し、エタノール溶性成分を抽出する。
（３）抽出液を収集し、３０−７０℃下で減圧し、エタノール臭がしなくなるまでエタノールを回収し、抽出物を得る。
（４）抽出物濃縮液を更に冷凍乾燥させ、ハマナツメ葉片アルコール抽出物を得る。

さらに、上記の中医薬抽出物はベンジン或いは酢酸エチルを使って抽出処理を行う。中医薬抽出物はベンジン、酢酸エチル、ブタノールによって抽出し、回収した溶剤を冷凍乾燥し、３つの極性部位の抽出物を得る。いずれもイソアルコールで溶解し、それぞれの腫瘍細胞に対する抑制効果を測定したところ、該中医薬抽出物のベンジン部分と酢酸エチル部分とに良好な抗腫瘍活性が認められ、ブタノール抽出部位には抗腫瘍活性が認められなかった。酢酸エチル部位の抗腫瘍活性が最も良かった。

さらに、上記ハマナツメ抽出物の主な成分には三テルペノイド類、フラボン類、アルカロイド類及びクマリン類が含まれる。

上記の技術プロトコルにおいて、該ハマナツメ抽出物を抗線維化薬物に応用した場合、ハマナツメ植物全体或いは任意の一部を原材料にする場合、優先的に葉を原材料とする。

根、茎、葉全部或いはハマナツメ全体の任意の一部を原材料にする場合、ハマナツメ抽出物は以下の方法で得られる。新鮮品或いは冷凍乾燥した根、茎、葉全部或いはハマナツメ全体の任意の一部を準備し、使用時に上記の予備処理したハマナツメ新鮮品或いは冷凍乾燥品を有機溶媒に浸漬して抽出する。或いはハマナツメ新鮮品又は冷凍乾燥品を直接有機溶媒に浸漬し、ハマナツメ抽出物を得る。有機溶媒抽出の方法は浸漬法、回流法、濾過法等に限らず、本分野の一般的な抽出方法を使用してもよい。

上記のハマナツメに有機溶媒処理を行う場合、優先的に新鮮品或いは冷凍乾燥品を使用する。

上記の有機溶剤はメタノール、１０−１００％エタノールから優先的に選び、優先的に９５％のエタノールを選択する。

ハマナツメ抽出物は以下の方法で優先的に製造する。新鮮なハマナツメ全体を採取し、８−１０倍量の９５％エタノールで１日浸漬し、ハマナツメを粉砕し、さらに６−１０倍量の９５％エタノールに２−３日浸漬し、抽出液を採取し、減圧して溶剤を回収することで、抽出物の濃縮液を得る。これを乾燥させることでハマナツメエタノール抽出物を得る。このときの乾燥方法は減圧乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥、マイクロウェイブ乾燥に限らない。

優先的に新鮮なハマナツメ茎葉を選択し、８倍量の９５％エタノールに１日浸漬し、ハマナツメを粉砕し、１０倍量の９５％エタノールで抽出し、回流抽出する。抽出液を収集し、６０℃下で減圧し、アルコール臭がしなくなるまでエタノールを回収する。得られた抽出濃縮液を乾燥させた後ハマナツメエタノール抽出物を得る。

優先的に新鮮なハマナツメ茎葉を選択し、８倍量のメタノールに１日浸漬し、ハマナツメを粉砕、１０倍量のメタノールで抽出し、回流抽出する。抽出液を収集し、６０℃下で減圧し、アルコール臭がしなくなるまでメタノールを回収する。得られた抽出濃縮液を乾燥させた後ハマナツメメタノール抽出物を得る。

更に説明すると、ハマナツメエタノール抽出物を水分散させた後、ベンジン、酢酸エチルで抽出し、濃縮後乾燥させることでベンジン抽出物或いは酢酸エチル抽出物を得ることができる。

上記技術プロトコルにおいて、該ハマナツメ抽出物で抗真菌薬物を製造する場合、ハマナツメ全体或いはその一部を原材料とし、優先的に葉を原材料とする。

ハマナツメ抽出物の製造方法：
ハマナツメ全体或いはその任意の一部を採取し、ハマナツメの体積の１−２０倍量のメタノール或いはエタノールし、或いはメタノール或いはエタノール抽出物に対して酢酸エチル或いはベンジンで抽出する。抽出液を濃縮後乾燥させることで、ハマナツメ抽出物を製造できる。

前述したハマナツメは優先的に新鮮品、冷凍乾燥品或いはメタノール或いはエタノール処理をしたサンプルを使用する。前述した抽出方法は浸漬、回流、濾過である。前述した乾燥方法は減圧乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥或いはマイクロウェイブ乾燥である。

前記で製造したハマナツメ抽出物にはテルペノイド類、フラボン類、アルカロイド類、クマリン類及びテルペノイド類、フラボン類、アルカロイド類、クマリン類のグリコシド類と単体とが含まれる。

前述のハマナツメ抽出物の各種製剤にはハマナツメ抽出物タブレット、顆粒剤、軟膏剤、凝固剤、塗膜剤、湿布剤、洗剤と噴霧剤が含まれる。

本発明において、ハマナツメ抽出物の抗真菌活性と各種製剤への抗真菌活性の応用とを提供する。前述したハマナツメ抽出物はハマナツメメタノール、エタノール、酢酸エチル、ベンジン或いは類似溶媒抽出物である。ハマナツメ新鮮品、冷凍乾燥品、メタノール（エタノール）或いはその他の有機溶媒予備処理したサンプルを原料とし、有効成分の安定性を確保する。

上記技術プロトコルにおいて、該ハマナツメ抽出物を免疫機能低下或いは／及び自己免疫性疾患の薬物に応用する場合、ハマナツメ全体或いはその一部を薬剤の原料として使用し、優先的に葉を薬剤の原料とする。

ハマナツメ抽出物の製造方法は以下の通り。ハマナツメ全体或いは一部を採取し、ハマナツメの体積の１−２０倍量のメタノール或いはエタノールで採取し、或いはメタノール或いはエタノール抽出物に対して酢酸エチル或いはベンジンで抽出する。抽出液を濃縮後乾燥させ、ハマナツメ抽出物を製造できる。

前述したハマナツメは優先的に新鮮品、冷凍乾燥品或いはメタノール或いはエタノール処理をしたサンプルを使用する。前述した抽出方法は浸漬、回流、濾過である。前述した乾燥方法は減圧乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥或いはマイクロウェイブ乾燥である。

前記で製造したハマナツメ抽出物にはテルペノイド類、フラボン類、アルカロイド類、クマリン類及テルペノイド類、フラボン類、アルカロイド類、クマリン類のグリコシド類と単体とが含まれる。

前述のハマナツメ抽出物の各種製剤にはハマナツメ抽出物タブレット、顆粒剤、軟膏剤、凝固剤、塗膜剤、湿布剤、洗剤及び噴霧剤が含まれる。

前述したハマナツメ抽出物の応用において、免疫機能低下関連疾患或いは／及び自己免疫性疾患の薬物の製造に、ハマナツメ抽出物は単独で或いはハマナツメ抽出物を主な活性成分として薬物構成や治療免疫機能低下関連疾患或いは／及び自己免疫性疾患の薬物に組み合わせて、応用できる。

上記技術プロトコルにおいて、該ハマナツメ抽出物を口腔及び消化器炎症或いは対潰瘍の薬物に応用する場合、ハマナツメ全体或いはその一部を薬剤の原料とし、優先的に葉を薬剤の原料とする。

ハマナツメ抽出物の製造方法は以下の通り：
ハマナツメ全体或いは一部を採取し、ハマナツメの体積の１−２０倍量のメタノール或いはエタノールで抽出し、或いはメタノール或いはエタノール抽出物に対して酢酸エチル或いはベンジンで抽出する。抽出液を濃縮後乾燥させることで、ハマナツメ抽出物を製造できる。製造したハマナツメ抽出物にはテルペノイド類、フラボン類、アルカロイド類、クマリン類及テルペノイド類、フラボン類、アルカロイド類、クマリン類のグリコシド類と単体とが含まれる。

前述したハマナツメは優先的に新鮮品、冷凍乾燥品或いはメタノール或いはエタノール処理をしたサンプルを使用する。前述した抽出方法は浸漬、回流、濾過である。前述した乾燥方法は減圧乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥或いはマイクロウェイブ乾燥である。

前述のハマナツメ抽出物の各種製剤にはハマナツメ抽出物タブレット、顆粒剤、軟膏剤、凝固剤、塗膜剤、湿布剤、洗剤及び噴霧剤が含まれる。

ハマナツメ抽出物は単独で或いはハマナツメ抽出物を主な活性成分として薬物と組み合わせて、口腔消化器或いは／及び潰瘍薬物に応用することができる。

以下に実例を通した具体的な実施方法を紹介する。本発明の上記内容に対してさらに詳細な説明を行う。説明は本発明を制限しない。

以下は本発明のハマナツメ抽出物の成分研究である。
提供したサンプル試液の配合：
抽出物のサンプル１ｇを採取し、２５ｍｌの無水エタノールに溶かし、遠心分離する。上澄み液２ｍｌを採取し、無水エタノールで５倍に希釈する。最終濃度は０．００８ｇ／ｍｌである。

（１）三テルペノイド類成分の検査
Ａ．Ｌ−Ｂ反応
サンプルを無水酢酸中に溶かし、濃硫酸-無水酢酸（１：２０）を数滴加え、黄色＞赤＞紫＞青等の変化を確認し、最後色あせることを確認する。これは三テルペノイド類化合物が含まれていることを表している。
Ｂ．Ｋａｈｌｅｎｂｅｒｇ反応
サンプルのクロロホルム或いはアルコール溶液を濾紙の上にたらし、２０％の五塩化アンチモンのクロロホルム溶液（或いは五塩化アンチモンが飽和したクロロホルム溶液）を吹きかけ、乾燥させた後６０−７０℃に加熱し、青くなった場合、三テルペノイド類化合物が含まれていることを示す。
Ｃ．Ｒ−Ｈ反応
サンプル溶液を濾紙の上にたらし、２５％トリクロロ酢酸エタノール溶液を吹きかけ、１００℃まで加熱して、赤色を呈し、少しずつ紫色に変化すれば、三テルペノイド類化合物が含まれていることを示す。
Ｄ．Ｓａｌｋｏｗｋｉ反応
サンプルをクロロホルムに溶かし、濃硫酸を加えたあと、硫酸層で赤色或いは青色を示し、クロロホルム層に蛍光色が出現すれば、三テルペノイド類化合物が含まれていることを示す。
Ｅ．Ｔｓｈμｇａｅｆｆ反応
サンプル溶液を無水酢酸に溶かし、塩化アセチル数滴及び塩化亜鉛結晶を数個加え、微加熱して淡い赤色或いは紫色を呈すれば、三テルペノイド類化合物が含まれていることを示す。

（２）フラボン類成分の検査
Ａ．塩酸-マグネシウム粉末還元反応（還元反応）
少量のサンプルを１ｍｌエタノール中にとかし、少量のマグネシウム粉末と濃塩酸を加え、容器を振って液体の色を観察する。赤紫色になった場合、フラボン類化合物が含まれていることを示す。
Ｂ．三塩化アルミニウム反応（金属イオンの絡合反応）
ガラス棒でサンプル溶液をすくい、濾紙に塗る。風乾させ、１％の三塩化アルミニウムエタノール溶液を吹きかけ、乾燥させ、観察する。紫外線ライト下で鮮明な黄色になった場合、フラボン類化合物が含まれていることを示す。
Ｃ．三塩化鉄反応（金属イオンの絡合反応）
ガラス棒でサンプル溶液をすくい、濾紙に塗る。風乾させ、３％の三塩化鉄エタノール溶液を吹きかけ、乾燥させると、暗い青色の蛍光斑点が現れ、これにアンモニアを吹きかけると茶色の蛍光斑点になった場合、フラボン類化合物が含まれていることを示す。
Ｄ．アルカリ性試験剤
ガラス棒でサンプル溶液をすくい、濾紙にぬる。乾燥させた後、水酸化ナトリウム水溶液を吹きかけるか、アンモニア蒸気中に曝露し、蛍光灯下で観察すると、アンモニア蒸気がサンプルの色を黄色に変色させるならば、フラボン類化合物が含まれていることを示す。

（３）アルカロイド類成分の検査
Ａ．ドラーゲンドルフ法
１．次硝酸ビスマス０．８５ｇを無水酢酸１０ｍｌと４０ｍｌの水に溶かす。２．ヨウ化カリウム８ｇを２０ｍｌの水に溶かす。溶液１と溶液２を等量混合し、遮光瓶に移し貯蔵液とする。使用前に１ｍｌの貯蔵液、４ｍｌの無水酢酸と１２ｍｌの水と混合する。サンプル溶液を前述の試験溶剤に加えると、赤茶色になり、蒸留水を加え振ると沈殿が見られるならば、アルカロイド類化合物が含まれていることを示す。
Ｂ．ヨード-ヨウ化カリウム（Ｗａｇｎｅｒ）法
ヨード１ｇとヨウ化カリウム１０ｇを５０ｍｌの水に溶かし、２ｍｌの酢酸を加え、水を１００ｍｌまで加える。上記試験剤を適量採取し、１ｍｌのサンプル溶液を加えて茶色になった場合、アルカロイド類化合物があることを示す。
Ｃ．タングストケイ酸（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）法
５ｇのタングストケイ酸を１００ｍｌの水に溶かし、濃塩酸少量を加えｐＨ＝２前後に調整する。上記試験剤を適量採取し、１ｍｌのサンプル液を加え褐色になった場合、アルカロイド類化合物が含まれていることを示す。

（４）クマリン類成分の検査
Ａ．ヒドロキサム酸鉄反応
１ａ．塩酸ヒドロキシルアミン２０ｇを５０ｍｌの水に溶かし、エタノールを用いて２００ｍｌに希釈し、冷蔵する。１ｂ．水酸化カリウム５０ｇを少量の水に溶かし５００ｍｌのエタノールを加える。２．塩化鉄（ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）１０ｇを２０ｍｌの３６％の塩酸溶液中に溶かし、ジエチルエーテル２００ｍｌを加え、混合し、密封容器に保存する。使用時に試液１ａと１ｂを１：２の割合で混合し、沈殿物を濾過し、濾液を冷蔵庫に保管する。ガラス棒でサンプルをすくい取り濾紙に塗り、ａｂ混合液を噴霧し、乾かし、再度試液２を噴霧した時、赤色を呈すれば、クマリン類化合物を含まれていることを示す。
Ｂ．ジアゾ化反応
１．２-ニトロアニリン０．３５ｇを濃塩酸５ｍｌに加え、水を５０ｍｌまで加える。
２．亜硝酸ナトリウム５ｇに水５０ｍｌを加え、１、２液を等量採取し、コールドウォーターバス内で混合する。少量のサンプル液を採取し、ジアゾ化試験剤を加え、赤オレンジ色を呈した場合、クマリン類化合物が含まれていることを示す。
上記の研究により、本発明ハマナツメ抽出物の主な成分にはフラボン類、テルペノイド類、アルカロイド類、クマリン類、また、上記のフラボン、テルペノイド、アルカロイド、クマリンのグリコシド体及び単体成分の他に多糖類和セルロースが含まれていることが分かった。

Ｉ．ハマナツメ葉抽出物の抗腫瘍活性
１．ハマナツメ葉片抽出
（１）ハマナツメ新鮮葉１ｋｇを採取し、８−１０倍量の９５％エタノールに１−２日浸漬（作用：１．新鮮な葉の活性酵素を無効化し、有効成分の破壊を防ぐ、２．新鮮葉の硬度を高め、粉砕に有利にする）し、新鮮葉を粉砕する。再度１０倍量の９５％エタノール（６０−１００％のエタノール抽出）で３日間浸漬し、エタノール溶性成分を抽出する。抽出物を収集し、３０−４０℃にてエタノールをアルコール臭がない状態まで回収し、得た抽出物濃縮液をさらに冷凍乾燥させることで、ハマナツメの新鮮葉エタノール抽出物を得る。
（２）残滓を陰干しし、８−１０倍の水で３日間浸漬し水溶性成分を採取する。採取液を収集し、冷凍乾燥させることでハマナツメ新鮮葉水抽出物を得る。
（３）ハマナツメ葉乾燥品（室温自然乾燥）を上記の方法で抽出し、ハマナツメ葉乾燥エタノール抽出物と水抽出物を得る。
（４）ハマナツメ新鮮葉をエタノール浸漬し、陰干しすることで、干し葉片を得る。得られたハマナツメをエタノール浸漬させ、陰干したものを上記の方法で抽出し、エタノール及び水抽出物を得る。

２．抗腫瘍活性
ハマナツメ葉片抽出物の抗腫瘍活性研究を比較した。成長期の多種腫瘍細胞を採取（子宮頸癌株Ｈｅｌａ、ヒト肝癌細胞株ＳＭＭＣ−７７２１、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９、ヒト結腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２、白血病細胞株ＫＳ５６２、胃癌細胞株ＭＧＣ−８０３を使用）し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１０％の胎牛血清を含む相応の培養液で沈殿細胞の濃度を１×１０^５個/ｍｌの細胞懸濁液に調整した後、細胞を９６ウェルの培養プレートに接種する。各ウェルに細胞懸濁液２００μｌ注入し、その後一定濃度の無菌抽出物溶液を加える。各ウィルの抽出物最終濃度を０．０２、０．１、０．２、０．４、０．５、０．８、１．０、２．０ｍｇ／ｍｌにし、混合後３７℃、５％ＣＯ_２の培養器の中で２４時間培養したあと、培養液を吸い出しＰＢＳで二度洗浄する。再度各ウィルに５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴリン酸緩衝液２９μｌと１５０μｌの培養液を加え、同様の条件下で４時間培養し、培養を終了する。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養プレートのウィル内の培養液を捨て、各ウィルに１５０μｌのＤＭＳＯを加え、１０分間振動させ、形成されたホルマザン顆粒を十分に溶解させた後、酵素計測器で吸光度を計測する。選択する波長は５７０ｎｍである。抽出物の腫瘍細胞に対するＩＣ５０を計算した。結果は表１を参照する。

結果からわかるように、ハマナツメ新鮮葉エタノール抽出物及びハマナツメ葉片のエタノール浸漬及び陰干しエタノール抽出物は良好な腫瘍抑制作用を持つが、その他の抽出物は抗腫瘍活性を持たなかった。分析の結果、活性抽出物の溶解性と安定性に原因があると思われる。

３．ハマナツメ葉片エタノール抽出物の成分含有量測定
（１）三テルペノイド類成分含有量の測定
本サンプル粉末を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、１０ｍｌ容器内に移す。酢酸エチルを一定値まで加え、精密に４ｍｌの溶液を採取し、１０ｍｌの容器に移す。溶剤を揮発させた後、５％バニリン-無水酢酸０．４ｍｌ、過塩素酸１．６ｍｌを加え混ぜ合わせる。酢酸エチルで一定値まで希釈し、７０℃の恒温ウォーターバスで１５分加熱し、冷却して室温に戻す。１０ｍｌの容器に移し、酢酸エチルを一定値まで加えて希釈し、混ぜ合わせる。５４０ｎｍの波長で吸光度を計測し、サンプル溶液中の総三テルペノイド含有量（三テルペノイドはｃｅａｎｏｔｈｉｃ ａｃｉｄとして計算する）を試算する。結果、１ｇのエタノール抽出物には三テルペノイド類は０．０５２±０．０１０ｇ含まれていた。
（２）フラボン類成分含量測定
本サンプル粉末を０．１ｇずつ、３サンプル（２ｇの生薬に相当）精密に採取し、５０ｍｌ容器内に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷したエタノールを一定値まで加え、混ぜ合わせる。精密に１ｍｌ採取し、１０ｍｌの容器に移し、水を一定量加え、混ぜ合わせる。精密に３ｍｌ採取し、２５ｍｌの容器に移し、吸光度を測定し、サンプル溶液中の総フラボン含有量（フラボンの量はルチンで計算する）を算出する。結果、１ｇのエタノール抽出物にはフラボンが０．３２５±０．０４３ｇ含まれていた。
（３）アルカロイド類成分含有量測定
サンプル粉末を１ｇずつ、３サンプル精密に採取し、密封できるフラスコに移す。１８％のアンモニア水２ｍｌで１時間湿潤させ、ジエチルエーテル：クロロホルム：エタノール（２４：８：２．５）の混合溶液３０ｍｌを加える。超音波で２０分抽出し、傾けて上澄み液をフラスコから出し、再度上記混合溶剤３０ｍｌを加え、３０分冷蔵する。再度超音波振動で２０分抽出し、濾過し、同じ溶剤１５ｍｌで３回残滓と濾紙を洗浄する。濾液と併せてフラスコ内に移す。６０℃のウォーターバスで乾燥させ、正確に１０ｍｌ採取したクロロホルムで完全に溶かし、再度正確に５ｍｌを採取し、漏斗に移す。６ｍｌのクロロホルムを加え、２ｍｌの緩衝液（ｐＨ＝５．０、０．２Ｍフタル酸水素カリウム緩衝液）を加える。１ｍｍｏｌ・Ｌ−１のＢＴＢ溶液で滴定しながら混ぜ合わせ、終点に近付いたらクロロホルム層を分離させ、再度新たにクロロホルム５ｍｌを加え、再度滴定しながら混ぜ合わせる。静止させ分離させ、水の層が黄色くなり始めたら終点である。アルカロイド総数（アルカロイドはハマナツメアルカリＢで計算する）を計算した。結果、１gのエタノール抽出物のアルカロイド類含有量は０．０２８±０．００７ｇであった。
（４）クマリン類成分含有量測定
測定後のクマリン類成分含有量：１％−１０％。

４．ハマナツメ葉片エタノール抽出物の３つの極性部位の抗癌活性研究
ハマナツメ葉片エタノール抽出物をベンジン、酢酸エチル、ｎ−ブチルアルコールの順で抽出し、溶剤を回収した後冷凍する。３つの極性部位の抽出物はイソアルコールで溶解させる。成長期の各種癌細胞を採取（子宮頸癌株Ｈｅｌａ、ヒト肝癌細胞株ＳＭＭＣ−７７２１、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９、ヒト結腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２、白血病細胞株Ｋ５６２、胃癌細胞株ＭＧＣ−８０３を使用）し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１０％の胎牛血清を含む相応の培養液で沈殿細胞の濃度を１×１０個／ｍｌの細胞懸濁液に調整した後、細胞を９６ウェルの培養プレートに接種する。各ウェルに細胞懸濁液２００μｌ注入し、その後一定濃度の無菌抽出物溶液を加える。各ウィルの抽出物最終濃度を０．０２、０．１、０．２、０．４、０．５、０．８、１．０、２．０ｍｌにし、混合後３７℃、５％ＣＯ_２の培養器の中で２４時間培養したあと、培養液を吸い出しＰＢＳで二度洗浄する。再度各ウィルに５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴリン酸緩衝液２０μｌと１５０μｌの培養液を加え、同様の条件下で４時間培養し、培養を終了する。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養プレートのウィル内の培養液を捨て、各ウィルに１５０μｌのＤＭＳＯを加え、１０分間振動させ、形成されたホルマザン顆粒を十分に溶解させた後、酵素計測器で吸光度を計測する。選択する波長は５７０ｎｍである。抽出物の腫瘍細胞に対するＩＣ５０を計算した。結果は表２を参照する。結果からハマナツメ葉片抽出物のベンジン部分と酢酸エチル部位の活性が良く、特に酢酸エチル部位の活性が良かった。ｎ−ブチルアルコールの採取部位は実験濃度範囲内においてＩＣ５０を計測できなかった。我々はさらに酢酸エチルの部分について研究を進める予定である。

５．酢酸エチル極性部位の対ＥＡＣマウスの作用効果研究
腫瘍Ｓ１８０を移植したマウスに対する抑制作用：
昆明種マウスの右腋皮下にＳ１８０懸濁液０．２ｍｌ（約１×１０^６の腫瘍細胞）を上記接種し、接種２４時間後、マウスを分類、ナンバリングし、対照グループとして１０匹、及び実験グループを計３グループに分け、それぞれ大量グループ、中量グループ、低量グループとして各１０匹を振り分け、それぞれのグループに対して胃へのカテーテル投薬を１日１回、計１４回行った。陽性対照グループにはシクロホスファミド（８５ｍｇ／ｋｇ）を毎日胃へのカテーテル投薬を行った。投薬量、回数、時間は実験グループと同じ条件で行った。最終投薬後２４時間後に実験動物を殺処分し、体重計量後、完全に腫瘍を剥離し計量して腫瘍率を調べた。結果は表３を参照する。

II．ハマナツメ全体抽出物の抗腫瘍活性
（実施例１）
ハマナツメ全体１ｋｇを採取し、８倍量の９５％エタノールに１日浸漬し、粉砕する。再度１０倍量の９５％エタノールに２日間浸漬し、抽出液を採取する。５０℃下で減圧し、アルコール臭がなくなるまでエタノールを回収し、乾燥後ハマナツメエタノール抽出物を得る。

（実施例２）
ハマナツメ茎葉１ｋｇを採取し、１０倍量の９５％エタノールに１日浸漬し、粉砕する。再度１０倍量の９５％エタノールを加え回流抽出し、抽出液を得る。６０℃下で減圧し、アルコール臭がなくなるまでエタノールを回収し、乾燥後ハマナツメエタノール抽出物を得る。ハマナツメエタノール抽出物に水を加え分散させた後、ベンジン、酢酸エチルで抽出し、ハマナツメベンジン抽出物と酢酸エチル抽出物を得る。

（実施例３）
ハマナツメ全体１ｋｇを採取し、１０倍量のメタノールに１日浸漬し、粉砕する。再度８倍量のメタノールで２日間浸漬し、抽出液を得る。４０℃下でアルコール臭がなくなるまでメタノールを回収し、乾燥後ハマナツメメタノール抽出物を得る。ハマナツメメタノール抽出物に水を加え、ベンジン、酢酸エチルで順次抽出し、ハマナツメベンジン抽出物と酢酸エチル抽出物を得る。

（実施例４）
実施例２のハマナツメベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、１０ｍｌの容器に移す。酢酸エチルを一定量加え、精密に４ｍｌ溶液を採取し、１０ｍｌ容器内に移す。溶剤が揮発したあと、５％のバニリン-無水酢酸０．４ｍｌ、過塩素酸１．６ｍｌを加え混ぜ合わせ、酢酸エチルで一定量まで希釈し、７０℃の恒温ウォーターバスで１５分加熱したあと、室温まで冷却する。１０ｍｌの容器に移し酢酸エチルで一定量まで希釈し、混ぜ合わせ、５４０ｎｍの波長で吸光度を計測する。試験液の三テルペノイド含有量（三テルペノイドはｃｅａｎｏｔｈｉｃ ａｃｉｄとして計算する）を算出する。１ｇのハマナツメ抽出物に含まれる三テルペノイド類成分の含有量は２３ｍｇであった。
実施例２のハマナツメベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、５０ｍｌの容器に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷し、エタノールを一定量加え混ぜ合わせる。精密に１ｍｌ採取し、１０ｍｌの容器に移す。水を一定量入れ混ぜ合わせる。精密に３ｍｌ採取し、２５ｍｌの容器に移す。５１０ｎｍの波長で吸光度を計測し、サンプル中のフラボン含有量（フラボン量はルチンで計算する）を計測する。結果１ｇのハマナツメ抽出物にはフラボンが合計１０３ｍｇ含まれていた。
実施例２のハマナツメベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、コルク付きのフラスコに移す。１８％のアンモニア水で１時間湿潤させ、ジエチルエーテル：クロロホルム：エタノール（２５：８：２．５）の割合の混合溶剤３０ｍｌを加え、超音波抽出を２０分行う。フラスコを傾け、上澄み液を破棄し、再度上記の混合剤を３０ｍｌ加え、３０分放置する。再度超音波振動で２０分抽出し、濾過する。同じ溶剤１５ｍｌで残滓と濾紙を３回洗浄し、フラスコ内の濾液と合わせる。６０℃のウォーターバスで乾燥させ、正確に採取した１０ｍｌのクロロホルムを使って全て溶かし、正確に５ｍｌ採取し、漏斗内に移す。６ｍｌのクロロホルム、２ｍｌの緩衝液(ｐＨ＝５．０，０．２Ｍフタル酸水素カリウム緩衝液)を加える。１ｍｍｏｌ・Ｌ−１のＢＴＢで滴定し、常に揺らし混ぜながら終点に近づいたときにクロロホルム層を分離し、再度新しいクロロホルムを５ｍｌ加え、滴定を続けながら揺らし混ぜる。静止させ分離させて水が黄色くなれば終点である。アルカロイドの総含有量を調べる（アルカロイドはハマナツメアルカリＢで計算する）。結果、１ｇのハマナツメ抽出物のアルカロイド含有量は２１ｍｇであった。
実施例２のハマナツメベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、５０ｍｌの容器に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷し、エタノールを一定量加え混ぜる。精密に１ｍｌを採取し、１０ｍｌの容器に移す。７０％のエタノールを一定量加え、混ぜ合わせる。３ｍｌを精密に採取し、２５ｍｌの容器に移す。３４０ｎｍ波長で吸光度を測定する。溶液中のクマリン含有量を調べる（クマリン含有量はウンベリフェロンの量で計算する）。結果、１ｇのハマナツメ抽出物にはクマリンが１０．２ｍｇ含まれていた。

（実施例５）
実施例２のハマナツメ酢酸エチル抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、１０ｍｌの容器に移し、酢酸エチルを加える。再度精密に４ｍｌ採取し１０ｍｌの容器に移す。溶剤を揮発させた後、５％のバニリン-無水酢酸０．４ｍｌ、過塩素酸１．６ｍｌを加えて混ぜ合わせ、酢酸エチルを一定量入れて希釈する。７０℃の恒温ウォーターバスで１５分加熱し、室温まで冷ます。１０ｍｌの容器に移し、酢酸エチルを加えて希釈し、混ぜ合わせる。５４０ｎｍの波長で吸光度を計測し、サンプル中の三テルペノイド含有量を算出する（三テルペノイドはｃｅａｎｏｔｈｉｃ ａｃｉｄとして計算する）。結果、１ｇのハマナツメ抽出物には三テルペノイド類成分が１０８ｍｇ含まれていた。
実施例２のハマナツメ酢酸エチル抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し、５０ｍｌの容器に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷ます。エタノールを一定量いれ、混ぜ合わせる。精密に１ｍｌを採取し、１０ｍｌの容器に移す。水を一定量加え、混ぜ合わせる。精密に３ｍｌ採取し、２５ｍｌの容器に移し、５１０ｎｍの波長で吸光度を計測する。試験サンプル溶液中のフラボン含有量を調べる（フラボン量はルチンで計算）。その結果１ｇのハマナツメ抽出物にはフラボンが合計で４９７ｍｇ含まれていた。
実施例２のハマナツメ酢酸エチル抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し、コルク付きのフラスコに移す。１８％のアンモニア水で１時間湿潤させる。ジエチルエーテル：クロロホルム：エタノール（２５：８：２．５）の混合液３０ｍｌを加える。超音波抽出を２０分行い、濾過する。同様の溶剤で１５分間３回残滓と濾紙を洗浄し、フラスコ内に濾過する。６０℃のウォーターバスで乾燥させ、１０ｍｌのクロロホルムで全部溶かし、再度正確に５ｍｌ採取し、漏斗に移し、６ｍｌのクロロホルム、２ｍｌ緩衝液(ｐＨ＝５．０，０．２Ｍフタル酸水素カリウム緩衝液)を加える。１ｍｍｏｌ・Ｌ−１のＢＴＢで滴定し、つねに揺らし混ぜながら終点に近づいたときにクロロホルム層を分離し、再度新たにクロロホルムを５ｍｌ加え、滴定を続けながら揺らし混ぜる。静止させ分離させて水が黄色くなれば終点である。アルカロイドの総含有量を調べる（アルカロイドはハマナツメアルカリＢで計算する）。結果、１ｇのハマナツメ抽出物のアルカロイド含有量は１０７ｍｇであった。
実施例２のハマナツメベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し、５０ｍｌの容器に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷し、エタノールを一定量加え混ぜる。精密に１ｍｌを採取し、１０ｍｌの容器に移す。７０％のエタノールを一定量加え、混ぜ合わせる。３ｍｌを精密に採取し、２５ｍｌの容器に移す。３４０ｎｍ波長で吸光度を測定する。溶液中のクマリン含有量を調べる（クマリン含有量はウンベリフェロンの量で計算する）。結果、１ｇのハマナツメ抽出物にはクマリンが１８６ｍｇ含まれていた。

１．ハマナツメエタノール抽出物の体外抗腫瘍活性研究
成長期の各種癌細胞を採取（子宮頸癌株Ｈｅｌａ、ヒト肝癌細胞株ＳＭＭＣ−７７２１、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９、ヒト結腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２、白血病細胞株Ｋ５６２、胃癌細胞株ＭＧＣ−８０３を使用）し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１０％の胎牛血清を含む相応の培養液で沈殿細胞の濃度を１×１０^５個／ｍｌの細胞懸濁液に調整した後、細胞を９６ウェルの培養プレートに接種する。各ウェルに細胞懸濁液２００μｌ注入し、その後一定濃度の無菌抽出物溶液を加える。各ウィルの抽出物最終濃度を０．０２、０．１、０．２、０．４、０．５、０．８、１．０、２．０ｍｇ／ｍｌにし、混合後３７℃、５％ＣＯ_２の培養器の中で２４時間培養したあと、培養液を吸い出しＰＢＳで二度洗浄する。再度各ウィルに５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴリン酸緩衝液２０μｌと１５０μｌの培養液を加え、同様の条件下で４時間培養し、培養を終了する。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養プレートのウィル内の培養液を捨て、各ウィルに１５０μｌのＤＭＳＯを加え、１０分間振動させ、形成されたホルマザン顆粒を十分に溶解させた後、酵素計測器で吸光度を計測する。選択する波長は５７０ｎｍである。抽出物の腫瘍細胞に対するＩＣ５０を計算した。結果は表４を参照する。結果、ハマナツメ全体抽出物が良好な腫瘍抑制効果を示した。

２．実施例２の３種類のハマナツメ抽出物の体外抗腫瘍活性研究
実施例１のハマナツメエタノール抽出物に対して、順次、ベンジン、酢酸エチル、ｎ−ブチルアルコールを用いて抽出した。回収溶液は乾燥させ、ハマナツメベンジン、酢酸エチル、ｎ−ブチルアルコール抽出物のそれぞれについて、いずれもイソアルコールに溶解させる。成長期の各種癌細胞を採取（子宮頸癌株Ｈｅｌａ、ヒト肝癌細胞株ＳＭＭＣ−７７２１、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９、ヒト結腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２、白血病細胞株Ｋ５６２、胃癌細胞株ＭＧＣ−８０３を使用）し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１０％の胎牛血清を含む相応の培養液で沈殿細胞の濃度を１×１０^５個／ｍｌの細胞懸濁液に調整した後、細胞を９６ウェルの培養プレートに接種する。各ウェルに細胞懸濁液２００μｌ注入し、その後一定濃度の無菌抽出物溶液を加える。各ウィルの抽出物最終濃度を０．０２、０．１、０．２、０．４、０．５、０．８、１．０、２．０ｍｇ／ｍｌにし、混合後３７℃、５％ＣＯ_２の培養器の中で２４時間培養したあと、培養液を吸い出しＰＢＳで二度洗浄する。再度各ウィルに５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴリン酸緩衝液２０μｌと１５０μｌの培養液を加え、同様の条件下で４時間培養し、培養を終了する。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養プレートのウィル内の培養液を捨て、各ウィルに１５０μｌのＤＭＳＯを加え、１０分間振動させ、形成されたホルマザン顆粒を十分に溶解させた後、酵素計測器で吸光度を計測する。選択する波長は５７０ｎｍである。抽出物の腫瘍細胞に対するＩＣ５０を計算した。結果は表５を参照する。結果からハマナツメベンジン抽出物と酢酸エチル抽出物に良好な抗腫瘍活性が認められた。特に酢酸エチル部位が良く、ｎ−ブチルアルコール抽出物は実験濃度範囲内ではＩＣ５０を測定できなかった。

３．ハマナツメエタノール、メタノール、ベンジン及び酢酸エチル抽出物のＳ１８０マウスの影響
Ｓ１８０腫瘍細胞を８ｄ接種した健康状態が良好な腫瘍源マウスを採取し、腹部皮膚を消毒した後、腹水を採取し、無菌生理食塩水を利用し１：４（腹水体積：生理食塩水）の混合懸濁剤を準備する。１８−２０ｇのオスの昆明種マウス８２匹を体重毎にランダムに７グループに振り分け、それぞれモデル対照グループ（０．５％トラガカント）、陽性対照グループ（シクロホスミファミド、ＣＴＸ）、酢酸エチル抽出物少量投薬グループ、酢酸エチル抽出物大量投薬グループ、エタノール抽出物グループ、メタノール抽出物グループ、ベンジン抽出物グループとした。それぞれの右腋皮下に０．２ｍｌの前述した懸濁液を接種した。２時間後、モデル対照グループと薬物グループにそれぞれ被験物或いは懸濁剤の胃へのカテーテル投薬を毎日１回、１４日間連続で行った。陽性対照グループはＣＴＸの腹腔注射を隔日１回、計７回行った。最終投薬後２４時間後に頸椎脱臼でマウスを殺処分し、腫瘍を剥離、計量し、腫瘍抑制率を算出した。（（１−実験グループ平均腫瘍重量/モデル対照グループ平均腫瘍重量）＊１００％）、結果は表６を参照する。

結果、ハマナツメ全体抽出物の酢酸エチル抽出物１．６ｇ／ｋｇの胃管投薬は、Ｓ１８０のマウス体内の成長を明確に抑制でき、尚且つ１．６ｇ／ｋｇの投薬強度とシクロホスファミド４０ｍｇ／ｋｇの隔日腹腔投与はエタノール、メタノール、ベンジン抽出物４．８ｇ／ｋｇと同じように腫瘍重量減少、腫瘍抑止率ともに５０％を超えており、これら４種類の抽出物は比較的良い抗腫瘍活性を示している。

４．ハマナツメエタノール、メタノール、ベンジン及び酢酸エチル抽出物のＥＡＣマウスに対する影響
ＥＡＣを８ｄ接種した健康状況の良好なＥＡＣマウスを採取し、腹部皮膚を消毒後、腹水を抽出する。無菌食塩水を利用し懸濁液４×１０^６／ｍｌを準備する。１８−２０ｇのオスの昆明種マウス８２匹を体重毎に分け、７組にランダムで振り分ける。それぞれモデル対照グループ（０．５％トラガカント）、陽性対照グループ（シクロホスファミド、ＣＴＸ）、酢酸エチル抽出物低量投薬グループ、酢酸エチル抽出物大量投薬グループ、エタノール抽出物グループ、エタノール抽出物グループ、ベンジン抽出物グループとする。それぞれに腹腔内に前述した０．２ｍｌ懸濁液を接種する。２時間後、モデル対照グループ及び各薬物グループにそれぞれサンプル又は懸濁液を１日１回胃管投薬し、実験動物が瀕死するまで継続的に投薬を続ける。陽性対照グループの腹腔注射には隔日１回、ＣＴＸを計７回行った。動物が瀕死時には頸椎脱臼で処理し、瀕死時間は生存時間に含める。殺処分後に体重を図り、腹水を出し切り、再度体重を図る。その差を腹水の重量とする。結果は表７である。

実験結果として、ハマナツメ全体抽出物酢酸エチル抽出部は、０．４ｇ／ｋｇ及びそれ以上の投薬量の胃管投薬で、顕著にＥＡＣマウスの成長を抑制でき、動物の生存時間を延長できた。尚且つ１．６ｇ／ｋｇの投薬量の腹水抑制作用強度とシクロホスファミドとは類似しているが、後者は動物の生存時間を延長できず、一定のメリットを有していた。エタノール、メタノール、ベンジン抽出物の４．８ｇ／ｋｇも効果的に生存時間を延長し、腹水製造を抑制した。これら四種の抽出物は効果的な抗腫瘍活性である。

５．ハマナツメ酢酸エチル抽出物とパクリタキセル及びシノブホタリンの同時投薬によるＳ１８０マウスへの影響
Ｓ１８０を８ｄ接種した健康状況の良好な腫瘍源マウスを採取し、腹部皮膚を消毒したあと、腹水を採取し、無菌生理食塩水を利用し１：４（腹水体積：生理食塩水体積）の混濁液を準備する。１８−２０ｇのオス昆明種マウス８４匹を体重毎に分け、７組にランダムで振り分ける。それぞれモデル対照グループ（０．５％トラガカント）、陽性対照グループ（シクロホスファミド、ＣＴＸ）、酢酸エチル抽出物グループ、パクリタキセルグループ、シノブホタリン抽出物グループとパクリタキセル同時投薬グループと、シノブホタリン同時投薬グループに分け、それぞれ右側腋皮下に０．２ｍｌの前述混濁液を接種する。２ｈ後モデル対照グループと薬物グループにそれぞれ胃管投薬と静脈注射でサンプル或いは混濁液を毎日１回、連続１４日間行う。陽性対照グループ腹腔注射にはＣＴＸを隔日１回計７回行う。最終投薬後、２４時間で頸椎脱臼させ殺処分し、腫瘍を剥離し重量を図り、腫瘍抑制率を算出する（（１-実験組平均腫瘍重量/モデル対照グループ平均腫瘍重量）＊１００％）。結果は表８を参照する。

実験結果によれば、ハマナツメ全体酢酸エチル抽出物の０．４ｇ／ｋｇの胃管投薬では、Ｓ１８０のマウス体内成長に対して明確な抑制作用は見られなかった。パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ、シノブホタリン１ｍｌ／ｋｇは一定の効果を示した。しかし同投薬量のハマナツメ全体酢酸エチル抽出物をパクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ、シノブホタリン１ｍｌ／ｋｇを同時使用したところ、パクリタキセルの腫瘍抑制率より高い結果を示し、ハマナツメ全体抽出物とその他の抗腫瘍薬物との同時使用は該薬物の抗腫瘍薬効を高めることが分かった。

III．ハマナツメ抽出物の抗繊維化活性
（実施例１）
ハマナツメ全体１ｋｇを採取し、８倍量の９５％エタノールに１日浸漬した後、粉砕し、さらに１０倍量の９５％のエタノールに２日間浸漬し、抽出液を採取する。５０℃でアルコール臭がなくなるまでエタノールを減圧回収し、乾燥後ハマナツメエタノール抽出物を得る。

（実施例２）
ハマナツメ茎葉１ｋｇを、１０倍量の９５％エタノールに１日浸漬した後、粉砕し、さらに１０倍量の９５％エタノールを加え、回流抽出し、抽出液を回収する。ハマナツメエタノール抽出物に水を加えた後、ベンジン、酢酸エチルで抽出し、ハマナツメベンジン抽出物と酢酸エチル抽出物を得る。

（実施例３）
ハマナツメ全体１ｋｇを採取し、１０倍量のメタノールに１日浸漬した後、粉砕し、再度８倍量のメタノールに２日間浸漬し、抽出液を得る。４０℃下でメタノールを減圧回収し、乾燥後ハマナツメメタノール抽出物を得る。ハマナツメメタノール抽出物に水を加え、ベンジン、酢酸エチルで抽出したあと、ハマナツメベンジン抽出物と酢酸エチル抽出物を得る。

（実施例４）
実施例２のハマナツメベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、１０ｍｌ容器に移し、酢酸エチルを一定量まで追加し、精確に４ｍｌの溶液を採取し、１０ｍｌの容器に移し、溶剤を揮発させ、５％バニリン-無水酢酸０．４ｍｌ、過塩素酸１．６ｍｌを加え、混ぜ合わせ、酢酸エチルを規定量まで加え、７０℃の恒温ウォーターバスで１５分加熱する。室温まで冷まし、１０ｍｌの容器に酢酸エチルを規定量まで加え、５４０ｎｍの波長で吸光度を測定する。サンプル溶液中の三テルペノイド含有量（三テルペノイドはｃｅａｎｏｔｈｉｃ ａｃｉｄとして計算する）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物には三テルペノイド類成分が２３ｍｇ含まれていた。
実施例２のハマナツメベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し、５０ｍｌの容器に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷し、エタノールを一定量加え混ぜる。精密に１ｍｌを採取し、１０ｍｌの容器に移す。３ｍｌを精密に採取し、２５ｍｌの容器に移す。５１０ｎｍ波長で吸光度を測定し、溶液中のフラボン含有量を調べる（フラボン有量はルチンの量で計算する）。結果、１ｇのハマナツメ抽出物にはフラボンが１０３ｍｇ含まれていた。
実施例２のハマナツメベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し、コルク付きのフラスコ内に移す。１８％のクロロホルムで１時間湿潤させ、ジエチルエーテル：クロロホルム：エタノール（２５：８：２．５）の混合溶剤３０ｍｌを加える。２０分超音波抽出し、フラスコ内の上澄み液を採取し、さらに前述の混合溶剤３０ｍｌを加え、３０分冷蔵保存し、２０分超音波振動で抽出する。濾過した後１５ｍｌの同じ溶剤で残滓と濾紙を３回洗浄し、それらと濾液をフラスコ内に移す。６０℃のウォーターバスで乾燥させ、正確に１０ｍｌのクロロホルムですべてを溶解させ、再度正確に５ｍｌ採取し、漏斗に移す。６ｍｌのクロロホルムと２ｍｌの緩衝液（ｐＨ＝５．０，０．２Ｍフタル酸水素カリウム緩衝液）を加える。１ｍｍｏｌ・Ｌ−１のＢＴＢで滴定し、絶えず揺らし混ぜる。終点に近づいた後、クロロホルム層を分離し、再度新たにクロロホルム５ｍｌを加え、滴定しつつ絶えず揺らし混ぜあわせる。静止させて分離させ、水層が黄色くなったら終点である。アルカロイドの総含有量（ハマナツメアルカリＢをアルカロイドの含有量として計算する）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物にはアルカロイドが２１ｍｇ含まれていた。
実施例２のハマナツメベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し５０ｍｌ容器に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷却して、エタノールを規定量追加し、混ぜ合わせる。１ｍｌ精密に採取し、１０ｍｌの容器に移し、７０％エタノールを規定量加え、混ぜ合わせる。精密に３ｍｌ採取し、２５ｍｌの容器に移す。３４０ｎｍの波長で吸光度を測定する。サンプル中のクマリン含有量を調べる（クマリン含有量はウンベリフェロンの量で計算する）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物にはクマリンが１０．２ｍｇ含まれていた。

（実施例５）
実施例２のハマナツメ酢酸エチル抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、１０ｍｌの容器に移す。酢酸エチルを規定量まで加え、４ｍｌの溶液を精密に採取し１０ｍｌの容器に移す。溶剤を揮発させた後、５％のバニリン-無水酢酸０．４ｍｌ、過塩素酸１．６ｍｌを加え、酢酸エチルを規定量加えて希釈する。７０℃の恒温ウォーターバスで１５分加熱し、室温まで冷まし、１０ｍｌの容器に移す。酢酸エチルを規定量加えて希釈し、よく混ぜあわせ、５４０ｎｍの波長で吸光度を測定する。サンプル中の三テルペノイド含有量を算出する（三テルペノイドはｃｅａｎｏｔｈｉｃ ａｃｉｄとして計算する）。結果、１ｇのハマナツメ抽出物には三テルペノイド類成分が１０８ｍｇ含まれていた。
実施例２のハマナツメ酢酸エチル抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し５０ｍｌの容器に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷やす。エタノールを規定量加え、混ぜ合わせる。精密に１ｍｌ採取し、１０ｍｌの容器に移す。水を規定量加え、混ぜ合わせる。精密に３ｍｌ採取し、２５ｍｌの容器に移す。５１０ｎｍの波長の吸光度を計測してサンプル液中の総フラボン含有量を計測する（ルチンの量でフラボン量を測定する）。結果、１ｇのハマナツメ抽出物にはフラボンが４９７ｍｇ含まれていた。
実施例２のハマナツメ酢酸エチル抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し、コルクが付けられる容器に移す。１８％のアンモニア水２ｍｌで１時間湿潤させ、ジエチルエーテル：クロロホルム：エタノール（２４：８：２．５）の混合溶液３０ｍｌを加える。超音波で２０分抽出を行い、傾けて上澄み液をフラスコから出し、再度上記混合溶剤３０ｍｌを加え、３０分冷蔵する。再度超音波振動で２０分抽出し、濾過し、同じ溶剤１５ｍｌで３回残滓と濾紙を洗浄する。濾液と併せてフラスコ内に移す。６０℃のウォーターバスで乾燥させ、正確に１０ｍｌのクロロホルムで完全に溶かし、再度正確に５ｍｌを採取し、漏斗に移す。６ｍｌのクロロホルムを加え、２ｍｌの緩衝液（ｐＨ＝５．０、０．２Ｍフタル酸水素カリウム緩衝液）を加える。１ｍｍｏｌ・Ｌ−１のＢＴＢ溶液で滴定しながら混ぜ合わせ、終点に近付いたらクロロホルム層を分離させ、再度新たにクロロホルム５ｍｌを加え、再度滴定しながら混ぜ合わせる。静止させ分離させ、水の層が黄色くなり始めたら終点である。アルカロイド総数を計算した（アルカロイドはハマナツメアルカリＢで計算する）。結果、１ｇのエタノール抽出物のアルカロイド類含有量は１０７ｍｇだった。
ハマナツメ酢酸エチル抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し、５０ｍｌの容器に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷ます。エタノールを一定量入れ、混ぜる。精密に１ｍｌを採取し、１０ｍｌの容器に移す。７０％のエタノールを一定量加え、混ぜ合わせる。精密に３ｍｌ採取し、２５ｍｌの容器に移し、３４０ｎｍの波長で吸光度を計測し、試験サンプル溶液中のクマリン含有量を調べる（クマリン量はウンベリフェロンで計算）。その結果１ｇのハマナツメ抽出物にはフラボンが合計で１８６ｍｇ含まれていた。

１．肝繊維化ラットへの影響
ＳＤラット６０匹（２００−２４０ｇ、オス）を体重毎に分け、ランダムで空白対照グループ（０．５％トラガント）、モデル対照グループ（０．５％トラガント）、陽性対照グループ（デキサメタゾン，１ｍｇ／ｋｇ）、ハマナツメ抽出物（実施例１の方法で得た）低量投薬グループ（０．４ｇ／ｋｇ）、中量投薬(０．８ｇ／ｋｇ)、大量投薬（１．６ｇ／ｋｇ）にわける。空白対照グループ以外、１ｍｌ／ｋｇの４０％四塩化炭素植物油溶液を毎週２回、３ヶ月連続で皮下注射し、同時に高脂肪飼料と５％エタノール水溶液を与える。検査物を毎日１回、３ヶ月連続で胃管投薬する。投薬終了後、翌日腹部大動脈から採血し、血漿を分離し、ＡＬＴ、ＰＣ−III、ＨＡ、ＬＨレベルを調べる。動物を殺処分し、肝臓を採取して病理検査を行う。血清検査の結果は表９を参照する。

結果、モデルグループに比べ、ハマナツメ抽出物の投薬量が０．８ｇ／ｋｇ及び１．６ｇ／ｋｇの時、４０％四塩化炭素植物油溶液による肝臓繊維化に対して一定の保護作用がみられた。特に大量投薬時、血液検査指数が明らかに改善された。
病理結果において、モデルグループの肝臓細胞の水様変性が顕著で、明確な肝細胞壊死と脂肪変性がみられ、肝細胞化は明確であることがわかった。ハマナツメ抽出物の大量投薬と中量投薬グループの肝細胞水様変性と脂肪変性程度は明らかに抑制されており、肝細胞の繊維化に対して良好な抑制効果があることがわかった。

２．ラット肺繊維化に対する影響
ＳＤラット（２００−２４０ｇ、オス）６０匹を体重毎に分け、ランダムで仮手術対照グループ（０．５％トラガント）、モデル対照グループ（０．５％トラガント）、陽性対照グループ（デキサメタゾン，１ｍｇ／ｋｇ）、ハマナツメ抽出物（実施例１の方法で得たもの）低量投薬グループ（０．４ｇ／ｋｇ）、中量投薬(０．８ｇ／ｋｇ)、大量投薬（１．６ｇ／ｋｇ）にわける。全ての実験動物に対して、１０％抱水クロラール（３５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔注射して麻酔を行い、気管を分離する。仮手術対照グループ以外、５ｍｌ／ｋｇのブレオマイシン生理食塩水溶液０．４ｍｌ、仮手術対照グループには生理食塩水を投薬する。を毎週２回、３ヶ月連続で皮下注射し、同時に高脂肪飼料と５％エタノール水溶液を与える。検査物を毎日１回、３ヶ月連続で胃管投薬する。投薬終了後、翌日腹部大動脈から採血し、血漿を分離し、ＡＬＴ、ＰＣ−III、ＨＡ、ＬＨレベルを調べる。動物を殺処分し、肝臓を採取して病理検査を行う。血清検査の結果は表９を参照する。術後翌日から毎日１回、連続３０日間投薬する。頸椎脱臼で殺処分した動物から、肺を取り出し、部分臓器を粉砕して、ヒドロキシプロリン含有量を測定し、一部は病理観察を行う。肺組織のヒドロキシプロリン含有量測定結果は表１０を参照する。

結果、モデルグループと比べ、ハマナツメ抽出物は０．８ｇ／ｋｇ及び１．６ｇ／ｋｇ投薬時に効果的にラット肺組織中のヒドロキシプロリン含有量を低下させることができ、肺線維化に良好な抑制作用があることを示した。
病理検査結果によると、モデルグループのラットには明確な肺線維化病変が見られ、肺間質の大量線維化細胞や大範囲繊維結合組織沈着、肺胞構造破壊、一部肺胞腔消失を呈した。モデルグループと比べ、ハマナツメ抽出物の各投薬量グループのラットの線維結合組織の沈着は少なく、肺間質繊維細胞も少なかった。投薬量が大きいグループほどこの傾向が顕著で、本抽出物が一定の潜在的な肺線維化治療薬物であることを示した。

３．ハマナツメ抽出物とポリエンホスファチジルコリンの同時投薬のラット肝線維化に対する影響
ＳＤラット６０匹（２００−２４０ｇ、オス）を体重毎に分け、ランダムで空白対照グループ、モデル対照グループ、陽性対照グループ（デキサメタゾン，１ｍｇ／ｋｇ）、ハマナツメ抽出物グループ（実施例１の方法で得たもの、０．８ｇ／ｋｇ)、ポリエンホスファチジルコリングループ（１ｍｌ／ｋｇ）、同時投薬グループ（ハマナツメ抽出物０．８ｇ／ｋｇ＋ポリエンホスファチジルコリン１ｍｌ／ｋｇ）にわける。空白対照グループ以外、１ｍｌ／ｋｇの４０％四塩化炭素植物油溶液を毎週２回、３ヶ月連続で皮下注射し、同時に高脂肪飼料と５％エタノール水溶液を与える。検査物を毎日１回、３ヶ月連続で胃管投薬する。投薬終了翌日に腹部大動脈から採血し、血漿を分離し、ＡＬＴ、ＰＣ−III、ＨＡ、ＬＨレベルを調べる。動物を殺処分し、肝臓を採取して病理検査を行う。血清検査の結果は表１１を参照。

４．ハマナツメ抽出物とリグストラジン同時投薬によるラット肺線維化への影響
ＳＤラット６０匹（２００−２４０ｇ、オス）を体重毎に分け、ランダムで空白対照グループ、モデル対照グループ、陽性対照グループ（デキサメタゾン，１ｍｇ／ｋｇ）、ハマナツメ抽出物グループ（実施例１の方法で得たもの、０．８ｇ／ｋｇ、ｏｐ)、リグストラジングループ（１ｍｌ／ｋｇ、ｉｐ）、同時投薬グループ（ハマナツメ抽出物０．８ｇ／ｋｇ、ｏｐ；リグストラジン注射液４０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）に分ける。すべての動物に１０％抱水クロラール（３５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔注射で麻酔を行い、気管を分離し、仮手術対照グループ以外のそれぞれに５ｍｇ／ｋｇのブレオマイシン生理食塩水溶液０．４ｍｌを注入し、仮手術対照グループには生理食塩水を注入する。手術後翌日よりサンプルを毎日１回、連続３０日間胃管投薬或いは注射する。頸椎脱臼で動物を殺処分し、肺を採取し、一部を粉砕し、ヒドロキシプロリン含有量を測定し、一部に対して病理検査を行う。肺組織中のヒドロキシプロリン含有量測定値結果は表１２を参照。

結果、単独でリグストラジン４０ｍｇ／ｋｇを投与しても実験的肺線維化には明確な効果はみられなかったが、同時投薬によって効果的にモデルラット肺組織中のヒドロキシプロリン含有量を低下させることができ、リグストラジン４０ｍｇ／ｋｇに比べ明確な差が見られた。ハマナツメ抽出物には肺線維化治療薬物の治療効果を効果的に向上させることができることが示された。

IV．ハマナツメ抽出物の抗真菌活性
（I）実施例 ハマナツメ抽出物の製造
１．ハマナツメエタノール抽出物の製造
（１）ハマナツメ全体１ｋｇを採取し、８倍量の９５％エタノールに１−２日浸漬した後、葉、根、茎を粉砕し、さらに１２倍量の９５％のエタノールに３日間浸漬し、抽出液を採取する。エタノールを減圧回収し、濃縮液を冷凍乾燥後、ハマナツメエタノール抽出物を得る。
（２）ハマナツメ全体の新鮮品１ｋｇ（或いはその一部）を粉砕し、ハマナツメ８倍量の９５％エタノールで３回回流抽出し、抽出液を収集する。エタノールを減圧回収し、濃縮液を冷凍乾燥後、ハマナツメメタノール抽出物を得る。
（３）ハマナツメ全体の新鮮品（根、茎、葉等）１ｋｇを採取し、冷凍乾燥後粉砕（粉砕後に冷凍乾燥するのも可）し、ハマナツメ１０倍量の９５％エタノールを加え、３回回流抽出し、抽出液を回収する。エタノールを減圧回収し、濃縮液を冷凍乾燥させて、ハマナツメエタノール抽出物を得る。

２．ハマナツメメタノール抽出物の製造
ハマナツメ植物全体の新鮮品１ｋｇを採取、粉砕しハマナツメ体積６倍量のメタノールを加え、３回回流抽出する。メタノールを減圧回収し、濃縮液を冷凍乾燥させてハマナツメメタノール抽出物を得る。

３．ハマナツメベンジン抽出物の製造
（１）ハマナツメエタノール抽出物の濃縮液体をベンジンで抽出し、ベンジンを回収してから乾燥させる。
（２）ハマナツメメタノール抽出物乾燥サンプルに１０倍量の水混濁液を加え、ベンジンで抽出し、ベンジンを回収してから乾燥させる。
（３）ハマナツメエタノール抽出物の乾燥品に１０倍量のベンジンで回流抽出し、ベンジンを乾燥させて回収する。

４．ハマナツメ酢酸エチル抽出物の製造
（１）ハマナツメエタノール抽出物の濃縮液体に対して１０倍量のベンジンで抽出物を得た後さらに１０倍量の酢酸エチルで抽出する。酢酸エチルを回収後、乾燥させる。
（２）ハマナツメメタノール抽出物の乾燥品に１０倍量の水混濁液を加え、１０倍量のベンジンを回収した後、１０倍量の酢酸エチルを抽出する。酢酸エチルを回収後、乾燥させる。
（３）ハマナツメエタノール抽出物の乾燥サンプルに対して、６倍量のエチル回流を２回行う。酢酸エチルを回収してから乾燥させる。

５．ハマナツメ酢酸エチルの抽出物タブレットの製造
３００ｇハマナツメ酢酸エチル抽出物を採取し、粉砕後、４０ウィルで濾過し、１００ｇ微晶質セルロース、５７．５ｇ乳糖、２０ｇクロスカルメロースナトリウムを加え、噴射体積濃度を混ぜあわせ９５％エタノール溶液を適量使い、顆粒に圧縮し、２４ウィルのフィルターに通して５０℃で乾燥させ、２０ｇクロスカルメロースナトリウムと２．５ｇのステアリン酸マグネシウムを加え、十分に混ぜ合わせ、圧縮し、ハマナツメ酢酸エチル抽出物タブレットを得る。

６．ハマナツメエタノール抽出物顆粒剤の製造
１０００ｇのハマナツメエタノール抽出物を採取し、粉砕したあと４０ウィルでフィルタリングし、４０００ｇの粉砂糖を加える。混ぜた後、均等に９５％濃度のエタノール溶液を噴霧し、顆粒状にこねる。２４ウィルでフィルタリングし、５０℃で乾燥させた後、顆粒にし、ハマナツメエタノール抽出物顆粒剤を得る。

７．ハマナツメメタノール抽出物軟膏剤の製造
１１５ｇのステアリルアルコールを採取し、１１５ｇ白ワセリン、７０ｇグリセリンモノステアラートを加熱溶解し、油状物を得る。４０ｇのハマナツメメタノール抽出物を加える。別途１００ｇのグリセリン、１５ｇのラウリル硫酸ナトリウム、０．０１ｇの塩酸Ｌ−システインに６５０ｍｌの水を加え溶解させ、水状物を得る。それぞれ７５−８０℃に加熱し攪拌した後、水状物をゆっくりと油状物に加え、１５分攪拌し続ける。ハマナツメメタノール抽出物軟膏剤を得る。

８．ハマナツメエタノール抽出物ジェル剤の製造
１０ｇカルボマーを４２０ｍｌの純水に加え、攪拌する。１００ｍｌのプロピレングリコールを加え攪拌、１８ｇのトリエタノールアミンを加え、ジェル状にする。別途１００ｇハマナツメエタノール抽出物を採取し、２ｇのエチルパラベンと共に３５０ｍｌのエタノールに溶かし、攪拌してからジェル状物に加え、攪拌する。

９．ハマナツメエタノール抽出物塗膜剤の製造
４０ｇのポリビニルアルコール１２４を採取し、４００ｍｌの純水に溶かす。別途１００ｇのハマナツメエタノール抽出物を４００ｍｌのエタノール中にとかし、さらに１００ｍｌのグリセリンを加え攪拌する。ゆっくりとポリビニルアルコール溶液中に溶かし、攪拌してから濾過し、濾過器にエタノールを１０００ｍｌ加える。

１０．ハマナツメベンジン抽出物湿布剤の製造
１００ｇハマナツメベンジン抽出物の粉末を乳鉢に加え、５００ｍｌのピーナツオイルを加え、さらにゆっくりと水酸化カルシウム溶液を１０００ｍｌまで加え、白色乳状物を得る。

１１．ハマナツメエタノール抽出物洗剤の製造
１００ｇのハマナツメエタノール抽出物を乳鉢に加え、５０ｍｌのグリセリンと適量の純水を加える。ノリ状に練り、少しずつ純水を加えて全量が均等になれば完成である。

（II）ハマナツメ抽出物の真菌活性研究
実施例１（１）で製造したハマナツメエタノール抽出物１ｇを採取し、５％のイソアルコール溶液に溶解させ、１０ｍｌの溶液を作る。０．２２ｕｍのフィルターで除菌する。１ｍｌの除菌した上記溶液を採取し、溶解冷却して５０℃にした９ｍｌのＰＤＡ培養液に加える。十分に混ぜ合わせ、迅速に直径６ｃｍの培養プレートに流し込み、静止させ、１０ｍｇ／ｍｌのハマナツメ抽出物が含まれるＰＤＡ培養プレートを作る。同様体積の５％イソアルコール溶液で空白対照ＰＤＡ培養プレートを作る。
採取した菌コロニーを上記薬品が含まれたＰＤＡ培養プレートに接種し、２５℃で恒温培養する。対照グループのコロニーが培養プレートの縁に到達するのを待ち、十字交差法ですべての培養プレート上のコロニー直径を計測し、校正して菌抑制率を算出する。

結果は表１３の通りである。ハマナツメエタノール抽出物は各種真菌に対して明確な抑制作用を見せた。真菌はどれも代表的な発病菌である。結論として、ハマナツメエタノール抽出物には強力な抗真菌活性があり、真菌類薬物の製造に応用できる可能性が高い。

V．ハマナツメ葉抽出物による免疫機能低下及び／或いは自己免疫疾の治療
（I）ハマナツメ抽出物の製造
１．全体エタノール抽出物の製造
ハマナツメ全体１ｋｇを採取し８倍量の９５％エタノールに１日浸漬し、粉砕する。さらに１０倍量の９５％エタノールに２日間浸漬し、抽出液を採取する。アルコール臭がなくなるまでエタノールを５０℃下で減圧回収し、乾燥させることでハマナツメエタノール抽出物を得る。

２．茎葉エタノール、ベンジンと酢酸エチル抽出物の製造
ハマナツメ茎葉１ｋｇを採取し、１０倍量の９５％エタノールに１日浸漬し、粉砕する。１０倍量の９５％エタノールで回流採取し、抽出液を得る。アルコール臭がなくなるまでエタノールを６０℃下で減圧回収し、乾燥後ハマナツメエタノール抽出物を得る。ハマナツメエタノール抽出物に水を加え、ベンジン、酢酸エチルでそれぞれ抽出することで、ハマナツメベンジン抽出物と酢酸エチル抽出物を得る。

３．全体ベンジンと酢酸エチル抽出物の製造
ハマナツメ全体１ｋｇを１０倍量のエタノールに１日浸漬し、粉砕する。さらに８倍量のメタノールに２日浸漬し、抽出液を得る。４０℃下でメタノールを減圧回収し、乾燥させてハマナツメエタノール抽出物を得る。ハマナツメエタノール抽出物に水を加えベンジン、酢酸エチルでそれぞれ抽出することで、ハマナツメベンジン抽出物と酢酸エチル抽出物を得る。

４．成分定量分析
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、１０ｍｌの容器に移す。酢酸エチルを一定量加える。４ｍｌを精密に採取し、１０ｍｌの容器に移す。溶剤を揮発させた後、５％のバニリン−無水酢酸０．４ｍｌ、過塩素酸１．６ｍｌを加え混ぜ合わせ、酢酸エチルを一定量加え、希釈し、７０℃の恒温ウォーターバスで１５分加熱する。室温まで冷却し、１０ｍｌ容器に移し、酢酸エチルを一定量加えて希釈する。よく混ぜ合わせた後、５４０ｎｍ波長の吸光度を測定し、トリテルペノイドの総含有量（アメリカンカテキンでトリテルペノイドの含有量を計算する）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物におけるトリテルペノイド類の含有量は２３ｍｇだった。
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し、５０ｍｌの容器に移し、エタノールを適量加える。超音波で溶解したあと、冷し、エタノールを一定量加え、混ぜ合わせる。精密に１ｍｌ採取し、１０ｍｌ容器に移し、水を一定量加え、混ぜ合わせる。精密に３ｍｌ採取し、２５ｍｌの容器に移し、５１０ｎｍの波長で吸光度を計測し、サンプル溶液中の総フラボン含有量（ルチンでフラボン量を計算）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物のフラボン含有量は１０３ｍｇだった。
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し、コルク付きのフラスコに移す。１８％のアンモニア水２ｍｌを加え、１時間湿潤させ、ジエチルエーテル：クロロホルム：エタノール（２５：８：２．５）の混合溶剤３０ｍｌを加える。超音波抽出を２０分行い、上澄み液を捨て、再度上記混合溶剤を３０ｍｌ加え、３０分冷蔵し冷ます。さらに超音波振動で２０分抽出を行い、同じ溶剤１５ｍｌで３回残滓と濾紙を洗浄し、濾液とフラスコ内の溶液を混ぜる。６０℃のウォーターバスで加熱乾燥させ、正確に１０ｍｌのクロロホルムで全部溶かし、正確に５ｍｌを採取し少量分液漏斗に移す。６ｍｌのクロロホルムと２ｍｌ緩衝液(ｐＨ＝５．０，０．２Ｍフタル酸水素カリウム緩衝液)を加える。１ｍｍｏｌ・Ｌ−１のＢＴＢで滴定しつつ絶え間なく振動させ、終点に近づいた時点で、クロロホルム層を分離し、新たにクロロホルムを５ｍｌ再度加える。滴定を続け、絶え間なく振動させて混ぜ合わせる。水層が黄色くなったら終点である。アルカロイド（ハマナツメアルカリＢでアルカロイドを計算）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物のアルカロイド含有量は２１ｍｇだった。
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル、精密に採取し、５０ｍｌの容器に移す。エタノール適量を加え、超音波で溶解させ、冷ます。エタノールを一定量加え、よく混ぜ合わせる。精密に１ｍｌを採取し、１０ｍｌの容器に移す７０％のエタノールを一定量加え、よく混ぜ合わせる。精密に３ｍｌを採取し、２５ｍｌの容器に移す。３４０ｎｍの波長で吸光度を測定する。サンプル溶液中のクマリン含有量（クマリンの量はウンベリフェロンが計算）を算出する。クマリン含有量（ウンベリフェロンでクマリンの量を算出する）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物の総クマリン含有量は１０．２ｇだった。
ハマナツメ茎葉酢酸エチル抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、１０ｍｌの容器内に移し、酢酸エチルを一定量加える。そこから精密に４ｍｌの溶液を採取し、１０ｍｌの容器に移す。溶剤が揮発したあと、５％のバニリン−無水酢酸０．４ｍｌ、過塩素酸１．６ｍｌを混ぜ合わせる。酢酸エチルを一定量加え、希釈し、７０℃の恒温ウォーターバスで１５分加熱し、室温に冷まし、１０ｍｌの容器に移す。酢酸エチルを一定量加え、希釈し、よく混ぜ合わせた後、５４０ｎｍの波長の吸光度を測定し、サンプル溶液中のトリテルペノイド総含有量（アメリカンカテキンでトリテルペノイドの量を計算）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物に含まれるトリテルペノイド類成分は１０８ｍｇだった。
ハマナツメ茎葉酢酸エチル抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、５０ｍｌの容器に移し、エタノールを適量加え、超音波で溶解させる。冷まし、エタノールを一定値加え、混ぜ合わせる。精密に１ｍｌ採取し、１０ｍｌの容器に移し、水を一定量加えて混ぜ合わせる。精密に３ｍｌ採取し、２５ｍｌの容器に移し、５１０ｎｍの波長の吸光度を計測し、サンプル溶液中の総フラボン含有量（ルチンでフラボン量を計算）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物に含まれるフラボンは４９７ｍｇだった。
ハマナツメ全体酢酸エチル抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、コルク付きのフラスコに移し、１８％のアンモニア水２ｍｌで１時間湿潤させる。ジエチルエーテル：クロロホルム：エタノール（２５：８：２．５）の混合溶剤３０ｍｌを加え、超音波抽出を２０分行い、フラスコ内の上澄み液を捨て、さらに上記混合溶剤を３０ｍｌ加える。３分ほど冷却し、再度超音波振動で２０分抽出を行い、濾過し、同じ溶剤１５ｍｌで３回残滓と濾紙を洗浄する。洗浄液と濾液をフラスコ内で混ぜ合わせ、６０℃のウォーターバスで蒸発させ、１０ｍｌのクロロホルムを正確に採取して加え、すべて溶解させた後、再度５ｍｌを採取し少量分液漏斗に移す。６ｍｌのクロロホルムと、２ｍｌ緩衝液(ｐＨ＝５．０，０．２Ｍフタル酸水素カリウム緩衝液)を加える。１ｍｍｏｌ・Ｌ−１のＢＴＢで滴定し、断続的に揺らし混ぜ合わせる。終点に近付いたらクロロホルム層を分離させ、新たに５ｍｌのクロロホルムを加え、滴定中も絶え間なく揺らし混ぜ合わせる。静止させて水層が黄色くなったら終点である。総アルカロイド（ハマナツメアルカリＢでアルカロイドを計算）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物中のアルカロイド含有量は１０７ｍｇだった。
ハマナツメ全体酢酸エチル抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、５０ｍｌ容器内に移す。エタノールを適量加え、混ぜ合わせる。３ｍｌを精密に採取し、２５ｍｌの容器に移し、３４０ｎｍの波長の吸光度を測定し、サンプル溶液の総クマリン含有量（ウンベリフェロンでクマリン量を計算）を算出する。結果、１ｇハマナツメ抽出物の総クマリン含有量は１８６ｍｇだった。

（II）ハマナツメ製剤の製造
１．タブレット剤の製造
ハマナツメ全体エタノール抽出物を３００ｇ採取し、適切な補材、例えば１００ｇ微晶質セルロース、５７．５ｇ乳糖、２０ｇクロスカルメロースナトリウム等を加え、タブレット剤を製造する。

２．カプセル剤の製造
ハマナツメ茎葉酢酸エチル抽出物を採取し、適切な補材を加える。例えば乳糖、加圧性澱粉、カルボキシメチル澱粉、微晶質セルロース等でカプセル剤を製造する

３．顆粒剤の製造
ハマナツメ全体メタノール抽出物を採取し、適量の補材を加える。例えば、乳糖、澱粉、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、微粉シリコン等で顆粒剤を製造する。

４．軟膏剤の製造
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を採取し、適量の補材を加える。例えばステアリルアルコール、グリセロールモノステアレート、グリセリン、ステアレート等で軟膏剤を製造する。

５．栓剤の製造
ハマナツメ全体エタノール抽出物を採取し、適量の補材を加える。例えば混合脂肪酸グリセリド、ＰＥＧ、蜜ろう等で栓剤を製造する。

（III）体外細胞学研究
１．ハマナツメ抽出物のマウス体外増殖脾臓リンパ細胞に対する影響
１．１．マウス脾臓リンパ細胞の製造
無菌で昆明マウスの脾臓を採取し、ＲＰＭＩ１６４０を適量加えた培養プレート内に置く。注射器針で細かく砕き、２００ウィルのフィルターでろ過したあと、遠心管に移し、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄したあと、細胞を収集する。１ｍｌのヘモグロビン裂解液を加える。４℃下で５−１０分放置したあと、１５００ｒ／分で５分間遠心分離し、上澄み液を捨てる。ＲＰＭＩ１６４０培養ベースで２回洗浄し、最後に細胞懸濁液を１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０完全培養プレートに浮かせる。トリパンブルー染色測定で生存率を測定し、結果、脾臓組織の生存率は９５％以上だった。上記の脾臓組織懸濁液を細胞密度２×１０^６個／ｍｌに希釈する。

１．２．ハマナツメ抽出物のマウス体外増殖リンパ細胞に対する影響
２×１０^６個／ｍｌの脾臓細胞懸濁液を１００μｌ／ウィルの９６ウィルプレートに加える。空白グループ、対照グループとハマナツメ抽出物グループに分ける。対照グループの各ウィルには１００μｌのＲＰＭＩ１６４０完全培養ベースを加える。ハマナツメ抽出物には各ウィルにさらに１００μｌの異なる濃度のハマナツメ抽出物のＲＰＭＩ１６４０完全培養ベース溶液を加える。別途空白グループをつくり、培養ベースのみを加える。上記の９６ウィルプレートを５％ＣＯ_２、３７℃の培養器内にて６０時間培養する。ウィルプレートを取り出し、各ウィルの液体を吸い出し、ＰＢＳで３回洗浄した後、１００μｌの培養ベースと２０μｌのＩＭＴＴ液（５ｍｇ・ｍｌ^−１）を加える。再度３７℃、５％ＣＯ_２の培養器（体積比で５％ＣＯ_２を含む湿度環境）で４時間培養し、培養プレートを取り出す。上澄み液を吸い出し、１５０μｌのジメチルスルホキシドを加える。ウィルプレートを微孔振動機で１０分振動させ、結晶ホルマザンを十分に溶解させた後、酵素免疫検査機上で４９０ｎｍの色彩比較を行った結果、公式（１）でハマナツメ抽出物のマウス体外脾臓細胞平均生存率を算出する。
平均生存率（％）=（実験グループ値−空白グループ値）／（対照グループ値−空白グループ値）× １００％ （１）

結果、ハマナツメ抽出物濃度が０．００４ｍｇ／ｍｌ、０．０２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌの時、マウス脾臓細胞の平均生存率が１１７．８５％、１０７．２１％及び７７．４６％となった。結果から低濃度のハマナツメ抽出物はマウスの体外脾臓細胞増殖を促進することができ、高濃度のハマナツメ抽出物は脾臓細胞の増殖に一定の抑制作用があった。

２．ハマナツメ抽出物のＣｏｎＡ誘導された脾臓細胞体外増殖の影響
２×１０^６個／ｍｌの脾臓細胞懸濁液を１００μｌ／ウィルの９６ウィルプレートに加える。空白グループ、対照グループとハマナツメ抽出物グループに分ける。対照グループの各ウィルには１００μｌのＲＰＭＩ１６４０完全培養ベースを加える。ＣｏｎＡグループにはさらに１００μｌのＣｏｎＡが２５μｇ／ｍｌ含まれるＲＰＭＩ１６４０完全培養ベース溶液を加える。ハマナツメ抽出物には各ウィルにさらに１００μｌの異なる濃度のハマナツメ抽出物のＲＰＭＩ１６４０完全培養ベース溶液を加える（溶液中に２５μｇ／ｍｌ ＣｏｎＡが含まれている）。別途空白グループを作り、培養ベースのみ加える。上記９６ウィルプレートを５％ＣＯ_２、３７℃の培養器内で６０時間培養する。ウィルプレートを取り出し、各ウィル内の液体を吸い出し、ＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌの培養ベースと２０μｌのＩＭＴＴ液（５ｍｇ・ｍｌ^−１）を加え、さらに３７℃、５％ＣＯ_２の培養器（体積比で５％ＣＯ_２を含む湿度環境）で４時間培養した後、細胞培養プレートを取り出し、上澄み液を吸い出し、１５０μｌジメチルスルホキシドを加え、培養プレートを微孔板振動機に１０分間かける。結晶ホルマザンが十分に溶解した後、酵素免疫計測器にて４９０ｎｍで彩色比較する。公式（１）に基づいてＣｏｎＡグループとハマナツメ抽出物グループのマウスの脾臓組織体外平均生存率を計算した。再度公式（２）でハマナツメ抽出物のＣｏｎＡ誘導のマウス脾臓細胞体外増殖の増殖率を計算した。
相対増殖率（％）=（実験グループ／ＣｏｎＡ対照グループ−１）×１００％ （２）

結果、ハマナツメ抽出物濃度が０．００４ｍｇ／ｍｌ、０．０２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ時、ＣｏｎＡグループに比べると、相対増殖率はそれぞれ１５．１１％、５．６９％と−１４．３５％だった。結論として低濃度のハマナツメ抽出物はＣｏｎＡ誘導と比べてマウス脾臓細胞体外増殖に促進作用が認められ、高濃度時の抑制作用がより突出していることが分かった。

３．ハマナツメ抽出物のＬＰＳ誘導による脾臓細胞体外増殖に対する影響
９６ウィルのウィルプレートに２×１０^６個／ｍｌの脾臓細胞懸濁液を１００μｌ／ウィル加える。空白グループ、対照グループ、ＬＰＳグループ及びハマナツメ抽出部グループに分ける。対照グループの各ウィルには１００μｌのＲＰＭＩ１６４０完全培養ベースを加える。ＬＰＳグループにはさらに１００μｌのＬＰＳが２０μｇ／ｍｌ含まれるＲＰＭＩ１６４０完全培養ベース溶液を加える。ハマナツメ抽出物グループの各ウィルには１００μｌの異なる濃度のハマナツメ抽出物を含むＲＰＭＩ１６４０完全培養ベース溶液（溶液中には同時に２０μｇ／ｍｌのＬＰＳが含まれる）を加える。別途空白グループを作り、培養ベースのみを加える。上記の９６ウィルプレートを５％ＣＯ_２、３７℃の培養器にて６０時間培養する。プレートを取り出し、ウィル内の液体を吸い出し、ＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌ培養ベースと２０μｌＭＴＴ液（５ｍｇ・ｍｌ^−１）を加え、再度３７℃、５％ＣＯ_２の培養器（体積比で５％ＣＯ_２を含む湿度環境）で４時間培養する。プレートを取り出し、上澄み液を吸い出し、１５０μｌのジメチルスルホキシドを加え、プレートを微孔振動機に１０分掛ける。結晶物ホルマザンが十分に溶解した後、酵素免疫計測器で４９０ｎｍの色彩比較を行う。記録に対して公式（１）を用いてＬＰＳグループとハマナツメ抽出物のマウス脾臓細胞の体外平均生存率を算出する。再度公式（２）を用いてハマナツメ抽出物のＬＰＳ誘導のマウス脾臓細胞体外増殖の増殖率を調べた。
結果、ハマナツメ抽出物の濃度が０．００４ｍｇ／ｍｌ、０．０２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ時、ＬＰＳグループの相対増殖率はそれぞれ３４．３７％、２０．４８％と−１５．６０％で、ハマナツメ抽出部低濃度時、ＬＰＳ誘導マウス脾臓細胞体外増殖率には促進作用があり、高濃度時には抑制作用があることが分かった。これはハマナツメ抽出物のＣｏｎＡ誘導の脾臓細胞体外増殖に双方向性免疫調節機能がある結論と一致している。

（IV）薬理学検証
１．エタノール、メタノール、ベンジン抽出物及び酢酸エチル抽出物の免疫低下非特異性免疫機能に対する影響（腹腔マクロファージ呑噬法）
ＫＭマウス８０匹を体重に基づき８グループ、それぞれ懸濁剤グループ（０．５％トラガカント）、モデル対照グループ（０．５％トラガカント）、陽性対照グループ（カワラタケ多糖類）、酢酸エチル抽出物低量投薬グループ、酢酸エチル抽出物大量投薬グループ、エタノール抽出物グループ、メタノール抽出物グループ、ベンジン抽出物グループに分ける。サンプル薬物或いは懸濁剤を毎日１回、連続１４日間、胃管投薬する。懸濁剤対照グループ以外、投薬第８、１０、１２日に２５ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド生理食塩水溶液を腹腔注射し、免疫低下を引き起こす。第１３日、１４日にそれぞれ６％澱粉溶液を腹腔注射する。第１４日目の最終投薬１時間後、５％トリヘモグロビン生理食塩水懸濁液１ｍｌを腹腔注射する。３０分後、頸椎脱臼で殺処分し、腹腔に生理食塩水２ｍｌを注入し、腹部を軽くマッサージする。１分後腹部を切開し、腹腔洗浄液１ｍｌを吸い取り、２枚のスライドに均等に乗せ、３７℃の保温器内で３０分培養する。生理食塩水で洗浄し、陰干しし、１：１のアセトン-メタノール溶液に固定し、４％（ｖ／ｖ）Ｇｉｅｍｓａ−ＰＢＳで３分染色する。蒸留水で洗浄し、陰干しし、顕微鏡でマクロファージのパーセントを算出する。

結果は表１４の通りである。ハマナツメ酢酸エチル抽出物は０．１ｇ／ｋｇ及びそれ以上の薬物を１４日間胃管投薬した場合、顕著に免疫機能を高め、マウス腹腔マクロファージの貪食機能を抑制した。尚且つ０．４ｇ／ｋｇの投薬強度とカワラタケ多糖類グループの結果に有意差が見られなかった。エタノール、メタノール、ベンジン抽出物１．２ｇ／ｋｇも免疫低下マウス腹腔マクロファージの貪食機能を効果的に増強することが分かった。該四種類の抽出物は免疫低下動物に対して効果的に免疫増強作用があることを示している。

２．エタノール、メタノール、ベンジン抽出物及び酢酸エチル抽出物の免疫低下マウスの特異性免疫機能に対する影響（２，４−ジフルオロフェニル硝酸による耳腫脹法）
ＫＭマウス８０匹を体重に基づき８グループ、それぞれ懸濁剤グループ（０．５％トラガカント）、モデル対照グループ（０．５％トラガカント）、陽性対照グループ（カワラタケ多糖類）、酢酸エチル抽出物低量投薬グループ、酢酸エチル抽出物大量投薬グループ、エタノール抽出物グループ、メタノール抽出物グループ、ベンジン抽出物グループに分ける。サンプル薬物或いは懸濁剤を毎日１回、連続１４日間、胃管投薬する。懸濁剤対照グループ以外に、投薬第８、１０、１２日に２５ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド生理食塩水溶液を腹腔注射し、免疫を低下させる。第９日目に１％ ２，４−ジフルオロフェニル硝酸（ＤＮＦＢ）溶液（１００ｍｇ ＤＮＦＢを採取して１：１のアセトン−植物油混合物を混ぜ合わせる。１０ｍｌ）２５μｌをマウス腹部に塗る。第１３日の投薬１時間後に１０μｌの１％ＤＮＦＢ溶液をマウス左耳に塗布する。塗布後２４時間、最終投薬後１時間後に頸椎脱臼で殺処分し、耳を切除、重さを量り、耳の腫脹度を測る。

結果は表１５の通りである。ハマナツメ酢酸エチル抽出物は免疫低下マウスのＤＮＦＢによる耳腫脹程度を増加させ、免疫低下動物の細胞免疫機能に対して増強作用を示した。エタノール、メタノール、ベンジン抽出物１．２ｇ／ｋｇ、及び酢酸エチル抽出物の作用は類似しており、該四種類の抽出物はともに免疫低下動物の特異性免疫作用を効果的に強化することを示した。

３．エタノール、メタノール、ベンジン抽出物と酢酸エチル抽出物の正常マウスの非特異性免疫機能への影響（腹腔マクロファージ貪食法）
ＫＭマウス８０匹を体重に基づき８グループ、それぞれ懸濁剤グループ（０．５％トラガカント）、陽性対照グループ（カワラタケ多糖類）、抑制作用陽性対照グループ、酢酸エチル抽出物低量投薬グループ、酢酸エチル抽出物大量投薬グループ、エタノール抽出物グループ、メタノール抽出物グループ、ベンジン抽出物グループに分ける。抑制作用陽性対照グループに第１３日目に一過性皮下注射を行う以外、サンプル薬物或いは懸濁剤を毎日１回、連続１４日間、胃管投薬する。第１３日目、１４日目にそれぞれ６％澱粉溶液を腹腔注射する。第１４日目の最終投薬１時間後、５％トリヘモグロビン生理食塩水懸濁液１ｍｌを腹腔注射する。３０分後、頸椎脱臼で殺処分し、腹腔に生理食塩水２ｍｌを注入し、腹部を軽くマッサージする。１分後腹部を切開し、腹腔洗浄液１ｍｌを吸い取り、２枚のスライドに均等に乗せ、３７℃の保温器内で３０分培養する。生理食塩水で洗浄し、陰干しし、１：１のアセトン-メタノール溶液に固定し、４％（ｖ／ｖ）Ｇｉｅｍｓａ−ＰＢＳで３分染色する。蒸留水で洗浄し、陰干しし、顕微鏡でマクロファージのパーセントを算出する。

結果は表１６の通りである。ハマナツメ酢酸エチル抽出物０．４ｇ／ｋｇ １４日間の胃管投薬はある程度正常マウス腹腔マクロファージの貪食作用を抑制できたが、０．１ｇ／ｋｇにおいて明確な作用は見られなかった。エタノール、メタノール、ベンジン抽出物１．２ｇ／ｋｇもそれぞれ程度が異なる抑制効果をみせ、四種類の抽出物が正常動物に対しても軽度の免疫抑制作用があることが分かった。

４．エタノール、メタノール、ベンジン抽出物及び酢酸エチル抽出物の正常マウスの特異性免疫機能に対する影響（２，４−ジフルオロフェニル硝酸による耳腫脹法）
ＫＭマウス８０匹をそれぞれ懸濁剤グループ（０．５％トラガカント）、抑制作用対照グループ（シクロホスファミド）、陽性対照グループ（カワラタケ多糖類）、酢酸エチル抽出物低量投薬グループ、酢酸エチル抽出物大量投薬グループ、エタノール抽出物グループ、メタノール抽出物グループ、ベンジン抽出物グループに分ける。抑制作用陽性グループが第１３日目に一過性皮下注射を行う以外、その他のグループはサンプル薬物或いは懸濁剤を毎日１回、連続１４日間、胃管投薬する。投薬第９日目に１％ ２，４−ジフルオロフェニル硝酸（ＤＮＦＢ）溶液（１００ｍｇ ＤＮＦＢを採取して１：１のアセトン-植物油混合物を混ぜ合わせる。１０ｍｌ）２５μｌをマウス腹部に塗る。第１３日目に投薬１時間後、１０μｌの１％ ＤＮＦＢ溶液をマウス左耳に塗布する。塗布後２４時間、最終投薬後１時間後に頸椎脱臼で殺処分し、耳を切除、重さを量り、耳の腫脹度を測る。

結果は表１７の通りである。ハマナツメ酢酸エチル抽出物は０．１ｇ／ｋｇで正常マウスのＤＮＦＢによる耳腫脹を抑制しており、正常動物に対しても一定の免疫機能抑制作用を持つことが分かった。エタノール、メタノール、ベンジン抽出物１．２ｇ／ｋｇ及び酢酸エチル抽出物の作用は類似しており、四種の抽出物はどれも一定の特異性免疫抑制作用を持つことが分かった。

５．エタノール、メタノール、ベンジン抽出物及び酢酸エチル抽出物のＳＬＥ実験用マウスに対する治療作用及び細胞免疫に関する影響
ＫＭマウス８０匹を体重に基づき８グループ、それぞれ懸濁剤対照グループ（０．５％トラガカント）、モデル対照グループ（０．５％トラガカント）、陽性対照グループ（ＴＷＨＦ）、酢酸エチル抽出物少量投薬グループ、酢酸エチル抽出物大量投薬グループ、エタノール抽出物グループ、メタノール抽出物グループ、ベンジン抽出物グループに分ける。懸濁液対照グループ以外は０．５ｍｌのプリスタンを腹腔注射し、サンプル或いは混濁液を毎日１回、連続３０日間胃管投薬する。最終投薬２４時間後に目の縁から採血した後、４℃冷凍遠心分離で血清を分離し、ＥＬＩＳＡ測定で血清中の抗ｄｓＤＮＡ抗体レベルを測定する。
別途同様のグループでモデルをコピーし、プリスタンを注射した後第２４日目に、懸濁剤対照グループ以外、各グループの腹腔に５％のトリヘモグロビン生理食塩懸濁液を０．２ｍｌ注射し、第３０日目までプリスタンを投薬し続ける。最終投薬２４時間後、目の縁から２０μｌ採決し、１ｍｌ生理食塩水の中に加える。その後それぞれ４％のトリヘモグロビン生理食塩水懸濁液０．５ｍｌと１０％ラット血清０．５ｍｌに加え、混ぜ合わせたあと、０．５時間３７℃で培養し、３０００ｒｐｍで１０分遠心分離する。上澄み液１ｍｌを採取し、３ｍｌのブロー氏液を加え、５４０ｎｍで色彩比較をする。

結果は表１８の通りである。ハマナツメ酢酸エチル抽出物０．４ｇ／ｋｇは効果的に実験的ＳＬＥマウスの血清中のｄｓＤＮＡ抗体レベルを抑制することができた。これはＳＬＥに対する治療作用があることを示している。エタノール、メタノール、ベンジン抽出物１．２ｇ／ｋｇ及び酢酸エチル抽出物の作用は類似している。これは四種の抽出物がそれぞれＳＬＥに対して一定の作用を持つことを示している。ＳＬＥは体液免疫の異常な上昇といえる。本実験においてモデル動物の溶血素レベルは正常動物より明らかに高く、ハマナツメ酢酸エチル抽出物０．１ｇ／ｋｇは効果的に異常上昇した溶血素レベルを下げることができた。エタノール、メタノール、ベンジン抽出物１．２ｇ／ｋｇ及び酢酸エチル抽出物の作用は類似しており、４種の抽出物は免疫機能異常亢進に対して顕著な抑制作用があることを示した。

VI．ハマナツメ抽出物の口腔及び消化器炎症と潰瘍の治療
（I）ハマナツメ抽出物の製造
１．全体エタノール抽出物の製造
ハマナツメ全体１ｋｇを採取し、８倍量の９５％エタノールに１日浸漬させた後、粉砕し、再度１０倍量の９５％エタノールに２日間浸漬させ、抽出液を収集する。アルコール臭がなくなるまでエタノールを５０℃下で減圧回収する。乾燥後ハマナツメエタノール抽出物を得る。

２．茎葉エタノール、ベンジンと酢酸エチル抽出物の製造
ハマナツメ茎葉１ｋｇを採取し、１０倍量の９５％エタノールに１日浸漬させた後、粉砕し、再度１０倍量９５％エタノールを加え、回流抽出し、抽出液を得る。アルコール臭がなくなるまでエタノールを６０℃下で減圧回収し、乾燥後ハマナツメエタノール抽出物を得る。ハマナツメエタノール抽出物に水を加え、ベンジン、酢酸エチルでそれぞれ抽出することでハマナツメベンジン抽出物と酢酸エチル抽出物を得る。

３．全体ベンジンと酢酸エチル抽出物の製造
ハマナツメ全体１ｋｇを採取し、１０倍量のメタノールで１日浸漬した後、粉砕し、さらに8倍量のメタノールに２日間浸漬し、抽出液を得る。メタノールを４０℃下で減圧回収し、乾燥後ハマナツメメタノール抽出物を得る。ハマナツメメタノール抽出物に水を加え、ベンジン、酢酸エチルで抽出することで、ハマナツメベンジン抽出物と酢酸エチル抽出物を得る。

４．成分定量分析
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、１０ｍｌの容器に移す。酢酸エチルを一定量加え、再度４ｍｌの溶液を精密に採取し１０ｍｌの容器に移し、溶剤を揮発させる。５％バニリン−氷酢酸０．４ｍｌ、過塩素酸１．６ｍｌを加え、混ぜ合わせる。酢酸エチルを一定量加えて希釈し、７０℃の恒温ウォーターバスで１５分加熱し、室温まで冷ます。１０ｍｌの容器内に酢酸エチルを一定量加えて希釈し、混ぜ合わせ、５４０ｎｍの波長の吸光度を測定する。被験薬溶液中の総トリテルペノイド含有量（トリテルペノイドはアメリカンカテキンで計算）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物にはトリテルペノイド類成分が２３ｍｇ含まれていた。
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し５０ｍｌ容器に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷ます。エタノールを一定量加えよく混ぜる。精密に１ｍｌ採取し、１０ｍｌの容器に移す。水を一定量加え、よく混ぜる。精密に３ｍｌ採取し、２５ｍｌの容器に移し、５１０ｎｍ波長の吸光度を測定し、被験薬溶液中の総フラボン含有量（フラボンはルチンで計算する）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物の総フラボン含有量は１０３ｍｇだった。
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し、コルク付きのフラスコに移し、１８％アンモニア水２ｍｌで１時間湿らせる。ジエチルエーテル：クロロホルム：エタノール（２５：８：２．５）混合溶剤３０ｍｌを加え、超音波振動に２０分掛け、上澄み液を捨て、さらに上記混合溶剤を３０ｍｌ加え、３０分冷し、超音波振動に２０分掛け、濾過し、同様の溶剤１５ｍｌで３回残滓と濾紙を洗浄し、フラスコに戻す。６０℃のウォーターバスで乾燥させ、１０ｍｌのクロロホルムを使用してすべて溶解させる。５ｍｌを正確に採取し、少量分液漏斗に移し、６ｍｌのクロロホルムと２ｍｌ緩衝液(ｐＨ＝５．０，０．２Ｍフタル酸水素カリウム緩衝液)を加える。１ｍｍｏｌ・Ｌ−１のＢＴＢで滴定しつつ絶え間なく振動させ、終点に近づいた時点で、クロロホルム層を分離し、新たにクロロホルムを５ｍｌ再度加える。滴定を続け、絶え間なく振動させて混ぜ合わせる。水層が黄色くなったら終点である。アルカロイド（ハマナツメアルカリＢでアルカロイドを計算）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物のアルカロイド含有量は２１ｍｇだった。
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、５０ｍｌ容器に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷ます。エタノールを一定量加えよく混ぜる。精密に１ｍｌ採取し、１０ｍｌの容器に移す。７０％エタノールを一定量加え、よく混ぜる。精密に３ｍｌ採取し、２５ｍｌの容器に移し、３４０ｎｍ波長の吸光度を測定し、被験薬溶液中の総クマリン含有量（クマリンはウンベリフェロンで計算する）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物の総クマリン含有量は１０．２ｍｇだった。
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、１０ｍｌの容器に移す。酢酸エチルを一定量加え、再度４ｍｌの溶液を精密に採取し１０ｍｌの容器に移し、溶剤を揮発させる。５％バニリン−氷酢酸０．４ｍｌ、過塩素酸１．６ｍｌを加え、混ぜ合わせる。酢酸エチルを一定量加えて希釈し、７０℃の恒温ウォーターバスで１５分加熱し、室温まで冷ます。１０ｍｌの容器内に酢酸エチルを一定量加えて希釈し、混ぜ合わせ、５４０ｎｍの波長の吸光度を測定する。被験薬溶液中の総トリテルペノイド含有量（トリテルペノイドはアメリカンカテキンで計算）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物にはトリテルペノイド類成分が１０８ｍｇ含まれていた。
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し５０ｍｌ容器に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷ます。エタノールを一定量加えよく混ぜる。精密に１ｍｌ採取し、１０ｍｌの容器に移す。水を一定量加え、よく混ぜる。精密に３ｍｌ採取し、２５ｍｌの容器に移し、５１０ｎｍ波長の吸光度を測定し、被験薬溶液中の総フラボン含有量（フラボンはルチンで計算する）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物の総フラボン含有量は４９７ｍｇだった。
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル精密に採取し、コルク付きのフラスコに移し、１８％アンモニア水２ｍｌで１時間湿らせる。ジエチルエーテル：クロロホルム：エタノール（２５：８：２．５）混合溶剤３０ｍｌを加え、超音波振動に２０分掛け、上澄み液を捨て、さらに上記混合溶剤を３０ｍｌ加え、３０分冷し、超音波振動に２０分掛け、濾過し、同様の溶剤１５ｍｌで３回残滓と濾紙を洗浄し、フラスコに戻す。６０℃のウォーターバスで乾燥させ、１０ｍｌのクロロホルムを使用してすべて溶解させる。５ｍｌを正確に採取し、少量分液漏斗に移し、６ｍｌのクロロホルムと２ｍｌ緩衝液(ｐＨ＝５．０，０．２Ｍフタル酸水素カリウム緩衝液)を加える。１ｍｍｏｌ・Ｌ−１のＢＴＢで滴定しつつ絶え間なく振動させ、終点に近づいた時点で、クロロホルム層を分離し、新たにクロロホルムを５ｍｌ再度加える。滴定を続け、絶え間なく振動させて混ぜ合わせる。水層が黄色くなったら終点である。アルカロイド（ハマナツメアルカリＢでアルカロイドを計算）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物のアルカロイド含有量は１０７ｍｇだった。
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を０．１ｇずつ、３サンプル採取し、５０ｍｌ容器に移す。エタノールを適量加え、超音波で溶解させ、冷ます。エタノールを一定量加えよく混ぜる。精密に１ｍｌ採取し、１０ｍｌの容器に移す。７０％エタノールを一定量加え、よく混ぜる。精密に３ｍｌ採取し、２５ｍｌの容器に移し、３４０ｎｍ波長の吸光度を測定し、被験薬溶液中の総クマリン含有量（クマリンはウンベリフェロンで計算する）を算出する。結果、１ｇのハマナツメ抽出物の総クマリン含有量は１８６ｍｇだった。

（II）ハマナツメ製剤の製造
１．タブレット剤の製造
ハマナツメ全体エタノール抽出物を３００ｇ採取し、適切な補材、例えば１００ｇ微晶質セルロース、５７．５ｇ乳糖、２０ｇクロスカルメロースナトリウム等を加え、タブレット剤を製造する。

２．カプセル剤の製造
ハマナツメ茎葉酢酸エチル抽出物を採取し、適切な補材を加える。例えば乳糖、加圧性澱粉、カルボキシメチル澱粉、微晶質セルロース等でカプセル剤を製造する。

３．顆粒剤の製造
ハマナツメ全体メタノール抽出物を採取し、適量の補材を加える。例えば、乳糖、澱粉、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、微粉シリコン等で顆粒剤を製造する。

４．軟膏剤の製造
ハマナツメ茎葉ベンジン抽出物を採取し、適量の補材を加える。例えばステアリルアルコール、グリセロールモノステアレート、グリセリン、ステアレート等で軟膏剤を製造する。

５．栓剤の製造
ハマナツメ全体エタノール抽出物を採取し、適量の補材を加える。例えば混合脂肪酸グリセリド、ＰＥＧ、蜜ろう等で栓剤を製造する。

（III）ハマナツメ抽出物の用途の薬理学検証
１．エタノール、メタノール、ベンジン抽出物及び酢酸エチル抽出物の幽門結紮によるラットの実験的胃潰瘍に対する影響
ＳＤラット８０匹を体重に基づき８グループ、それぞれモデル対照グループ（０．５％トラガカント）、陽性対照グループ（ラニチジン）、酢酸エチル抽出物少量投薬グループ、酢酸エチル抽出物中量投薬グループ、酢酸エチル抽出物大量投薬グループ、エタノール抽出物グループ、メタノール抽出物グループ、ベンジン抽出物グループに分類する。被験薬を毎日１回、３日間胃管投薬する。最終投薬から１時間後幽門結紮術を行い、術後１５時間後に動物を頸椎脱臼で殺処分する。胃を採取し、１％ホルムアルデヒドで２０分固定した後解剖する。顕微鏡で粘膜損傷状況を観察し、潰瘍指数と潰瘍抑制率を算出する。

結果は表１９の通りである。ハマナツメ酢酸エチル抽出物は０．２ｇ／ｋｇ及びそれ以上の胃管投薬３回で明確に幽門結紮によるラットの胃潰瘍を抑制し、尚且つ０．４ｇ／ｋｇ投薬量グループの作用強度はラニチジン６０ｍｇ／ｋｇと比べて顕著な差異は認められなかった。エタノール、メタノール、ベンジン抽出物１．２ｇ／ｋｇも効果的に胃潰瘍を抑制でき、四種の抽出物は胃潰瘍に対してよい作用をもたらすことが分かった。

２．エタノール、メタノール、ベンジン抽出物及び酢酸エチル抽出物の２，４，６−トリニトロトルエンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるラットの実験的結腸炎に対する影響
ＳＤラット９０匹を体重に基づき９グループ、それぞれ仮手術対照グループ（０．５％トラガカント）、モデル対照グループ（０．５％トラガカント）、陽性対照グループ（デキサメタゾン）、酢酸エチル抽出物少量投薬グループ、酢酸エチル抽出物中量投薬グループ、酢酸エチル抽出物大量投薬グループ、エタノール抽出物グループ、メタノール抽出物グループ、ベンジン抽出物グループに分ける。動物には絶食２４時間後ペントバルビタールナトリウムで麻酔を行い、ＴＮＢＳと４０％エタノールで浣腸し、実験的結腸炎モデルを再現する。再現後６時間から被験薬を投薬する。投薬後５日、尾静脈から採血し、白血球数を算出する。第６日にウレタン麻酔を行い腹主動脈から採血した後、頸椎脱臼で殺処分する。肛門から口側に向かって９ｃｍの結腸を採取し、冷水のウォーターバスにて腸膜を切開、内容物を洗浄し、潰瘍面積を計測し、潰瘍面積％を算出する。結腸の重さを測った後、結腸粘膜を採取し、ＥＬＩＳＡで腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−ａ）濃度を測定する。

結果は表２１の通りである。ＴＮＢＳによるラットの実験的結腸炎は炎症細胞の増加、炎症細胞因子レベルの上昇と結腸表面の潰瘍を引き起こす。ハマナツメ酢酸エチル抽出物０．２ｇ／ｋｇ及びこれ以上の投薬量は白血球及び重要な発炎因子ＴＮＦ−ａの増加と潰瘍面積を抑制できた。エタノール、メタノール、ベンジン抽出物１．２ｇ／ｋｇと酢酸エチル抽出物の作用とは類似しており、四種類の抽出物は比較的良好な抗結腸炎作用を有していた。

３．エタノール、メタノール、ベンジン抽出物及び酢酸エチル抽出物のアンモニア水によるラット実験的慢性胃炎に対する影響
ＳＤラット１２０匹を体重に基づき１０グループ、それぞれ正常対照グループ（０．５％トラガカント）、モデル対照グループ（０．５％トラガカント）、陽性対照グループ（三九胃泰顆粒）、酢酸エチル抽出物少量投薬グループ、酢酸エチル抽出物中量投薬グループ、酢酸エチル抽出物大量投薬グループ、エタノール抽出物グループ、メタノール抽出物グループ、ベンジン抽出物グループに分ける。全ての動物に対して０．０２％のアンモニア水を毎日１回、９０日間、胃管投薬する。同時に被験薬を１日１回、連続９０日胃管投薬する。最終投薬の翌日に動物を頸椎脱臼で殺処分する。胃上辺を採取し、１０％のホルマリンで固定、パラフィン埋蔵し、切片をＨＥ及びＰＡＳで染色する。ＨＥ染色で炎症反応状況をカウントし、胃体部粘膜の厚さを計測する。ＰＡＳ染色は陽性層の厚さと粘液層の厚さを測定する。

結果は表２１の通りである。ハマナツメ酢酸エチル抽出物はアンモニア水による実験的慢性胃炎に対する炎症抑制レベル、胃粘膜と粘液層の厚さに対する増加効果、特に炎症抑制及び粘液層の増加に顕著な効果があった。エタノール、メタノール、ベンジン抽出物１．２ｇ／ｋｇ及び酢酸エチル抽出物の作用は類似しており、四種の抽出部は良好な抗慢性胃炎があることがわかった。

４．酢酸エチル抽出物と三九胃泰併用の幽門結紮によるラットの実験的胃潰瘍の影響
ＳＤラット５０匹を体重に基づき５グループ、それぞれモデル対照グループ（０．５％トラガカント）、陽性対照グループ（ラニチジン）、酢酸エチル抽出物グループ、三九胃泰グループ、同時投薬グループに分ける。胃管で被験薬を毎日１回、３回投薬する。最終投薬後１時間後に幽門結紮術を行い、術後１５時間で頸椎脱臼による殺処分を行う。胃を採取し、１％ホルムアヒデビドで２０分固定した後解剖する。顕微鏡で粘膜損傷程度を観察し、潰瘍指数と潰瘍抑制率を算出する。

結果は表２２の通りである。ハマナツメ酢酸エチルは０．２ｇ／ｋｇの胃管投薬３回で幽門結紮によるラットの胃潰瘍に顕著な抑制効果を見せた。単独で使用した三九胃泰は特に影響はなかったが、本発明の抽出物と併用すると顕著な抗胃潰瘍効果をみせた。抗胃潰瘍薬物或いは併用に協同作用が見られた。

５．酢酸エチル抽出物と三九胃泰併用のアンモニア水によるラットの実験的慢性胃炎に対する影響
本試験は薬効学試験２と同時に行った。結果は表２１を参照する。正常対照グループ及びモデル対照グループは共用した。結果、三九胃泰は顕著に粘膜層の厚みを増加させ、炎症を抑制したが、粘膜層の厚みに影響は見られなかった。本発明の抽出物と併用した後、三九胃泰の効果をある程度強化し、粘膜層の厚みを効果的に増加させた。他の慢性胃炎薬物とは協同作用があるとみられる。

上記を総括すると、本発明のハマナツメ抽出物或いは原型薬剤ハマナツメには顕著な抗腫瘍活性、抗真菌活性、抗繊維化と双方向免疫調整作用があり、口腔及び消化器炎症と潰瘍に対する治療効果があることがわかる。

（付記）
（付記１）
ハマナツメの医薬製造における抗線維化の使用。

（付記２）
ハマナツメの医薬製造における抗真菌活性の使用。

（付記３）
ハマナツメの医薬製造における抗腫瘍活性の使用。

（付記４）
ハマナツメの医薬製造における口腔及び消化器炎症或いは／及び潰瘍関連疾患治療の使用。

（付記５）
ハマナツメの医薬製造における双方向免疫調整作用の使用。

（付記６）
ハマナツメはハマナツメ植物全体或いは任意の一部を使用し、
好ましくは、前記一部が根、茎、葉、花、果実の一部或いはそれらの混合であり、
さらに好ましくは、前記一部が葉の部分、であることを特徴とする付記１−５のいずれか一つに記載の用途。

（付記７）
ハマナツメ植物全体或いはその一部を薬剤の原材料として、一般的な方法で製造すること、を特徴とするハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記８）
製造方法一は、
Ａ、ハマナツメ植物全体或いはその一部を薬剤の原材料とし、
Ｂ、溶剤で抽出し、乾燥させることで得られることを含むこと、を特徴とする付記７に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記９）
製造方法二は、
Ａ．ハマナツメ植物全体或いはその一部を薬剤の原材料とし、
Ｂ．溶剤ａで抽出し濾過濃縮することで、濃縮液を得、
Ｃ．溶剤ｂを用いてステップＢで得た濃縮液を抽出し、液体状物を得、乾燥することで得られ、或いはステップＢで得られた濃縮液を乾燥させることで抽出物１を得、溶剤ｂで抽出、乾燥させることで得られる、を含むこと、を特徴とする付記７に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。
ステップＡで述べた原材料薬とするハマナツメはその新鮮品、冷凍乾燥品、有機溶媒処理品であり、
好ましくは、有機溶媒処理品の製造方法はハマナツメを有機溶媒で浸漬させ、
さらに好ましくは、有機溶媒はエタノール、メタノール、酢酸エチル、ベンジン、イソアルコール等であり、さらに好ましくはメタノールまたはエタノールを含むこと、を特徴とする付記７または８に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記１０）
前記有機溶媒処理品の有機溶媒はメタノール、エタノール、イソアルコール、酢酸エチル或いはベンジンを含み、好ましくはメタノール或いはエタノールを含むこと、を特徴とする付記９に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記１１）
前記製造方法一のステップＢにおいて、前記溶剤にはメタノール、エタノール、イソアルコール、酢酸エチル或いはベンジンが含まれ、好ましくはメタノール或いはエタノールを含むこと、を特徴とする付記８に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記１２）
前記製造方法一のステップＢにおいて、採用する方法は浸漬、回流または滲出であること、を特徴とする付記８に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記１３）
前記製造方法一のステップＢにおいて、乾燥方法は減圧乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥或いはマイクロウェイブ乾燥であること、を特徴とする付記８に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記１４）
前記製造方法二のステップＢにおいて、前記溶剤ａにはメタノール或いはエタノール、イソアルコールが含まれ、好ましくはメタノール或いはエタノールを含むこと、を特徴とする付記８に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記１５）
前記製造方法二のステップＣにおいて、前記溶剤ｂには酢酸エチルまたはベンジンが含まれること、を特徴とする付記８に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記１６）
前記製造方法二のステップＢ及びステップＣにおいて、抽出方法は浸漬法、回流法滲出法或いは抽出法であること、を特徴とする付記８に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記１７）
前記製造方法二のステップＢ及びステップＣにおいて、乾燥方法は減圧乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥或いはマイクロウェイブ乾燥であること、を特徴とする付記８に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記１８）
前記製造方法一のステップＢにおいて、溶剤とハマナツメの用量関係について、溶剤添加量はハマナツメ質量の１−２０倍であり、
好ましくは、溶剤添加量はハマナツメ質量の５−１５倍であり、
更に好ましくは、溶剤添加量はハマナツメ質量の８−１０倍であり、
溶剤としてメタノール或いはエタノールを採用した場合、メタノール或いはエタノール添加量はハマナツメ質量の１−２０倍であり、
前記製造方法二のステップＢにおいて、溶剤ａとハマナツメの用量関係は、溶剤ａ添加量はハマナツメ質量の１−２０倍であり、
好ましくは溶剤ａ添加量はハマナツメ質量の５−１５倍であり、
更に好ましくは溶剤ａ添加量はハマナツメ質量の８−１０倍であること、を特徴とする付記８に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記１９）
エタノールの濃度は１０−９５％であり、
好ましくはエタノール濃度が５０−９５％のものを採用し、
更に好ましくは、エタノール濃度が９５％のものを採用すること、を特徴とする付記１０、１１、１４或いは１８に記載のハマナツメ抽出物の製造方法。

（付記２０）
付記７−１９のいずれか一つに記載の製造方法で得るハマナツメ抽出物。

（付記２１）
主な成分にはフラボン類、テルペノイド類、アルカロイド類、クマリン類が含まれ、
好ましくは前記フラボン類、テルペノイド類、アルカロイド類、クマリン類グリコシド及びその単体成分及び多糖類とセルロースが含まれること、を特徴とする付記２０に記載のハマナツメ抽出物。

（付記２２）
ハマナツメ抽出物の活性成分に薬学上使用可能な補材を加えて製剤に加工すること、を特徴とする付記２０或いは２１に記載のハマナツメ抽出物の薬物混合物。

（付記２３）
前記製剤は内服製剤、注射製剤、外用製剤、放出制御製剤或いは希釈製剤であり、
好ましくは、内服製剤はタブレット剤、カプセル剤、顆粒剤、微丸剤、微球剤、または滴丸剤であり、
好ましくは、外用製剤は貼り薬、軟膏剤、ジェル剤、塗膜剤、湿布剤、栓剤、洗剤或いは噴霧剤であること、を特徴とする付記２２に記載のハマナツメ抽出物の薬物混合物。

（付記２４）
抗繊維化薬物の製造における付記２０或いは２１に記載のハマナツメ抽出物の用途。

（付記２５）
前記線維化は肺線維化、腎線維化、肝線維化、および心筋線維化を含むこと、を特徴とする付記２４に記載の用途。

（付記２６）
線維化を治療する中医薬と西洋医薬とを併用すること、を特徴とする付記２４に記載の用途。

（付記２７）
前記中医薬、西洋医薬は、三七人参サポニン、リグストラジン、丹参、刺五加注射液、リグストラジン注射液、紅花注射液、銀杏フラボングリコシド、生脉、丹参注射液、双黄連、香丹注射液、益气活血顆粒、抗繊顆粒、肺康顆粒、百合固金丸、ｐｏｗｄｅｒ ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｇｅｃｋｏ ｇｉｎｓｅｎｇ ｐｉｌｌｓ、ゲンゲ、西紅花、生地黄、三七、絞股藍、姜黄、黄葵、アミグダリン、テトランドリン、大黄素、エンテカビル、ラミブジン、β-カロテン、ビタミンＥ、ホスファチジルコリン、Ｓ−腺グリコシドメチオニン、プロスタグランジン、プロスタグランジンＥ２、コルヒチン、エストロゲン、アンギオテンシンＩＩレセプター阻害剤、交感神経系統抑制剤、インターフェロン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ抑制剤、ヘパリン、シルビニン、ウルソデオキシコール酸からなる群より選択されるものであること、を特徴とする付記２６に記載の用途。

（付記２８）
抗腫瘍活性の薬物の製造における付記２０或いは２１に記載のハマナツメ抽出物の用途。

（付記２９）
腫瘍治療効果がある中医薬または西洋医薬を加えること、を特徴とする付記２８に記載の用途。

（付記３０）
前記中医薬または西洋医薬は放射線治療、免疫治療、ＤＮＡ損傷の化学療法剤、インターフェロン複製の化学療法剤と免疫調節薬物であり、
好ましくは、ＴｏｐｏＩ抑制剤、ＴｏｐｏＩＩ抑制剤、アルキル化剤、ＤＮＡ嵌合剤、ＤＮＡ嵌入剤とフリーラジカル発生剤、細胞複製を阻害する化学療法剤、ＴＫ抑制剤、プロテアーゼ抑制剤、癌の表現タンパクと結合して細胞複製力を低下させる抗体、タンパク或いは酵素抑制剤、その他腫瘍を治療する中医薬、西洋医薬はイリノテカン、トポテカン、カンプトテシン及びその類似物或いは代謝物、ドキソルビシン、エトポサイドグリコシド、テニポサイドグリコシド、ダウノルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、メトトレキサート、ミトマイシンＣ、シクロホスファミド、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ベロマイシン、５−フルオロウラシル、カペシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シトシンアラビノシドグリコシド、メルカプトプリン、チオグアニンヌクレオチド、ペントスタチン、ヒドロキシカルバミド、パクリタキセル、イチイテルペノイド及びその関連類似物、ビンクリスチン、ビンかアルカロイド及び関連類似物、サリドマイド及びその関連類似物、メシル酸イマチニブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、華蟾素、姫松茸、珍珠梅酢酸エチル抽出物、ライチ核水提液、当雷公藤紅素、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓｕｓ Ｂｅｌｌａｔｕｓ、カルボキシメチル、Ａｌｉｓｏｌエキス濃縮物、甘草多糖、アンジェリカ・シネンシス多糖類、ソラレン、五味子多糖からなる群より選択されるものであること、を特徴とする付記２９に記載の用途。

（付記３１）
抗真菌活性の薬物の製造における付記２０或いは２１に記載のハマナツメ抽出物の用途。

（付記３２）
口腔及び消化器炎症或いは／及び関連疾患の薬物の製造における付記２０或いは２１に記載のハマナツメ抽出物の用途。

（付記３３）
双方向免疫調節作用の薬物の製造における付記２０或いは２１に記載のハマナツメ抽出物の用途。

（付記３４）
双方向免疫調節作用は免疫機能異常によって引き起こされる免疫機能低下或いは／及び自己免疫疾患のためであること、を特徴とする付記３３に記載の用途。

（付記３５）
免疫機能異常の免疫機能低下には風邪、だるさ、腫瘍或いはエイズが含まれること、を特徴とする付記３４に記載の用途。

（付記３６）
免疫機能異常の自己免疫疾患にはリウマチ性関節炎、ＳＬＥ、強皮症、甲状腺機能亢進、青少年糖尿病、原発性血小板紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、潰瘍性結腸炎或いは慢性肝炎が含まれること、を特徴とする付記３４に記載の用途。

Claims (1)

1. ハマナツメの医薬製造における抗腫瘍活性の使用。