KR20210102152A - 동과씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 조성물 - Google Patents

동과씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동과씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

동과씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 조성물{A COMPOSITION FOR IMMUNE ENHANCEMENT COMPRISING BENICASA HISPIDA EXTRACT}
본 발명은 동과씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물에 관한 것으로, 의약품 및 식품 등 다양한 용도로서 활용 가능하다.
모든 생물체는 생명을 영위하기 위해 끊임없이 많은 영양소를 필요로 하며, 이러한 영양소는 식품의 형태로 항상 외부로부터 공급되거나 일부는 체내에서 합성된다.
음식물 속에는 인간의 생명현상을 유지하는데 필요한 물질들이 포함되어 있으며, 인간은 음식물을 섭취하여 소화기관에서 소화시키고 흡수하여 체내의 조직세포에 공급함으로써 생명을 유지하고 있다.
따라서 좋은 영양은 건강한 신체를 유지시켜주며, 건강한 신체는 건강한 정신을 보장한다.
영양은 직접, 간접으로 질병의 원인이 되기도 하며, 질병의 예방 및 치료에도 관여하는 것으로 알려져 있는데, 인체에 필요한 영양소의 균형섭취 제대로 이루어지지 않아 생기는 영양분의 부족도 문제이고, 과잉섭취 또한 심각한 문제이며, 이로 인해 각종 질병이 유발될 수 있다.
최근 생활수준이 높아지고 식생활이 서구화되면서 영양과잉, 운동부족 등으로 인한 비만, 당뇨, 고혈압 및 심장병 등과 같은 성인병 발병률이 증가하고 있다. 또한 평균수명 연장으로 인하여 인구가 점차 노령화되면서 건강에 대한 관심이 점차 높아지고 있다.
건강증진(health promotion)은 질병, 특히 만성 퇴행성질환이나 감염증, 계속되는 스트레스에 대한 저항력의 증가, 일상의 활동력의 증대를 꾀하는 것으로 이를 위해 영양의 개선, 면역기능 강화, 적절한 운동과 휴식, 정신적 활동의 지속 등 생활양식 전반에 미치는 관리가 요구된다.
한편, 최근 들어 체형의 서구화 및 평균 신장의 상승으로 인하여 키 성장인자에 대한 관심이 높아지고 있다.
성장을 광의의 개념으로 정의하면 신장의 증가뿐 아니라 신체 각 기관의 크기와 기능의 증대를 포함하는 것이라 할 것이나, 이를 협의의 개념으로 정의하자면 신장의 증가를 의미하는 것으로 볼 수 있다.
신장의 증가는 영양과 성장 호르몬 등의 여러 요인에 의한 연골 조직의 합성, 골격 길이 성장 및 골격 조직의 광범위한 증식을 포함하는 골격 대사를 통하여 이루어진다.
골(骨) 조직은 특수하게 분화된 형태의 결합 조직으로, 간엽세포, 연골세포, 조골세포, 파골세포, 골수세포 등 여러 종류의 세포로 구성된 결합조직이다.
파골세포에 의한 골 흡수량과 조골세포에 의한 골 형성량 사이에는 균형이 유지되고 있는데, 성장기에는 조골세포에 의한 골 형성 능력이 최고치에 이르러 골 형성량이 골 흡수량을 훨씬 능가하게 되므로 뼈 성장이 이루어진다.
특히 과거 병적인 상태의 성장부진에 쓰이던 성장호르몬 요법이 근래에 키 성장에 대한 관심이 높아져 감에 따라 정상 신장을 가지고 있는 성장기 어린이 및 청소년에게도 적용되고 있다.
그러나 상기 성장 호르몬 제제 투여법은 성장 호르몬이 부족한 사람의 경우에는 뛰어난 효과를 보이지만, 호르몬 분비가 정상적인 대다수의 사람들에게는 말단 비대증, 성장 호르몬 항체 양성, 전신 알레르기 반응, 갑상선 기능 저하증 등의 여러 가지 부작용을 야기할 수 있는 문제점이 있다.
뿐만 아니라 성장호르몬 요법의 기간과 비용이 과도하고, 암 발생 및 다른 성장인자들의 교란을 일으키는 등의 문제점이 발견되고 있으며, 성장 촉진을 위한 건강보조식품은 과학적으로 검증되지 않은 경우가 대부분이다.
따라서, 성장 촉진에 있어서 그 효능이 과학적으로 검증되고, 안전한 식품소재의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 연구를 통해 동과씨 추출물이 면역세포를 활성화시킴으로써 면역기능을 증강시킬 뿐만 아니라 뼈의 형성에 관여하는 조골세포의 분화를 촉진함으로써 뼈 건강 개선에도 도움을 줄 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 생체 안전성이 우수한 천연 식물 유래의 기능성 식의약품을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 동과씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물이 제공된다.
일 실시예에 있어서, 상기 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 핵산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매로 추출될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 뼈 건강 개선 또는 성장 촉진 용도를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 골 질환 예방 또는 개선 용도를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 골 형성 부전증, 골연화증, 골량 감소증, 골절, 골 결손 및 고관절 감소증으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 로스팅(roasting) 동과씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물이 제공된다.
일 실시예에 있어서, 상기 동과씨는 150 내지 300℃에서 5 내지 50분간 로스팅될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 뼈 건강 개선 또는 성장 촉진 용도를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 천연 추출물을 유효성분으로 포함하여 생체 안전성이 우수할 뿐만 아니라 면역 증진 활성 및 뼈 건강 개선 효과가 우수하므로 건강기능식품 뿐만 아니라 골 질환의 치료 용도로서 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 동과씨 추출물의 세포 독성을 평가한 결과이다. (A)는 동과씨 열수 추추물, (B)는 동과씨 에탄올 추출물, (C)는 로스팅된 동과씨 열수 추출물 (D)는 로스팅된 동과씨 에탄올 추출물이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 동과씨 추출물의 면역 증진 활성을 평가(NO assay)한 결과이다. (A)는 동과씨 열수 추추물, (B)는 동과씨 에탄올 추출물, (C)는 로스팅된 동과씨 열수 추출물 (D)는 로스팅된 동과씨 에탄올 추출물이다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 동과씨 추출물의 면역 증진 활성(TNF-a, IL-6 생성량)을 평가한 결과이다. (A)는 동과씨 열수 추추물, (B)는 동과씨 에탄올 추출물, (C)는 로스팅된 동과씨 열수 추출물 (D)는 로스팅된 동과씨 에탄올 추출물이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 동과씨 추출물의 조골세포 분화 촉진 활성을 평가한 결과이다. (A)는 동과씨 에탄올 추출물, (B)는 로스팅된 동과씨 에탄올 추출물이다.
도 6 및 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 동과씨 추출물의 ALP활성을 평가한 결과이다. (A)는 동과씨 에탄올 추출물, (B)는 로스팅된 동과씨 에탄올 추출물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다.
또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세히 기술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 아니함은 자명하다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 동과씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물이 제공된다.
상기 “동과씨”는 박과의 한해살이 덩굴성 식물로 동과 또는 동화의 성숙한 종자를 일컫는다. 상기 동과(winter melon)는 주로 아시아의 아열대 지역과 우리나라 남부지역에 분포하며, 여름에 개화하여 가을에 호박모양의 긴 타원형 열매를 맺는데, 열매 속 종자에는 사포닌, 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid) 및 불포화지방산 등과 같은 성분이 다량 함유되어 있다.
상기 동과는 식용 또는 약용하여 왔고, 과거에는 동화선, 동화누르미, 동화적, 동화돈채 등 다양한 조리법으로 식용한 것으로 보고되고 있고 있다.
한편, 동과씨는 동과자, 백과자(白瓜子), 동과인(冬瓜仁)이라고도 불리우며, 늦여름부터 초가을 사이에 여문 씨를 받아 햇볕에 말려 약재로 사용되고 있다.
상기 동과씨는 거담, 해열, 이뇨, 소염, 위궤양 예방, 히스타민 분비억제, 항종양, 항비만, 고혈압 예방, 당뇨 및 고혈당에 의한 혈관손상 치료, 비알코올성 지방간 개선 및 피부미용 등 다양한 효능을 가지는 것으로 알려져 있으나, 면역 활성이나 뼈의 형성과 관련된 효능은 알려진 바 없으며, 본 발명자들은 상기 동과씨 추출물의 면역 증진 활성이나 이를 이용한 골 질환 치료 효과를 규명하고자 하였다.
상기 “면역(immunity)”은 생물체 내에서 병원체와 종양 세포 등을 탐지한 후 무력화하여 질병으로부터 생명체를 보호하는 기작을 의미하는 것으로, 상기 “면역 증진(Immunostimulation)”은 암 및 염증 등과 같은 다양한 질환에 대한 신체 방어 기전을 보강하는 일련의 치료학적 또는 예방학적 전략을 모두 포함할 수 있다.
상기 “유효성분으로 포함하는”은 투여하고자 하는 개체에 대한 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 양을 포함하는 것을 의미하며, 상기 동과씨 추출물은 생체 안전성이 우수하므로 당업자가 양적 상한을 적절히 조정할 수 있다.
상기 “추출물”은 용매와 추출 원료를 특정 조건 하에서 접촉시킴으로써 추출 원료에 함유된 유효성분이 전이된 용매를 지칭하는 것으로, 천연물로부터 원료에 함유된 성분을 분리해낸 물질이라면, 추출 방법이나 성분의 종류와 무관하게 모두 포함할 수 있다. 예컨대, 물이나 유기용매를 이용하여 천연물로부터 용매에 용해되는 성분을 추출한 것, 천연물의 특정 성분, 예컨대 오일과 같은 특정 성분만을 추출하여 얻어진 것 등을 모두 포함할 수 있다.
상기 추출물은 동과씨를 건조 후 분말화하거나, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득할 수 있다.
상기 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 핵산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매로 추출될 수 있고, 바람직하게는 60 내지 90%(w/w) 농도의 에탄올에 의해 추출될 수 있다.
상기 원료에 포함된 유효성분은 용매의 극성에 따라 추출 비율이 상이해질 수 있으므로, 용매에 따른 생리 활성 물질의 선택성을 고려하여 달리할 수 있다.
상기 추출물은 추출 원료를 물로 수세한 후 건조 및 분쇄하여, 원료 중량의 8 내지 12배에 달하는 부피의 용매로 약 1 내지 24시간 동안 환류 순환 추출, 가압 추출, 초음파 추출 등 통상적인 방법으로 추출 및 여과하여 제조할 수 있다.
상기 추출물은 감압 증류 또는 동결 건조 등과 같은 추가적인 공정에 의해 분말 상태로 수득할 수 있다.
상기 추출물은 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 추출물은 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획물을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 골 질환 예방 또는 개선 용도를 더 포함할 수 있다.
상기 골 질환(bone disease)은 조골세포의 활성 촉진 또는 파골세포의 활성 억제를 통해 골량 증가가 필요 또는 요구되는 상태 또는 질병을 의미하는 것으로, 예컨대, 대사성 골 질환 또는 정형외과적 골 질환일 수 있다.
상기 “대사성 골 질환”은 파골세포의 과다한 생성 또는 활성으로 인해 나타나는 상태 또는 질병을 의미하며, 골량 저하 질환을 포함할 수 있다. 상기 골량 저하 질환이란 골밀도의 저하, 골조직의 연화 등의 증상을 수반하는 골량의 저하가 나타나는 상태 또는 질환을 의미한다.
상기 골 질환은 골다공증, 골 형성 부전증, 골연화증, 골량 감소증, 골절, 골 결손 및 고관절 감소증으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 성장 촉진 또는 뼈 건강 개선 용도일 수 있다.
상기 “성장”이란 단순히 신장이 증가하는 것뿐 만 아니라 신체 각 기관의 해부학적, 형태학적 크기와 기능이 증가하는 것, 즉 기능의 발달 및 기관으로의 분화를 모두 의미할 수 있다.
상기 식품 조성물은 동과씨 추출물을 포함하여 뼈 길이를 성장시키고, 성장판 연골세포의 대사를 촉진하는 등 부작용 없이 우수한 성장 촉진 효과를 가져올 수 있어 특히 어린이 성장 촉진용 식품소재로서 유용하게 사용될 수 있다.
상기 “뼈 건강”은 정상적인 뼈의 분해와 재형성이 일어나는 것을 의미하며, 체내 칼슘이 부족하거나 여러 가지 외부 요인으로 인해 뼈의 분해와 재형성 균형이 깨지면 골다공증, 골관절염 등 골 관련 질환이 발생할 수 있다.
상기 조성물은 조골 세포의 분화에 영향을 미치며 골 재생을 촉진함으로써 관절 및 뼈 건강을 효과적으로 유지시킬 수 있다.
상기 조성물은 식품 조성물, 예컨대 면역 증진, 성장 촉진이나 골 질환 관련 건강기능식품으로서 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 상기 기능성은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미할 수 있다.
상기 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 적합성 여부를 판단할 수 있다.
상기 식품 첨가물 공전에 기재된 품목은 예컨대 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류를 들 수 있다.
상기 조성물은 면역 증진, 또는 골 질환의 개선을 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 면역 증진, 또는 골 질환의 개선을 목적으로 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조 및 가공될 수 있다.
구체적으로 상기 정제 형태의 건강기능식품은 동과씨 추출물, 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
상기 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 동과씨 추출물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캅셀제는 동과씨 추출물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 솔비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 환 형태의 건강기능식품은 동과씨 추출물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.
상기 과립형태의 건강기능식품은 동과씨 추출물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
또한, 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 동과씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
또한, 상기 조성물은 면역활성을 증진시킴으로써, 면역결핍, 면역저하 또는 면역계 손상으로 인한 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다
상기 “예방”은 병리학적 현상의 발생 빈도 또는 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 예방은 완전할 수 있으며 또는 부분적일 수도 있다. 이 경우에는 개체 내의 염증에 의해 발생되는 증상이 상기 조성물을 사용 하지 않은 경우와 비교하여 감소하는 현상을 의미할 수 있다.
상기 “치료”는 치료하고자 하는 대상 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위하여 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하며, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위하여 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과는 질병의 발생 또는 재발을 예방하거나, 증상을 완화시키거나, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키거나, 전이를 예방하거나, 질병 진행 속도를 감소시키거나, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키거나, 예후를 개선시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 전신 또는 국소 투여될 수 있으며, 상기 투여는 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다.
상기 조성물은 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 사용될 수 있고, 상기 고형제제는 상기 동과씨 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 또한, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있고, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양이 대상체에 투여될 수 있다. 상기 “약제학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 조성물은 인공골, 인공관절, 골 고정재, 골 대체제, 골 수복재, 골 충진재 및 골 이식재로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질에 사용될 수 있다.
상기 골 형성 촉진용 조성물은 골 질환 또는 치주질환의 예방 및 치료용으로 사용될 수 있으며, 인공골, 골 고정재, 골 대체제, 골 수복재, 골 충진재 또는 골 이식재에 적용되기 용이한 형태로 제조될 수 있다.
상기 골 이식재나 골 대체체는 협의로는 골 조직 내의 공간을 충진하는 용도로 사용될 수 있고, 광의로는 뼈나 치아의 일부를 대체하는데 사용될 수 있다. 따라서, 상기 골 형성 촉진용 조성물은 압착, 압축, 가압접촉, 패킹, 압박, 굳힘 등의 방법을 사용하여 퍼티, 페이스트, 주형 가능한 스트립, 블록, 칩 등의 형태로 사용될 수 있고, 화학적 첨가물을 이용하여, 겔, 과립, 페이스트, 정제, 펠렛 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 분말 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 로스팅(roasting) 동과씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물이 제공된다.
상기 "로스팅(roasting)"은 150℃ 이상의 높은 건열을 사용해 수분을 더하지 않고 가열하는 방법이다. 상기 로스팅을 위한 가열 장치는 오븐, 가스레인지, 전자레인지 등이 될 수 있으나, 온도를 조절할 수 있는 가열 장치라면 특별히 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 동과씨는 150 내지 300℃에서 5 내지 50분간 로스팅될 수 있고, 바람직하게는 200 내지 250℃에서 10 내지 15분간 로스팅될 수 있다.
상기 로스팅에 의해 동과씨에 함유된 다양한 유효성분의 함량이 증감할 수 있으며, 본 발명자들은 상기 로스팅 공정에 의해 면역 증진 활성이 현저히 증대될 수 있음을 규명하였다.
이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.
제조예 1 : 열수 추출물(HR1910-W) 제조
파쇄한 동과씨 건조물에 100배의 정제수를 넣고 100 ℃에서 4시간 동안 가열한 후 여과하였다.
수득한 액상 추출물을 회전감압농축기로 농축(20 brix)한 후 동결건조기를 이용하여 동과씨 추출물을 수득하였다. 분말화하여 수득한 추출물의 수율은 건조물 대비 13.3%였다.
제조예 2 : 에탄올 추출물(HR1910-70E) 제조
파쇄한 동과씨 건조물에 100배의 에탄올(70% v/v)를 넣고 100 ℃에서 4시간 동안 가열한 후 여과하였다.
수득한 액상 추출물을 회전감압농축기로 농축(20 brix)한 후 동결건조기를 이용하여 동과씨 추출물을 수득하였다. 분말화하여 수득한 추출물의 수율은 건조물 대비 6.4%였다.
제조예 3 : 로스팅 열수 추출물(HR1910-S-W) 제조
동과씨 건조 시료에 대한 가열처리(로스팅)를 수행하였다. 미리 충분히 예열 후 로스팅 공정을 수행하였다. 가열온도는 200℃, 250℃, 300℃이었으며, 각 온도에서 10분, 15분, 20분 시간 범위에서 위즈웰 컨벡션 전기오븐(CKF 4D)를 이용하여 로스팅을 수행하였다.
각 조건에서 각 로스팅된 동과씨는 동등한 수준의 활성이 나타났으나, 250℃에서 15분간 로스팅된 동과씨의 활성이 가장 우수하였으므로 해당 시료로서 활성 평가를 진행하였다.
파쇄한 로스팅 동과씨 건조물에 100배의 정제수를 넣고 100 ℃에서 4시간 동안 가열한 후 여과하였다.
수득한 액상 추출물을 회전감압농축기로 농축(20 brix)한 후 동결건조기를 이용하여 동과씨 추출물을 수득하였다. 분말화하여 수득한 추출물의 수율은 건조물 대비 16.1%였다.
제조예 4 : 로스팅 에탄올 추출물(HR1910-S-70E) 제조
제조예 3과 동일한 방법으로 로스팅을 수행하였다. 250℃에서 15분간 로스팅된 동과씨로 활성 평가를 진행하였다.
파쇄한 로스팅 동과씨 건조물에 100배의 에탄올(70% v/v)를 넣고 100 ℃에서 4시간 동안 가열한 후 여과하였다.
수득한 액상 추출물을 회전감압농축기로 농축(20 brix)한 후 동결건조기를 이용하여 동과씨 추출물을 수득하였다. 분말화하여 수득한 추출물의 수율은 건조물 대비 9.4%였다.
실험예 1 : 세포 배양
세포주인 RAW264.7 macrophage cell은 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas. USA)에서 구입하여 사용하였다.
세포의 배양을 위하여 10% Fetal Bovin Serum(FBS, Hyclone USA), 100 units/mL penicillin/Streptoycin(Hyclone, USA)이 함유된 DMEM(Dulbecco's modified of Eagle's medium, Hyclone,USA) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 존재하의 incubator(Thermo, Forma, Germany)에서 배양하였다.
실험예 2 : 독성 평가(MTT assay)
살아있는 세포 내 미토콘드리아의 탈수소효소에 의해 Tetrazolium salt(WST-1)에서 formazan으로 변화하는 것을 이용하여, 생성된 formazan의 농도를 spectrophotometer로 측정함으로써 세포 생존률을 측정하였다.
Ez-cytox(Dozen, Korea)을 이용하여 프로토콜에 따라 MTT assay를 수행하였다.
Raw264.7 세포를 5x103 cells / 100μL로 96 well에 분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
농도별로 시료를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10% MTT 시약이 포함된 배지로 교체하고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 450 nm 파장에서 microplate reader(Epoch, Biotek)로 측정하였다.
각 시료에 대한 세포생존율에 의한 독성 평가는 3회 반복하여 측정하였으며, 그에 대한 평균값과 표준편차를 산출하였다.
도 1을 참조하면, 제조예 1 내지 4의 추출물은 모든 농도(10, 100, 1000 μg/mL) 범위에서 세포 독성이 나타나지 않았다.
실험예 3 : 면역 효능 평가(NO assay)
Nitric Oxide(NO)의 농도 측정을 위해 그리스 반응(griess reaction)을 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
N-(1-naphthyl)-ethylenediamine, sulfanilamide, 및 NO2 -가 반응하여 azo couling을 이루는데, 두 개의 링 형태가 540nm의 파장에서 최대 흡광도 값을 가진다.
Raw264.7 세포를 5x104 cells / 250μL로 24 well plate 에 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
시료를 농도별로 처리하고 48시간 동안 CO2 배양기에 배양하였다. 세포배양 상등액 50 μL를 취해 N1 buffer 50μL를 혼합하고 5 내지 10분 상온에 반응시켰다. N2 buffer 50 μL를 혼합하여 10분간 반응시킨 후 microplate reader(Epoch, Biotek)를 이용하여 560nm 흡광도를 측정하였다.
동일한 방법으로 3회 측정하였으며, 그에 대한 평균값과 표준편차를 구하였다.
도 2를 참조하면, 동과씨 열수 추출물(제조예 1)의 경우 1000 μg/mL에서 NO 농도가 대조군 대비 약 21% 증가하였으며, 동과씨 에탄올 추출물(제조예 2)은 1000 μg/mL에서 대조군 대비 약 59% 증가하였다.
로스팅된 동과씨 열수 추출물(제조예 3)의 경우 10 μg/mL에서 NO 농도가 대조군 대비 약 75%, 100 μg/mL에서 약 355% 증가하였으며, 1000 μg/mL에서 약 416% 증가하였다.
로스팅된 동과씨 에탄올 추출물(제조예 4)의 경우100 μg/mL에서 NO 농도가 대조군 대비 약 119%, 1000 μg/mL에서 약 226% 증가하였다.
상기 결과는 동과씨 추출물이 면역 증진 효과가 우수할 뿐만 아니라, 로스팅에 의해서 면역 증진 활성이 현저하게 증대될 수 있음을 시사한다.
실험예 4 : 면역 효능 평가(TNF-a 및 IL-6 생성량 평가)
면역 증가 효능을 알아보기 위해 Raw264.7 세포를 5x104 cells/250μL로 24 well plate 에 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
시료를 농도별로 처리하고 4시간동안 CO2 배양기에 배양한 후 세포 부유액을 원심 분리하여 세포들은 침전시켜 상층액을 수집하였다.
상층액 내 TNF-a 및 IL-6 생성량을 ELISA kit(R&D systems Inc., Minneapolis, MN, USA를 이용하여 사용자 매뉴얼에 기재된 방법대로 정량하였다.
도 3을 참조하면, 동과씨 열수 추출물(제조예 1)의 경우 100 μg/mL에서 대조군 대비 TNF-a 양이 약 220 pg/mL 증가하였으며, 1000 μg/mL에서 대조군 대비 약 395 pg/mL 증가하였다.
동과씨 에탄올 추출물(제조예 2)의 경우 10 μg/mL에서 대조군 대비 TNF-a 양이 약 97 pg/mL, 100 μg/mL에서 약 472 pg/mL, 1000 μg/mL에서 대조군 대비 약 494 pg/mL 증가하였다.
로스팅된 동과씨 열수 추출물(제조예 3)의 경우 10 μg/mL에서 대조군 대비 TNF-a 양이 약 296 pg/mL, 100 μg/mL에서 약 429 pg/mL, 1000 μg/mL에서 대조군 대비 약 462 pg/mL 증가하였다.
로스팅된 동과씨 에탄올 추출물(제조예 4)의 경우10 μg/mL에서 대조군 대비 TNF-a 양이 약 339 pg/mL, 100 μg/mL에서 약 432 pg/mL, 1000 μg/mL에서 대조군 대비 약 473 pg/mL 증가하였다.
도 4를 참조하면, 동과씨 열수 추출물(제조예 1)의 경우 100 μg/mL에서 대조군 대비 IL-6 양이 약 156 pg/mL 증가하였으며, 1000 μg/mL에서 대조군 대비 약 643 pg/mL 증가하였다.
동과씨 에탄올 추출물(제조예 2)의 경우 100 μg/mL에서 대조군 대비 IL-6 양이 약 190 pg/mL, 1000 μg/mL에서 대조군 대비 약 709 pg/mL 증가하였다.
로스팅된 동과씨 열수 추출물(제조예 3)의 경우 100 μg/mL에서 대조군 대비 IL-6 양이 약 551 pg/mL, 1000 μg/mL에서 대조군 대비 약 1378 pg/mL 증가하였다.
로스팅된 동과씨 에탄올 추출물(제조예 4)의 경우100 μg/mL에서 대조군 대비 IL-6 양이 약 258 pg/mL, 1000 μg/mL에서 대조군 대비 약 1143 pg/mL 증가하였다.
상기 동과씨는 로스팅 처리하였을 때 특히 낮은 농도에서도 매우 높은 수준의 면역 증진 활성이 확인되었다.
상기 결과는 동과씨 추출물이 면역 증진 효과가 우수할 뿐만 아니라, 로스팅에 의해서 면역 증진 활성이 현저하게 증대될 수 있음을 시사한다.
실험예 5 : 조골세포 분화 활성 평가
뼈 건강 효능을 알아보기 위해 조골세포(MC3T3-E1)를 5x103 cells/100μL로 96 well에 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다.
시료를 농도별로 처리하고 48시간 CO2 배양기에 배양하였다. 배양 후 MTT(EZ-cytox, Daillab) 용액을 처리하고 2시간 동안 CO2 배양 후 450 nm 파장에서 microplate reader(Epoch, Biotek)로 분석하였다.
도 5를 참조하면, 동과씨 에탄올 추출물(제조예 2)의 경우 100 μg/mL에서 조골세포 분화량이 대조군 대비 약 22% 증가하였으며, 1000 μg/mL에서 대조군 대비 약 42% 증가하였다.
로스팅된 동과씨 에탄올 추출물(제조예 4)의 경우1000 μg/mL에서 조골세포 분화량이 대조군 대비 약 34% 증가하였다.
동과씨 열수 추출물(제조예 1), 로스팅된 동과씨 열수 추출물(제조예 3)의 경우 상기 에탄올 추출물과 동등한 수준의 조골세포 분화활성이 확인되었다.
상기 결과는 동과씨 추출물이 조골세포의 분화를 촉진하므로 칼슘과 같은 무기질을 흡착시킴으로써 뼈 건강을 유지함에 있어서 효과적임을 시사한다.
실험예 6 : ALP 활성 평가(ALP assay)
세포 분화를 확인하고자 조골세포에 특이적으로 발현하는 ALP(alkaline phosphatase) 활성도를 측정하였다.
MC3T3-E1(조골세포)를 5x103 cells/250μL로 48 well에 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다.
농도별로 시료를 처리하고 7일 동안 CO2 배양기에서 배양하였다. PBS로 세척하고 Lysis buffer를 첨가하여 용해시킨 후 12,000rpm에서 15분간 원심 분리하였다.
세포막 성분 등을 침전시켜 상층액을 수집하고, ALP assay kit를 이용하여 상층액 내 ALP 활성을 정량하였다.
도 6을 참조하면, 동과씨 에탄올 추출물(제조예 2)의 경우, 100 μg/mL에서 ALP 활성이 대조군 대비 88% 증가하였으며, 1000 μg/mL에서 120% 증가하였다.
로스팅된 동과씨 에탄올 추출물(제조예 4)의 경우1000 μg/mL에서 ALP 활성이 대조군 대비 약 102% 증가하였다.
동과씨 열수 추출물(제조예 1), 로스팅된 동과씨 열수 추출물(제조예 3)의 경우 상기 에탄올 추출물과 동등한 수준의 ALP 활성이 확인되었다.
상기 결과는 동과씨 추출물이 조골세포의 분화를 촉진하므로 무기질을 흡착시켜 뼈 건강을 유지함에 있어서 효과적임을 시사한다.
실험예 7 : ALP활성 평가(Western blot)
배양이 끝난 세포를 수집하여 PBS로 2회 세척 후 lysis buffer을 첨가하여 용해시켰다. 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다.
BSA(bovine serum albumin)를 사용하여 단백질 농도를 표준화하였다. lysate 30μg 10% gel SDS-PAGE로 분리하여 PVDF membrane에 120V, 90분 동안 transfer 하였다.
membrane의 blocking은 5% 탈지유(skim milk)가 함유된 TBS-T 용액에서 1시간 동안 실시하였다.
1차 항체(1:100~1000)는 4℃에서 한 시간 동안 배양시킨 후 다음 날 TBS-T로 3회 세척하였다.
2차 항체로는 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 항마우스(anti-mouse)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.
TBS-T로 3회 세척하고 ECL 기질과 3분간 반응 후 화학 발광(chemiluminescence)을 통해 분석하였다.
도 7을 참조하면, 동과씨 에탄올 추출물(제조예 2)의 경우, 10 μg/mL에서 ALP 활성이 대조군 대비 약 47%, 100 μg/mL에서 대조군 대비 약 136% 증가하였다.
로스팅된 동과씨 에탄올 추출물(제조예 4)의 경우1000 μg/mL에서 ALP 활성이 대조군 대비 약 98% 증가하였다.
동과씨 열수 추출물(제조예 1), 로스팅된 동과씨 열수 추출물(제조예 3)의 경우 상기 에탄올 추출물과 동등한 수준의 ALP 활성이 확인되었다.
상기 결과는 동과씨 추출물이 뼈 건강 관련 작용기전에 영향을 미치며 조골세포의 분화를 조절함으로써 뼈 건강 유지에 있어 효과적임을 시사한다.
실험예 8 : 골 재생 유도 활성 평가
in vivo에서 동과씨 추출물의 골 재생 유도 효과를 확인하기 위해 두개골이 결손된 생쥐에 동과씨 추출물, BMP-2 또는 대조군을 처리한 후, 마이크로 CT(μCT) 및 조직학 분석을 수행하였다.
마이크로 CT(μCT) 분석에 따르면, 동과씨 추출물(1000 μg/mL) 및 BMP-2은 6주 전 구간을 걸쳐 골 형성을 증가시킨 반면, 대조군에서 극소의 골 형성이 유도되었다.
조직학적 시험에 따르면, 제조예 1 내지 4의 시료 처리에 의해 대부분 섬유상 조직인 대조군 영역과 달리 결손 부위의 골 형성이 확인되었다.
실험예 9 : 장골 길이 성장 활성 평가
흰쥐의 골 성장에 대한 동과씨 추출물의 효능을 측정하였다.
측정 방법은 정상적인 골 대사를 관찰하기 위한 방법으로 형광인자가 칼슘과 킬레이트 결합을 통해 골에 침착되는 현상을 이용한 것이다.
골 생성이 가장 활발한 성장기에 형광인자를 투여하면 투여된 형광인자는 골성장판 하부의 골신생부에 가장 많이 침착하여 선을 형성하므로, 시료를 1회 투여한 후 일정 기간 후에 형광선과 성장판 사이의 길이를 형광현미경으로 관찰하여 성장한 길이를 측정하였다.
수집한 절편을 슬라이드 글라스 위에 놓고 건조한 후 형광현미경을 이용하여 골 조직 내 형광인자의 침착으로 형성된 선과 성장판 사이의 길이를 측정함으로써 측정된 랫트의 장골 길이 성장 정도를 측정하였다.
측정 결과, 동과씨 열수 추출물(제조예 1) 및 동과씨 에탄올 추출물(제조예 2)을 투여한 경우 대조군 대비 길이 성장이 각각 19%, 23% 증가하였으며, 제조예 3 및 4의 시료 처리에 의해 동등한 수준의 장골 길이 성장 증가가 확인되었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (4)

  1. 로스팅(roasting) 동과씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 로스팅 동과씨 추출물은 열수 추출된 것인, 면역 증진용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 동과씨는 150 내지 300℃에서 5 내지 50분간 로스팅된 것인, 면역 증진용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 동과씨는 250℃에서 15분간 로스팅된 것인, 면역 증진용 조성물.
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