KR101089716B1

KR101089716B1 - 플라보노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 이들의 합병증의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101089716B1
Application number: KR1020090134236A
Authority: KR
Inventors: 정태숙; 백남인
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2009-12-30
Publication date: 2011-12-07
Also published as: KR20110077610A

Abstract

본 발명은 플라보노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 이들의 합병증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 파르네소이드 엑스 수용체(farnesoid X receptor; FXR)의 활성을 효과적으로 억제하여 간에서의 콜레스테롤 수치를 효과적으로 낮춤으로써 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 이들의 합병증의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

플라보노이드계 화합물, 콜레스테롤 대사 질환, 고지혈증, FXR

Description

플라보노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 이들의 합병증의 예방 및 치료용 조성물{Compositions for the prevention or treatment of hyperlipidemia, hypercholestrolaemia, or complication thereof containing flavonoid compounds or pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient}

본 발명은 플라보노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 이들의 합병증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

체내에 콜레스테롤이 과도하게 축적되면 심혈관계 질환뿐만 아니라 퇴행성 신경질환과 같은 치명적인 질병을 유발시킨다(Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96, 6660). 따라서 간에서의 콜레스테롤 항상성 기작에 따라 잉여콜레스테롤로부터 담즙산이 생성되고, 이 담즙산의 배출은 체내에 과도하게 축적되어 있는 유독한 콜레스테롤을 제거시킬 뿐만 아니라 지용성 필수 비타민의 흡수를 돕는다.

파르네소이드 엑스 핵수용체(farnesoid X receptor; FXR)는 인간의 지질과 콜레스테롤 대사에 관여하는 핵수용체로 알려져 있으며, 체내 쓸개즙 생성의 항상성을 유지하는 중요 인자이다. FXR이 활성화되면 간에서 콜레스테롤 이화작용을 하는 효소인 콜레스테롤 7α 수산화효소(Cholesterol 7α-hydroxylase)의 생성을 억제한다(Science, 1999, 284, 1362; Science, 2001, 294, 1866). 또한 FXR은 산세포에서 콜레스테롤의 분해를 담당하는 cytochrome P450 (CYP) 경로의 담즙 생성 단백질들과 담즙 운반 단백질들의 발현을 저해하여 콜레스테롤의 체외 배출을 저해하며(Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103, 11323; J Biol Chem. 2000, 275, 10918), FXR을 적중시킨 담즙분비 억제모델 마우스에서 담즙을 생성하는 CYP 단백질과 담즙을 분비하는 ABCG8, Mrp4 등 여러 운반체들의 발현을 증가시키고, 반대로 담즙을 재흡수하는 BSEP의 발현을 감소시킴으로써 지질대사가 개선된다고 알려져 있다(Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103, 11323). 따라서, FXR의 활성을 억제하면 생체내의 과도하게 축적된 콜레스테롤을 제거하는데 유용하다. 특히 인도에서 민간요법으로 사용해 온 구굴 나무(guggul tree)로부터 분리한 구굴스테론(guggulsterone)은 FXR의 길항제(antagonist)로 작용하여 고지혈증 치료제로 널리 사용되고 있으며, 간에서의 콜레스테롤 수치를 효과적으로 낮추어 준다(Science, 2002, 296, 1703). 따라서 선택적인 FXR의 활성 억제 물질은 콜레스테롤 대사 질환 및 고지혈증 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

한편, 바이칼레인(baicalein)은 항바이러스(Cell Mol Biol Res, 1993, 39, 119), 항암(Urology, 2000, 55, 951), 항산화(Pharmacol Res, 2001, 43, 173) 등의 약리작용이 보고되어 있으며, 황금추출물(ganhuangenin)은 항산화 작용을 통한 지질과산화 억제(Phytother Res, 1999, 13, 479), 피부 미백(대한민국특허등록, 831419), 노화 억제(대한민국특허등록, 2004107713) 등이 보고되어 있다. 그러나 바이칼레인과 간후안제닌(ganhuangenin)의 FXR의 길항 효과에 대한 생리활성은 전혀 알려지지 않았다.

이에, 본 발명자들은 부작용이 적은 새로운 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 이들의 합병증의 예방 및 치료제를 천연물에서 탐색하던 중, 플라보노이드계 화합물인 바이칼레인(baicalein)과 간후안제닌(ganhuangenin)이 FXR에 대한 억제활성이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 플라보노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 이들의 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 플라보노이드 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 이들의 합병증의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 콜레스테롤 대사 질환 또는 고지혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 플라보노이드 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 이들의 합병증의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 조성물에 포함되는 황금으로부터 분리한 플라보노이드계 화합물은 파르네소이드 엑스 수용체(farnesoid X receptor; FXR)의 활성을 효과적으로 억제하여 간에서의 콜레스테롤 수치를 효과적으로 낮춤으로써 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 이의 합병증의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 플라보노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 이의 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 플라보노이드계 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 바이칼레인(baicalein, 5,6,7-trihydroxyflavone), 하기 화학식 2로 표시되는 간후안제닌(ganhuangenin, 2',5,5',7-tetrahydroxy-6',8-dimethoxyflavone) 또는 이들의 혼합인 것을 포함할 수 있다:

[화학식 1]

[화학식 2]

.

본 발명에 따른 상기 플라보노이드계 화합물은 이의 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물, 용매화물, 시판되는 시약을 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 황금으로부터 추출, 분리 및 정제된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포 스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1 또는 2의 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산 화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속 염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물에 포함되는 플라보노이드계 화합물은 FXR의 억제활성 또는 FXR을 길항하는 작용을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 상기 합병증으로는 관상 동맥 질환, 협심증, 경동맥 질환, 뇌졸중, 뇌동맥경화증, 콜레스테롤 담석, 제II형 당뇨병, 지질 이상증, 비만, 만성 염증성 장애 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 플라보노이드계 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 이들의 합병증의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 건강식품 조성물에 있어서, 상기 플라보노이드계 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 바이칼레인(baicalein, 5,6,7-trihydroxyflavone), 하기 화학식 2로 표시되는 간후안제닌(ganhuangenin, 2',5,5',7-tetrahydroxy-6',8-dimethoxyflavone) 또는 이들의 혼합인 것을 포함할 수 있다:

[화학식 1]

[화학식 2]

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본 발명에 따른 건강식품 조성물에 있어서, 상기 플라보노이드계 화합물은 파르네소이드 엑스 수용체(farnesoid X receptor; FXR)의 억제활성 또는 FXR을 길항하는 작용을 갖는다.

본 발명에 따른 건강식품 조성물에 있어서, 상기 합병증으로는 관상 동맥 질환, 협심증, 경동맥 질환, 뇌졸중, 뇌동맥경화증, 콜레스테롤 담석, 제II형 당뇨병, 지질 이상증, 비만, 만성 염증성 장애 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 상기 조성물에 포함되는 플라보노이드계 화합물의 FXR 억제 활성을 확인하기 위하여, FXR에 대한 억제 활성을 FXR co-activator recruitment 분석법으로 측정한 결과, 상기 플라보노이드계 화합물은 FXR에 대한 활성 억제 효과가 우수함을 알 수 있었다. 특히, 플라보노이드계 화합물인 바이칼레인(baicalein, 5,6,7-trihydroxyflavone) 및 간후안제닌(ganhuangenin, 2',5,5',7-tetrahydroxy-6',8-dimethoxyflavone)은 FXR에 대한 50% 활성저해 농도(IC₅₀)가 각각 4.0 μM, 6.4 μM로 뛰어난 길항 효과를 나타내었다(표 1 참조). 같은 조건에서 기존에 알려진 FXR 길항제인 구굴스테론(guggulsterone)의 IC₅₀ 값은 11.8 μM로 나타났다.

파르네소이드 엑스 수용체(farnesoid X receptor; FXR)(이하, 인간 수용체에 대해서는 NR1H4라 하기도 함)는 원형형 2핵 수용체이며, 이것은 레티노이드 엑스 수용체(retinoid X receptor; RXR)와 헤테로 이중체형으로 표적 유전자의 프로모터 영역에 결합하는 유전자를 활성화한다(Cell 1995, 81, 687). NR1H4의 관련 생리적 리간드는 담즙산이며(Science 1999, 284, 1365), 이중 가장 강력한 것은 케노데옥시콜산(CDCA)이고, 이 CDCA는 담즙산 항상성에 관여하는 몇몇 유전자 발현을 조절한다. FXR은 간, 소장, 결장, 난소, 부신 및 신장에서 발현된다. 세포내 유전자 발 현 조절을 넘어서 FXR은 파라크라인(paracrine) 또는 엔도크라인(endocrine) 신호 전달에도 관련되어 있다(Genes Dev. 2003, 17, 1581; Cell Metab . 2005, 2, 217).

파르네소이드 엑스 수용체 및/또는 고아 핵 수용체 활성을 포함하여, 핵 수용체 활성은 다양한 질환 및 장애들에 관련되어 있으며, 상기 질환은 고지혈증 및 고콜레스테롤혈증, 및 이들의 합병증으로서 관상 동맥 질환, 협심증, 경동맥 질환, 뇌졸중, 뇌동맥경화증, 황색종(International Patent Application Publication No. WO 00/57915)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

파르네소이드 X 수용체 및/또는 고아 핵 수용체 활성을 포함하여, 핵 수용체 활성은 생리학적 과정에 관련되어 있으며, 이들은 트리글리세라이드 대사, 이화, 수송 또는 흡수, 담즙산 대사, 이화, 수송, 흡수, 재흡수 또는 담즙 풀 조성, 콜레스테롤 대사, 이화, 수송, 흡수 또는 재흡수를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 즉, FXR은 콜레스테롤 담석, II형 당뇨병, 지질 이상증 또는 비만, 만성 염증성 장애(염증성 장 질환 또는 만성 간내 담즙정체) 및 기타 다수의 질환 등과 같은 다양한 질환의 병인 및 치료와 관련된 다양한 생리적 과정 조절에 관여한다(Arterioscler . Thromb . Vasc . Biol . 2005, 25, 2020; Mini Rev . Med . Chem . 2005, 5, 719).

FXR은 간에서 담즙산 합성 네트워크를 조절한다. 간 엑스 수용체(liver X receptor, LXR)는 콜레스테롤을 담즙산으로 변환하는 주요 효소 콜레스테롤 7α-히드록실라제(Cyp7A1)를 조절하는 핵 수용체 liver receptor homolog 1(LRH-1)을 유도하는 반면, FXR은 LRH-1을 우세하게 억제하는 추가적인 핵 수용체인 short heterodimer partner (SHP)를 암호화하는 mRNA의 상향 조절을 통하여 Cyp7A1의 유도를 억제한다. FXR은 콜산(cholic acid, CA) 또는 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid, CDCA)과 같은 일차 담즙산인 이 경로의 최종 산물과 결합하기 때문에, 이것을 유전자 발현 수준의 되먹임 저해의 예로서 간주할 수 있다(Mol . Cell 2000, 6, 507). SHP를 통한 담즙산 합성의 억제와 유사하게 FXR은 소위 ABC(ATP-결합 카세트에 대한) 수송체의 범위를 유도하며, 상기 수송체는 간세포 세포질에서 독성 담즙산을 소관인 담즙이 유래하는 소담관 분기로 수송하는 것에 관여한다. 이러한 FXR의 간장 보호 기능은 간에서 몇몇 ABC-수송체의 저발현(under-expression) 또는 과발현(over-expression)이 보였던 FXR 적중(knockout) 생쥐에서 규명되었다(Cell 2000, 102, 731). 지단백질로부터 인단백질로 지질 운송을 중재하는 주요 효소 phospholipid transfer protein (PLTP)(J. Biol . Chem . 2000, 275, 39313)뿐만 아니라, 주요 담즙염 배출 펌프인 human bile salt expert pump (BSEP; ABCB11, J. Biol . Chem . 2001, 276, 28857); Hepatology 2002, 35, 589)은 FXR에 의한 리간드 지향성(ligand-directed) 전사 활성의 직접 표적이다(J. Pharmacol . Exp . Ther . 2005, 312, 759; Curr . Drug Targets Immune Encodcr . Metabol. Disord . 2005, 5, 289). 또한, 콜레스테롤 7α-히드록실라제 유전자(CYP7A1) 전사(J. Biol . Chem . 2000, 275, 10918), HDL 대사(J. Biol. Chem. 2000, 275, 39313), 고지질혈증, 담즙울체, 및 증가된 콜레스테롤 유출 및 ATP 결합 카세트 수송인자 단백질(ABC1)의 증가된 발현(International Patent Application Publication No. WO00/78972)의 조절은 FXR에 의해 조절되거나 영향을 받는다. FXR 조절자로서 작용하는 화합물은 국제 특허 공개 제WO 2004/048349호, 제WO 2003/015771호 및 제WO 2000/037077호에 개시된 것이 있으며, 더 작은 분자의 FXR 조절자가 알려져 있다(Curr . Med . Chem. 2005, 12, 1017).

따라서, 본 발명에 따른 상기 플라보노이드계 화합물은 파르네소이드 엑스 수용체 및/또는 고아 핵 수용체를 포함하는 핵 수용체의 활성이 관련되어 있는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 또는 완화시키는 데에 유용하다. 보다 구체적으로는 고지질혈증 및 고콜레스테롤혈증, 및 이들의 합병증으로서 관상 동맥 질환, 협심증, 경동맥 질환, 뇌졸중, 뇌 동맥경화증, 콜레스테롤 담석, 제II형 당뇨병, 지질 이상증, 비만, 만성 염증성 장애 등의 예방, 치료, 개선제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 황금으로부터 분리한 플라보노이드계 화합물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1 종 이상을 함유할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 투여를 위해서 상기에 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 사용하여 제조할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판)(Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 본 발명의 조성물 내에 포함되는 플라보노이드계 화합물의 일일 투여량은 0.1 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 일 회 내지 수 회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 조성물에 포함되는 황금으로부터 분리한 플라보노이드계 화합물을 마우스에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 상기 플라보노이드계 화합물은 경구 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1000 ㎎/㎏ 이상인 것으로 나타났다(실험예 2 참조).

본 발명의 상기 조성물은 심혈관계 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 플라보노이드계 화합물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 플라보노이드계 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 상기 플라보노이드계 화합물은 원료에 대하여 1 내지 20 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g 이다.

본 발명의 상기 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만, 본 발명의 조성물을 일반적으로 100 중량부 당 0 내지 20 중량부의 범위에서 선택된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 황금으로부터 플라보노이드계 화합물의 분리

본 발명에 따른 상기 조성물의 플라보노이드 화합물은 황금(Scutellaria baicalensis)으로부터 분리하여 얻은 것이 바람직한데, 반드시 황금으로 제한되는 것은 아니다. 상기 황금은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.

본 실험에 사용된 황금은 서울 경동시장에서 구입하여 사용하였다. 황금 뿌 리(건물 중 3.4 g)를 세절하고 80% 메탄올(MeOH) 수용액(18 ℓ)에 담가서 24 시간 동안 실온에서 추출하였다. 추출물은 여과지(no. 2)로 여과하고, 남은 것은 동일한 방법으로 1회 더 추출하였다. 얻어진 여액을 모두 합쳐 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻었다. 얻어진 추출물은 물(3 ℓ)과 에틸아세테이트(EtOAc, (3 ℓ×2)로 분배 추출하였고, 물 분획은 다시 n-부탄올(n-BuOH, 3 ℓ)로 분배 추출하였다. 각 분획을 감압 농축하여 에틸아세테이트 분획(SBE, 62 g), n-부탄올 분획(SBB, 56 g) 및 물 분획(SBH, 972 g)을 얻었다. 에틸아세테이트 분획(SBE, 62 g)을 클로로폼(CHCl₃, 1 ℓ)와 메탄올(1 ℓ)로 용해시킨 뒤 실온에서 하루 동안 침전시켰다. 침전물을 여과지로 여과하여 화합물 1(baicalein, 14 g)을 얻었다.

위에서 화합물 1을 포함하는 침전물을 제거한 여액을 감압 농축한 후 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(CHCl₃, : MeOH = 30: 1 20: 1 10 : 1)을 실시하여 총 33개의 분획물(SBE-1 내지 SBE-33)을 얻었다. 얻어진 분획들에 대하여 TLC로 확인한 결과, 16번부터 19번 분획이 동일한 Rf 값과 유사한 발색 양상을 보였다. 이들 분획을 감압 농축하여 화합물 2(ganhuangenin, 570 ㎎)를 얻었다.

화합물 1(baicalein, 5,6,7-trihydroxyflavone): 노란색 분말; mp 258-260 ℃; MS m/z: 270 [M]⁺; IR (KBr) cm^-1 3411, 1654; ¹H-NMR (400 MHz, DMSO, δ): 8.00(2H, d, J=7.8 Hz, H-2', 6'), 7.52(2H, d, J=7.8 Hz, H-3', 5'), 7.52(1H, m, H-4'), 6.88(1H, s, H-3), 6.58(1H, s, H-8); ¹³C-NMR (100 MHz, DMSO, δ): 182.2(C-4), 162.9(C-2), 153.7(C-7), 149.9(C-9), 147.0(C-5), 131.9(C-1'), 129.4(C-6), 129.2(3', 5'), 126.41((2', 6'), 104.4(C-10), 94.2(C-8).

화합물 2(ganhuangenin, 2',5,5',7-tetrahydroxy-6',8-dimethoxyflavone): 노란색 무정형 분말(CHCl₃-MeOH); mp 250-255 ℃; MS m/z: 346 [M]⁺; IR (KBr) cm^-1 3470, 3094, 1658, 1616; ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD, δ): 6.29(1H, s, H-3'), 6.30(1H, s, H-6'), 6.56(1H, d, J=8.0 Hz, H-3'), 6.68(1H, d, J=8.0 Hz, H-4'), 3.81(3H, s, OCH₃); ¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD, δ): 155.5(C-2), 139.0(C-3), 178.6(C-4), 161.7(C-5), 97.8(C-6), 165.3(C-5'), 114.3(C-6'), 60.1(7'-OMe), 56.0(8'-OMe), 55.8(9'-OMe).

본 발명에 따른 조성물에 포함되는 황금으로부터 분리한 플라보노이드계 화합물이 콜레스테롤 대사 질환 및 고지혈증 관련 인자의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, FXR 활성 억제 효과(Lipids 2003, 38, 1149)를 하기 실험예를 통해 측정하였다.

< 실험예 1> 본 발명에 따른 상기 플라보노이드계 화합물의 FXR 활성에 미치는 영향

본 발명에 따른 상기 플라보노이드계 화합물의 FXR에 대한 길항 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1-1. E. coli 에서의 FXR 단백질의 제조

Human liver cDNA Library (Marathon RACE kit; Clontech DB Biosciences)에서 클로닝된 FXR 유전자를 E.coli 발현 벡터인 pET28a에 삽입하여 준비하고 E.coli (BL21)에 형질전환시켜 mini culture sacle로 37 ℃에서 18 시간 동안 진행한 후 이를 1/60의 비율로 100 m㎖로 스케일업(scale-up)하여 37 ℃에서 배양한다. 4 시간 동안 배양 후, 10 μM IPTG를 처리하여 4 시간 동안 FXR을 유도하여 세포를 회수한다. 이를 Ni² ⁺컬럼에서 FXR만을 분리정제한 후, 회수된 분획을 투석(dialysis)하여 사용하며, 투석버퍼(dialysis buffer)의 조성은 25 mM HEPES, pH 7.6, 2 mM MgCl₂, 20% 글리세롤, 1 mM EDTA, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 1% Nonidet P-40, 200 μM PMSF, and 1 ㎍/㎖ 류펩틴이다.

1-2. FXR coactivator recruitment assay

위에서 발현한 FXR 단백질을 이용하여 실험을 진행한다. 우선 뉴트라비딘(neutravidin)이 코팅된 96-well clear plate (Pierce)에 소량의 70% 에탄올을 처리하여 플레이트(plate)의 코팅된 면을 활성화시킨 후 분석버퍼(assay buffer, Perkinelmer사 제품)에 녹인 100 nM SRC-1 50 ㎕를 처리한 후 1 시간 동안 배양시킨다. 그 후 세척버퍼(washing buffer, Perkinelmer사 제품) 100 ㎕로 1회 수세 후, 분석버퍼에 준비된 FXR을 최종농도 400 nM과 준비된 CDCA(chenodeoxycholic acid)를 최종농도 100 μM로 처리 후 2 시간 동안 배양한다. 그 후 세척버퍼 100 ㎕로 1회 수세 후 5 nM Eu-N1 His antibody 50 ㎕를 처리한 후 1 시간 동안 배양한다. 이를 세척버퍼 100 ㎕로 3회 수세 후 증강용액(Enhancement solution, Perkinelmer사 제품) 30 ㎕를 처리한 다음 20 분간 진탕하고 Victor2의 TRF mode에서 탐색한다. FXR coactivator recruitment assay는 CDCA와 FXR, SRC-1의 복합체(또는 착체, complex)가 FXR 길항제(antagonist)에 의해 SRC-1이 해리(dissociation)되고, 그 결과 해리된 FXR이 세척(washing out)되어 Nu-N1 His antibody와의 바인딩(binding)이 줄어들게 되어 신호가 줄어드는 실험적 원리를 이용하여 FXR에 대한 길항 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기의 도 1 및 표 1에 나타내었다.

플라보노이드 화합물(FXR 길항제)	FXR 길항 활성(IC₅₀, μM)
바이칼레인(화합물 1)	4.0
간후안제닌(화합물 2)	6.3
구굴스테론(양성대조군)	11.8

도 1 및 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 조성물에 포함되는 황금으로부터 분리한 플라보노이드계 화합물 1과 화합물 2는 FXR 활성 억제능이 뛰어난 FXR 길항제로서 콜레스테롤 대사 질환 및 고지혈증의 예방 및 치료에 유용한 화합물임을 알 수 있었다.

< 실험예 2> ICR 마우스에 대한 경구투여 급성 독성실험

본 발명에 따른 상기 조성물에 포함되는 플라보노이드계 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 실시하였다.

4 주령의 특정 병원체 부재(specific pathogens free) ICR 마우스 암컷 12 마리와 숫컷 12 마리(암수 각각 3마리/용량군)를 온도 22±3 ℃, 습도 55±10%, 조명 12L/12D의 동물실내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용되기 전 1주일 정도 순화시켰다. 실험동물용 사료((주)제일제당, 마우스 및 랫트용) 및 음수는 멸균한 후 공급하였으며 자유 섭취시켰다.

상기 실시예에서 얻은 플라보노이드계 화합물을 0.5% 트윈 80을 용매로 하여 50 ㎎/㎖ 농도로 조제한 후, 마우스 체중 20 g당 0.2 ㎖(500 ㎎/㎏), 0.4 ㎖(1,000 ㎎/㎏)씩 경구 투여하였다. 시료는 단 회 경구 투여하였으며, 투여 후 7일 동안 다음과 같이 부작용 또는 치사 여부를 관찰하였다. 즉, 투여 당일은 투여 후 1 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간 뒤에, 그리고 투여 익일부터 7일째까지는 매일 오전, 오후 1회 이상씩 일반증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 또한, 투여 7일째에 동물을 치사시켜 해부한 후 육안으로 내부 장기를 검사하였다. 투여 당일부터 1일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 플라보노이드계 화합물에 의한 동물의 체중 감소 현상을 관찰하였다.

시험 결과, 시험물질을 투여한 모든 마우스에서 특기할 만한 임상증상은 없었고 폐사된 마우스도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 황금으로부터 분리한 플라보노이드계 화합물 1과 화합물 2는 모든 마우스에서 1000 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)이 적어도 1,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

이하, 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

< 제제예 1> 약학적 제제의 제조

1-1. 산제의 제조

플라보노이드계 화합물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

1-2. 정제의 제조

플라보노이드계 화합물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

1-3. 캡슐제의 제조

플라보노이드계 화합물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

1-4. 주사액제의 제조

플라보노이드계 화합물 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 플라보노이드계 화합물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명유리로된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다. 상기 리그난계 화합물 대신에 육두구 추출물, 이의 가용추출물 또는 이의 분획물을 이용하는 경우, 상기 추출물 또는 분획물은 용매를 완전히 제거하고 정제수에 희석한 것을 사용한다.

<제제예 2> 식품의 제조

플라보노이드계 화합물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

2-1. 조리용 양념의 제조

플라보노이드 화합물 0.2 내지 10 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2-2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

플라보노이드계 화합물 0.2 내지 1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

2-3. 밀가루 식품의 제조

플라보노이드계 화합물 0.1 내지 5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2-4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

플라보노이드계 화합물 0.1 내지 1.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

2-5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

플라보노이드계 화합물 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

2-6. 유제품(dairy products)의 제조

플라보노이드계 화합물 0.1 내지 1.0 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

2-7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 플라보노이드계 화합물을 진공 농축기에서 감압하에서 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 플라보노이드계 화합물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류 (현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%)

종실류 (들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%)

플라보노이드계 화합물의 건조분말 (1 중량%)

영지 (0.5 중량%)

지황 (0.5 중량%)

<제제예 3> 음료의 제조

3-1. 탄산음료의 제조

설탕 5~10%, 구연산 0.05 내지 0.3%, 카라멜 0.005 내지 0.02%, 비타민 C 0.1 내지 1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79 내지 94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85 내지 98 ℃에서 20 내지 180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5 내지 0.82% 주입하여 플라보노이드계 화합물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

3-2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 플라보노이드계 화합물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3-3. 야채쥬스의 제조

플라보노이드계 화합물 0.5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1000 에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

3-4. 과일쥬스의 제조

플라보노이드계 화합물 0.1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

도 1은 본 발명에 따른 상기 플라보노이드계 화합물(바이칼레인, 간후안제닌)의 FXR 활성에 미치는 영향을 실험예 1에 따라 측정한 결과이다.

Claims

삭제
하기 화학식 2로 표시되는 간후안제닌(ganhuangenin, 2',5,5',7-tetrahydroxy-6',8-dimethoxyflavone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고지혈증; 고콜레스테롤혈증; 또는 이들의 합병증으로서 관상 동맥 질환, 협심증, 경동맥 질환, 뇌졸중, 뇌동맥경화증, 콜레스테롤 담석, 제II형 당뇨병, 지질 이상증, 비만 및 만성 염증성 장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:

[화학식 2]

.
제2항에 있어서, 상기 간후안제닌은 파르네소이드 엑스 수용체(farnesoid X receptor; FXR)의 억제활성 또는 길항 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
삭제
삭제
하기 화학식 2로 표시되는 간후안제닌(ganhuangenin, 2',5,5',7-tetrahydroxy-6',8-dimethoxyflavone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고지혈증; 고콜레스테롤혈증; 또는 이들의 합병증으로서 관상 동맥 질환, 협심증, 경동맥 질환, 뇌졸중, 뇌동맥경화증, 콜레스테롤 담석, 제II형 당뇨병, 지질 이상증, 비만 및 만성 염증성 장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물:

[화학식 2]

.
제6항에 있어서, 상기 간후안제닌은 파르네소이드 엑스 수용체(farnesoid X receptor; FXR)의 억제활성 또는 길항 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.
삭제