CN103550323B - 一种具有抗肿瘤活性的马甲子提取物的用途及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了马甲子及其提取物在制备抗肿瘤药物中的用途及制备方法，其中马甲子提取物作为唯一活性成分，该马甲子提取物从马甲子的叶片中提取得到，并公开了制备其使用乙醇溶液进行提取的方法，以及所述的马甲子提取物作为制备抗肿瘤药物的用途，所述马甲子提取物对肿瘤具有良好的抑制效果。

Description

一种具有抗肿瘤活性的马甲子提取物的用途及制备方法

技术领域

本发明涉及中药提取及应用领域，具体是指一种具有抗肿瘤活性的马甲子提取物的用途及制备方法。

背景技术

肿瘤是危害人类健康最严重的一类常见病、多发病。中药治疗肿瘤在稳定瘤体，调节机体功能，增加免疫能力，改善临床症状，减轻放化疗毒副作用，延长带瘤生存时间方面有独特疗效。目前，祖国传统中药在肿瘤的治疗方面己取得了令人注目的成就，大力开展中医药治疗肿瘤的研究是一项非常有意义的探索。植物不仅是新型抗肿瘤药的重要来源之一，如长春新碱、喜树碱、紫杉醇等抗肿瘤药的发现和用途，而且植物药对机体免疫功能的调节作用也越来越受到人们的关注。研究表明不少中草药及其有效成分对免疫具有调节作用，这种调节作用既有增强作用也有抑制作用，有些则有双向调节作用，如黄芪、人参、当归、淫羊藿、菟丝子、刺五加、虫草、灵芝等等被证实对免疫功能具有增强作用，包括对细胞免疫、体液免疫、吞噬细胞吞噬功能、细胞因子的释放等多方面的明显增强作用，在抗肿瘤、抗感染等方面有着广泛用途的前景。

药物治疗作为治疗肿瘤的重要手段之一，虽然取得了一定的效果，但对于大多数类型的肿瘤，特别是对发病率较高的实体瘤的药物治疗效果仍然难以令人满意，因此发现与研究新型有效的抗肿瘤药物是生物医药科研领域的重大课题与长期任务。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中药提取物，该中药提取物是由马甲子鲜叶片经过醇提提取的，该中药提取物具有良好抗肿瘤活性。

本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的中药提取物，该中药提取物从马甲子的叶片中提取得到。马甲子是一种常见药用植物，据报道枝叶根花果均可药用。收载于《中药大辞典民间》及一些地方药物志，民间有不少肿瘤患者长期服用，取得满意的治疗效果，基于民间用途的经验，选择其树叶提取分离，对粗提物和不同极性提取物的体外抗肿瘤活性极进行了初筛，表明马甲子叶片的提取物具有良好的抗肿瘤活性。

进一步优选的被提取马甲子的叶片为鲜叶。分别对马甲子的鲜叶与马甲子叶干品进行提取以获得提取物，马甲子叶干品的提取物没有抗肿瘤活性，故选择马甲子鲜叶进行提取。

进一步地，所述被提取的马甲子的叶片为经过乙醇浸泡并干燥的叶片。使用乙醇浸泡马甲子的鲜叶，之后避光晾干，再经过乙醇提取，依旧可以获得该中药提取物的抗肿瘤的活性成分，且与使用鲜叶提取效果相同，可以满足提取物的抗肿瘤效果，方便存放与实验。

进一步地，所述中药提取物主要成分包括三萜类，黄酮类，生物碱类以及香豆素类。取样品1g，溶于25ml无水乙醇中，离心。取上清液2ml，无水乙醇稀释5倍，至终浓度为0.008g/ml，通过对其的成分做反应测试，最后确定含有三萜类，黄酮类，生物碱类以及香豆素类几类成分。

进一步地，所述1g中药提取物中，三萜类成分含量为0.01~0.05g，黄酮类成分含量为0.2~0.5g，生物碱类成分含量为0.02~0.05g，香豆素类成分含量为0.01~0.1g。

本发明还提供了一种制备上述中药提取物的方法，所述方法为使用乙醇溶液醇提。制备马甲子叶片中的提取物的方法可以使用醇提和水提，根据提取结果显示，醇提效果较优，故优选醇提作为制备上述中药提取物的主要方法。基于乙醇毒性小，易挥发等优良特性，选择乙醇溶液作为醇提的主要溶剂。

进一步地，所述醇提的具体步骤为：

（1）取马甲子叶片，加入5-15倍量的50%~95%乙醇浸泡；

（2）将叶片进行粉碎，再加入5-15倍量的50%~95%乙醇浸渍，提取醇溶性成分；

（3）收集提取液，30~70℃下减压回收乙醇至无醇味，得到的提取物；

（4）将提取物浓缩液进一步冷冻干燥即得马甲子叶片醇提物。

本发明提供的中药提取物作为制备治疗肿瘤药物的用途。

进一步地，所述中药提取物通过石油醚或乙酸乙酯进行萃取处理。将该中药提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，回收溶剂并冻干，得到3个极性部位的萃取物，均用异丙醇溶解，然后测试其对肿瘤细胞的抑制效果，结果该中药提取物的石油醚部位和乙酸乙酯部位具有很好的抗肿瘤活性，正丁醇提取部位显示无抗肿瘤活性，乙酸乙酯部位表现更好的抗肿瘤活性。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

本发明的中药提取物具有良好的抗肿瘤效果，加快了抗肿瘤药物的研究进程。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

1、马甲子叶片提取

取马甲子鲜叶1kg，加入8-10倍量的95%乙醇浸泡1-2天后（作用：1、使鲜叶中的活性酶系失活，避免对有效成分的破坏；2、使鲜叶硬度增加，更利于下一步的粉碎流程），将鲜叶进行粉碎，再加入10倍量的95%乙醇（60~100%乙醇提取）浸渍3天提取醇溶性成分。收集提取液，30~40℃下加压回收乙醇至无醇味，得到的提取物浓缩液进一步冷冻干燥即得马甲子鲜叶醇提物。

将提取残渣晾干，加入8~10倍量的水浸渍3天提取水溶性成分，收集提取液，冷冻干燥即得马甲子鲜叶水提物。

马甲子叶干品（室温自然干燥）按照上述方法进行提取，获得马甲子叶干品醇提物及水提物。

马甲子鲜叶片经过乙醇浸泡，之后置于避光处晾干，获得干叶片，所得马甲子经过乙醇浸泡并晾干的叶片按照上述方法进行提取，获得醇提物及水提物。

2、抗肿瘤活性

比较马甲子叶片提取物的抗肿瘤活性研究。取处于对数生长期的多种肿瘤细胞（采用的肿瘤细胞株有如下几种：宫颈癌细胞株Hela；人肝癌细胞株SMMC-7721；人肺癌细胞株A549；人结肠癌细胞株Caco-2；白血病细胞株K562；胃癌细胞株MGC-803；），2000rpm离心5min，用含有含10%胎牛血清的相应培养液将沉淀细胞浓度调为1×10⁵个/ml细胞悬液后，将细胞接种于96孔培养板。每孔加细胞悬液200μl，然后分别加入一定浓度无菌的提取物溶液，使每孔内的提取物终浓度为0.02、0.1、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0、2.0mg/ml，混匀后置37℃、5%CO₂孵箱中培养24h后，析出培养液并用PBS洗涤两次，再向每孔加入5mg/ml的MTT磷酸缓冲液20μl以及150μl培养基，同样条件下继续培养4h后终止培养。2000rpm离心5min，然后弃去培养板孔内的培养液，每孔加入150μlDMSO，震荡10min，使形成的甲臜颗粒充分溶解后，酶标仪检测吸光值。选择测定波长为570nm。计算提取物对肿瘤细胞的IC50。结果见表1。由结果可知，马甲子鲜叶醇提物及马甲子经过乙醇浸泡并晾干的叶片醇提取物具有良好的肿瘤抑制效果，其他几种提取物并不具有抗肿瘤活性，分析原因可能与活性提取物的溶解性以及稳定性有关。

马甲子提取物对不同肿瘤细胞的抑制作用：

3、马甲子叶片醇提物的成分研究

样品供试液的配制：取醇提物样品1g，溶于25ml无水乙醇中，离心。取上清液2ml，无水乙醇稀释5倍，至终浓度为0.008g/ml。

样品：即醇提物固体。

（1）三萜类成分的检识

A.L-B反应

将样品溶于乙酸酐中，加浓硫酸－乙酸酐（1：20）数滴，可产生黄→红→紫→蓝等颜色变化，最后褪色，表明含有三萜类化合物。

B.Kahlenberg反应

将样品的氯仿或醇溶液点于滤纸上，喷20%五氯化锑的氯仿溶液（或三氯化锑饱和的氯仿溶液），干燥后60－70℃加热，显蓝色，表明含有三萜类化合物。

C.R-H反应

将样品供试液滴在滤纸上，喷出25%三氯乙酸乙醇溶液，加热至100℃，显红色，逐渐变为紫色，表明含有三萜类化合物。

D.Salkowki反应

将样品溶于氯仿，加入浓硫酸后，在硫酸层呈现红色或蓝色，氯仿层有绿色荧光出现，表明含有三萜类化合物。

E.Tschugaeff反应

将样品溶于冰乙酸中，加乙酰氯数滴及氯化锌结晶数粒，稍加热，则呈现淡红色或紫红色，表明含有三萜类化合物。

（2）黄酮类成分的检识

A.盐酸－镁粉还原反应（还原反应显色）

取少量样品溶于1mL乙醇中，加入少许镁粉及浓盐酸，振荡片刻，观察反应颜色呈紫红色，表明含有黄酮类化合物。

B.三氯化铝反应（金属离子的络合反应显色）

用玻璃棒蘸取样品供试液涂于滤纸上，吹干，喷1％的三氯化铝乙醇溶液，吹干，观察现象。置紫外灯下显鲜黄色，表明含有黄酮类化合物。

C.三氯化铁反应（金属离子的络合反应显色）

用玻璃棒蘸取供试液涂于滤纸上，吹干，在紫外灯下观察荧光后，喷3％的三氯化铁乙醇溶液，吹干，出现暗蓝色荧光斑点，再经氨熏后转变为棕色荧光斑点，表明含有黄酮类化合物。

D.碱性试剂显色

用玻璃棒蘸取供试液涂于滤纸上，干燥后，喷以氢氧化钠水溶液或暴露于氨蒸汽中，在日光灯下观察时，氨蒸汽能使样品色点转变为亮黄色，表明含有黄酮类化合物。

（3）生物碱类成分的检识

A.改良碘化铋钾（Dragendorff）法

①次硝酸铋0.85g溶于10ml冰醋酸与40ml水中；②碘化钾8g溶于20ml水中。试液①与试液②等量混合置棕色瓶内保存作贮备液。用前将1ml贮备液、4ml冰醋酸与12ml水混合。将样品供试液加入上述试剂中，呈红棕色溶液，加蒸馏水一摇即有沉淀产生，表明含有生物碱类化合物。

B.碘-碘化钾（Wagner）法

碘1g与碘化钾10g溶于50ml水，加2ml乙酸，加水至100ml。取上述试剂适量，加入1ml样品供试液即显棕褐色，表明含有生物碱类化合物。

C.硅钨酸（Bertrand）法

5g硅钨酸溶于100ml水中，加浓盐酸少量调至pH＝2左右。取上述试剂适量，加入1ml样品供试液即显棕褐色，表明含有生物碱类化合物。

（4）香豆素类成分的检识

A.异羟肟酸铁反应

①a.盐酸羟胺20g溶于50ml水，用乙醇稀释至200ml，冷处保存；b.氢氧化钾50g溶于少许水中，加500ml乙醇。②氯化铁（FeCl₃·6H₂O）10g溶于20ml36％盐酸溶液中，加乙醚200ml摇匀，置密闭容器内保存。使用时将试液①a.与①b.按1：2混合，滤去沉淀，滤液放冰箱保存。用玻璃棒蘸取样品供试液涂于滤纸上，先喷ab混合试液，稍干，再喷试液②，即显红色，表明含有香豆素类化合物。

B.重氮化试剂反应

①对硝基苯胺0.35g，溶于浓盐酸5ml中，加水至50ml；②亚硝酸钠5g，加水50ml。取①、②液等量在冰水浴中混合后使用。取少量样品供试液滴加重氮化试剂，即显橙红色，表明含有香豆素类化合物。

4、马甲子叶片醇提物的成分含量测定

（1）三萜类成分含量测定

取本品粗粉约0.1g，各三份，加入10ml容量瓶内，加乙酸乙酯至刻度，再从中精密吸取4ml溶液加入10ml容量瓶内，挥干溶剂后，加入5%香草醛-冰醋酸0.4ml、高氯酸1.6ml，混匀，并由乙酸乙酯稀释至刻度，置7O℃恒温水浴中加热15min，冷却至室温，并转移至10ml容量瓶中加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，在540nm波长处测定吸收度，计算供试品溶液中总三萜含量（含三萜以美洲茶酸计）。经计算1g醇提物中三萜类含0.052±0.010g。

（2）黄酮类成分含量测定

取本品粗粉约0.1g，各三份（相当于2g生药），精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，测定吸光度，计算供试品溶液中总黄酮含量（含黄酮量以芦丁计）。经计算1g醇提物中总黄酮含0.325±0.043g。

（3）生物碱类成分含量测定

取样品粉末约1g，各三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，以18%氨水2ml润湿1h，加乙醚2氯仿2乙醇(25∶8∶2.5)混合溶剂30ml，超声提取20min，倾出上清液至小锥形瓶中，再加入上述混合溶剂30ml，冷浸放置半小时,再超声震荡提取20min，滤过，以相同溶剂15ml分3次洗涤残渣和滤纸,合并滤液于锥形瓶中，于60℃水浴上蒸干，准确加入10ml氯仿使其全部溶解,再准确吸取5mL转移至小分液漏斗中，加6mL氯仿，2ml缓冲液(pH=5.0，0.2M邻苯二甲酸氢钾缓冲液)。用1mmol·L-1溴麝香草酚蓝溶液滴定，并不断震摇；接近终点时，分出氯仿层，再加入新鲜氯仿5ml，继续滴定并不断震摇，静置分层，至水层略显黄色即为终点。计算总生物碱(含生物碱以马甲子碱B计)。经计算1g醇提物中生物碱类含量为0.028±0.007g。

（4）香豆素类成分含量测定

经测定，香豆素类成分含量为：1%~10%。

5、马甲子叶片醇提物3种极性部位抗肿瘤活性研究

将马甲子叶片醇提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，回收溶剂并冻干，得到3个极性部位的萃取物，均用异丙醇溶解。取处于对数生长期的各种肿瘤细胞（采用的肿瘤细胞株有如下几种：宫颈癌细胞株Hela；人肝癌细胞株SMMC-7721；人肺癌细胞株A549；人结肠癌细胞株Caco-2；白血病细胞株K562；胃癌细胞株MGC-803；），2000rpm离心5min，用含有含10%胎牛血清的相应培养液将沉淀细胞浓度调为1×105个/ml细胞悬液后，将细胞接种于96孔培养板。每孔加细胞悬液200μl，然后分别加入一定浓度无菌的提取物溶液，使每孔内的提取物终浓度为0.002、0.01、0.02、0.04、0.05、0.08、0.1、0.2mg/ml，混匀后置37℃、5%CO₂孵箱中培养24h后，析出培养液并用PBS洗涤两次，再向每孔加入5mg/ml的MTT磷酸缓冲液20μl以及150μl培养基，同样条件下继续培养4h后终止培养。2000rpm离心5min，然后弃去培养板孔内的培养液，每孔加入150μlDMSO，震荡10min，使形成的甲臜颗粒充分溶解后，酶标仪检测吸光值。选择测定波长为570nm。计算提取物对肿瘤细胞的IC50。结果见表2。由结果可知，马甲子叶片醇提物的石油醚部位和乙酸乙酯部位具有很好的抗肿瘤活性，特别是乙酸乙酯部位表现出更好的活性，正丁醇提取部位在试验浓度范围内无法计算IC50。我们将进一步对乙酸乙酯部位进行研究。

马甲子叶片醇提物不同极性部位对肿瘤细胞的抑制作用：

6、乙酸乙酯极性部位对荷艾氏腹水瘤小鼠的作用效果研究

对小鼠移植瘤S180的抑制作用：

取昆明种小鼠，于右前腋皮下常规接种S180悬液0.2ml（约1×10⁶个瘤细胞），接种24h后，将小鼠随机分组编号，对照组鼠数为10只，实验组共三组，分为高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组10只，每组灌胃给药，每天1次，共14次。阳性对照组每天灌胃环磷酰胺（85mg/kg），给药量、次数、时间同实验组。末次给药后24h，处死动物，称体重后完整剥离瘤块并称重，计算抑瘤率。

乙酸乙酯极性部位对荷艾氏腹水瘤小鼠的作用：

*：与对照组相比，P<0.05，差异具有统计学意义。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.马甲子提取物在制备抗肿瘤药物中的用途，其中马甲子提取物作为唯一活性成分，所述马甲子提取物的制备方法为使用乙醇溶液提取，所述乙醇溶液提取的具体步骤为：

（1）取马甲子鲜叶片，加入5-15倍量的50%~95%乙醇浸泡；或马甲子鲜叶片经过乙醇浸泡并干燥后，再加入5-15倍量的50%~95%乙醇浸泡；

（2）将上述步骤（1）所得叶片进行粉碎，再加入5-15倍量的50%~95%乙醇浸渍，提取醇溶性成分；

（3）收集提取液，30~70℃下减压回收乙醇至无醇味，得提取物浓缩液；

（4）将提取物浓缩液冷冻干燥，即得。

2.根据权利要求1任一项所述的用途，其特征在于：所述马甲子提取物的主要成分包括三萜类，黄酮类，生物碱类以及香豆素类。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：1g所述马甲子提取物中，三萜类成分含量为0.01~0.05g，黄酮类成分含量为0.2~0.5g，生物碱类成分含量为0.02~0.05g，香豆素类成分含量为0.01~0.1g。

4.一种制备权利要求1中所述的马甲子提取物的方法，其特征在于：所述方法为使用乙醇溶液提取，所述乙醇溶液提取的具体步骤为：

（1）取马甲子鲜叶片，加入5-15倍量的50%~95%乙醇浸泡；或马甲子鲜叶片经过乙醇浸泡并干燥后，再加入5-15倍量的50%~95%乙醇浸泡；

（2）将上述步骤（1）所得叶片进行粉碎，再加入5-15倍量的50%~95%乙醇浸渍，提取醇溶性成分；

（3）收集提取液，30~70℃下减压回收乙醇至无醇味，得到提取物浓缩液；

（4）将提取物浓缩液冷冻干燥，即得。