CN101391961A - 余甘子叶或果实抗癌中药及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从余甘子叶或果实中提取的具有抗癌、抗菌作用的活性成分,将余甘子叶或果实分别用95%乙醇和50%乙醇进行渗漉提取后,取50%乙醇浸膏再分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行部位分离,利用硅胶柱层析法对乙酸乙酯部位进行分离纯化,得到纯结晶化合物结晶I和结晶II,用该化合物制成不同的中药制剂,有较好的抗肝癌、宫颈癌、胃癌、黑色素瘤、白血病的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗肿瘤(抗癌)的中药,特别是从余甘子提取的化合物中制备具有抗肿瘤(抗癌)作用的药物的方法。
技术背景
余甘子树(phyllanthus emblica L.)是大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属(phyllanthus)落叶小乔木或灌木,余甘子树在我国主要分布在福建、广东、云南、贵州、四川、海南、广西等省区,资源丰富,余甘子果自古以来即被我国人民视为具有保健作用而加以利用,果实生食酸甜酥脆,初食时味酸涩,食用后回味甘甜爽口,故名余甘,据报道,目前全世界约有17个国家的传统药物体系中使用了余甘子;在我国约有16个民族使用该药,其中以汉族和藏族等尤为习用。国内部分省市早已开始了对余甘子资源的开发利用,一些地方已优选优良品种,并大面积经济栽培。余甘子是一味重要的传统民族药,已被载入1995年、2000年和2005年版《中华人民共和国药典》,余甘子过去为我国少数民族常用药材,已被《中国药典》收载。该植物的果实、根、树皮、叶均可供药用。余甘子性昧甘、酸、涩、凉,归肺、胃经。其功能与主治为清热凉血,消食健胃,生津止咳;用于血热血瘀、消化不良、腹胀、咳嗽、喉痛及口干。有人分析余甘子的主要化学成分含有维生素C、多种氨基酸和鞣质,其中包括葡萄糖投食子鞣质(glucogallin)、没食子酸(gallic acid)、鞣料云实精(carilagin)、原诃子酸(terchebin)、诃子酸(chebulinicacid)、粘酸(mucic acid)、油柑酸(phyllemblic acid)等。近年来,人们对余甘子进行了多方面研究,并用有机溶剂对其有效成分进行提取,发现提取物中有一些抗菌活性成分,对葡萄球菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌及痢疾杆菌均有抑制作用,在民族药学研究中,亚洲的一些国家如斯里兰卡、缅甸、巴基斯坦、尼泊尔等国均有采用余甘子治疗眼部疾病、痢疾、肠胃炎,有的用于治疗淋病等。我国民间则有利用余甘果抗菌、生津止咳及治疗急慢性咽喉炎的历史,经现代检测技术还发现,余甘子果实中含多种抗氧化成分:维生素C,鞣质,维生素E,还含超氧化物歧化酶(SOD)。因此很多医学工作者对余甘子进行了多方面的研究。
近年来公开文献报道了一些余甘子化学成分以及药理研究的内容,例如:广东省农业科学院蚕业研究所,广东省果蔬深加工重点实验室的陈智毅、刘学铭、吴继军、李升锋、邹宇晓在【刊名】中国南方果树.2004,33(1).-58-61公开了“余甘子的药理研究和利用综述”,研究认为余甘子提取物具有抗诱变、抗致畸、防肿瘤可对抗环境化学因子对哺乳类动物细胞的诱变作用,该作用强于同等剂量的维生素C;在模拟胃液条件下,余甘子鲜果汁能有效地阻断N一亚硝基吗啉合成,其阻断率为90.17,而同浓度维生素C阻断率仅23.9;余甘子果汁、果粉对大鼠体内对N一亚硝基脯氨酸(NPRO)合成的阻断率分别达100和96.29,余甘果汁较维生素C的阻断作用更为明显。作者观察了余甘子果汁对我围胃癌高发区受试者内源性亚硝化的阻断作用,结果表明,受试者体内过高的亚硝化潜力已被余甘子果汁完全阻断,并认为在胃癌高发区合理饮用新鲜余甘子果汁就可对体内过高的亚硝化水平有较好的阻断作用,可以有效地降低胃癌及其肿癌的发病一。
北京中医药大学中药学院、北京微量化学研究所的张兰珍、赵文华等在《中国中药杂志》.2003,28(10).-940-943研究藏药余甘子的化学成分。方法:各种色谱法分离纯化,理化和现代波谱法鉴定结构。结果:分离鉴定出11个化合物,分别为没食子酸(I),鞣花酸(II),I-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(III),3,6-二-O--没食子酰基-D-葡萄糖(IV),诃子酸(V),槲皮素(VI),诃黎勒酸(VII),鞣云实精(VIII),3-乙基没食子酸(3-ethoxy-4,5-dihydroxy-bellzcic acid,IX),isoscrtiniin(X),1,6-二-O-没食子酰基-D-葡萄糖(XI)。结论:3-乙基没食子酸(3-ethoxy-4,5-dihydroxy-benzoic acid)为一新化合物,isostrietiniin为首次从余甘子中得到的化合物。提取分离:取去核余甘子干果粗粉2000g,70%丙酮渗漉提取,40℃以下减压浓缩成粉状得提取物820g。取200g粗提物用水分散,醋酸乙酯反复萃取,萃取液浓缩得醋酸乙酯部分42g,水液减压回收,浓缩至小体积。醋酸乙酯和水部分分别上ToyopearlHW一40(c)色谱柱,H2O及稀EtOH梯度洗脱,各组分经聚酰胺TLC和HPLC检测,合并相同组分,分别再经SephadexLH-20,MCI gel ClIP20P,Toyopearl HW一40(F)色谱柱反复纯化,从醋酸乙酯部分得到化合物I(105mg),11(78nag),VI(45mg),IX(32mg)。从水部分得到化合物III(32mg),IV(57nag),V(16mg),VII(46rag),VIII(79mg),X(65mg),XI(47rag)。
广西中医学院的李萍、谢金鲜、林启云在《中国民族民间医药杂志.》2003(3).-161-164研究了民族药余甘子对D—半乳糖胺致小鼠急性肝损伤的影响,实验利用D—半乳糖胺(D—Gal—N)一次性腹腔注射(ip)诱发小白鼠急性肝损伤模型,通过测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及肝糖元、肝脏系数,观察余甘子水提醇沉物对肝损伤的保护作用。结果:余甘子水提醇沉物各剂量组成均降低血清ALT、AST、ALP、MDA含量和肝脏系数,提高血清SOD活性及促进肝糖元合成,并可改善肝脏组织病理损伤,其作用呈剂量依赖性。结论:余甘子水提醇沉物有一定程度抗自由基与抗脂质过氧化作用,对D-Gal—N所致的急性损伤具有明显的保护作用。
福建安摩乐制药实业有限公司的李昌玲在《药学进展》2001,25(4).-210-213认为中草药余甘子在新药和保健食品开发方面极具应用价值。余甘子的药理研究表明,其具抗微生物感染、抗氧化、抗肿瘤、降血脂和血糖、降压、补益等多种生物学活性,且无明显毒副作用。
夏泉、孔杰在《中国中药杂志》发表了“传统药物余甘子的民族药学研究”的文章,系统研究了余甘子的民族药学,介绍了余甘子的生物学特性,地理分布格局,化学组成以及近年来所开展的药理研究成果,并介绍了17个国家及民族在其医疗实践中对余甘子的传统使用。通过跨文化比较研究指出,作为一种重要的传统药物,余甘子与保肝,抗癌,健胃,抗诱变,抗衰老等35种功能有关,是一种具有广阔开发前景的药用植物。
本专利权人广西中医学院于2005年8月22日向中国知识产权局申请了“具有抗癌、抗菌作用的余甘子提取物及其中药制剂的生产方法”的发明专利,专利号:200510036622.0名称:公开号:CN1733752授权日:2008年4月16日发明人:钟振国;董明姣,该发明公开了一种从余甘子的根、树皮、叶或果实中提取的具有抗癌、抗菌作用的黄酮类化合物,其提取方法可以采用水煮法、醇提法、大孔树脂吸附法、萃取法得到,在该专利说明书中公开了将制得的黄酮类化合物制成不同的中药制剂,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、伤寒沙门菌、肺炎克雷伯菌、甲型链球菌和乙型溶血性链球菌即表现出抑制作用。对白血病细胞株L1210和P388D1、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、神经肿瘤细胞株NG108-15以及人肝癌细胞株Hele7404,也具有较好的抑制作用。但是该专利在2005年之前还仅仅对余甘子进行提取,得到的提取物是黄酮类化合物,直接将黄酮类化合物试验其抗肿瘤作用,还没有对这些黄酮类化合物进行有效成分的分离以及具体化学结构进行鉴定,对提取的黄酮类化合物是如何抗肿瘤的作用机制还不是十分清楚。
发明内容
本发明的目的是提供从余甘子叶或果实提取的化合物中分离出具体的有效成分,并用这些活性成分作为制备抗肿瘤(抗癌)作用药物的原料,从而更好地利用我国的中草药资源,丰富中草药治疗疾病的领域。
本发明是在专利号:200510036622.0的基础上,经过深入研究以及进一步其抗肿瘤的作用机制来完成的,发明的技术方案如下:
1、将余甘子叶或果实分别用95%乙醇和50%乙醇进行渗漉提取后,取50%乙醇浸膏再分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行部位分离,利用硅胶柱层析法对乙酸乙酯部位进行分离纯化,得到纯结晶化合物结晶I和结晶II;经过检测,得出结晶I主要的成分是没食子酸(分子式为C7H6O5),结晶II的主要的成分为没食子酸乙酯(分子式为C9H10O5)。结晶I和结晶II也可能还有其它一些成分。
2.在体外实验,采用MTT法、细胞集落形成法测定结晶I和结晶II对人肝癌细胞株Bele7404、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、白血病细胞株P388D1、小鼠肝癌细胞株H22和小鼠肉瘤细胞株S180的生长抑制情况,并用小鼠脾淋巴细胞对结晶I与结晶II进行免疫毒性测试,为下一步的研究奠定基础;3.在体内动物实验,建立S180小鼠实体瘤、腹水瘤和H22小鼠实体瘤、腹水瘤模型,观察结晶I对小鼠实体瘤抑瘤率和腹水瘤生命延长率的影响;4.采用瑞氏和吉姆萨混染法、吖啶橙染色法观察结晶I和结晶II对肿瘤细胞凋亡的影响;用FCM法观察结晶I和结晶II对肿瘤细胞凋亡及细胞周期的影响,初步探讨其抗肿瘤作用机制。
以下是具体方法:
1、余甘子叶或果实有效成分的提取:
(1)渗漉提取和分离
将余甘子叶或果实用粉碎机粉碎成碎片,每kg用10升体积浓度80—95%的乙醇浸泡20—60小时,然后用95%乙醇渗漉提取,收集10倍量的渗漉液;后改用50%乙醇浸泡30—50小时,最后再用新鲜的50%乙醇渗漉,收集10倍量的渗漉液,回收渗漉液中的乙醇后得到50%乙醇浸膏。
(2)乙醇浸膏分部位的提纯
用100-200目的硅胶,将50%乙醇浸膏拌匀,每1Kg50%乙醇浸膏用1Kg硅胶,依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯回流提取,其中,石油醚、三氯甲烷分别回流3次,每次1小时,乙酸乙酯部位回流时间6次,每次1小时,第1次1小时,回收溶剂,回收成分放置蒸发皿于100℃水浴挥干,得到乙酸乙酯部位浸膏。
(3)有效成分的分离
取上述第(2)步的余甘子叶或果实50%乙醇提取液中的乙酸乙酯部位干膏加95%乙醇溶解后用100~200目的硅胶(粗孔2号硅胶,层析用,青岛海洋化工厂生产)进行拌样并装柱,用硅胶柱层析法分离,依次用不同比例的石油醚-乙酸乙酯(100:0,100:1,60:1,30:1,10:1,5:1,1:1,0:1)进行梯度洗脱,每瓶约30min,收集流份为每份500ml。从第392-535流分得到白色针晶状结晶I,从第540-629流分得到淡黄色针晶状结晶II。
(1)结晶I的结构解析
a理化性质及检识反应:外观:为白色针晶状结晶,遇光变棕褐色。mp:235~235.5℃。
溶解度:稍溶于水,溶于乙醇和乙醚,不溶于氯仿和苯。
b化学检识:三氯化铁试验:阳性(呈蓝色)。氯化钠明胶试验:阳性(出现白色沉淀)。
c质谱:测定条件:快原子轰击
d综合解析
综合质谱、13C核磁共振谱、核磁共振氢谱等图谱得出结晶I的分子式为C7H6O5,可推测出结晶I的结构如下:
(2)结晶II的结构解析
a理化性质及检识反应
外观:为白色针晶状结晶,遇光变棕褐色。mp:151~154℃。溶解度:溶于水。
b化学检识:三氯化铁试验:阳性(呈蓝色)。氯化钠明胶试验:阳性
c综合解析
综合质谱、13C核磁共振谱、核磁共振氢谱等图谱得出结晶II的分子式为C9H1005,可推测出结晶II的结构如下:
3、余甘子叶或果实有效成分的药理研究
本发明人通过对余甘子叶或果实提取物没食子酸乙酯进行研究,的实验结果表明,在体内外的抗癌试验研究表明,其有良好的抗肝癌、白血病、胃癌的效果。
4、抗肝癌、白血病、胃癌药物的制备
余甘子叶或果实提取物没食子酸和没食子酸乙酯可以制备成治疗肝癌、白血病、胃癌的药物,例如可根据需要,制备不同的剂型:口服给药制剂,如口服液、片剂、胶囊、含片、丸剂;注射给药制剂,如注射剂等。
本发明的优点是:
1、渗漉法是一种较好的提取方法,该法设备简单,操作安全,节能降耗,减少成分破坏,有煎煮法不可比拟的优点,所以本发明采用了渗漉法进行提取,经过对95%乙醇的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和50%乙醇的氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位做过体外筛选,结果为50%乙醇的乙酸乙酯部位的抗肿瘤效果较好。所以,用95%乙醇渗漉将其中的脂溶性成分尽量提取完全,后再换50%乙醇进行渗漉,将其中的水溶性成分尽量提取完全,分别用石油醚、氯仿回流提取后,再用乙酸乙酯回流,得到有效部位。
2、本发明采用柱层析法,用不同比例的石油醚-乙酸乙酯(100:0,100:1,60:1,30:1,10:1,5:1,1:1,0:1)将50%乙醇的乙酸乙酯部位进行梯度洗脱。其中,我们分离得到的两个有效成分结晶I与结晶II通过做理化性质及检识反应还有综合质谱、13C核磁共振谱、核磁共振氢谱等图谱可知道其均为酚类,并已确定了结晶I与结晶II的化学结构式。
3、肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病。因此,肿瘤学一直是医学研究的重点,寻找有效的抗肿瘤药物与方法,彻底攻克肿瘤是世界医学界的重要研究课题。研究表明许多中药具有抗肿瘤作用,但其作用成分复杂,尤其是复方,具有多种作用成分和通过多种作用途径产生抗肿瘤作用。弄清中药余甘子叶或果实的抗肿瘤作用途径和靶位点对加速抗肿瘤中药的开发具有重要意义。据文献记载,余甘子叶或果实含余甘子酸、蛇床子醇、β-谷甾醇、并没食子酸、没食子酸、3,6-二没食子酰葡萄糖、鞣料云实精、诃黎勒酸、诃子酸、葡萄糖没食子鞣甙。我们对50%乙醇的乙酸乙酯部位进行了化学成分的预实验,黄酮类的3项反应为阳性,酚类的2项反应为阳性,甾体或三萜类反应也均为阳性反应,与文献报道基本一致。
4、本发明首先采用柱层析的方法,用不同比例的石油醚-乙酸乙酯对50%乙醇提取液中的乙酸乙酯部位进行梯度洗脱,得到若干个样品,我们选取了结晶I与结晶II。将得到的几个样品采用Bele7404、Hela、SGC7901、P388D1、B16、H22和S180七种肿瘤细胞株进行筛选,确定抗肿瘤成分为结晶I与结晶II,并用小鼠脾淋巴细胞对结晶I与结晶II进行免疫毒性测试,为下一步的研究奠定基础。然后我们将结晶I的体内抗肿瘤实验,建立S180和H22小鼠移植性肿瘤模型,观察药物对S180和H22荷瘤小鼠的瘤体生长抑制和生存期的延长情况。最后是对结晶I与结晶II的抗肿瘤作用机制研究,观察其对Bele7404细胞株细胞周期及细胞凋亡的影响。(具体方法见以下试验)
5、在我们的200510036622.0中国专利中,对余甘子叶或果实提取物具有抗肿瘤、抗乙肝病毒、抗菌和防止慢性支气管炎并肺气肿的药理作用作过相关的研究,实验结果表明余甘子叶提取物具有抗肿瘤、抗菌和防止慢性支气管炎并肺气肿作用,并且有效成分集中在50%乙醇提取液中的乙酸乙酯部位。但是,其有效成分仍然是不清楚的,所以本发明在抗肿瘤药效实验的跟踪下,拟弄清其抗肿瘤有效成分及对其作用机制进行研究,这样就为人们进一步开发余甘子提供一种科学的方法,为人类抗击癌症开辟一条新路。
具体实施方式
实施例1、将50kg余甘子叶或果实用粉碎机粉碎成50目大小的叶子,用95%乙醇浸泡48h,48h后用新鲜的95%乙醇渗漉提取,收集10倍量的渗漉液;后改用50%乙醇浸泡48h,48h后用新鲜的50%乙醇渗漉,收集10倍量的渗漉液,回收渗漉液中的乙醇后得到50%乙醇浸膏5785g。
用6000g硅胶(100-200目)拌匀后,依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯回流提取,回收溶剂,浓缩后得到乙酸乙酯部位干膏(228.4g)。
化学成分预试验
为弄清乙酸乙酯部位干膏成分的类型以便提出合理的提取分离工艺,取少量乙酸乙酯部位进行系统成分预试实验。成分的预试实验结果如下:
表1 余甘子叶或果实50%乙醇提取液乙酸乙酯部位的成分预试结果
注:“+”表示阳性结果,“-”阴性结果。
有效成分的分离
取余甘子叶或果实50%乙醇提取液中的乙酸乙酯部位加95%乙醇溶解后用100~200目的硅胶进行拌样并装柱,用硅胶柱层析法分离,依次用不同比例的石油醚-乙酸乙酯(100:0,100:1,60:1,30:1,10:1,5:1,1:1,0:1)进行梯度洗脱,收集流份为每500ml一份。
乙酸乙酯部位的提取
从50kg的余甘子叶或果实得到50%乙醇提取液乙酸乙酯部位浸膏228.4g,得率为4.57%。
有效成分的分离:从第392-535流分得到白色针晶状结晶I(2.649g),从第540-629流分得到淡黄色针晶状结晶II(6.347g)。
检测与上述技术方案的方法相同,并用质谱测定:快原子轰击,确定是结晶I与结晶II的化合物。
药物制备
实施例一
取以上提取方法所得余甘子叶或果实提取的乙酸乙酯部位化合物10克,加适量的水溶解,加入60克蔗糖粉,溶解,灭菌,分装,制得口服液100ml。每100ml口服液相当于100g余甘子生药材。
实施例二
取以上提取方法所得余甘子叶或果实提取的乙酸乙酯部位化合物10克,加纯水溶解,微孔过滤,分装入冻干瓶,冷冻干燥,供注射用。每瓶相当于10g余甘子生药材。
实施例三
取以上提取方法五所得余甘子叶或果实提取的乙酸乙酯部位化合物,加适量淀粉制粒,压成片剂,基片重0.3g,或包衣,每片相当于4g余甘子生药材。
实施例四
制备实施例三所得颗粒,装入零号胶囊,每囊装0.6克,每粒胶囊相当于8g余甘子生药材。
实施例五
提取方法所得余甘子叶或果实提取的乙酸乙酯部位化合物100克,加1400克白糖粉,制成颗粒,分装成每袋重15克的颗粒剂。每袋相当于10g余甘子生药材。
本发明的余甘子黄酮类化合物具体药理和药效学临床试验。
为了进一步确定余甘子叶叶或果实的抗肿瘤有效成分和其作用机制,本研究共分为四个部分完成。首先采用柱层析的方法,用不同比例的石油醚-乙酸乙酯对50%乙醇提取液中的乙酸乙酯部位进行梯度洗脱,得到六个样品,其中包括结晶I与结晶II。第二部分将得到的六个样品采用Bele7404、Hela、SGC7901、P388D1、B16、H22和S180七种肿瘤细胞株进行筛选,确定抗肿瘤成分为结晶I与结晶II,并用小鼠脾淋巴细胞对结晶I与结晶II进行免疫毒性测试,为下一步的研究奠定基础。第三部分为结晶I的体内抗肿瘤实验,建立S180和H22小鼠移植性肿瘤模型,观察药物对S180和H22荷瘤小鼠的瘤体生长抑制和生存期的延长情况。第四部分为结晶I与结晶II的抗肿瘤作用机制研究,观察其对Bele7404细胞株细胞周期及细胞凋亡的影响。
一、余甘子叶或果实提取的乙酸乙酯部位化合物体外抗肿瘤作用研究
1 实验材料和方法
1.1 肿瘤细胞株
人肝癌细胞株Bele7404、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、白血病细胞株P388D1和黑色素瘤细胞株B16等均购自上海细胞生物研究所细胞库;小鼠肝癌细胞株H22和小鼠肉瘤细胞株S180均购自广西中医药研究所。
1.2 细胞实验试剂
MTT(四甲基噻唑蓝)为德国Sigma公司产品,批号:020609
FBS(胚胎牛血清)为美国Hyclone公司产品,批号:0407
RPMI1640培养基为美国GIBCO公司产品,批号:1120708
Trypisn(胰蛋白酶)购自天津市景洋生物制品有限责任公司,批号:200503
DMSO(二甲基亚砜)购自天津汇英化学试剂有限公司,批号:20030526
Wright,s stain(瑞氏染色素)购自上海三爱思试剂有限公司,批号:20011026
Giemsa,s stain(吉氏染色素)购自上海试剂三厂,批号:20000324
卡那霉素,德国Sigma公司分装
L-谷氨酰胺,Amresco分装
ConA sigma分装,广州威佳科技有限公司生产
LPSsigma分装,BioSharp公司生产
1.3 实验方法
1.3.1 RPM1640完全培养液的配置
RPMI1640完全培养液:含RPMI1640培养基、3%谷氨酰胺、卡那霉素750μg/ml、10%或15%FBS(临用前加)。
1.3.2 MTT法
在96孔培养板中每孔加入200ul(含有5000个/ml肿瘤细胞)10%FBS的RPMI1640培养液,置37℃,10%CO2培养箱中培养24h后(P388D1、H22、S180离心处理),弃去旧培养液。实验组分别加入新的培养液190ul/孔,然后加入不同浓度待测样品10ul/孔,使每孔样品终浓度结晶I与结晶II均分别为1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml,细胞对照孔则加入200ul/孔新的培养液,每组4平行孔,置37℃,10%CO2培养液培养4天后,弃去上清液,加入200ul/孔新鲜配置的含0.2mg/mlMTT的无血清培养液,37℃继续培养4h。4h后弃上清夜,加入200μl/孔DMSO,振荡混匀后,用酶标仪(波长为570nm,参比波长为450nm)测定OD值,按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率:
肿瘤细胞生长抑制率=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%,并计算结晶I与结晶II对不同肿瘤细胞株的IC50 [6]
1.3.3 集落形成法
采用SGC7901、Bele7404、H22、S180四种肿瘤细胞株。取对数生长期的SGC7901和Bele7404肿瘤细胞株各一瓶,经胰蛋白酶Trypisn消化后作成单个分散细胞悬液,作活细胞计数,用10%FBSRPMI1640培养液配成含500个/ml细胞悬液,取35mm培养皿,4个为一组,阴性对照组每皿加2ml细胞悬液。实验组分别加入结晶I与结晶II各100μl,加入稀释后的细胞悬液2ml,使结晶I与结晶II终浓度为20μg/ml,摇匀后置37℃10%CO2培养箱培养7天,弃去培养液,先用瑞氏染液染色5min后,然后用Giemsa's溶液与Sorensen磷钼酸缓冲液以1:9混合成工作液(现配现用),染色10min。流水冲洗、晾干,在20×的显微镜下计数含50个细胞以上的集落,重复4次。其中H22、S180用半固体软琼脂集落培养法,取对数生长期的H22和S180肿瘤细胞株各一瓶,作活细胞计数,用15%FBSRPMI1640培养液配成含1000个/ml细胞悬液,置37℃预温。取35mm培养皿,4个为一组,每个实验组分别加入终浓度为20μg/ml结晶I与结晶II各100μl,对照组加入等体积的培养液,取在沸水中融化的5%琼脂液1份,加入到9份37℃含15%FBSRPMI1640培养液中,摇匀后迅速加入到培养皿中,每个1ml,混匀后,置室温使琼脂凝固。取预温的细胞悬液按每9.4ml加5%的琼脂液0.6ml的比例混匀,加到已铺底层琼脂的培养皿中,每个1ml,置室温使琼脂凝固。盖上培养皿盖,置37℃10%CO2培养箱培养7天,在16×的显微镜下计数直径大于75μm(50个细胞以上)的集落。按下式计算集落形成率及抑制率:
集落形成率(%)=克隆数/接种细胞数×100%
集落抑制率(%)=1-克隆数/对照组克隆数×100%
1.3.4 结晶I与结晶II对小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应的影响
1.3.4.1 脾脏淋巴细胞的制备
颈椎脱臼处死3只昆明种小鼠,用75%的酒精浸泡5分钟,无菌操作取出脾脏,在RPMI1640液中将脾脏剪成1-2mm3小块,用0.2%的胰酶37℃消化3分钟后用200目的细胞筛滤,制成单个细胞悬液,用RPMI1640洗涤2次后离心(1000rpm,5min),用含10%小牛血清RPMI1640完全培养基制成3×106个/ml的脾细胞悬液。
1.3.4.2 脾脏淋巴细胞增殖活性的检测
将悬液以160μl/孔加入培养板中,在脾细胞的培养板中分别加入T、B淋巴细胞增殖的刺激因子刀豆蛋白A(ConA)250μg/ml和大肠杆菌脂多糖(LPS)200μg/ml,每孔20μl,然后待测样品每孔加20μl,终浓度为80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml,每组4平行孔,培养板在37℃含5%CO2的培养箱中孵育48h后,用MTT法测定T、B淋巴细胞增殖的活细胞数。MTT法测定同1.3.2。
1.3.4.3 结果处理
T淋巴细胞生长抑制率=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%
B淋巴细胞生长抑制率=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%
1.4 统计学处理
采用Excel软件统计,两组之间的样本均数比较采用t检验。
2 实验结果
2.1 MTT法
2.1.1 抗肿瘤活性成分筛选
用人肝癌细胞株Bele7404、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901对分离出来的6种样品:样品1、样品2、结晶I、结晶II、样品3与样品4在25μg/ml-100μg/ml的范围内进行初筛。
在分离得出的样品1、样品2、结晶I、结晶II、样品3与样品4中,当浓度大于25μg/ml时,结晶I与结晶II对Bele7404、Hela和SGC7901肿瘤细胞株的抑制率均大于30%;当浓度为50μg/ml时,结晶I与结晶II对Bele7404、Hela和SGC7901肿瘤细胞株的抑制率均大于60%,其抑制率与浓度成正比。
根据初筛结果,对其中增殖抑制率大于30%的结晶I与结晶II用7种不同组织来源的细胞:Bele7404、Hela、SGC7901、P388D1、B16、H22和S180进行扩大筛选,
经过观察倒置显微镜下Bele7404细胞对照组的细胞成集落,细胞较丰富且形态均一且较大,呈多边形,折光性好;结晶I2.5μg/ml组,细胞集落变小,细胞大小不一,细胞散在;结晶I10μg/ml组,细胞散在,胞体皱缩变小,折光性减弱;结晶I40μg/ml组,细胞散在,胞体皱缩且细胞轮廓消失,并可见凋亡小体。结晶II2.5μg/ml组,细胞基本成集落,其中散在一些细胞,细胞折光性减弱;结晶II10μg/ml组,细胞散在增多,偶见成簇的细胞团,细胞变小;结晶II40μg/ml组,细胞集落消失,可见许多弥漫较小的细胞组织。
当浓度为5μg/ml时,结晶I对Bele7404肿瘤细胞抑制率大于40%;当浓度为40μg/ml时,结晶I与结晶II对Bele7404肿瘤细胞抑制率均大于60%。可见结晶I与结晶II对Bele7404肿瘤细胞有较强的杀伤作用,且抑制率与浓度成正比。
表2 结晶I与结晶II对Bele7404肿瘤细胞的抑制作用(x±s,n=4)
注:与细胞对照组比较,*p<0.01。
由表2可知,结晶I对Bele7404肿瘤细胞有很强的杀伤作用,且抑瘤率与细胞对照组相比差异有显著性(p<0.01),抑制率与浓度有较好的相关性,按对数回归方程计算,结晶I(r=97.38%),其IC50为9.03μg/ml。结晶II对Bele7404肿瘤细胞也有一定的抑制作用,而且抑制率与浓度有很好的相关性(r=97.94%),其IC50为20.50μg/ml。提示结晶I有较强的体外抑制Bele7404肿瘤细胞作用,结晶II对Bele7404肿瘤细胞有一定的抑制作用。
2.1.3 结晶I和结晶II对SGC7901细胞增殖的影响
当浓度为10μg/ml时,结晶I与结晶II对SGC7901肿瘤细胞抑制率大于40%;且在浓度为40μg/ml时,结晶I与结晶II对SGC7901肿瘤细胞抑制率均大于60%。可见结晶I与结晶II对SGC7901肿瘤细胞有一定的杀伤作用,且抑制率与浓度成正比。
表3 结晶I与结晶II对SGC7901肿瘤细胞的抑制作用(x±s,n=4)
注:与细胞对照组比较,*p<0.01。
由表3可知,结晶I与结晶II对SGC7901肿瘤细胞有一定的杀伤作用,其IC50分别为15.95μg/ml和17.66μg/ml,且抑瘤率与细胞对照组相比差异有显著性(p<0.01)。其中结晶I抑制率与浓度的相关性为(r=97.72%),结晶II为(r=97.47%)。
2.1.4 结晶I和结晶II对Hela细胞增殖的影响
当浓度为5μg/ml时,结晶I对Hela肿瘤细胞抑制率大于40%;当浓度为40μg/ml时,结晶I与结晶II对Hela肿瘤细胞抑制率均大于70%。可见结晶I与结晶II对Hela肿瘤细胞有较强的杀伤作用,且抑制率与浓度成正比。
表4 结晶I与结晶II对Hela肿瘤细胞的抑制作用(x±s,n=4)
注:与细胞对照组比较,*p<0.01。
由表4可知,结晶I与结晶II对Hela肿瘤细胞有较强的杀伤作用,且抑瘤率与细胞对照组相比差异有显著性(p<0.01)。按对数回归方程计算结晶I抑制率与浓度的相关性为(r=94.17%),其IC50为9.71μg/ml;结晶II(r=97.27%),其IC50为11.66μg/ml。提示结晶I与结晶II有较强的体外抑制Hela肿瘤细胞的作用。
2.1.5 结晶I和结晶II对P388D1细胞增殖的影响
当浓度为2.5μg/ml时,结晶I与结晶II对P388D1肿瘤细胞抑制率均大于40%;当浓度为20μg/ml时,结晶II对P388D1肿瘤细胞抑制率大于70%,可见结晶I与结晶II对P388D1肿瘤细胞有很强的杀伤作用。
表5 结晶I与结晶II对P388D1肿瘤细胞的抑制作用(x±s,n=4)
注:与细胞对照组比较,*p<0.01。
由表5可知,结晶I与结晶II对P388D1肿瘤细胞有很强的杀伤作用,且抑瘤率与细胞对照组相比差异有显著性(p<0.01),其IC50分别为3.99μg/ml和7.48μg/ml。其中结晶II抑制率与浓度有较好的相关性,按对数回归方程计算,结晶II(r=98.61%)。提示结晶I与结晶II有较强的体外抑制P388D1肿瘤细胞作用。
表6 结晶I与结晶II对B16肿瘤细胞的抑制作用(x±s,n=4)
注:与细胞对照组比较,*p<0.01。
从表6可以看出,结晶I和结晶II对B16肿瘤细胞有较强的杀伤作用,终浓度均为40.00、20.00、10.00、5.00、2.5、1.25μg/ml时,抑瘤率与细胞对照组相比差异均有显著性(p<0.01),按对数回归方程计算,结晶I(r=94.67%),其IC50为2.35μg/ml;结晶II(r=89.49%),其IC50为15.18μg/ml。
2.2 集落形成法
综合分析结晶I与结晶II对肿瘤细胞增殖影响的筛选结果,发现这两种化合物对Bele7404、SGC7901、H22、S180四种肿瘤细胞株有较好的抑制作用。为了进一步检查结晶I与结晶II对这四种细胞增殖的影响,采用集落形成法对这四种细胞进行再筛选。结果见表9-表12。
表9 结晶I和结晶II在浓度为20μg/ml对Bele7404肿瘤细胞集落形成的影响(%)(x±s,n=4)
注:与阴性对照组比较:*p<0.01
表10 结晶I和结晶II在浓度为20μg/ml对SGC7901肿瘤细胞集落形成的影响(%)(x±s,n=4)
注:与阴性对照组比较:*p<0.01
表11 结晶I和结晶II在浓度为20μg/ml对S180肿瘤细胞集落形成的影响(%)(x±s,n=4)
注:与阴性对照组比较:*p<0.01
表12 结晶I和结晶II在浓度为20μg/ml对H22肿瘤细胞集落形成的影响(%)(x±s,n=4)
注:与阴性对照组比较:*p<0.01
从表9-表12可以看出,结晶I对Bele7404、SGC7901、S180、H22细胞集落形成率分别为19.91%、21.62%、3.90%、3.24%,与阴性对照组比较,有显著性差异(p<0.01);且结晶I在浓度为20μg/ml时,除对Bele7404和SGC7901细胞的增殖抑制率分别为65.07%和59.55%外,对S180和H22的增殖抑制率均达到90%以上。
结晶II对Bele7404、SGC7901、S180、H22细胞集落形成率分别为29.60%、29.40%、3.50%、5.11%,与阴性对照组比较,有显著性差异(p<0.01);且结晶II在浓度为20μg/ml时,除对Bele7404和SGC7901细胞的增殖抑制率分别为47.92和44.94外,对S180和H22的增殖抑制率均达到90%以上。
2.3 脾脏淋巴细胞增殖活性的检测
为了测试结晶I与结晶II对正常免疫细胞增殖的影响,检测了其对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响,结果见表13。
表13 结晶I与结晶II对脾细胞增殖的影响
从表13可以知道,结晶I和结晶II对脾细胞免疫毒性较小。
3讨论
本研究通过MTT法和集落形成法证明了结晶I与结晶II的抗癌活性,表明本发明所采用的方法及方案具有可行性和科学性。抗肿瘤药物的筛选方法繁多,大体上分为体外和体内方法二类。每种方法各有其优点及局限性,用某一种简单方法难以肯定药物的抗癌作用。由于癌细胞生长具有相对的自主性,故可在体外建立具有无限增殖能力的细胞系。用体外细胞作抗癌药筛选具有用药少(5-10mg),周期短,费用省等优点。与非瘤性筛选体系相比,体外筛选结果与体内实验的相关性好,因此已被一些研究机构作为常规的抗癌药初筛手段[8-9]。
本实验发明采用MTT法对分离出来的六个样品进行筛选,确定了抗肿瘤成分为结晶I和结晶II。实验结果表明,结晶I和结晶II在一定程度上可抑制七种不同组织来源的肿瘤细胞株的繁殖。
因此,为了进一步验证前面筛选的结果,本发明再用集落形成法进行扩大筛选,实验结果与MTT法的结果相一致,进一步佐证了结晶I与结晶II有抗肿瘤作用。
由于在体外的抑瘤活性实验中,结晶I与结晶II对肿瘤细胞显现较强的抗癌活性,我们又进行了动物体内实验。目前临床上常用的抗肿瘤药大多经动物移植性肿瘤筛选而发现的。按照我国目前的条件和情况,从天然产物中寻找新抗肿瘤药物可选用S180实体型、艾氏实体型、Lewis肺癌、败血病L1210和P358、黑色素瘤、肝癌腹水或实体型等动物模型进行筛选[15]。结合本实验条件,首先选择S180实体瘤模型和H22实体瘤模型对结晶I的体内抗肿瘤活性进行筛选。
按实体瘤实验疗效评价规定[16]:当天然药物对瘤体抑瘤率大于30%,并经统计学处理有明显差异时,连续3次疗效稳定,则说明药物有一定的疗效。由表14可见,结晶I对S180细胞低、中剂量组的肿瘤抑制率高达30%以上,其中高剂量组达到50.62%;由表15可见,结晶I三剂量组瘤重与肿瘤模型对照组比较,均有显著差异,其中中、高剂量组抑瘤率均大于30%。结果表明结晶I能抑制小鼠S180、H22肉瘤的生长,且其抑瘤率也随剂量增大而升高,说明其抑制作用有一定的剂量依赖性。同时,化疗药物环磷酰胺(CTX)的抗肿瘤效果虽然较高,但在实验过程中可观察到小鼠的体重下降,活动性差、皮毛脱落等毒副作用,且对小鼠的肝脏和脾脏等免疫器官抑制作用较大,也就是说环磷酰胺在发挥抗肿瘤作用的过程中同时对机体的免疫力有较大的破坏,导致体重异常下降,免疫器官受损;而本实验中的结晶I在发挥抗肿瘤作用过程中,小鼠活动性强,皮毛光滑,体重较正常,没有表现出明显的毒副作用。
筛选肿瘤药物的给药途径应与推荐临床用药的途径相同,一般初筛时均用腹腔注射(i.p.),静脉给药者可用腹腔注射代替,口服可用灌胃的方法[17]。为检验结晶I口服的效果,我们进行了腹水瘤小鼠灌胃实验,以生命延长率作为衡量指标。结果显示,由表16可知在对S180小鼠生命延长率的实验中,结晶I在125mg/kg和250mg/kg组小鼠平均生存期与对照组比较,差异有显著性意义,表明结晶I对S180有一定的抑制作用,能明显提高S180小鼠的生命延长率;且由表17可知,结晶I高、中、低三个剂量组小鼠平均生存期与对照组比较,有非常显著差异性意义,表明结晶I对H22有一定的抑制作用,能明显提高H22小鼠的生命延长率。
二、本发明结晶II抗肿瘤作用机制研究
1 实验材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
昆明种纯系健康小鼠,6周龄,18-22g,购自广西中医学院实验动物中心。
1.1.2 细胞株
Bele7404细胞株购自上海细胞生物研究所细胞库
1.1.3 实验仪器
流式细胞仪,美国产(Beckman),型号:Epricsxl
稳压稳流电泳仪,北京市六一仪器厂,型号:DYY-6B
倒置荧光显微镜(Nikon),日本产,型号:TE2000-U
Vortex上海医科大学仪器厂,型号:XW-80A
1.1.4 实验试剂
吖啶橙:sigma分装
蛋白酶K:Beyotime产品编号:C0007-2
裂解液:Beyotime产品编号:C0007-1
Tris平衡苯酚:北京市双翔达生化试剂仪器经营部生产,批号:
20060412
氯仿:北京化学试剂公司,AR,批号:020404LPS
醋酸铵:Beyotime产品编号:C0007-3
无水乙醇:成都市科龙化工试剂厂,批号:20061103
TE:Beyotime产品编号:C0007-4
琼脂糖:购自上海伯奥生物科技有限公司,批号:20000822
RnaseA:sigma分装,上海申能博彩生物科技有限公司
PI:sigma分装
1.1.5 PBS的配置
PBS(0.01M,PH7.2-7.4):KH2PO4 0.345g,NaHPO4·H2O 1.56g,NaCl 8.0g,KCl 0.2g加水定容至1000ml,高压灭菌。
1.2 实验方法
1.2.1 形态学检测
1.2.1.1 瑞氏和吉姆萨混染法
取对数生长期Bele7404细胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培养基配成1×105个/ml的细胞悬液,接种在放置有载玻片的培养皿中。其中,在实验组分别加入结晶I与结晶II药物,使药物终浓度均为20μg/ml,对照组加入等体积的培养液,置含10%CO2 37℃温箱中培养3天。三天后,取出载玻片,用甲醇固定10min。先用Wright's染液染色1min,然后用Giemsas溶液与Sorensen磷酸缓冲液以1:9混合成工作液(现配现用),染色10min。流水冲洗、凉干,镜检。
1.2.1.2 吖啶橙(AO)染色法
取对数生长期Bele 7404细胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培养基配成1×106个/ml的细胞悬液,分装于培养瓶中。其中,在实验组分别加入结晶I与结晶II药物,使药物终浓度均为20μg/ml,对照组加入等体积的培养液,置含10%CO237℃温箱中培养3天。三天后,用胰酶消化,制备细胞悬液,分别取各实验组和对照组95μl细胞悬液,均加入5μl吖啶橙储存液,混匀。取1滴混合液滴在载玻片上,盖上盖玻片,37℃下染色10min,置于荧光显微镜下紫外光激发,40×荧光物镜观察,随机计数100个细胞,计数Bele7404细胞凋亡率,并选取一个形态典型的视野拍照。
凋亡率(%)=凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%
1.2.2 细胞凋亡的FCM检测(PI和Hoechst33342双染色法
取对数生长期Bele7404细胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培养基配成2×106个/ml的细胞悬液,分装于培养瓶中。其中,在实验组分别加入结晶I与结晶II药物,使药物终浓度均为20μg/ml,对照组加入等体积的培养液,置含10%CO2 37℃温箱中培养3天。三天后,用胰酶消化,制备细胞悬液。离心收集细胞,PBS洗一次,离心弃PBS,再用PBS充分混匀细胞,加入冰冷的70%乙醇,混匀,用封口膜封口,4℃过夜。弃去70%乙醇,PBS洗两次,用剩余的约0.5mlPBS混匀固定的细胞,加入RnaseA(终浓度为50μg/ml),37℃消化1h后加入PI(终浓度为50μg/ml)和2mmol/L Hoechst33342,4℃染色1h。上机。在FACS420流式细胞计上测定;氩离子激光器488或514nm波长光激发;阻断滤片为620nm长波通滤片。
2 实验结果
2.1 瑞氏和吉姆萨混染法
以20μg/ml浓度(以下同)培养人肝癌细胞株Bele7404,在加药72h后,用瑞氏和吉姆萨染液染色后,在倒置显微镜下观察,细胞经用瑞氏和吉姆萨染液染色后,倒置显微镜下观察可见,阴性对照组的细胞膜较完整,胞质透明,核膜完整,核大而圆;而给药组的细胞则凋亡变圆变小,核质固缩。
2.2 吖啶橙(AO)染色法
以终浓度均为20μg/ml的结晶I和结晶II培养人肝癌细胞株Bele7404,72h后,用吖啶橙染色,在荧光显微镜下紫外光激发,40×荧光物镜观察,随机计数100个细胞,计算细胞凋亡率,即凋亡指数(AI),并选取一个形态典型的视野拍照。
表18 结晶I和结晶II处理72h细胞凋亡指数(AI)(%)(x±s)
注:与阴性对照组比较:*P<0.01
从表18可知,在倒置显微镜40×下观察随机计数100个细胞,计算细胞凋亡率(AI),结晶I的凋亡率为12.5,结晶II的凋亡率为41.3,两者的凋亡指数与阴性对照组相比较有显著性差异(p<0.01)。
阴性对照组的细胞染色均匀,荧光很强;结晶I和结晶II处理组可看见凋亡细胞,细胞核中有鲜绿色的斑点,细胞有裂解现象。
表19 流式细胞仪分析的各组细胞周期分布和凋亡指数
注:与阴性对照组比较:*P<0.01
由流式细胞仪分析结果可知:结晶I20μg/ml处理,胃癌细胞Bele7404的凋亡率为10.7%,结晶II20μg/ml处理,凋亡率为39.2%(如图32)。由各周期时相变化(表19)可知结晶I处理的Bele7404G0/G1期和S期细胞减少,而G2/M期细胞增加;而结晶II处理的Bele7404G0/G1期和G2/M期细胞增加,而S期细胞明显减少。
3 讨论
目前,恶性肿瘤是严重威胁人类健康的顽疾,给人类带来巨大的精神压力和经济负担。随着肿瘤诊断治疗技术的不断完善,治疗水平不断提高,中医药在肿瘤治疗中的地位和综合优势愈显重要[22]。抗肿瘤中草药的发掘和筛选已向纵深发展,近年来,从天然植物中寻找新的抗肿瘤药物已成为新药研究的主要发展方向之一[23]。研究从余甘子叶或果实提取物中分离并筛选出抗肿瘤活性成分,已初步确定结晶I和结晶II有抗肿瘤活性,其诱导细胞凋亡是抗肿瘤机制之一,引起凋亡的原因可能跟阻滞细胞周期有关。
六、临床效果
因本发明尚未获得新药临床批件,不能进入临床研究,因此只在4例志愿者身上进行临床应用实验。
例一黄××,女,广西南宁市人,43岁,查出患胃癌3个月,予上述制备实例三所得片剂口服,每日三次,每次4片,半年期间病情没有恶性发展。
例二莫××,男,广西南宁市人,37岁例行体检时查出淋巴细胞增值。予上述制备实例二所得口服液口服,每日三次,每次50ml,5个月病情有所好转。
例三黄××,男,广西横县农民,52岁,肺癌病人。因经济困难中断医院正常治疗,改为服用制备实例六所得胶囊30天,期间病情没有恶性发展。
例四董××,男,广西恭城县农民,60岁,患白血病。因病况反复发作,加上经济困难而中断医院正常治疗,改为服用制备实例五所得颗粒剂40天,病情有所好转。
Claims (4)
2、如权利要求1所述的具有抗癌作用的化合物的制备方法,其特征在于:将余甘子叶或果实分别用95%乙醇和50%乙醇进行渗漉提取后,取50%乙醇浸膏再分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行部位分离,利用硅胶柱层析法对乙酸乙酯部位进行分离纯化,得到结晶化合物没食子酸和没食子酸乙酯。
3、根据权利要求2所述的具有抗癌作用的化合物的制备方法,其特征在于:将提取的抗癌化合物化合物做成以下制剂或剂型:口服给药制剂:口服液、片剂、胶囊、含片、丸剂;注射给药制剂:注射剂;喷雾给药制剂。
4、如权利要求1所述的具有抗癌作用的化合物在制备治疗肝癌、白血病、胃癌方面的应用。
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2008
- 2008-10-28 CN CNA2008100738640A patent/CN101391961A/zh active Pending
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