CN102145062B - 刺梨果活性提取物及其制备方法、检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了刺梨果活性提取物及其制备方法、检测方法和应用,将刺梨果按常规工艺提取,过滤,弃去刺梨渣,滤液减压浓缩,用有机溶剂萃取,回收有机溶剂,加水分散,过滤,水洗沉淀,合并滤液,分别将滤液和沉淀进行干燥,分别得活性提取物B和A。本发明所提供的制备方法不仅解决了刺梨中有效活性成分的提取、富集和精制问题,该制备工艺还易于实现工业化生产;所提供的检测方法可有效确保活性提取物的质量;所得活性提取物的抗恶性肿瘤活性显著,且与临床抗癌药有协同作用,并具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,可用于制备治疗恶性肿瘤疾病的药物、辅助药物或作为保健食品添加剂,也可用于制备预防或治疗糖尿病的药物、保健品或作为食品添加剂,具有较高的应用价值和良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及刺梨果活性提取物、特别是刺梨果三萜有效部位活性提取物和刺梨果三萜与黄酮(+)-儿茶素有效部位活性提取物及其制备方法、检测方法和应用,属于中药或天然药物技术领域。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)是严重危害人类健康的疾病。据统计,2007年全球新发癌症患者约1200万人,因癌症死亡760万人,每天约有2万人死于癌症。此外,癌症的发病率还在持续上升,预计2020年全球新发癌症患者将达1500万。肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌及鼻咽癌被确定为我国重点防治的八大癌症。药物治疗是肿瘤的主要疗法之一,特别是对出现肿瘤转移的患者,药物治疗尤其重要。药品销售的数据表明,全球制药企业50强2007年的处方药销售额增长为2.8%,而其中抗肿瘤类药物增长最快,达14%。2006年数据同样表明,在10类药物中抗肿瘤药物的销售增长居首位,达20.5%。这反映了对抗肿瘤药物的持续、快速增长的市场需求。现有的抗癌药物如斑蝥素、紫杉醇、顺铂、羟基喜树碱及其衍生物等临床用药,虽然延长了许多癌症患者的生命周期,在一定程度上改善了生活质量,但毒副作用明显,且易产生抗药性。因此,研究开发新的抗肿瘤药物成为迫切的需要。然而,自紫杉醇、喜树碱等天然抗肿瘤药物问世以来,目前尚缺乏新的突破。因此,聚焦我国广泛的药用植物,从中寻找新一代的抗肿瘤候选药物是当务之急。
本发明旨在以资源丰富、民间应用历史悠久且有高含量抗恶性肿瘤活性物质的蔷薇科植物刺梨(Rosa roxbughii Tratt)为研究对象,经深入系统的制备工艺与药理活性研究,得到工艺稳定、疗效显著、质量可控、使用安全的天然药物有效部位活性提取物,以优选出新的抗肿瘤候选药物。
刺梨主产于我国西南地区,药食兼用,安全性极高,已有大量栽培。刺梨果有效部位具有调节机体免疫功能、延缓衰老、解毒、抗动脉粥样硬化、抗应激等功效(张春妮,周毓,汪俊军.刺梨药理研究的新进展,医学研究生学报,2005,18(11):1049-1051,及其引用文献)。在抗肿瘤方面,已有报道的研究主要针对刺梨汁(强宏娟,张春妮,陈桂嫒等.刺梨汁对人白血病K562细胞生长的抑制作用[J].中国肿瘤临床与康复,2000,7(4):32-34;吴立夫,何刚,何照范等.刺梨汁对二甲基亚硝胺前体物肝脏肿瘤作用的防护效应[J].贵州农学院学报,1987,(2):25)。另外,有两项专利申请公开了以刺梨作为原料配伍的复方药物:一是《一种用于肿瘤放化疗后辅助治疗的药物》(邓杰,龙险峰,张明江,唐修静,发明专利申请CN1440795);二是《治疗肿瘤疾病的中草药药剂》(晏正录,国家发明专利,CN101129896)。而目前为止对刺梨中抗肿瘤有效部位的提取、精制与分析、检测等研究尚属空白。
发明内容
本发明的目的在于:提供刺梨果活性提取物及其制备方法、检测方法和应用。本发明提供的制备方法不仅有效浓缩、富集了刺梨果中的活性成分,且该工艺易于实现工业化生产;所得活性提取物具有显著的抗肿瘤作用和较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,可用于制备治疗恶性肿瘤疾病的药物、辅助药物或作为保健食品添加剂,也可用于制备预防或治疗糖尿病的药物、保健品或作为食品添加剂(营养补充剂)。
本发明的技术方案:刺梨果活性提取物的制备方法:将刺梨果按常规工艺提取,过滤,弃去刺梨渣,滤液减压浓缩,用有机溶剂萃取,回收有机溶剂,加水分散,过滤,水洗沉淀,合并滤液,将滤液浓缩干燥得活性提取物B,将沉淀进行干燥得活性提取物A。
更具体的制备方法为:取刺梨干果或鲜果,用6~20倍重量的20~95%乙醇或甲醇水溶液回流或浸渍提取1~4次,每次0.5~3小时,滤过,合并滤液,回收乙醇或甲醇至无醇味,加水定容至相对密度1.05~1.25的浸膏,用有机溶剂萃取1~4次,有机溶剂与水的比例为0.5~2∶1,合并有机溶剂层,回收有机溶剂,加水超声或加热进行分散,抽滤,水洗沉淀1~5次,合并滤液,将滤液浓缩干燥得活性提取物B,将沉淀进行干燥得活性提取物A。
前述有机溶剂为正丁醇、乙酸乙酯或氯仿。
前述干燥采用微波真空干燥、减压真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
前述制备方法制备得到的刺梨果活性提取物A,其中总三萜含量大于50%。
前述制备方法制备得到的刺梨果活性提取物B,其中总三萜含量大于45%,(+)-儿茶素含量不少于5%。
活性提取物A中的主要活性成分为三萜化合物,包括野鸭春酸(Euscaphic acid)、委陵菜酸(Tormentic acid)和刺梨酸(Roxburic acid)等;活性提取物B中的主要活性成分为三萜化合物和黄酮化合物,包括刺梨苷(Kaji-ichigoside F1)、野蔷薇苷(Rosamulin)和(+)-儿茶素((+)-Catechin)等。
前述刺梨果活性提取物A的检测方法为刺梨果活性提取物A中总三萜类化合物的含量测定方法,该方法是以熊果酸对照品为对照,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色比色法测定。
前述刺梨果活性提取物B的检测方法包括刺梨果活性提取物B中总三萜类化合物的含量测定方法和黄酮类化合物(+)-儿茶素的含量测定方法;总三萜类化合物的含量测定方法是以熊果酸对照品为对照,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色比色法测定;(+)-儿茶素的含量测定方法是以(+)-儿茶素对照品为对照,以0.04mol/L枸橼酸溶液∶N,N-二甲基甲酰胺∶四氢呋喃=45∶8∶2为流动相的高效液相色谱法。
具体的总三萜类化合物的含量测定方法为:精密称取真空干燥至恒重的熊果酸对照品5.4mg,置25ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液;称取干燥的刺梨果活性提取物A或B样品,用甲醇定容至50ml,取0.5ml显色测吸光度,作为供试品溶液;取0.5ml供试品溶液,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法,在544nm最大吸收波长下测定吸光度;根据熊果酸对照品的线性回归方程由吸光度计算出浓度C,然后由浓度C计算出样品中总三萜类化合物的含量。
具体的黄酮类化合物(+)-儿茶素的含量测定方法为:照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.04mol/L枸橼酸溶液∶N,N-二甲基甲酰胺∶四氢呋喃=45∶8∶2为流动相;检测波长为280nm;柱温35℃;理论板数按儿茶素峰计算不低于3000;
对照品溶液的制备取(+)-儿茶素对照品,精密称定,加甲醇∶水=1∶1混合液制成每1ml含(+)-儿茶素0.15mg的溶液,即得;
供试品溶液的制备取提取物B粉末20mg,精密称定,置50ml量瓶中,加甲醇∶水=1∶1混合液40ml,超声处理20分钟,并加甲醇∶水=1∶1混合液至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,即得;
刺梨果活性提取物B中(+)-儿茶素含量不少于5%。
前述刺梨果活性提取物A或B可用于制备治疗恶性肿瘤疾病的药物、辅助药物或者作为保健食品添加剂。
前述刺梨果活性提取物A或B可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂用于制备预防或治疗糖尿病的药物、保健品或者作为食品添加剂(营养补充剂)。
前述的药物剂型为硬胶囊、片剂、口服液、颗粒剂、软胶囊或滴丸剂。
为了验证本发明所述刺梨果活性提取物的药理活性,申请人进行了一系列试验研究:
A、体内抗肿瘤活性试验
受试药物:
注射用环磷酰胺,江苏恒瑞医药股份有限公司,批号:08052921;
试验仪器:METTLER AE-240电子分析天平,瑞士。
试验动物:
1、来源及种属:KM小鼠,雌雄兼用,体重18~22g。由贵阳医学院实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(黔)2002-0001。
2、饲养条件:KM小鼠,雌雄分笼饲养于洁净动物饲养柜中,小鼠每笼10只。动物室光照充足,通风和空调设备良好,室温18~25℃,相对湿度50~70%。
数据分析与处理:
试验例1:刺梨果活性提取物抗肿瘤活性实验
1.材料与方法:
实验瘤株:S180(广谱癌)、H22(肝癌),由重庆中药研究所提供,复苏后接种于昆明种小鼠腹腔。
小鼠荷瘤S180、H22实体型肿瘤模型的建立:将S180、H22接种于小鼠体内,于无菌条件下抽取接种8~10d生长良好的小鼠腹水,用生理盐水稀释为1×107~2×107/mL瘤细胞悬液,活细胞计数,活细胞率大于95%。以0.2mL/只接种于昆明种异体小鼠右前肢腋窝皮下(每只小鼠注射约2×106~4×106个),建立小鼠实体型肿瘤的模型。将造模小鼠均衡体重,随机分为8组,每组10只,设立模型组(生理盐水),环磷酰胺阳性对照组(30mg/kg.d),样品A、B高剂量组(32g生药/kg.d)、样品A、B低剂量组(16g生药/kg.d)。各组小鼠均于肿瘤接种次日开始给药,灌胃给药,给药容积均为0.2ml/10g,每日1次,连续给药8d。末次给药后24h,动物称重,颈椎脱臼处死,剥离瘤体,称取瘤体湿重,计算抑瘤率。试验结果见表1、表2。
肿瘤抑瘤率计算公式为:肿瘤抑瘤率=(1-给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100%
2.试验结果:
与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。
表2刺梨果活性提取物对小鼠荷瘤H22实体型肿瘤的影响
与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。
试验结果显示,样品A、样品B高、低剂量对小鼠荷瘤S180实体型肿瘤均有明显抑制作用,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05,P<0.01),样品A高、低剂量及样品B高剂量抑瘤率>40%;样品B高剂量对小鼠荷瘤H22实体型肿瘤抑制作用明显,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05),抑瘤率>30%。此结果表明样品A、样品B具有显著的抗肿瘤作用。
试验例2:刺梨果活性提取物与环磷酰胺协同抗肿瘤活性实验
1.材料与方法:
实验瘤株及模型的建立同试验例1。将造模小鼠均衡体重,随机分为6组,每组10只,设立模型组(生理盐水),环磷酰胺低剂量组(10mg/kg.d),环磷酰胺高剂量组(20mg/kg.d),样品A低剂量组(16g生药/kg.d),样品A低剂量与环磷酰胺低剂量协同组(16g生药/kg.d+10mg/kg.d),样品A低剂量与环磷酰胺高剂量协同组(16g生药/kg.d+20mg/kg.d)。各组小鼠均于肿瘤接种次日开始给药,刺梨果活性提取物与生理盐水灌胃给药,给药容积为0.2ml/10g;环磷酰胺注射给药,给药溶剂为0.1ml/10g,每日1次,连续给药8d。末次给药后24h,动物称重,颈椎脱臼处死,剥离瘤体,称取瘤体湿重,计算抑瘤率及协同系数。试验结果见表3。
肿瘤抑瘤率计算公式为:肿瘤抑瘤率=(1-给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100%
协同系数=模型组平均瘤重×联合用药组平均瘤重/单药组a平均瘤重×单药组b平均瘤重
当抑瘤率>40%,P<0.05时为抗肿瘤有意义;当协同系数<1时为有协同性。
2.试验结果:
与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。
试验结果显示,环磷酰胺高剂量组和样品A协同环磷酰胺低剂量组对小鼠荷瘤S180实体型肿瘤有明显抑制作用,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05,P<0.01),抑瘤率>40%;样品A低剂量与环磷酰胺低剂量的协同系数为0.5225,小于1,说明样品A与环磷酰胺具有协同抗肿瘤作用。
B、α-葡萄糖苷酶抑制活性试验
1.试剂与仪器
1.1试剂和供试样品
α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)购自OSAKA BIO公司(日本);4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNP6)购自Sigma公司;阿卡波糖(Acarbose,拜糖平)购自德国拜耳公司;供试样品NCL-3(活性提取物A,编号:NCL080906-3)和NCL-4(活性提取物B,编号:NCL080906-4);
1.2仪器
Max-190型酶标仪(Molecular Devices公司,美国)、恒温培养箱(上海博泰实验设备有限公司,中国)、旋转蒸发仪(BüCHI公司,瑞士)、96孔板细胞购自Corning Costar(Cambridge MA公司,美国)。
2.试验方法
2.1实验用液的配制
磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer,PB,pH 6.9)的配制:先配制0.1mol/L的NaH2PO4和0.1mol/L的Na2HPO4溶液,两者按一定比例混合即成0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(PB,pH6.9),室温保存即可。反应终止液Na2CO3(1mol/L)溶液的配制:称取10.6g的Na2CO3,加蒸馏水至100mL溶解即得。4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液(4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside,PNP6,2.5mM)的配制:称取PNP-G固体0.015g,加入PB缓冲液20mL,再放入搅拌石,搅拌30分钟即可,注意要避光保存。α-葡萄糖苷酶溶液(0.1U/mL)的配制:取α-葡萄糖苷酶高浓度母液(50U/mL)2.0μL,经500倍稀释后配成0.1U/mL浓度的酶液。阳性药阿卡波糖的配制:取阿卡波糖(拜糖平,M=645.6)一片(50mg)碾碎后,加入5mL PB缓冲液,配成浓度为10mg/mL的阿卡波糖,取上清液用PB缓冲液依次10倍稀释至1mg/mL,0.1mg/mL,0.01mg/mL,0.001mg/mL等系列浓度。
2.2供试样品的制备
将供试样品NCL080906-3和NCL080906-4分别取出一定量,溶于纯DMSO(二甲基亚砜)中,配成浓度为100mmol/L的高浓度母液;然后在临用前以PB缓冲液稀释到所需浓度,DMSO的最终体积分数均为0.1%。
2.3α-葡萄糖苷酶活性的检测方法
本检测采用96孔板筛选体系,反应体系为:80μL磷酸钾缓冲液(pH 6.9)中加入α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,0.1U/ml)10μL,加入一定浓度的样品溶液10μL,37℃恒温10min,然后加入PNP6(2.5mmol/L)20μL,37℃恒温反应15min,再加入40μL的Na2CO3溶液(1mol/L)终止反应,于405nm波长下测定吸光度值(A值),该反应体系的总体积为160μL。
阿卡波糖(Acarbose)为本法的阳性对照,同时设定空白对照(只加缓冲液)和阴性对照(只加缓冲液和酶液),酶活性抑制率按下式计算:
3.统计处理
所有数据采用平均值±标准差表示。
4.试验结果:
根据以上结果可以看出,NCL080906-3(活性提取物A)和NCL080906-4(活性提取物B)均具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
为了确保本发明刺梨果活性提取物的质量可控,申请人进行了一系列试验,建立了本刺梨果活性提取物中有效成分总三萜类化合物的含量测定方法和黄酮化合物(+)-儿茶素的含量测定方法:
1、仪器与试药
1.1主要仪器HP8345紫外分光光度仪(美国惠普);AL104型电子天平(万分之一);旋转蒸发仪(BUCHI);超声清洗仪;恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)。
1.2试药:熊果酸对照品(批号:110742-200516)购于中国药品生物制品检定所。所用试剂均为分析纯。样品A(即活性提取物A)批号(NCL080906-3,NCL100926-3,NCL101201-3z);样品B(即活性提取物B)批号(NCL080906-4,NCL100926-4,NCL101201-4z)。
2、总三萜类化合物含量的测定方法(香草醛-冰醋酸-高氯酸显色比色法)
2.1对照品溶液制备
精密称取真空干燥至恒重的熊果酸对照品5.4mg,置25ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。
2.25%香草醛-冰醋酸用量考察
精密吸取熊果酸对照品溶液0.5mL 6份,水浴蒸干后各加5%香草醛-冰醋酸0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL,然后再各加高氯酸0.6mL,于60℃水浴中加热10min,取出置冰水中冷却,加冰醋酸5mL,摇匀后在544nm处测定吸收值,结果显示,0.5mL5%香草醛-冰醋酸为最佳用量。
2.3高氯酸用量考察
取熊果酸对照品溶液0.5mL 6份,水浴蒸干,各加5%香草醛-冰醋酸0.5mL,再分别加高氯酸0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL,于60℃水浴中加热10min,取出置冰水中冷却,加冰醋酸5mL,摇匀后在544nm处测定吸收值,结果显示,1.0mL为高氯酸最佳用量。
2.4水浴温度及时间的选择
吸取熊果酸对照品溶液0.5mL为一份,同上法分别在50℃、60℃、70℃、80℃水浴中加热5、10、15、20、25、30min后观察、测定,结果表明70℃水浴加热20min为最佳条件。
2.5含量测定的方法
(1)线性关系考察称取干燥至恒重的熊果酸对照品5.02mg定容至25ml,分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml,采用香草醛-高氯酸显色,在544nm最大吸收波长下测定吸光度,以质量浓度对吸光度作标准曲线,得线性关系方程为:Y=6.9063X-0.0605r=0.9998。
(2)样品中总三萜含量的测定方法
称取干燥样品(活性提取物A或B),用甲醇定容至50ml,取0.5ml显色测吸光度,作为供试品溶液。取0.5ml供试品溶液,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法,在544nm最大吸收波长下测定吸光度。由吸光度根据线性回归方程计算出浓度C,然后由浓度C计算出样品中总三萜的含量。选择不同批次的样品(活性提取物A与B)测定结果如下:
样品批号 | 称样量/mg | A(545nm) | 测得值/mg | 50ml含量/mg | 百分含量/% |
NCL080906-3 | 9.94 | 0.4413 | 0.0727 | 7.27 | 73.139 |
NCL080906-4 | 6.15 | 0.2598 | 0.0464 | 4.64 | 75.447 |
NCL100926-3 | 13.02 | 0.5079 | 0.0823 | 8.23 | 63.210 |
NCL100926-4 | 11.87 | 0.3093 | 0.0536 | 5.36 | 45.156 |
NCL101201-3z | 10.10 | 0.3744 | 0.0630 | 6.30 | 62.376 |
NCL101201-4z | 14.05 | 0.5704 | 0.0914 | 9.14 | 65.053 |
3、黄酮化合物(+)-儿茶素的含量测定方法
方法:照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.04mol/L枸橼酸溶液-N,N-二甲基甲酰胺-四氢呋喃(45∶8∶2)为流动相;检测波长为280nm;柱温35℃;理论板数按儿茶素峰计算不低于3000。
对照品溶液的制备取(+)-儿茶素对照品,精密称定,加甲醇-水(1∶1)混合液制成每1ml含(+)-儿茶素0.15mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备取活性提取物B粉末约20mg,精密称定,置50ml量瓶中,加甲醇-水(1∶1)混合液40ml,超声处理20分钟,并加甲醇-水(1∶1)混合液至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,即得。
选择不同批次的样品(活性提取物B)(+)-儿茶素含量测定结果如下:
样品批号 | 百分含量/% |
NCL080906-3 | 0 |
NCL080906-4 | 8.73 |
NCL100926-3 | 0.13 |
NCL100926-4 | 10.02 |
NCL101201-3z | 0.5 |
NCL101201-4z | 13.46 |
与现有技术相比,本发明所提供的制备方法不仅解决了刺梨果中有效活性成分的提取、富集和精制问题,该制备工艺还易于实现工业化生产;所提供的检测方法可有效确保活性提取物的质量;所得活性提取物的抗恶性肿瘤活性显著,且与临床抗癌药有协同作用,并具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,可用于制备治疗恶性肿瘤疾病的药物、辅助药物或作为保健食品添加剂,也可用于制备预防或治疗糖尿病的药物、保健品或作为食品添加剂(营养补充剂),具有较高的应用价值和良好的应用前景。
附图说明
图1是熊果酸对照品的线性关系标准曲线图。
具体实施方式
实施例1:刺梨果活性提取物的制备:取刺梨鲜果1kg,用80%乙醇回流提取2次,每次2小时,加醇量为原料重量的10倍,滤过,合并滤液,回收乙醇至无醇味,加水定容至相对密度1.15的浸膏,用乙酸乙酯萃取3次,乙酸乙酯与水的比例为1∶1,合并乙酸乙酯层,回收乙酸乙酯,加水超声或加热进行分散,抽滤,水洗沉淀3次,合并滤液,将滤液进行真空干燥得活性提取物B,将沉淀进行真空干燥得活性提取物A。
实施例2:刺梨果活性提取物的制备:取刺梨果1kg,用95%乙醇回流提取3小时,加醇量为原料重量的12倍,滤过,合并滤液,回收乙醇至无醇味,加水定容至相对密度1.25的浸膏,用乙酸乙酯萃取4次,乙酸乙酯与水的比例为0.5∶1,合并乙酸乙酯层,回收乙酸乙酯,加水超声或加热进行分散,抽滤,水洗沉淀4次,合并滤液,分别将滤液和沉淀进行微波真空干燥,分别得活性提取物B和活性提取物A。
实施例3:刺梨果活性提取物的制备:取刺梨鲜果1kg,用70%甲醇回流提取3次,每次1.5小时,加醇量为原料重量的6倍,滤过,合并滤液,回收甲醇至无醇味,加水定容至相对密度1.1的浸膏,用正丁醇萃取4次,正丁醇与水的比例为1∶1,合并正丁醇层,回收正丁醇,加水超声或加热进行分散,抽滤,水洗沉淀3次,合并滤液,分别将滤液和沉淀进行减压真空干燥,分别得活性提取物B和活性提取物A。
实施例4:刺梨果活性提取物的制备:取刺梨干果1kg,用50%乙醇浸渍提取3次,每次1小时,加醇量为原料重量的15倍,滤过,合并滤液,回收乙醇至无醇味,加水定容至相对密度1.15的浸膏,用乙酸乙酯萃取3次,乙酸乙酯与水的比例为2∶1,合并乙酸乙酯层,回收乙酸乙酯,加水超声或加热进行分散,抽滤,水洗沉淀5次,合并滤液,分别将滤液和沉淀进行喷雾干燥,分别得活性提取物B和活性提取物A。
实施例5:刺梨果活性提取物的制备:取刺梨干果1kg,用20%乙醇回流提取4次,每次0.5小时,加醇量为原料重量的20倍,滤过,合并滤液,回收乙醇至无醇味,加水定容至相对密度1.05的浸膏,用氯仿萃取1次,氯仿与水的比例为1.5∶1,合并氯仿层,回收氯仿,加水超声或加热进行分散,抽滤,水洗沉淀1次,合并滤液,分别将滤液和沉淀进行冷冻干燥,分别得活性提取物B和活性提取物A。
实施例6:刺梨果活性提取物A的检测:即总三萜类化合物的含量测定:
精密称取真空干燥至恒重的熊果酸对照品5.4mg,置25ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液;称取干燥的刺梨果活性提取物A样品,用甲醇定容至50ml,取0.5ml显色测吸光度,作为供试品溶液;取0.5ml供试品溶液,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法,在544nm最大吸收波长下测定吸光度;根据熊果酸对照品的线性回归方程由吸光度计算出浓度C,然后由浓度C计算出样品中总三萜类化合物的含量。
实施例7:刺梨果活性提取物B的检测:
(1)总三萜类化合物的含量测定:
精密称取真空干燥至恒重的熊果酸对照品5.4mg,置25ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液;称取干燥的刺梨果活性提取物B样品,用甲醇定容至50ml,取0.5ml显色测吸光度,作为供试品溶液;取0.5ml供试品溶液,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法,在544nm最大吸收波长下测定吸光度;根据熊果酸对照品的线性回归方程由吸光度计算出浓度C,然后由浓度C计算出样品中总三萜类化合物的含量。
(2)黄酮化合物(+)-儿茶素的含量测定:
照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.04mol/L枸橼酸溶液-N,N-二甲基甲酰胺-四氢呋喃(45∶8∶2)为流动相;检测波长为280nm;柱温35℃;理论板数按儿茶素峰计算不低于3000;
对照品溶液的制备取(+)-儿茶素对照品,精密称定,加甲醇-水(1∶1)混合液制成每1ml含(+)-儿茶素0.15mg的溶液,即得;
供试品溶液的制备取提取物B粉末20mg,精密称定,置50ml量瓶中,加甲醇-水(1∶1)混合液40ml,超声处理20分钟,并加甲醇-水(1∶1)混合液至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,即得;
刺梨果活性提取物B中(+)-儿茶素含量不少于5%。
实施例8:刺梨果活性提取物的应用:将所制得的刺梨果活性提取物A或B过80目筛,加入适量糊精、乳糖,按等量倍增法混合均匀,加入HPMC溶液制软材,制粒,干燥,整粒,分装于胶囊壳中,得胶囊剂。该制剂口服,一日2~3次,每次服药量以活性提取物计为300-800毫克。可作为恶性肿瘤疾病的治疗药物或辅助药物,也可用于预防或治疗糖尿病;还可作为保健食品、食品营养补充剂用于改善和提高癌症病人或糖尿病人的生活质量。
实施例9:刺梨果活性提取物的应用:将所制得的刺梨果活性提取物A或B过筛,加入适量糊精、硬脂酸镁混匀,制粒,压片,即得片剂。该制剂口服,一日2~3次,每次服药量以活性提取物计为300-800毫克。可作为恶性肿瘤疾病的治疗药物或辅助药物,也可用于预防或治疗糖尿病;还可作为保健食品、食品营养补充剂用于改善和提高癌症病人或糖尿病人的生活质量。
实施例10:刺梨果活性提取物的应用:将所制得的刺梨果活性提取物A或B过筛,加入适量甘露醇及阿司帕坦,混匀,制成颗粒,干燥,即得颗粒剂。该制剂口服,一日2~3次,每次服药量以活性提取物计为300-800毫克。可作为恶性肿瘤疾病的治疗药物或辅助药物,也可用于预防或治疗糖尿病;还可作为保健食品、食品营养补充剂用于改善和提高癌症病人或糖尿病人的生活质量。
实施例11:刺梨果活性提取物的应用:取所制得的刺梨果活性提取物A或B,加入适量含0.1~30%蜂蜡的植物油,混合均匀,以明胶∶甘油∶蒸馏水∶防腐剂=0.8~1.1∶0.2~0.6∶0.6~1.1∶0.001~0.005制备囊材,压制,得软胶囊剂。该制剂口服,一日2~3次,每次服药量以活性提取物计为300-800毫克。可作为恶性肿瘤疾病的治疗药物或辅助药物,也可用于预防或治疗糖尿病;还可作为保健食品、食品营养补充剂用于改善和提高癌症病人或糖尿病人的生活质量。
实施例12:刺梨果活性提取物的应用:取所制得的刺梨果活性提取物A或B,加入熔融的聚乙二醇中,混匀,在保温条件下于植物油中滴制成丸,得滴丸剂。该制剂口服,一日2~3次,每次服药量以活性提取物计为300-800毫克。可作为恶性肿瘤疾病的治疗药物或辅助药物,也可用于预防或治疗糖尿病;还可作为保健食品、食品营养补充剂用于改善和提高癌症病人或糖尿病人的生活质量。
Claims (15)
1. 刺梨果活性提取物的制备方法,其特征在于:取刺梨干果或鲜果,用6~20倍重量的20~95%乙醇或甲醇水溶液回流或浸渍提取1~4次,每次0.5~3小时,滤过,合并滤液,回收乙醇或甲醇至无醇味,加水定容至相对密度1.05~1.25的浸膏,用有机溶剂正丁醇、乙酸乙酯或氯仿萃取1~4次,有机溶剂与水的比例为0.5~2:1,合并有机溶剂层,回收有机溶剂,加水超声或加热进行分散,抽滤,水洗沉淀1~5次,合并滤液,将滤液浓缩干燥得活性提取物B,将沉淀进行干燥得活性提取物A。
2. 根据权利要求1所述刺梨果活性提取物的制备方法,其特征在于:所述干燥采用微波真空干燥、减压真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
3. 如权利要求1-2中任一项所述制备方法制备得到的刺梨果活性提取物A,其中总三萜含量大于50%。
4. 如权利要求1-2中任一项所述制备方法制备得到的刺梨果活性提取物B,其中总三萜含量大于45%,(+)-儿茶素含量不少于5%。
5. 如权利要求3所述刺梨果活性提取物A的检测方法,其特征在于:所述检测方法为刺梨果活性提取物A中总三萜类化合物的含量测定方法,该方法是以熊果酸对照品为对照,采用香草醛—冰醋酸—高氯酸显色比色法测定,5%香草醛-冰醋酸与高氯酸的体积用量比为1∶2。
6. 如权利要求4所述刺梨果活性提取物B的检测方法,其特征在于:所述检测方法包括刺梨果活性提取物B中总三萜类化合物的含量测定方法和黄酮类化合物(+)-儿茶素的含量测定方法;总三萜类化合物的含量测定方法是以熊果酸对照品为对照,采用香草醛—冰醋酸—高氯酸显色比色法测定,5%香草醛-冰醋酸与高氯酸的体积用量比为1∶2;(+)-儿茶素的含量测定方法是以(+)-儿茶素对照品为对照,以0.04mol/L枸橼酸溶液∶N,N-二甲基甲酰胺∶四氢呋喃=45∶8∶2为流动相的高效液相色谱法。
7. 根据权利要求5所述刺梨果活性提取物A的检测方法,其特征在于:具体的总三萜类化合物的含量测定方法为:精密称取真空干燥至恒重的熊果酸对照品5.4mg,置25ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液;称取干燥的刺梨果活性提取物A样品,用甲醇定容至50ml,取0.5ml显色测吸光度,作为供试品溶液;取0.5ml供试品溶液,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法,加5%香草醛-冰醋酸0.5mL,加高氯酸1.0mL,在544nm最大吸收波长下测定吸光度;根据熊果酸对照品的线性回归方程由吸光度计算出浓度C,然后由浓度C计算出样品中总三萜类化合物的含量。
8. 根据权利要求6所述刺梨果活性提取物B的检测方法,其特征在于:具体的总三萜类化合物的含量测定方法为:精密称取真空干燥至恒重的熊果酸对照品5.4mg,置25ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液;称取干燥的刺梨果活性提取物B样品,用甲醇定容至50ml,取0.5ml显色测吸光度,作为供试品溶液;取0.5ml供试品溶液,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法,加5%香草醛-冰醋酸0.5mL,加高氯酸1.0mL,在544nm最大吸收波长下测定吸光度;根据熊果酸对照品的线性回归方程由吸光度计算出浓度C,然后由浓度C计算出样品中总三萜类化合物的含量。
9. 根据权利要求6所述刺梨果活性提取物B的检测方法,其特征在于:具体的黄酮类化合物(+)-儿茶素的含量测定方法为:照《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ D高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.04mol/L枸橼酸溶液∶N,N-二甲基甲酰胺∶四氢呋喃=45∶8∶2为流动相;检测波长为280nm;柱温35℃;理论板数按儿茶素峰计算不低于3000;
对照品溶液的制备 取(+)-儿茶素对照品,精密称定,加甲醇∶水=1∶1混合液制成每1ml含(+)-儿茶素0.15mg的溶液,即得;
供试品溶液的制备 取提取物B粉末20mg,精密称定,置50ml量瓶中,加甲醇∶水=1∶1混合液40ml,超声处理20分钟,并加甲醇∶水=1∶1混合液至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,即得;
刺梨果活性提取物B中(+)-儿茶素含量不少于5%。
10. 如权利要求3所述刺梨果活性提取物A在制备治疗恶性肿瘤疾病的药物、辅助药物或者保健食品添加剂中的应用。
11. 如权利要求4所述刺梨果活性提取物B在制备治疗恶性肿瘤疾病的药物、辅助药物或者保健食品添加剂中的应用。
12. 如权利要求3所述刺梨果活性提取物A作为α-葡萄糖苷酶--抑制剂在制备预防或治疗糖尿病的药物、保健品或者食品添加剂中的应用。
13. 如权利要求4所述刺梨果活性提取物B作为α-葡萄糖苷酶--抑制剂在制备预防或治疗糖尿病的药物、保健品或者食品添加剂中的应用。
14. 根据权利要求10或12所述刺梨果活性提取物A的应用,其特征在于:所述的药物剂型为硬胶囊、片剂、口服液、颗粒剂、软胶囊或滴丸剂。
15. 根据权利要求11或13所述刺梨果活性提取物B的应用,其特征在于:所述的药物剂型为硬胶囊、片剂、口服液、颗粒剂、软胶囊或滴丸剂。
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