CN101513398A - 白果酚在抗肿瘤中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及白果酚在抗肿瘤中的应用。所述白果酚是用包括如下步骤的方法制备的：从银杏(叶、果及外种皮)中制备得到银杏酸，将银杏酸加热处理脱羧，经纯化制得白果酚。本发明所制备的白果酚可有效地抑制人肿瘤细胞增殖，其对人肿瘤细胞的抑制作用均优于银杏酸。

Description

白果酚在抗肿瘤中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及白果酚在抗肿瘤中的应用。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)是我国特有的古老树种，银杏的叶、果均可入药，据“本草”记载，银杏作为药用已有六百多年的历史，二十世纪六十年代以来，银杏黄酮、内酯两大成分独特的药理作用和临床效果得到肯定，使银杏产首先在欧洲被广泛接受，目前以银杏黄酮、内酯为药效成分的银杏叶提取物(Extract of Ginkgo biloba，EGb)是公认的预防、治疗心脑血管疾病的天然植物药。

银杏酚酸是存在于银杏中的另一大类活性成分，银杏中的烷基酚酸类物质包括白果酚(ginkgols)、银杏酸(ginkgolic acids)和白果二酚(bilobols)，三者的结构式如下：

其中银杏酸的含量约占银杏叶干重的1％，外种皮干重的5％。由于银杏酸可疑的致敏作用，长期以来被认为是EGb中的有毒成分，要求其在EGb761中的含量必须在5ppm以下；而白果酚没有银杏酸所具有的致敏作用，因此在银杏叶提取物中对其没有限量要求。

随着人们对银杏叶及其提取物中的酚酸类物质的研究逐渐深入，发现银杏酸除了可疑的致敏作用外还具有许多生物活性：已有的研究表明银杏酸对多种G⁺菌有良好的抑制作用，能抑制部分人致病真菌及农业病源菌的生长。银杏酸对多种肺癌细胞株、淋巴瘤细胞株的生长有很好的抑制作用，而对正常细胞的毒性作用较小；作者研究了银杏酸对淋巴瘤U₉₃₇细胞的影响，发现银杏酸能诱导U₉₃₇细胞凋亡，说明银杏酸的抗肿瘤作用与诱导肿瘤凋亡有关。银杏酸还具有良好的杀灭钉螺作用，是银杏外种皮中的主要灭螺活性成分，相关工作作者已申请了相关专利(一种植物杀钉螺剂及其制备方法与使用方法)，并获得授权(专利号ZL200510122657.6)。

有关银杏酸的提取、制备、分析及活性已有多篇文献报导：

1.仰榴青，吴向阳，陈钧.高效液相色谱法测定银杏外种皮中的银杏酸.分析化学，2002，30(8)：901-905.

2.Van Beek T.A.Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts.J.ChromatographyA，2002，967：21-55.

3.H.Jaggy，E.Koch.Chemistry and Biology of Alkyphenols from Ginkgo biloba L..Pharmazie，1997，52：735-738.

4.杨小明，朱伟，陈钧，等.银杏酸单体的抗菌活性研究.中药材，2004，27(9)：661-663.

5.杨小明；钱之玉；陈钧.银杏外种皮中银杏酸的体外抗肿瘤活性研究.中药材，2004，27(1)：40-42.

6.吴向阳，仰榴青，陈钧.银杏酸单体的制备及抗菌作用研究.林产化学与工业，2003，

发明人在进一步的研究中发现：银杏酸结构中的羧基对热具有不稳定性，在加热的过程中容易脱羧而转化成白果酚；作者通过生物活性测定，发现白果酚的抗肿瘤活性比银杏酸更强，因此白果酚可以作为一种比银杏酸具有更强抗肿瘤效果、而无致敏作用的活性物质进行开发研究，有关白果酚抗肿瘤药物的研究对研发新型肿瘤治疗药物、对银杏资源的充分开发利用，将产生巨大的社会和经济效益。

由于白果酚在银杏叶、果及外种皮中的含量显著低于银杏酸，因此，除了直接从银杏中制备白果酚外，利用银杏酸容易脱羧的特点，通过银杏酸脱羧制备白果酚不失为一种更经济的白果酚制备方法。

有关利用银杏酸脱羧制备白果酚的方法，及白果酚的抗肿瘤活性目前均尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的化合物——白果酚的制备方法及其抗肿瘤的用途。

本发明所涉及的白果酚为烷基或烯基苯酚类化合物，具有通式(I)的结构。其中，R链为烷基或烯基，是抗肿瘤的主要活性成分，主要存在于银杏(Ginkgo biloba L.)的叶、果和外种皮中，或漆树科漆树属植物的叶、果及树皮中。其R基上的碳原子数为10～19，双键数0～3。其R基上碳原子可被其它原子，如O、S、N或卤素原子取代。

本发明所述白果酚可以采用以下方式制备：

以银杏酸为原料，采用加热方法脱除银杏酸苯环上的羧基，转化成白果酚，具体如下：

1、将银杏酸与碱金属、碱土金属或过渡金属氢氧化物按100∶1～10∶1的比例(g/g)混合后，在80℃～100℃加热、搅拌条件下进行1～4小时，脱去羧基得到白果酚粗品；

2、在白果酚粗品中加入2～10倍量(g/ml)的有机溶剂溶解，过滤，浓缩得到粗产物；

3、将粗产物用硅胶柱层析纯化，得到纯度不小于96％的白果酚同系物。

上述制备方法中，碱金属氢氧化物为氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾；

上述制备方法中，碱土金属氢氧化物为氢氧化铍、氢氧化镁或氢氧化钡；

上述制备方法中，过渡金属氢氧化物为氢氧化铜、氢氧化铁或氢氧化锌，但不限于这三种过渡元素氢氧化物；

上述制备方法中，有机溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯或氯仿；

上述制备方法中，所述硅胶柱层析纯化为梯度洗脱，洗脱液为氯仿和氯仿-甲醇混合溶液，氯仿-甲醇混合溶液比例从9∶1(v/v)逐渐变为5∶5(v/v)，但不限于这一洗脱剂组合体系。

所述的银杏酸通过化学分离方法，从银杏的叶、果、外种皮的提取物中得到；或对银杏叶提取物在提取加工过程中剩余的肥料中重新回收；或从其它植物含有本类化合物的各部分提取物中获得。

包含本发明化合物的药物可以是来源于银杏的叶、果和外种皮的提取物，也可以是来源于其它植物含有本类化合物的各部分提取物。

本发明要求保护该化合物及其药学上可接受的盐，酯，溶剂化物，结晶形态的物质。

包含本发明化合物的药物可以单独作为抗肿瘤剂使用，也可与其它抗肿瘤剂联合使用，以降低抗肿瘤效果或降低其毒副作用。

包含本发明化合物的药物组合物含有药物可以接受的载体；所述的组合物可以是注射液或口服药物制剂。

从植物中寻找抗肿瘤药物，在国内外均为抗癌药物研究的重点，有效地抗肿瘤化合物具有重要的临床价值和开发前景。我国有着丰富的银杏资源，每年随着白果的生产，大量的银杏外种皮被作为废弃物浪费掉，利用银杏外种皮中含量丰富的银杏酸为原料，制备具有显著抗肿瘤活性的白果酚化合物，对于新型抗肿瘤药物的开发，对于银杏资源的充分利用都具有重要意义。

具体实施方法

实施例1：白果酚同系物的制备

(1)银杏酸的提取：

将100g干燥、粉碎的银杏外种皮，按1∶5的比例加入石油醚(沸程60～90℃)超声萃取1h，过滤，滤渣重复提取两次，合并提取，挥去石油醚得外种皮提取浸膏。

将浸膏分次用少量石油醚溶解加样于硅胶柱上(硅胶120g，硅胶柱为32×400mm的玻璃柱，湿法装柱)，用石油醚∶乙醚∶甲酸＝89∶11∶1(V/V/V)洗脱，以薄层层析在254nm处出现荧光为检测，收集银杏酸组分，浓缩至干；重复过柱一次，得到的银杏酸组分水洗至中性，浓缩至干，或用无水NaSO₄干燥后，得银杏酸混合物。

(2)白果酚的制备：

取1.0g银杏酸和0.02g NaOH混于一个50ml的单颈烧瓶中，浸入100℃的水浴，磁力搅拌1小时，混合物冷却至室温，得到0.9g的白果酚，然后用3.0mL乙醇萃取。过滤，浓缩得到一黑褐色油状物。

该产物以乙醇溶解后，上样于硅胶柱(硅胶120g，硅胶柱为32×400mm的玻璃柱，湿法装柱)，分别采用氯仿、氯仿-甲醇混合溶液(比例从9∶1逐渐变为5∶5，V/V)洗脱，以薄层层析在254nm处出现荧光为检测，收集白果酚组分，浓缩至干；重复过柱一次，得到的白果酚同系混合物。

(3)白果酚的鉴定

制备得到的白果酚同系物为浅棕色液体，其甲醇溶液紫外吸收峰分别为201，275nm；红外光谱(KBr压片)上3340cm^-1处有宽的ν_O-H振动，1260cm^-1处ν_C-O和1370cm^-1处的δ_O-H(面内)均可证实为烷基取代苯酚。

LC-ESI-MS(Thermo electron Croporation)分析：安捷伦TC18柱(150×4.6mm，5μm)，流动相甲醇-3％HAc溶液(90∶10，v/v)，测得白果酚5个同系物的质量分别为276，304，302，330，328，分别对应于银杏酸C13:0，C15:0，C15:1，C17:1和C17:2。

实施例2：白果酚同系物的制备

(4)银杏酸的提取：

将100g干燥、粉碎的银杏外种皮，按1∶5的比例加入石油醚(沸程60～90℃)超声萃取1h，过滤，滤渣重复提取两次，合并提取，挥去石油醚得外种皮提取浸膏。

将浸膏分次用少量石油醚溶解加样于硅胶柱上(硅胶120g，硅胶柱为32×400mm的玻璃柱，湿法装柱)，用石油醚∶乙醚∶甲酸＝89∶11∶1(V/V/V)洗脱，以薄层层析在254nm处出现荧光为检测，收集银杏酸组分，浓缩至干；重复过柱一次，得到的银杏酸组分水洗至中性，浓缩至干，或用无水NaSO₄干燥后，得银杏酸混合物。

(5)白果酚的制备：

取1.0g银杏酸和0.01g Mg(OH)₂混于一个50ml的单颈烧瓶中，浸入90℃的水浴，磁力搅拌1小时，混合物冷却至室温，得到0.9g的白果酚，然后用8.5mL乙酸乙酯萃取。过滤，浓缩得到一黑褐色油状物。

该产物以乙醇溶解后，上样于硅胶柱(硅胶120g，硅胶柱为32×400mm的玻璃柱，湿法装柱)，分别采用氯仿、氯仿-甲醇混合溶液(比例从9∶1逐渐变为5∶5，V/V)洗脱，以薄层层析在254nm处出现荧光为检测，收集白果酚组分，浓缩至干；重复过柱一次，得到的白果酚同系混合物。

(6)白果酚的鉴定

制备得到的白果酚同系物为浅棕色液体，其甲醇溶液紫外吸收峰分别为201，275nm；红外光谱(KBr压片)上3340cm^-1处有宽的ν_O-H振动，1260cm^-1处ν_C-O和1370cm^-1处的δ_O-H(面内)均可证实为烷基取代苯酚。

LC-ESI-MS(Thermo electron Croporation)分析：安捷伦TC18柱(150×4.6mm，5μm)，流动相甲醇-3％HAc溶液(90∶10，v/v)，测得白果酚5个同系物的质量分别为276，304，302，330，328，分别对应于银杏酸C13:0，C15:0，C15:1，C17:1和C17:2。

实施例3：白果酚同系物的制备及抗肿瘤活性

(1)银杏酸的提取：

将100g干燥、粉碎的银杏外种皮，按1∶5的比例加入石油醚(沸程60～90℃)超声萃取1h，过滤，滤渣重复提取两次，合并提取，挥去石油醚得外种皮提取浸膏。

将浸膏分次用少量石油醚溶解加样于硅胶柱上(硅胶120g，硅胶柱为32×400mm的玻璃柱，湿法装柱)，用石油醚∶乙醚∶甲酸＝89∶11∶1(V/V/V)洗脱，以薄层层析在254nm处出现荧光为检测，收集银杏酸组分，浓缩至干；重复过柱一次，得到的银杏酸组分水洗至中性，浓缩至干，或用无水NaSO₄干燥后，得银杏酸混合物。

(2)白果酚的制备：

取1.0g银杏酸和0.08g Cu(OH)₂混于一个50ml的单颈烧瓶中，浸入80℃的水浴，磁力搅拌4小时，混合物冷却至室温，然后用5.0mL丙酮萃取。过滤，浓缩得到一黑褐色油状物。

该产物以氯仿溶解后，上样于硅胶柱(硅胶120g，硅胶柱为32×400mm的玻璃柱，湿法装柱)，分别采用氯仿、氯仿-甲醇混合溶液(比例从9∶1逐渐变为5∶5，V/V)洗脱，以薄层层析在254nm处出现荧光为检测，收集白果酚组分，浓缩至干；重复过柱一次，得到的白果酚同系混合物。

(3)白果酚的鉴定

制备得到的白果酚同系物为浅棕色液体，其甲醇溶液紫外吸收峰分别为201，275nm；红外光谱(KBr压片)上3340cm^-1处有宽的ν_O-H振动，1260cm^-1处ν_C-O和1370cm^-1处的δ_O-H(面内)均可证实为烷基取代苯酚。

LC-ESI-MS(Thermo electron Croporation)分析：安捷伦TC18柱(150×4.6mm，5μm)，流动相甲醇-3％HAc溶液(90∶10，v/v)，测得白果酚5个同系物的质量分别为276，304，302，330，328，分别对应于银杏酸C13:0，C15:0，C15:1，C17:1和C17:2。

(4)白果酚同系物的抗肿瘤活性

采用MTT法，白果酚以DMSO溶解，再用DMEM培养液稀释成需要浓度；将对数生长的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液制成5×10⁴个/mL细胞悬液，接种至96孔培养板中，每孔200μL于37℃，5％CO₂的培养箱内培养24h后，将不同浓度的药液加入上述培养孔内，设5个平行孔，以含10％胎牛血清的DMEM培养液为阴性对照，顺铂为阳性对照，继续培养48h，中止前4h加入5mg/ml MTT溶液20μL，培养4h后吸出培养液，加入DMSO 200μL，震荡均匀，在490nm处测定光密度(OD值)，按公式计算肿瘤细胞生长抑制率。抑制率(％)＝1-(OD_实验-OD_空白)/(OD_对照-OD_空白)×100％。实验设三次重复。

试验了白果酚对人肝癌细胞株SMMC7721、人白血病细胞株K562和人胶质瘤细胞株U251的细胞毒性，结果见表1。

表1、银杏酸、白果酚对人肿瘤细胞的抑制作用LD₅₀(mg/L)

Claims (5)

1、白果酚在抗肿瘤中的应用。

2、白果酚在制备抗肿瘤药物中的应用。

3、白果酚药学上可接受的盐，酯，溶剂化物，结晶形态的物质。

4、包含白果酚的药物单独作为抗肿瘤剂使用，或与其它抗肿瘤剂联合使用。

5、包含白果酚的药物组合物含有药物接受的载体；所述的组合物是注射液或口服药物制剂。