CN106588614B - 一种二苯基甲烷类化合物的制备方法及其应用 - Google Patents

一种二苯基甲烷类化合物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发属于医药技术领域，涉及二苯基甲烷类化合物的制备方法，具体涉及从狼毒大戟中提取二个二苯基甲烷化合物，月腺大戟素A和3,3'‑二乙酰基‑2,4'‑二甲氧基‑2',4,6,6'‑四羟基‑二苯基甲烷，提取工艺为对狼毒大戟药材粉末采用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行萃取。接着通过硅胶柱层析法对上述部位进行分离，制备方法简单快捷，重现性好，提取纯度高，获得的化合物中，二苯基甲烷类化合物具有较好的抗乳腺癌细胞活性作用，而2,4‑二羟基‑6‑甲氧基‑3‑甲基‑1‑苯乙酮无明显的抗乳腺癌细胞活性作用。由此可见，具有二苯基甲烷母核的化合物能明显抑制乳腺癌细胞活性，该类型化合物具有一定构效关系。

Description

一种二苯基甲烷类化合物的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体是从天然产物中筛选出抗乳腺癌细胞活性成分。
背景技术
乳腺癌为女性最常见的恶性肿瘤之一，其较高的发病率和逐渐上升的死亡率一直为全球关注的疾病。据2011年全球癌症统计报告显示，2008年全球乳腺癌新发病人数达到138.4万，占恶性肿瘤新发病总数的23.0％，而致死人数则高达45.9万，一些较发达的国家世界人口年龄标准化发病率为66.4/10万，而发展中国家则为27.3/10万。国内女性乳腺癌发病率占据女性癌症发病率的第1位，死亡率占据女性癌症死亡率的第6位。由于目前乳腺癌发病率以平均每年0.5％的趋势增长，估计到2030年，全球乳腺癌的发病人数和死亡人数将分别达到264万和170万。同时，调查也显示乳腺癌的发病年龄趋于年轻化，国内女性乳腺癌患者发病的中位年龄是48岁，比西方国家提早了10年(马纯华，颜君，孙邓南等.乳腺癌患者社会支持的研究现状.现代临床护理.2013，12(10)61-64)。目前治疗乳腺癌的药物可分类为天然活性成分，化学类药物以及常用的联合用药。化学类药物以环磷酰胺，卡培他滨，5-氟尿嘧啶等为主，天然的活性成分主要包括紫杉醇，姜黄素，长春新碱，芹黄素，三氧化二砷等(韩伟，阎雪莹，丁文财，等.抗乳腺癌药物的研究现状.黑龙江医药.2014，27(5)：1027-1029)，其中化学类药物所致不良反应的发生率之高，不容忽视，最主要表现为骨髓抑制，胃肠道的反应，同时还降低患者免疫力，引起恶心和呕吐等。天然活性成分紫杉醇从红豆杉中提取而来，虽对乳腺癌等恶性肿瘤有显著疗效，但红豆杉作为国家一级珍惜濒危保护植物，资源有限。因此开发毒副作用小，资源丰富的化合物越来越受到青睐。
我国传统中药狼毒为大戟科植物狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.或月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata的干燥根，狼毒大戟主产于辽宁，吉林，黑龙江，河北等地。狼毒始载于《神农本草经》，其味辛，性平，有毒，归肝、脾经，有逐水祛痰，散结杀虫之功效，主治水肿腹胀，痰、食、虫积、心腹疼痛、咳喘、瘰疬、痰核、疥癣、灭蝇蛆。民间将狼毒广泛用于抗肿瘤，抗结核及皮肤病的治疗，既往研究或临床实践表明狼毒提取物对肝癌及肺癌的作用效果显著(柯华红，王华倩，等.月腺大戟与狼毒大戟对人肝癌细胞BEL-7402体外增值的影响对比研究.中国药房.2012,23(15):1359-1361；姜红.狼毒大戟 对小鼠Lewis肺癌增值及转移的影响.实用医药杂志.2013,30(9):808-810)，但对乳腺癌的研究鲜有报道。目前对肝癌治疗的主要包括，针对表皮生长因子受体传导通路的靶向治疗，例如吉非替尼，厄罗替尼和西妥昔单抗，针对血管内皮生长因子的靶向治疗，包括贝伐单抗，沙利度胺等，以及多靶点治疗药物索拉非尼，该药物可同时起到抗血管生成和抗肿瘤细胞增殖的双重作用(陈敏山，张耀军，等.肝癌分子靶向药物治疗的研究进展.中华消化外科杂志.2009,8(2):96-97)。对肺癌治疗的主要包括多靶点药物索拉非尼，舒尼替尼，培美曲塞等(刘旭春，蒋国华.非小细胞肺癌多靶点药物治疗研究进展.Journal of Oncology.2010,16(12):918-921)。而传统治疗乳腺癌的药物主要有环磷酰胺，5-氟尿嘧啶，紫杉醇等，和以人类表皮生长因子受体2为靶点的新型乳腺癌治疗药物赫赛汀，拉帕替尼，帕妥珠单克隆抗体等(唐静，祖旭宇.乳腺癌靶向治疗药物的研究进展.中国药房.2011,22(41):3909-3911)。由此可见，作用于肝癌，肺癌与乳腺癌的的药物，虽抗肿瘤作用机制相似，但代表药物各不相同。目前从狼毒大戟中分离提取得到的化学成分种类较多，主要有二萜，三萜，香豆素，苯乙酮类化合物等(马良，王欢，王金兰，等.狼毒大戟地上部分化学成分研究.齐齐哈尔大学学报.2012,28(6):27-29)，其二萜类化合物虽为主要的活性成分，但化合物本身具有毒性限制了其发展(Yuping Tang,Wei Jiang,Qicheng Wu,et al.Comparative characteristicof the inflammatory diterpenes in the roots of Euphorbia fischeriana withdifferent preparation method using HPLC-ELSD.Fitoterapia.2012,(83):427-433)。本发明采用现代生物活性筛选模型，从狼毒大戟中首次提取分离得到的二苯基甲烷类化合物，来源丰富，毒副作用低，抗乳腺癌活性好，为进而开发成为对乳腺癌有较好治疗效果的新型药物，具有重要的意义。
化合物1，3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷目前确定为新化合物，因此无最新研究进展。
化合物2月腺大戟素A，3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-5'-甲基二苯基甲烷，经查阅文献，尚未发现药理活性方面研究报道。
发明内容
本发明的目的是对狼毒大戟进行系统性分离提取，并完成了不同提取物的体外抗乳腺癌细胞实验，筛选出狼毒大戟中抗乳腺癌细胞的有效单体成分，而单体成分诱导凋亡的机制还有待进一步的研究。
本发明的第一方面提供了从狼毒大戟中提取二苯基甲烷类化合物的方法，按照下述步骤进行：
30kg干燥狼毒大戟药材，粉碎后浸泡在80％乙醇回流提取2次，每次2小时，溶剂用量分别为180L和150L。合并提取液，趁热过滤，合并浓缩至无乙醇残留，浓缩体积至8L。取2L浓缩液加1L水稀释，依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次萃取溶剂均为3L，减压回收溶剂，最终得乙酸乙酯部分160g，乙酸乙酯部分过正相硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10：1，5:1，1:1洗脱，得Fr.1-Fr.7(Fr.1-Fr.7分别为不同洗脱梯度石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10：1，5:1，1:1洗脱得到的溶液)；
其中12gFr.2过正相柱，依次以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1洗脱，20:1洗脱部分再经过正相硅胶柱，用石油醚：二氯甲烷10:1洗脱，再经乙酸乙酯多次结晶得到3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷。
18gFr.3过正相柱，石油醚：乙酸乙酯：甲酸25:1:0.1，20:1:0.1，15:1:0.1，10:1:0.1,5:1:0.1,1:1:0.1梯度洗脱，其中石油醚：乙酸乙酯：甲酸15:1:0.1洗脱得月腺大戟素A。
本发明的第二方面提供了一种二苯基甲烷类化合物，该化合物为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷，其化学结构式如Ⅰ所示：
本发明的第三方面在于提供了上述二苯基甲烷类化合物的制备方法，按照下述步骤进行：
30kg干燥狼毒大戟药材，粉碎后浸泡在80％乙醇回流提取2次，每次2小时，溶剂用量分别为180L和150L。合并提取液，趁热过滤，合并浓缩至无乙醇残留，浓缩体积至8L。取2L浓缩液加1L水稀释，依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次萃取溶剂均为3L，减压回收溶剂，最终得乙酸乙酯部分160g，乙酸乙酯部分过正相硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10：1，5:1，1:1洗脱，得Fr.1-Fr.7(Fr.1-Fr.7分别为不同洗脱梯度石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10：1，5:1，1:1洗脱得到的溶液)；
其中12gFr.2过正相柱，依次以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1洗脱，20:1洗脱部分再经过正相硅胶柱，用石油醚：二氯甲烷10:1洗脱，再经乙酸乙酯多次结晶得到3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷。
本发明的第四方面在于提供了上述二苯基甲烷类化合物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
优选的，所述的乳腺癌细胞株为三阴性乳腺癌MDA-MB-231，Sum149，LuminalA型MCF-7，LuminalB型ZR-75-1，Her 2阳性型SKBr3，BT474。
本发明的益效是：
1.本发明通过醇提，各极性溶剂萃取，正相柱层析，重结晶等，从狼毒大戟中首次获得两个二苯基甲烷类化合物，制备过程均为常规单体提取分离方法，具有操作简单，重现性好，化合物得率高等优点。
2.本发明得到的两个二苯基甲烷类化合物与现有的临床药物相比较，不仅有明显的抗乳腺癌活性，单体易溶解，无毒性的优点，而且来自传统中药狼毒大戟，资源丰富，具有较好的实际操作意义。
3.本发明得到的两个二苯基甲烷类化合物，抗乳腺癌细胞活性明显优于另外一个苯乙酮类化合物，差异表现为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-5'-甲基二苯基甲烷〉3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷，而3,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2',6,6'-四羟基-二苯基甲烷和2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基-1-苯乙酮并无明显抗乳腺癌细胞活性。从构效关系上分析，二苯基甲烷结构为抑制乳腺癌细胞活性的关键，当二苯环上有甲基取代，其抗乳腺癌细胞活性的能力明显增强。当然，二苯基甲烷类化合物中两个苯环上取代基呈对称结构时，化合物无明显抗乳腺癌细胞活性；单环苯基母核，甲基取代也未显示出抗乳腺癌细胞活性的作用。
获得的化合物中，二苯基甲烷类化合物具有较好的抗乳腺癌细胞活性作用，且苯环上有甲基取代的月腺大戟素A抗乳腺癌细胞活性明显优于3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷。3,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2',6,6'-四羟基-二苯基甲烷虽具有二苯基甲烷母核结构，但却无抗肿瘤活性，发明人推测因其二苯基甲烷上取代基的对称结构，所以该化合物无抗乳腺癌活性，而2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基-1-苯乙酮无明显的抗乳腺癌细胞活性作用。由此可见，具有二苯基甲烷母核，且苯基取代无对称性的化合物能明显抑制乳腺癌细胞活性，该类型化合物具有一定构效关系。
附图说明：
图1为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-5'-甲基二苯基甲烷的1H-NMR；
图2为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-5'-甲基二苯基甲烷的13C-NMR；
图3为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷的1H-NMR；
图4为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷的13C-NMR；
图5为3,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2',6,6'-四羟基-二苯基甲烷的1H-NMR；
图6为3,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2',6,6'-四羟基-二苯基甲烷的13C-NMR；
图7为2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基-1-苯乙酮的1H-NMR；
图8为2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基-1-苯乙酮的13C-NMR。
具体实施方式
现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
实施例1：从狼毒大戟中制备单体化合物的方法
30kg干燥狼毒大戟药材，粉碎后浸泡在80％(乙醇：水80:20)乙醇回流提取2次，每次2小时，溶剂用量分别为180L和150L。合并提取液，趁热过滤，合并浓缩至无乙醇残留，浓缩体积至8L。取2L浓缩液加1L水稀释，依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次萃取溶剂均为3L，减压回收溶剂，得石油醚部分60g，乙酸乙酯部分160g，正丁醇部位20g。
乙酸乙酯部分过正相硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10：1，5:1，1:1洗脱，得Fr.1-Fr.7。
取12gFr.2过正相柱，依次以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1洗脱，20：1洗脱部分再经过正相硅胶柱，用石油醚：二氯甲烷10:1洗脱，再经乙酸乙酯多次结晶得15mg单体化合物，通过MS，NMR等测定其结构为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷(化合物1)。3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-5'-甲基二苯基甲烷的1H-NMR和13C-NMR见图1和2，EI/MS m/z 376[M]+,NMR值见表1，化学结构式如下式I所示：
取18gFr.3过正相柱，石油醚：乙酸乙酯：甲酸25:1:0.1，20:1:0.1，15:1:0.1，10:1:0.1,5:1:0.1,1:1:0.1梯度洗脱，其中15:1:0.1洗脱得17mg单一化合物，通过MS，NMR等测定其结构3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-5'-甲基二苯基甲烷(月腺大戟素A，化合物2)。3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷的1H-NMR和 13C-NMR见图3和4，EI/MS m/z 390[M]+，NMR值见表1，化学结构式如下式II所示：
表1化合物1和2的NMR信号归属
对比例
1.月腺大戟药材30kg粉碎后，用80％乙醇于65℃下热提2次，每次2小时，第一次溶剂用量为200L，第二次为150L。提取液分别趁热过滤，合并浓缩至无醇残留，浓缩至体积为7L。取浓缩液2L，用乙酸乙酯萃取三次，每次萃取溶剂体积为2L。合并乙酸乙酯萃取层，浓缩干燥得乙酸乙酯萃取物135g。
乙酸乙酯部位125g用1kg硅胶拌样，上正相硅胶柱层析，依次以石油醚-乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1进行梯度洗脱，得到Fr.1-Fr.7。取5.4g Fr.5上正相柱层析，以石油醚：乙酸乙酯20:1洗脱，得29mg单体化合物。通过MS，NMR等测定其结构3,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2',6,6'-四羟基-二苯基甲烷(化合物3)。化合物3的1H-NMR和13C-NMR见图5和6，EI/MS m/z 376[M]+，NMR值见表2，化学结构式如下式III所示：
表2化合物3的NMR信号归属
2.30kg干燥狼毒大戟药材，粉碎后浸泡在80％(乙醇：水80:20)乙醇回流提取2次，每次2小时，溶剂用量分别为180L和150L。合并提取液，趁热过滤，合并浓缩至无乙醇残留，浓缩体积至8L。取2L浓缩液加1L水稀释，依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次萃取溶剂均为3L，减压回收溶剂，得石油醚部分60g，乙酸乙酯部分160g，正丁醇部位20g。
乙酸乙酯部分过正相硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10:1，5:1，1:1洗脱，得Fr.1-Fr.7。
取7gFr.5过正相柱，石油醚：乙酸乙酯：甲酸15:1:0.5，12:1:0.5，9:1:0.5，6:1:0.5，3:1:0.5，1:1:0.5梯度洗脱，其中6:1:0.5洗脱得到某一单体化合物后，剩余部分合并再次过正相柱，以石油醚：乙酸乙酯：甲酸4:1:0.1洗脱得26mg单体化合物，通过MS，NMR等测定其结构2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基-1-苯乙酮(狼毒乙素，化合物4)。化合物4的1H-NMR和 13C-NMR见图7和8，EI/MS m/z 196[M]+，NMR值见表3，化学结构式如下式IV所示：
表3化合物4的NMR信号归属
实施例2：体外抗乳腺癌细胞实验
MTT法评价细胞毒性，选取6种型号乳腺癌细胞进行研究，分别为三阴性乳腺癌MDA-MB-231，Sum149，LuminalA型MCF-7，LuminalB型ZR-75-1，Her 2阳性型SKBr3，BT474。紫杉醇为阳性对照药。将上述6种乳腺癌细胞密度调整为5×104个/ml，接种到96孔培养板中，每孔接种100μL细胞悬液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜，观察细胞贴壁且生长良好后，设置阳性对照组，肿瘤细胞对照组和各个不同浓度药物的实验组。实验组加入8个梯度浓度的样品溶液，化合物1和2母液浓度为5mM，紫杉醇母液浓度为3.5mM，化合物2的样品溶液配制过程为通过稀释母液浓度125倍，167倍，200倍，250倍，333倍，再将母液稀释至50μM，继续稀释5倍，12.5倍，25倍，以上述稀释后得到的8个浓度梯度作用于6种乳腺癌细胞(给药后终浓度分别为20，15，12.5，10，7.5，5，2，1μM)；化合物1除作用于肿瘤细胞MDA-MB-231细胞，是通过将母液浓度稀释41.7倍，62.5倍，83.3倍，125倍，166.7倍，再将母液稀释至50μM，继续稀释2.5倍，5倍，12.5倍，得到8个梯度浓度的样品溶液以外(给药后终浓度分别为60，40，30，20，15，10，5，2μM)，作用于其余五种细胞的稀释方法同化合物2的处理方法；而阳性药紫杉醇是先将母液稀释87.5倍，116倍，再将母液稀释至350μM，然后稀释14倍，17.5倍，23.3倍，35倍，再将母液稀释至35μM，然后稀释8.75倍，17.5倍(给药后终浓度分别为20，15，12.5，10，7.5，5，2，1μM)，空白对照组中加等量培养基，肿瘤细胞对照组加等量PBS溶液，每个剂量设6个平行孔。分别置于37℃、5％CO2培养箱中培养72小时，之后每孔加入MTT液(5g/L)20μL。继续培养4小时，吸去上清液，每孔加入100μLDMSO，避光，低速震荡15min，使结晶充分溶解。
用酶标仪(波长492nm)测定吸光度(OD)值，计算不同浓度的化合物对乳腺癌细胞的抑制率。细胞抑制率＝(加药组OD值-调零孔OD值)/(对照组OD值-调零孔OD值)。由此计算阳性药紫杉醇，化合物1，2对不同细胞的抑制率。并确定72h半数抑制浓度，如表4所示。
对比例
发明人同时选取了实施例1对比例中二个化合物，二苯基甲烷类化合物3,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2',6,6'-四羟基-二苯基甲烷(化合物3)和具有单环结构的2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基-1-苯乙酮(化合物4)进行上述的体外抗乳腺癌细胞实验，72h细胞半数抑制浓度如表4所示。
表4 MTT法测定4个化合物及阳性药紫杉醇对各乳腺癌细胞生长的影响(72h半数抑制浓度)
附：-没有活性；
20μM(30％)表示给药浓度20μM时抑制率为30％。
结论
采用MTT法选用6种乳腺癌细胞来测试四个化合物的抗乳腺癌活性，其中化合物1和2显示出明显的抗乳腺癌活性，其中化合物2活性最高，而化合物3和4不具有体外抗乳腺癌活性。从构效关系上来看，二苯基甲烷结构是发挥抗乳腺癌细胞活性的基础，但二苯基甲烷结构中取代基完全对称的化合物3未显示抗乳腺癌细胞活性，仅有单苯环的化合物4也未显示抗乳腺癌细胞活性，同时二苯基甲烷结构上有甲基取代有助于增强其抗肿瘤活性的能力。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (5)

1.从狼毒大戟中提取二苯基甲烷类化合物的方法，按照下述步骤进行：
30kg干燥狼毒大戟药材，粉碎后浸泡在80％乙醇回流提取2次，每次2小时，溶剂用量分别为180L和150L；合并提取液，趁热过滤，合并浓缩至无乙醇残留，浓缩体积至8L；取2L浓缩液加1L水稀释，依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次萃取溶剂均为3L，减压回收溶剂，最终得乙酸乙酯部分160g，乙酸乙酯部分过正相硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10：1，5:1，1:1洗脱，得Fr.1-Fr.7；
其中12gFr.2过正相柱，依次以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1洗脱，20:1洗脱部分再经过正相硅胶柱，用石油醚：二氯甲烷10:1洗脱，再经乙酸乙酯多次结晶得到3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷；
18gFr.3过正相柱，石油醚：乙酸乙酯：甲酸25:1:0.1，20:1:0.1，15:1:0.1，10:1:0.1,5:1:0.1,1:1:0.1梯度洗脱，其中石油醚：乙酸乙酯：甲酸15:1:0.1洗脱得月腺大戟素A。
2.一种二苯基甲烷类化合物，其特征在于，该化合物为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷，其化学结构式如Ⅰ所示：
3.如权利要求2所述的二苯基甲烷类化合物的制备方法，按照下述步骤进行：
30kg干燥狼毒大戟药材，粉碎后浸泡在80％乙醇回流提取2次，每次2小时，溶剂用量分别为180L和150L；合并提取液，趁热过滤，合并浓缩至无乙醇残留，浓缩体积至8L；取2L浓缩液加1L水稀释，依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次萃取溶剂均为3L，减压回收溶剂，最终得乙酸乙酯部分160g，乙酸乙酯部分过正相硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10：1，5:1，1:1洗脱，得Fr.1-Fr.7；
其中12gFr.2过正相柱，依次以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1洗脱，20:1洗脱部分再经过正相硅胶柱，用石油醚：二氯甲烷10:1洗脱，再经乙酸乙酯多次结晶得到3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷。
4.如权利要求2所述的二苯基甲烷类化合物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的二苯基甲烷类化合物在制备治疗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的乳腺癌细胞株为三阴性乳腺癌MDA-MB-231、Sum149、LuminalA型MCF-7、LuminalB型ZR-75-1、Her 2阳性型SKBr3或BT474。
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