CN101979366B

CN101979366B - 莪术中的二苯庚烷类化合物及其医药用途

Info

Publication number: CN101979366B
Application number: CN201010291462.5A
Authority: CN
Inventors: 邱峰; 李军; 康宁; 陈丽霞
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2010-09-26
Filing date: 2010-09-26
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2030-09-26
Also published as: CN101979366A

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了从广西莪术提取分离的新二苯庚烷类化合物及其在医药领域的应用。采用高分辨质谱和一维、二维核磁共振光谱等波谱技术，以及化学方法确定了二苯庚烷类化合物的化学结构。二苯庚烷类化合物可以和药学上可接受的载体结合制备临床上可接受的药物，用于抗炎治疗。体外抑制脂多糖诱导的大鼠巨噬细胞合成一氧化氮(NO)实验表明，二苯庚烷类化合物具有很强的抑制一氧化氮产生的活性，可用于作为预防和/或治疗人类和动物的抗炎药物。

Description

莪术中的二苯庚烷类化合物及其医药用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，确切的说是莪术中的二苯庚烷类化合物及其用途。

技术背景

炎症是机体对各种致炎因子引起的损伤所发生的一系列保护性应答，血管反应是炎症过程的中心环节。炎症通常会引起全身反应，常见以发热、血液中白细胞数目增多以及严重时出现心、肝、肾等器官不同程度的变性、坏死、功能障碍等特征。急性炎症主要表现为红、肿、热、痛及功能障碍，是机体对于刺激的一种防御反应。但是，慢性炎症则表现为致炎因子持续存在并且损伤机体，可导致慢性胆囊炎、糖尿病、慢性肾盂肾炎、肺部疾病、癌症、心血管系统和神经系统的疾病以及一些自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎）等，对机体产生严重危害。

任何能够引起机体组织损伤的因素都可成为炎症的原因，即致炎因子。致炎因子来源于如下几个方面：生物因素，如细菌、真菌、病毒、支原体、立克次体、螺旋体和寄生虫等；物理因素，如高温、低温、放射线及强紫外线和机械损伤等；化学因素，强酸、强碱等化学物质侵害；异物，金属、木材碎屑、矿物粉尘颗粒等物质进入机体；自身坏死组织，由于自身或外界原因引起的组织坏死，组织的坏死便成为潜在的致炎因子；变态反应，机体免疫应答反应异常时，可引起不当的或者过度的免疫反应，造成自身组织和细胞损伤而导致炎症。在炎症发生时，有些致炎因子可直接损伤血管内皮细胞，引起血管的通透性升高，但许多致炎因子并不直接作用于局部组织，而主要是通过内源性化学因子的作用而导致炎症，因此这些内源性化学因子又称为炎症介质。炎症介质的释放及调控机制是炎症研究的重大课题，也是抗炎药物设计的主要靶点。炎症介质主要由巨噬细胞分泌，包括NO、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等。一氧化氮（NO）是一种极不稳定的生物自由基，分子小，分子结构简单，在常温下为气态，具有脂溶性可以快速透过生物膜扩散，微溶于水，生物半衰期为3—5秒。在机体内一氧化氮是由精氨酸上的胍基氮经过一氧化氮合成酶（NOS）的催化而形成的。一氧化氮广泛分布于机体各个组织中，它既有第二信使和神经递质的功能，又是效应分子，介导和调节包括炎症在内的多种生理和病理过程，并且在心、脑血管调节方面也有重要的生物学作用（生命科学，1998，10：188-190）。

一氧化氮合成酶（NOS）可分为两类，即结构型一氧化氮合成酶NOS(cNOS）和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS),cNOS根据产生部位不同，又可分为神经型一氧化氮合成酶(nNOS）和内皮型一氧化氮合成酶(eNOS）。结构型一氧化氮合成酶存在于不同种类的细胞中，而且能够在正常生理情况下持续表达，但是，诱导型一氧化氮合成酶只有在特定生理环境下才会表达，如在某些细胞因子[脂多糖（LPS）、肿瘤坏死因子（TNF-α)等]诱导下才表达其活性。一般认为由诱导型一氧化氮合成酶所产生的NO可能参与多种疾病发生的病理过程。NO不但直接参与了机体的炎症反应，而且还可以促进其他炎症介质（如前列腺素E2等）的释放，此外，NO的代谢异常还能导致中风、支气管哮喘、老年痴呆症、癌症等严重疾病（国外医学免疫学分册，1995，4：204-206）。

因此，在病理条件下，抑制NO等炎症介质的释放可以治疗多种疾病，包括局部或全身的炎症反应、类风湿性关节炎（放射免疫学杂志，2008，21：113-114）、多器官功能障碍综合症、糖尿病（华南国防医学杂志，2010，24：196-198）、心脑血管病（心血管病学进展，2002，23：113-115）、骨性关节炎、脊柱关节炎、炎性肠病（安徽医药，2008，12：1010-1012）、心力衰竭、系统性红斑狼疮、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、帕金森症、早老性痴呆（.广东药学院学报，2000，16：127-130）、抑郁症、败血病（国际流行病学传染病学杂志，2006，33：207-210）、支气管哮喘（中国职业医学，2008，35：424-426）、慢性阻塞性肺病（中华临床医师杂志，2009，3：62-64）、急性胰腺炎、牙龈炎、牙周炎、中枢神经损伤以及多种癌症等（江西医学院学报，2005，45：176-178；解剖科学进展，2005，11：268-271）。炎症介质己经成为抗炎药物研发中最重要的药物靶点之一，寻找活性强、毒性小的炎症介质抑制剂也日益成为新型抗炎药物研究热点。

广西莪术是姜科姜黄属植物，其干燥根茎是常用的传统中药之一。2005年版《中国药典》记载：莪术为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeoaulis Val.、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Ling或温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎。广西莪术味辛、苦，性温。主产于广西，四川、云南亦产。具有行气破血、消积止痛的作用。主治血气心痛、饮食积滞、脘腹胀痛、血滞经闭、痛经、癥瘕痞块、跌打损伤，是临床上常用中药。姜黄属植物中一般含有两大类活性成分，即二苯庚烷类化合物（Diarylheptanoids）和挥发油类化合物（Essential oils），除此之外，还含有二萜类、多糖类、酚酸类、甾醇类等成分。现已证明二苯庚烷类化合物和挥发油类成分是其主要生物活性成分

国内外学者通过药理学实验证实了二苯庚烷类化合物具有止吐、抗结核、保肝、抗球虫、抗真菌、抗癌和抑制前列腺素合成等多种生物活性。未见本发明所涉及的25种新二苯庚烷类化合物抑制NO等炎症介质释放的抗炎作用的相关报道。

发明内容

本发明的首要目的在于提供25种新二苯庚烷类化合物。

本发明的另一目的在于提供上述二苯庚烷类化合物作为制备抗炎药物的用途。

本发明的再一目的在于提供一种制备上述二苯庚烷类化合物的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：25种二苯庚烷类化合物的结构：

上述二苯庚烷类化合物可以作为制备抗炎药物应用。

所述抗炎药物是用于预防或者治疗由一氧化氮作为炎症介质的释放所导致的炎症。

所述抗炎药物含有治疗有效量的上述二苯庚烷类化合物和药学上可接受的载体。

所述二苯庚烷类化合物的制备方法，包括以下操作步骤：采用植物广西莪术为原料，用有机溶剂和/或水进行提取并且进行分离。

所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯中的一种或几种；所述提取的提取温度为20-100oC，提取时间为1-48小时；所述分离是采用色谱分离法和/或萃取法进行分离。

含有本发明二苯庚烷类化合物的抗炎药物可以为适用于口服应用的形式，例如，可为片剂、酊剂、含水或油混悬剂、可分散性粉剂、颗粒剂、乳剂、注射剂、糖浆剂、硬胶囊或者软胶囊。

含有本发明二苯庚烷类化合物的一种化合物或者两种以上化合物组合应用，作为抗炎药物，可以是适用于口服应用的形式，例如，可为片剂、酊剂、含水或油混悬剂、可分散性粉剂、颗粒剂、乳剂、注射剂、糖浆剂、硬胶囊或者软胶囊。

本发明相对现有技术具有如下的优点及效果：（1）提供了一种结构新颖的二苯庚烷类化合物；（2）运用体外抗炎活性筛选体系进行活性评价，发现本发明二苯庚烷类化合物能够有效地抑制小鼠巨噬细胞释放一氧化氮（NO）的活性，表明本发明所述二苯庚烷类化合物具有预防和治疗炎症及与一氧化氮信号传到有关的疾病，并具有良好的研究开发前景。

具体实施方式

本发明可通过下面的实施例加以说明。

实施例1：广西莪术中二苯庚烷类新化合物的提取分离

药材采购于广西省桂林市，并经沈阳药科大学中药学院孙启时教授鉴定为姜科姜黄属植物广西莪术（Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Ling），（也可用产于其它地区的莪术）取其干燥根茎10kg，按重量体积比加入3倍原料重的70%乙醇加热回流提取3次，每次3小时，合并提取液，回收溶剂，得到乙醇提取物分散于按重量体积比5倍的水中，分别用和水等体积的环己烷萃取3次，萃取后的水相再分别用与水等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，回收溶剂后得到乙酸乙酯总提取物65g（EE），萃取后的水相再分别用与水等体积的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，回收溶剂后等到正丁醇总提取物82g（EB）。将乙酸乙酯总提取物65g经硅胶柱色谱用氯仿-甲醇（100：1—0：100）梯度洗脱，得到9个流份EE1至EE9。对EE3进行Sephadex LH-20柱色谱分离，以流动相为氯仿-甲醇（1：1），得到3个流份EE31-EE33。运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相，从亚流份EE32中分离得到化合物15，从亚流份EE33中分离得到化合物12.对EE5进行Sephadex LH-20柱色谱分离，流动相为氯仿-甲醇（1：1），得到3个流份EE51-EE53。运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相，从亚流份EE52中分离得到化合物23和化合物24。对EE6进行硅胶柱色谱分离，流动相为氯仿-甲醇（1：9至8：2），得到5个流份EE61-EE65。运用制备硅胶薄层色谱，流动相为氯仿-甲醇以及手性柱色谱，流动相为乙腈-水，从亚流份EE63中分离得到化合物1和化合物2；运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相以及手性柱色谱，流动相为乙腈-水，从亚流份EE64中分离得到化合物7，化合物8，化合物9，化合物10和化合物11。对EE7进行硅胶柱色谱分离，流动相为氯仿-甲醇（1：1），得到4个流份EE71-EE74。运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相以及手性柱色谱，流动相为乙腈-水，从亚流份EE74中分离得到化合物3，化合物4，化合物5和化合物6。对EE8进行硅胶柱色谱分离，流动相为氯仿-甲醇（1：1），得到4个流份EE81-EE84。运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相，从亚流份EE82中分离得到化合物25，从亚流份EE83中分离得到化合物13和化合物14。将正丁醇总提取物82g经硅胶柱色谱用氯仿-甲醇（100：2—0：100）梯度洗脱，得到8个流份EB1至EB8。对EB2进行反相硅胶柱色谱分离，流动相为甲醇-水（0：1—9：1），得到4个流份EB21-EB24。运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相，从亚流份EB23中分离得到化合物21和化合物22。对EB3进行硅胶柱色谱分离，流动相为氯仿-甲醇（1：1），得到3个流份EB31-EB33。运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相，从亚流份EB32中分离得到化合物16和化合物17。对流份EB4进行反相硅胶柱色谱分离，流动相为甲醇-水（1：4—9：1），得到3个流份EB41-EB43。运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相，从亚流份EB43中分离得到化合物19，化合物20和化合物18。所得化合物为对映异构体混合物的，其拆分是应用填有手性固定相的色谱柱Chiralpak AD-RH(150mm×4.6mm,5μm)，检测波长为220nm，流速为0.5mL/min，经高效液相色谱仪得到分离，其中化合物1和2的分离以乙腈-水(50:50)为流动相，化合物3和4的分离以乙腈-水(40:60)为流动相，化合物5和6的分离以乙腈-水(30:70)为流动相，化合物8和9的分离以乙腈-水(50:50)为流动相，化合物10和11的分离以乙腈-水(30:70)为流动相，化合物19和20的分离以乙腈-水(30:70)为流动相。经Scifinder检索发现所得的这些二苯庚烷类化合物均为未见文献报道的新化合物。

所得各新化合物的物理化学常数如下：

化合物1与化合物2为对映异构体，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰316.1897[M+NH₄]⁺(calc.C₁₉H₂₆NO₃),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₁₉H₂₂O₃。IRν_max(KBr)谱显示：3375,2933,2856,1610,1515,1448,1365,1238,1113,1023,820cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：280(3.47)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表1。

化合物3与化合物4为对映异构体，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰332.1845[M+NH₄]⁺(calcd for C₁₉H₂₆NO₄,332.1856),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₁₉H₂₂O₄。IRν_max(KBr)谱显示:3372,2940,1712,1609,1513,1446,1368,1242,1172,1021,967,811cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：278(3.16)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表1。

化合物5与化合物6为对映异构体，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰334.2011[M+NH₄]⁺(calcd for C₁₉H₂₈NO₄,334.2013),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₁₉H₂₄O₄。IRν_max(KBr)谱显示:3375,2933,2856,1610,1515,1448,1365,1281,1238,1113,957,820cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：282(3.32)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表1。

化合物7，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰316.1899[M+NH₄]⁺(calcd forC₁₉H₂₆NO₃,316.1907),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₁₉H₂₂O₃。IRν_max(KBr)谱显示:3382,2940,2860,1687,1613,1514,1451,1379,1144,1026,830cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：283(3.64)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表1。

化合物8与化合物9为对映异构体，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰374.1957[M+NH₄]⁺(calcd for C₂₁H₂₈NO₅,374.1962),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₂₁H₂₄O₅。IRν_max(KBr)谱显示:3397,2938,1709,1654,1611,1516,1445,1379,1263,1200,1028,819cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：262(3.04)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表2。

化合物10与化合物11为对映异构体，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰376.2127[M+NH₄]⁺(calcd for C₂₁H₃₀NO₅,376.2118),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₂₁H₂₆O₅。IRν_max(KBr)谱显示:3397,2939,2846,1733,1613,1517,1459,1374,1242,1116,1026,959,820cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：262(3.12)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表2。

化合物12，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰314.1740[M+NH₄]⁺(calcd forC₁₉H₂₄NO₃,314.1751),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₁₉H₂₀O₃。IRν_max(KBr)谱显示:3362,2939,1701,1611,1514,1447,1372,1234,1031,830cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：262(3.05)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表2。

化合物13，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰355.1514[M+Na]⁺(calcd.forC₁₉H₂₄O₅Na,355.1516),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₁₉H₂₄O₅。IRν_max(KBr)谱显示:3319,2941,1610,1514,1449,1367,1239,1112,826cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：280.6(3.65)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表3。

化合物14，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰369.1671[M+Na]⁺(calcd.forC₂₀H₂₆O₅Na,369.1672),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₂₀H₂₆O₅。IRν_max(KBr)谱显示:3331,2940,1604,1517,1451,1369,1278,1152,1059,1032,816cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：282.4(3.85)，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表3。

化合物15，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰363.1802[M+H]⁺(calcd.forC₂₀H₂₇O₆,363.1802),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₂₀H₂₆O₆。IRν_max(KBr)谱显示:3234,2938,1677,1602,1516,1452,1272,1202,1128,1033,800cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：279.2(3.71)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表3。

化合物16，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰381.1675[M+Na]⁺(calcd.forC₂₁H₂₆O₅Na,381.1672),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₂₁H₂₆O₅。IRν_max(KBr)谱显示:3337,2941,1708,1613,1513,1450,1376,1262,1030,827cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：279.0(3.77)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表4。

化合物17，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰413.1578[M+Na]⁺(calcd.forC₂₁H₂₆O₇Na,413.1571),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₂₁H₂₆O₇。IRν_max(KBr)谱显示:3336,2943,1708,1605,1524,1445,1376,1281,1114,1023,958,813cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：283.2(3.64)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表4。

化合物18，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰439.1731[M+Na]⁺(calcd.forC₂₃H₂₈O₇Na,439.1727),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₂₃H₂₈O₇。IRν_max(KBr)谱显示:3372,2936,1708,1611,1515,1444,1376,1265,1114,1026,957,827cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：280.6(3.48)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表4。

化合物19与化合物20为对映异构体，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰397.1618[M+Na]⁺(calcd.for C₂₁H₂₆O₆Na,397.1622),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₂₁H₂₆O₆。IRν_max(KBr)谱显示:3320,2942,1708,1610,1514,1444,1376,1261,1113,1024,957,819cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：280.8(3.55)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表5。

化合物21，黄色油状物，¹³C和¹H NMR数据见表6。

化合物22，黄色油状物，¹³C和¹H NMR数据见表6。

化合物23，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰316.1904[M+NH₄]⁺(calc.316.1907C₁₉H₂₆NO₃),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₁₉H₂₂O₃。IRν_max(KBr)谱显示:3389,2925,1712,1614,1513,1449,1403,1386,1211,1116,1040,974,753cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：278.0(3.03)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表7。

化合物24，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰353.1358[M+Na]⁺(calcd.forC₁₉H₂₂O₅Na,353.1359),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₁₉H₂₂O₅。IRν_max(KBr)谱显示:3439,2943,1697,1614,1516,1447,1400,1370,1230,1173,1106,974,823cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：282.0(3.65)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表7。

化合物25，黄色油状物，HR-ESI-MS给出准分子离子峰367.1523[M+Na]⁺(calcd.forC₂₀H₂₄O₅Na,367.1516),结合碳谱与氢谱推测其分子式为C₂₀H₂₄O₅。IRν_max(KBr)谱显示:3414,2938,1694,1605,1515,1451,1371,1273,1152,1117,1033,958,815cm^-1处有吸收峰；UV(MeOH)λ_max：282.3(3.76)nm，浓硫酸-香草醛显粉红色。¹³C和¹H NMR数据见表7。

表1.化合物1—7的碳谱和氢谱数据

注：上述化合物所用测试溶剂为氘代甲醇；化合物1—6的氢谱测试为600MHz，化合物7的氢谱测试为300MHz；化合物1，2和7的碳谱测试为75MHz，化合物3—6的碳谱测试为150MHz。

表2.化合物8—12的碳谱和氢谱数据

注：上述化合物所用测试溶剂为氘代甲醇；化合物8—12的氢谱测试为600MHz；化合物8，9和12的碳谱测试为150MHz，化合物10和11的碳谱测试为75MHz。

表3.化合物13—15的碳谱和氢谱数据

注：上述化合物所用测试溶剂为氘代甲醇；化合物13—15的氢谱测试为600MHz，碳谱测试为150MHz。

表4化合物16—18的碳谱和氢谱数据

注：上述化合物所用测试溶剂为氘代甲醇；化合物16—20的氢谱测试为600MHz，碳谱测试为150MHz。

表5化合物19和20的碳谱和氢谱数据

表6化合物21和22的碳谱和氢谱数据

注：上述化合物所用测试溶剂为氘代甲醇；化合物21和22的氢谱测试为600MHz，碳谱测试为150MHz。

表7化合物23—25的碳谱和氢谱数据

注：上述化合物所用测试溶剂为氘代甲醇；化合物23—25的氢谱测试为600MHz，碳谱测试为150MHz。

实施例2：化合物1—25对脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7释放一氧化氮（NO）的抑制活性实验

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(ATCC TIB-71）培养于含10％热灭活（56oC，30min）胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素钠（Gibco）、100μg/mL链霉素(Gibco）的RPMI1640(Gibco）培养液中，37oC,5%CO_Z的恒温培养箱中孵育生长。由于NO极不稳定，在细胞培养上清液内很快代谢成亚硝酸基（NO₂ ^-），故采用Griess法测定样品中NO₂ ^-的浓度作为衡量NO水平的指标。Griess试剂A:0.1%N一萘乙二胺盐酸盐（naphthylethylene diaminedihydrochloride）溶于水中：Griess试剂B:1％对氨基苯磺酞胺（sulphanilamide）溶于5%H₃PO₄中。使用前等体积混合试剂A和B。用RPMI1640培养液将RAW264.7细胞稀释至5×10⁵cells/mL浓度，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μL细胞悬浮液。CO₂培养箱中培养lh后，每孔加入脂多糖（lipoplysaccharide,LPS)(Sigma)（终浓度1μg/mL)和DMSO溶解的不同浓度的测试样品0.4μL，同时设LPS组（加入LPS，但不加入测试样品，对NO释放的抑制率为0%）和空白对照组（不加入LPS和测试样品，仅加入0.4μL DMSO，对NO释放的抑制率为100%)，每个样品设4个平行孔。在37oC，5%CO₂恒温培养箱中培养24h，吸取100μL培养液上清至酶标板中，离心（1000×g,4oC，3min)，加入100μL Griess试剂，室温避光反应10min，于酶标仪测定其540nm处的吸光值。用浓度分别为1、5、10、50μmol/L的NaNO₂绘制标准曲线，根据NaNO₂标准曲线计算细胞培养上清液中NO₂ ^-的浓度进而计算测试样品对N0释放的抑制率。活性结果如表8所示：

表8.化合物1—25对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞释放一氧化氮（NO）的抑制活性结果

Claims

1.莪术中的二苯庚烷类化合物，化学名及结构式分别为：

化合物1：(3S)-1,7-双(4-羟基苯基)-(6E)-6-庚烯-3-醇

化合物2：(3R)-1,7-双(4-羟基苯基)-(6E)-6-庚烯-3-醇

化合物3：(3S)-1-(3,4-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)-(6E)-6-庚烯-3-醇

化合物4：(3R)-1-(3,4-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)-(6E)-6-庚烯-3-醇

化合物5：(3S)-1-(3,4-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)庚烷-3-醇

化合物6：(3R)-1-(3,4-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)庚烷-3-醇

化合物7：(3R)-1-(3,4-二羟基苯基)-7-苯基-(6E)-6-庚烯-3-醇

化合物8：(3S)-3-乙酰氧基-1-(3,4-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)-(6E)-6-庚烯

化合物9：(3R)-3-乙酰氧基-1-(3,4-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)-(6E)-6-庚烯

化合物10：(3S)-3-乙酰氧基-1-(3,4-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)庚烷

化合物11：(3R)-3-乙酰氧基-1-(3,4-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)庚烷

化合物12：(E)-1,7-双(4-羟基苯基)-6-庚烯-3-酮

化合物13：(3R′,5S′)-3,5-二羟基-1-(3,4-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)庚烷

化合物14：(3R′,5S′)-3,5-二羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羟基苯基)庚烷化合物15：(3R′,5S′)-3,5-二羟基-1-(3-甲氧基-4,5-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)庚烷

化合物16：(3R,5R)-3-乙酰氧基-5-羟基-1,7-双(4-羟基苯基)庚烷

化合物17：(3R,5R)-3-乙酰氧基-5-羟基-1,7-双(3,4-二羟基苯基)庚烷

化合物18：(3R,5R)-3,5-二乙酰氧基-1-(3,4-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)庚烷

化合物19：(3R,5R)-3-乙酰氧基-5-羟基-1-(3,4-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)庚烷

化合物20：(3S,5S)-3-乙酰氧基-5-羟基-1-(3,4-二羟基苯基)-7-(4-羟基苯基)庚烷

化合物21：2,3,5-三羟基-1-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-7-(3,5-二甲氧基-4-羟基苯基)庚烷

化合物22：2,3,5-三羟基-1-(4-羟基苯基)-7-(3,5-二甲氧基-4-羟基苯基)庚烷

化合物23：(5S)-5-羟基-1-(4-羟基苯基)-7-(3,4-二羟基苯基)-3-庚酮

化合物24：(5S)-5-羟基-1-(4-羟基苯基)-7-苯基-3-庚酮

化合物25：(5S)-5-羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羟基苯基)-3-庚酮

2.二苯庚烷类化合物的组合物，包括权利要求1所述化合物中的一种或者几种。

3.如权利要求1所述的莪术中的二苯庚烷类化合物的制备方法，具体步骤如下：

广西莪术（Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Ling），或其它地区的莪术，取其干燥根茎10kg，按重量体积比加入3倍原料重的70%乙醇加热回流提取3次，每次3小时，合并提取液，回收溶剂，得到乙醇提取物分散于按重量体积比5倍的水中，分别用和水等体积的环己烷萃取3次，萃取后的水相再分别用与水等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，回收溶剂后得到乙酸乙酯总提取物EE65g，萃取后的水相再分别用与水等体积的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，回收溶剂后得到正丁醇总提取物EB82g；

将乙酸乙酯总提取物65g经硅胶柱色谱用氯仿-甲醇100：1—0：100梯度洗脱，得到9个流份EE1至EE9，对EE3进行Sephadex LH-20柱色谱分离，以流动相为氯仿-甲醇1：1，得到3个流份EE31-EE33，运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相，从亚流份EE32中分离得到化合物15，从亚流份EE33中分离得到化合物12，对EE5进行SephadexLH-20柱色谱分离，流动相为氯仿-甲醇1：1，得到3个流份EE51-EE53；运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相，从亚流份EE52中分离得到化合物23和化合物24，对EE6进行硅胶柱色谱分离，流动相为氯仿-甲醇1：9至8：2，得到5个流份EE61-EE65；运用制备硅胶薄层色谱，流动相为氯仿-甲醇以及手性柱色谱，流动相为乙腈-水，从亚流份EE63中分离得到化合物1和化合物2；运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相以及手性柱色谱，流动相为乙腈-水，从亚流份EE64中分离得到化合物7，化合物8，化合物9，化合物10和化合物11；对EE7进行硅胶柱色谱分离，流动相为氯仿-甲醇1：1，得到4个流份EE71-EE74，运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相以及手性柱色谱，流动相为乙腈-水，从亚流份EE74中分离得到化合物3，化合物4，化合物5和化合物6；对EE8进行硅胶柱色谱分离，流动相为氯仿-甲醇1：1，得到4个流份EE81-EE84；运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相，从亚流份EE82中分离得到化合物25，从亚流份EE83中分离得到化合物13和化合物14，将正丁醇总提取物82g经硅胶柱色谱用氯仿-甲醇100：2—0：100梯度洗脱，得到8个流份EB1至EB8；对EB2进行反相硅胶柱色谱分离，流动相为甲醇-水0：1—9：1，得到4个流份EB21-EB24；运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相，从亚流份EB23中分离得到化合物21和化合物22；对EB3进行硅胶柱色谱分离，流动相为氯仿-甲醇1：1，得到3个流份EB31-EB33；运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相，从亚流份EB32中分离得到化合物16和化合物17；对流份EB4进行反相硅胶柱色谱分离，流动相为甲醇-水1：4—9：1，得到3个流份EB41-EB43；运用制备液相，以反相硅胶为固定相，甲醇-水为流动相，从亚流份EB43中分离得到化合物19，化合物20和化合物18；所得化合物为对映异构体混合物的，其拆分是应用填有手性固定相的色谱柱Chiralpak AD-RH150mm×4.6mm,5μm，检测波长为220nm，流速为0.5mL/min，经高效液相色谱仪得到分离，其中化合物1和2的分离以乙腈-水50:50为流动相，化合物3和4的分离以乙腈-水40:60为流动相，化合物5和6的分离以乙腈-水30:70为流动相，化合物8和9的分离以乙腈-水50:50为流动相，化合物10和11的分离以乙腈-水30:70为流动相，化合物19和20的分离以乙腈-水30:70为流动相。

4.权利要求1所述的二苯庚烷类化合物或权利要求2所述的组合物在制备抗炎药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗炎药物为用于预防或者治疗由一氧化氮作为炎症介质的释放所导致的炎症的药物。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗炎药物含有权利要求1的二苯庚烷类化合物或权利要求2所述的组合物和药学上可以接受的载体。