CN107427545A

CN107427545A - 青黛萃取物及其制备方法

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Publication number: CN107427545A
Application number: CN201680019978.XA
Authority: CN
Inventors: I.卡迪诺; L.尚塔拉; P.安德烈斯; Y-K.林; J-T.皮尔逊; A.比利; L.勒布罗纳
Original assignee: GALDEMA AG
Current assignee: GALDEMA AG
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2017-12-01
Also published as: EP3482763A1; RS58304B1; JP6820273B2; TWI732754B; US20190224264A1; US9861673B2; DK3209313T3; CA2981624A1; HRP20190088T1; BR112017021191A2; KR20170133497A; TW201642891A; JP2018510890A; AU2016245203A1; US20180099020A1; ES2709359T3; US10695391B2; HUE041308T2; BR112017021191B1; TR201901146T4

Abstract

本发明涉及从一种或多种植物原料，例如青黛及其萃取物制备萃取物的方法。本发明还涉及包含所述萃取物的组合物，以及组合物在医药或化妆品应用中的用途。

Description

青黛萃取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于从一种或多种植物原料，例如青黛(Indigo Naturalis)及其萃取物制备萃取物的方法。本发明还涉及一种包含所述萃取物的组合物，以及组合物在医药或化妆品应用中的用途。

背景

对于牛皮癣的常规治疗通常根据患者的年龄、性别、职业和认知能力，损害的类型和分布，患者对先前治疗方法的反应，和患者的其它医疗史而设计。对于牛皮癣的主要治疗方法包括局部疗法、全身疗法、生物制剂注射和光疗。用于局部疗法的组合物包括，例如，皮质类固醇、地蒽酚(可作为Margiton®购得)、煤焦油(可作为Polytar®购得)、骨化三醇(可作为Silkis®购得)、他扎罗汀(可作为Tazorac®购得)、水杨酸，这些组合物适合于治疗具有轻度症状的牛皮癣患者。例如甲氨蝶呤(MTX)、环孢菌素和维甲酸类的口服制剂通常用于全身疗法且适合于治疗具有中度至重度症状的牛皮癣患者。生物制剂包括阿来西普(可作为Amevive®购得)、依法珠单抗(可作为Raptiva®购得)、依那西普(可作为Enbrel®购得)和阿达木单抗(可作为Humira®购得)，它们适合于注射到具有中度至重度症状的牛皮癣患者中。光疗，例如，紫外线B (UVB)光疗、光化学疗法例如补骨脂素加紫外线A (PUVA)，适合于治疗具有重度症状的牛皮癣患者。

然而，需要另外的治疗方法。

概述

青黛(Indigo Naturalis)，例如青黛(Qingdai)，是一种从含靛青植物或产靛青植物的叶子制备的深蓝色粉末。所述植物优选选自木蓝(Indigofera tinctoria L.)、马蓝(Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek (syn. Strobilanthes cusia (Nees)、蓼蓝(Persicaria tinctoria (Aiton) Spach. (syn. Polygonum tinctorium Aiton, P. tinctorium Lour.))和菘蓝(Isatis tinctoria L. (syn. Isatis indigotica Fort.))。

使用青黛(Indigo Naturalis)或青黛(Qingdai)时遭遇的缺点之一是其在皮肤上产生深色及其在衣服上留下染色。青黛(Qingdai)是青黛(Indigo Naturalis)的俗名。它用NaOH或KOH水溶液从含靛青植物或产靛青植物萃取且相当于约5-15%有机化合物(包括生物碱类，其中存在靛青和靛玉红)和85-95%无机化合物(例如碳酸钙和氢氧化钙)的混合物。

另一个缺点可能是在传统上，在青黛产物中仅控制靛青和靛玉红。

因此，对以下仍存在未满足的需求：开发来自青黛或来自含靛青植物或产靛青植物的萃取物成可上市的药物，以获得比青黛颜色更浅的萃取物并表征和控制这样的萃取物的主要组分。更特别地，提供颜色更浅的萃取物，同时维持或增加其治疗或缓解皮肤疾病或病症例如牛皮癣的功效将是有利的。

本发明通过提供易于处理的精制萃取物解决这个问题，所述精制萃取物保留来自青黛(Indigo Naturalis)或青黛(Qingdai)的活性组分以确保临床效果和安全性。

本发明部分涉及一种从青黛(Indigo Naturalis)，例如从青黛(Qingdai)获得萃取物的方法，所述萃取物进而含有例如靛玉红和靛青，用于治疗或缓解皮肤疾病或病症例如牛皮癣。

在一个方面，本发明提供一种从一种或多种植物原料，例如青黛或一种或多种含靛青植物或产靛青植物(优选地选自木蓝、马蓝、蓼蓝和菘蓝)的叶子和/或茎制备萃取物的方法。该方法包括以下步骤：

a) 萃取步骤：用第一极性溶剂或中度极性溶剂萃取青黛或一种或多种如上选择的植物的叶子和/或茎，以获得萃取混合物；

b) 过滤步骤：过滤萃取混合物，以获得滤液；

c) 浓缩步骤：浓缩该滤液，以获得粗萃取物；

d) 洗涤步骤：用非-极性溶剂，和任选地用第二极性溶剂洗涤粗萃取物，以获得洗涤混合物；和

e) 过滤步骤：过滤洗涤混合物，任选地在例如依据用于干燥的常规方法的干燥步骤之后获得精制萃取物。

根据本发明的方法允许获得精制萃取物；这样的精制萃取物被定义如下。在以下描述中，术语“植物原料”指青黛(例如，可市售获得的青黛)，或含靛青植物或产靛青植物(优选地选自木蓝、马蓝、蓼蓝和菘蓝)的叶子和/或茎，在收获和收集之后，可通过例如发酵进行处理。

在一些实施方案中，用于萃取步骤a)的溶剂可包括，但不限于，二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、乙醇(包括含水乙醇，例如85%乙醇)、二甲亚砜(DMSO)、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、二甲基乙酰胺(DMA)、丙酮、2-丁酮、乙腈、乙酸异丙酯、2-甲基四氢呋喃(MeTHF)、甲基叔丁基醚、水、甲醇、氯仿、萜(柠檬烯、对-异丙基甲苯等)，或其组合。优选地，溶剂可以是乙酸乙酯、MeTHF、乙醇或含水乙醇。

此外，萃取步骤a)可以在从1:5至1:150 (g/mL)范围内，例如在从1:5至1:100范围内，例如1:6、1:15、1:20、1:30、1:50、1:100的植物原料对溶剂的比例(即，待萃取的材料的克数对溶剂的mL数)进行。

在特定的实施方案中，用于萃取步骤a)的溶剂是有机溶剂。更优选地，溶剂选自二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、乙醇、二甲亚砜、二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基乙酰胺、丙酮、2-丁酮、乙腈、乙酸异丙酯、2-甲基四氢呋喃、甲基叔丁基醚、甲醇、氯仿、萜及其组合。

在一些实施方案中，萃取步骤a)可被重复直至如通过在实施例8A中公开的HPLC方法测定的，在过滤步骤b)过滤的剩余植物原料中靛玉红含量(%w/w)少于0.10%。

在一些其它实施方案中，萃取步骤a)通过加热，例如直至回流进行。

萃取步骤a)之后进行过滤步骤b)，然后用于浓缩该滤液的浓缩步骤c)，以提供粗萃取物。过滤步骤b)可趁热进行。

在一些实施方案中，洗涤步骤d)可被重复直至如通过在实施例8A中公开的HPLC方法测定的，在精制萃取物中的靛玉红的量(% w/w)是至少55% (w/w)。

在一些实施方案中，用于洗涤步骤d)的溶剂选自水、具有5-8个碳原子的烷烃、具有2-6个碳原子的醇及其组合。例如，溶剂包括，但不限于，己烷、庚烷、乙醇、水或其组合。例如，在洗涤步骤d)中，在使用两种或更多种溶剂的情况下，依序或同时使用己烷或庚烷，和含水乙醇。

依据一个实施方案，用于步骤d)的非-极性溶剂是己烷。

依据另一个特定的实施方案，步骤d)用非-极性溶剂和第二极性溶剂执行。优选地，第二极性溶剂是乙醇。更优选地，用于步骤d)的非-极性溶剂是己烷，而第二极性溶剂是乙醇。

在一些其它实施方案中，从浓缩步骤c)获得的粗萃取物经历以下程序至少一个循环直至获得精制萃取物：粗萃取物用溶剂洗涤(步骤d))，并过滤(步骤(e))，得到精制萃取物，任选地随后进行干燥步骤。依据特定的实施方案，洗涤步骤d)和过滤步骤e)仅执行一个循环，以获得精制萃取物。当应用一个以上的循环时，可使用相同或不同的溶剂用于洗涤。此外，该粗萃取物可在回流下用溶剂洗涤，混合物可冷却至室温且接着过滤，得到精制萃取物，任选地随后进行干燥步骤。

在优选的实施方案中，进行两个循环。特别地，通过浓缩步骤c)获得的粗萃取物在非- 极性溶剂，优选己烷中洗涤(步骤d)并过滤(步骤e)，任选地随后进行干燥步骤。然后，己烷萃取物用有机极性溶剂，优选乙醇洗涤(步骤d)且接着过滤(步骤e)，以获得精制萃取物，任选地随后进行干燥步骤。

任选地，微粉化步骤在步骤e)之后执行，从而提供具有在25和35 µm之间，优选约30 µm粒径的精制萃取物。

在另一个优选的实施方案中，当精制萃取物在最后步骤中微粉化时，99%的获得的颗粒小于或等于30 µm。

在另一个方面，本发明提供一种得自青黛的精制萃取物。

本发明还提供一种含有作为组分的靛玉红的精制萃取物，其量为精制萃取物的至少55% (w/w)。在一些实施方案中，靛玉红以精制萃取物的至少60%、65%、70%、75%、80%或85%(w/w)的量存在。例如，靛玉红的量可以是精制萃取物的55-90% (w/w)，例如，精制萃取物的55-60%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、60-65%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%,65-70%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、70-75%、70-80%、70-85%、70-90%、75-80%、75-85%、75-90%、80-85%、80-90%，或85-90% (w/w)。

优选地，本发明提供一种含有作为组分的靛玉红的精制萃取物，其量为精制萃取物的至少65% (w/w)。

优选地，靛玉红的量是精制萃取物的65-90% (w/w)。

在一些实施方案中，精制萃取物含有作为组分的靛青。靛青的量可以是精制萃取物的0-15% (w/w)，例如，精制萃取物的0.1-15%、0.5-15%、1-15%、2-15%，或3-15% (w/w)。

在一些其它实施方案中，精制萃取物还含有作为组分的色胺酮。色胺酮的量可以是精制萃取物的0.01-5%或优选0.1-5% (w/w)，例如，精制萃取物的0.01-1%、0.05-1%、0.1-1%、0.1-5%、0.5-1%，或0.5-5% (w/w)。

在一些进一步的实施方案中，精制萃取物还含有作为组分的青黛酮。青黛酮的量可以是精制萃取物的0.1-5% (w/w)，例如，精制萃取物的0.1-1%、0.1-5%、0.5-1%，或0.5-5%(w/w)。

在一些进一步的其它实施方案中，在精制萃取物中，包含上述那些的两种或更多种，表示精制萃取物的至少60%(w/w)，例如65%、70%、75%、80%、85%、90%，或95% (w/w)，且优选至少90%(w/w)。表征的组分(包含上述那些的两种或更多种)的量是精制萃取物的60-99%(w/w)，例如60-95%、65-95%、70-95%、80-95%、85-95%、90-95%、60-99%、65-99%、70-99%、80-99%、85-99%或90-99% (w/w)且优选90-99% (w/w)。

在进一步的另一个方面，本发明提供一种药用组合物，其包含如上所述的精制萃取物和药学上可接受的载体。组合物呈现为局部或口服给药的形式。

在进一步的另一个方面，本发明提供一种化妆品组合物，其包含如上所述的精制萃取物和化妆品学上可接受的载体。组合物呈现为局部给药的形式。

在又一个方面，本发明提供精制萃取物在制备药物或化妆品组合物中的用途，其用于抑制角质化细胞的增殖或分化，抑制单核细胞浸润至真皮和表皮，抑制导致增生血管的血管变化，或抑制内皮细胞上的粘附分子的上调。所述用途包括给予刚刚描述的组合物至有需要的受试者(例如人)。

在进一步的另一个方面，本发明提供一种上述组合物，其用于治疗或缓解选自牛皮癣、炎性皮肤病况、甲真菌病、皮肤癌、异常角质化诱导的疾病、皮肤老化、脓疱性皮肤病和皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的皮肤疾病或病况。

在另一个方面，本发明提供一种抑制角质化细胞的增殖或分化，抑制单核细胞浸润至真皮和表皮，抑制导致增生血管的血管变化，或抑制内皮细胞上的粘附分子的上调的方法，其包括使本发明的精制萃取物与需要其的细胞接触的步骤。此方法可在体外或体内施用。

在更进一步的另一个方面，本发明提供一种用于治疗皮肤疾病或病况的方法，其包括给予有需要的受试者有效量的依据本发明的精制萃取物。所述疾病或病况选自牛皮癣、炎性皮肤病况、甲真菌病、皮肤癌、异常角质化诱导的疾病、皮肤老化、脓疱性皮肤病和CTCL。

在一些实施方案中，炎性皮肤病况可以是特应性皮炎、湿症或重复感染的皮肤。皮肤老化可以是皮肤年轻化，对疤痕或皮肤老化的组织再生。异常角质化可以是痤疮、鱼鳞病或掌跖角化病。皮肤癌可以是癌前期皮肤癌，例如，光化性角化病(AK)、鲍恩病(Bowen’sdisease)；皮肤癌，例如，SCC、BCC、NMSC；黑素瘤和HPV诱发的皮肤癌。

附图描述

本发明的以上和其它特征和优点将参照以下详细描述和附图而变得显而易见。

图1：靛青(A)和靛玉红(B)的示例性HPLC色谱图。

图2：色胺酮(A)、青黛(B)和实施例2的精制萃取物(C)的示例性HPLC色谱图。

图3：在IL-22诱发的牛皮癣模型中对得自青黛的萃取物体内评估的组和剂量。设计了5组研究并分别在研究1-5中概述。在研究1中，在20µL盐水中的100ng和500ng的IL-22，经i.d.用于诱导。在研究2-5中，在20µL盐水中的500ng的IL-22，经i.d.用于诱导。

图4：图说明在皮内注射IL-22后的耳部炎症。在研究中，小鼠的耳朵经皮内注射并在注射之间的天数测量耳部厚度。

图5：图说明在皮内注射IL-22后，得自青黛的萃取物对耳部炎症的作用。

详细描述

如本文所用的，靛玉红、靛青、色胺酮和青黛酮具有如在文献中提及的结构式，且更特别是以下结构。

“极性溶剂”指具有高介电常数和高偶极矩的溶剂；且例子包括水、醇，例如，从2至6个碳原子的醇(例如乙醇)、乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)，和二甲亚砜(DMSO)。

“中度极性溶剂”指具有适度高介电常数的溶剂；且例子包括乙酸乙酯、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、二甲基乙酰胺(DMA)、丙酮、2-丁酮、乙酸异丙酯、1,4-二噁烷、2-甲基四氢呋喃(MeTHF)、甲基叔丁基醚(MTBE)。

“非-极性溶剂”指具有低介电常数的溶剂；且例子包括乙醚、石油醚(PE)、甲苯和从5至8个碳原子烷烃，例如，庚烷、己烷、戊烷或环己烷。

“室温”指18℃-35℃。

术语“牛皮癣”或“银屑病”指本领域技术人员熟知的所有类型的牛皮癣。它包括，但不限于，慢性斑块性牛皮癣、点滴型牛皮癣(guttate psorisis)、红皮病型牛皮癣(erythrodermic psorisis)、脓疱型牛皮癣(pustular psorisis)、反转型牛皮癣(inversepsorisis) (也称为屈侧牛皮癣)、指甲牛皮癣、牛皮癣性关节炎。

术语“精制萃取物”指固体、半-固体或油性萃取物，优选固体萃取物，其含有少于10% (w/w)的在制备所述精制萃取物的方法所用的水和/或溶剂。精制萃取物更优选的特征为增加量的活性成分，包括生物碱类，其中存在靛青、靛玉红、色胺酮和/或青黛酮，优选地与青黛(Qingdai)或青黛(Indigo Naturalis)相比富含靛玉红。更特别地，根据本发明的精制萃取物包含至少60%，或更优选超过70 % (w/w)的活性成分，包括靛青、靛玉红、色胺酮和/或青黛酮。

如本文所用的术语“粗萃取物”指固体、半-固体或油性萃取物，优选固体或半-固体萃取物，其含有少于15% (w/w) (例如，5-15%、5-10%)的在制备精制萃取物的方法中所用的水和/或溶剂。与青黛(Qingdai)或青黛(Indigo Naturalis)比较，粗萃取物含有的靛玉红比精制萃取物少。粗萃取物通过根据本发明的浓缩步骤c)获得。浓缩步骤更特别地通过将滤液送至浓缩器(例如在减压下)执行，以除去用于方法中的水和/或溶剂，从而浓缩萃取物中存在的活性成分，包括靛青、靛玉红、色胺酮和/或青黛酮。

如本文所用的“一次循环”指按顺序执行一次的洗涤步骤d)和过滤步骤e)的两个步骤。如本文所用的“两次循环”指按顺序执行两次的洗涤步骤d)和过滤步骤e)的两个步骤。

术语“有效量”指对患者平均产生治疗益处(例如，疾病、病症或症状的改善、缓解或治愈)的精制萃取物的剂量水平。

本发明提供一种用于从青黛或从一种或多种含靛青植物或产靛青植物(优选地选自木蓝、马蓝、蓼蓝和菘蓝)的叶子和/或茎制备精制萃取物的方法。

青黛从木蓝、马蓝、蓼蓝和菘蓝的叶子和茎，优选地从叶子获得。优选地，青黛从蓼蓝(Persicaria Tinctoria)和/或马蓝(Baphicacanthus cusia)的叶子和茎获得。

当青黛为可市售获得的(可市售获得的青黛的例子(植物/供应商)：马蓝/Delong；木蓝(Indigofera tinctoria)/KMA出口商或Sam Vegetable Colours PVT Ltd；菘蓝(Isatis tinctoria)/Andrea Primavera或Bleu de Lectoure；蓼蓝(Polygonumtinctorium)/CouleurGarance或EARL 4 saisons)时，其可通过本领域通常已知的方法从一种或多种以上植物的叶子和茎生产。这些方法可概述如下：将新鲜收获的蓼蓝和/或马蓝的茎和叶子加入到露天的池中，将水加入池中以覆盖茎/叶子。在浸泡数天(26-30℃)后，茎/叶子将变得腐烂。然后添加石灰碱(lime soda)同时搅拌。当浸泡混合物的颜色从绿色变成深紫色时，收集沉淀物，洗涤(通常用水洗2-3次)，然后干燥，得到青黛粉末。

精制萃取物可根据本发明的方法制备，其包括由下列组成的步骤：a) (i) 将萃取溶剂，极性或中度极性溶剂(例如醇或乙酸乙酯)加入至青黛粉末，得到混合物；(ii) 加热并搅拌混合物一段时间(例如，30 min、1小时、2小时)；b) (iii) 过滤经加热的混合物，同时趁热除去不溶性副产物，得到滤液；c) (iv) 浓缩该滤液以得到粗萃取物；d) (v) 将洗涤溶剂(例如，水，或非-极性，或极性溶剂或其混合物)加入到粗萃取物中，以得到洗涤混合物；(vi) 加热并搅拌洗涤混合物一段时间(例如，30 min、1小时、2小时)；e) (vii) 例如在室温(例如18℃-35℃)过滤洗涤混合物，以收集精制萃取物；任选地(viii) 重复步骤(v)-(vii)，直至在残留物(即，萃取物)中的靛玉红的量(% w/w)超过55% (w/w)，优选地超过65%(w/w)，如通过在实施例8A中公开的HPLC方法所测定的，任选地(ix) 根据常规方法(例如，风干、冷冻干燥)干燥精制萃取物。在步骤(v)和(viii)中的洗涤溶剂可以是相同或不同的。

在优选的实施方案中，精制萃取物通过包括以下步骤的方法制备：

a) 用乙醇回流2-8小时萃取青黛，

b) 在不低于65℃的温度下过滤混合物，以获得滤液，

c) 浓缩滤液，以获得粗萃取物，任选地过滤粗萃取物(加入水)，以完全除去溶剂和仍存在于溶剂中的最后组分并干燥，

d) (i) 用己烷在不低于50℃的温度下洗涤粗萃取物15-60 min，

(ii) 在室温下过滤在步骤d) (i)中获得的混合物，以获得产物，任选地用乙醇和水冲洗之

(iii) 用乙醇在回流下洗涤在步骤d) (ii)中获得的产物，和

e) 在室温下过滤在步骤d)中获得的洗涤混合物并在低于80℃的温度下干燥生成的产物，以获得萃取物，其任选地被微粉化。

在另一个优选的实施方案中，当精制萃取物在最后步骤中被微粉化时，颗粒大小是约99%在25-35 µm范围内，优选约30 µm。

如本文所用的，“约”或“大约”将被本领域普通技术人员所理解，并且在某种程度上根据使用该术语的上下文而变化。如果鉴于使用该术语的上下文，本领域普通技术人员对该术语的使用不明白，则“约”或“大约”将意味着至多加或减特定术语的20%，优选10%。

成分例如靛青、靛玉红、色胺酮和青黛酮的含量可通过如在实施例8中公开的HPLC方法定量。

刚刚描述的方法使其有可能获得精制萃取物，其为容易处理且可进一步配制成药物或化妆品组合物。此外，所述方法提供富含靛玉红的萃取物。如此获得的精制萃取物的至少60% (w/w)组分被表征；优选至少90% (w/w)，其中一种或多种选自由靛青、靛玉红、色胺酮和青黛酮组成的列表。虽然从该方法获得的精制萃取物呈现固体形式，用于精制萃取物的液体形式的制剂可基于处理或配制需要，通过固体精制萃取物的简单溶解或增溶作用来制得。

在这种情况下，用于精制萃取物的液体形式可根据本发明的方法制备，其包括由下列组成的步骤：a) (i) 将萃取溶剂，极性或中度极性溶剂(例如醇或乙酸乙酯)加入青黛粉末，得到混合物；(ii) 加热并搅拌混合物一段时间(例如，30 min、1小时、2小时)；b)(iii) 过滤经加热的混合物，同时趁热除去不溶性副产物，得到滤液；c) (iv) 浓缩该滤液以得到粗萃取物；d) (v) 将洗涤溶剂(例如，水，或非-极性，或极性溶剂，或其混合物)加入粗萃取物中，以得到洗涤混合物；(vi) 加热并搅拌洗涤混合物一段时间(例如，30 min、1小时、2小时)；e) (vii) 例如在室温(例如18℃-35℃)过滤洗涤混合物，以收集精制萃取物；任选地(viii) 重复步骤(v)-(vii)，直至在残留物(即，萃取物)中的靛玉红的量(% w/w)超过55% (w/w)，优选地超过65% (w/w)，如通过在实施例8A中公开的HPLC方法所测定的，(ix)使如此获得的精制萃取物溶于药学上可接受的溶剂或载体。在步骤(v)和(viii)中的洗涤溶剂可以是相同或不同的。

本发明还提供一种优选地从植物萃取物、青黛萃取物或来自含靛青植物或产靛青植物(优选地选自木蓝、马蓝、蓼蓝和菘蓝)的叶子和/或茎的萃取物，通过如上所述的方法可获得的萃取物，所述可获得的萃取物包括作为组分的靛玉红，其量为精制萃取物的至少55% (w/w)，优选至少65% (w/w)。精制萃取物呈现固体形式且可通过上述方法或任何其它合适的方法制备。精制萃取物还可包含靛青、色胺酮和/或青黛酮，其可与靛玉红一起被共同萃取。尤其是，含有多成分的萃取物可提供协同效应。

本发明还提供一种包含精制萃取物的药用组合物。药用组合物可使用本领域技术人员熟知的技术配制成用于局部或口服给予的合适的剂型。药用组合物可另外地包含药学上可接受的载体例如在药物制造领域中广泛采用的那些载体。例如，药学上可接受的载体可包括一种或多种以下试剂：溶剂、乳化剂、助悬剂、分解剂、结合剂、赋形剂、稳定剂、螯合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润滑剂、吸收延缓剂、脂质体等。优选地，溶剂选自水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化二甘醇、环多元醇、凡士林、植物油和这些溶剂的任何混合物。优选地，药用组合物被配制成局部制剂，其可直接应用于皮肤，例如，罹患牛皮癣的皮肤。适合于药用组合物的局部制剂可以是乳剂、凝胶剂、软膏剂、霜剂、贴剂、擦剂、气溶胶、喷雾剂、洗剂、精华液(serum)、糊剂、泡沫剂或滴剂。在本发明的一个实施方案中，药用组合物通过使依据本发明的精制萃取物与基质例如本领域熟知的和通常使用的那些基质混合，配制成外用制剂。

在一些实施方案中，给予依据本发明的药用组合物的剂量和频率可取决于以下因素而变化：待治疗的疾病的严重性，给药途径，和待治疗的受试者的体重、年龄、身体状况和反应。在进一步的或另外的实施方案中，精制萃取物的量在约0.001-约1000 mg/kg体重/天的范围内，例如，约0.01-约500、300或100mg/kg体重/天。

本发明还提供一种包含精制萃取物的化妆品组合物。化妆品组合物可以适合于局部应用的形式存在，其包含化妆品学或皮肤病学上可接受的载体或媒介。“化妆品学或皮肤病学上可接受的”意指适合于使用的媒介，其中它们与皮肤或人皮肤附属物接触，而不造成毒性、不受性、不稳定性、过敏反应等风险。在化妆品组合物中，精制萃取物可先在一种或多种化妆品学或皮肤病学上可接受的溶剂，例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化二甘醇、环多元醇、凡士林、植物油或这些溶剂的任何混合物中溶解。

上述精制萃取物和组合物可用于疾病或病况的治疗或缓解。所谓治疗意味着至少缓解与受试者罹患的病理状况有关的症状，其中广义上使用的缓解指至少减少参数的量值，例如与待治疗的病理状况，例如皮炎、牛皮癣等有关的症状。因此，治疗也包括以下的情况，其中病理状况，或至少与其相关的症状，被完全抑制，例如，避免发生，或停止，例如终止，以致宿主不再罹患病理状况，或至少为病理状况特征的症状。因此，治疗包括治愈和控制疾病状况两者。因此，上述萃取物和组合物可用于治疗或缓解选自牛皮癣、炎性皮肤病况、甲真菌病、皮肤癌、异常角质化诱导的疾病、皮肤老化和脓疱性皮肤病的疾病或病况。

本发明还提供一种抑制角质化细胞的增殖或分化，抑制单核细胞浸润至真皮和表皮，抑制导致增生血管的血管变化，或抑制内皮细胞上的粘附分子的上调的方法，其包括给予上述萃取物和组合物至有需要的受试者。

关于其抑制增殖或分化、或炎症的活性，精制萃取物和组合物的功效可通过体外模型进行评估。例如，体外测试可在胞因子信号传导，包括STAT-3/STAT-1、MAPK、NFκB的途径上执行。

关于其在治疗疾病或病症中的活性，精制萃取物和组合物的功效可通过体内模型进一步评估。例如，可测试基因工程改造的小鼠，包括转基因和敲除模型。

本申请的新特征在所附权利要求书中具体阐述。本申请的特征和优点的更好的理解将通过参考以下阐明其中利用本申请原理的示例性实施方案的详细描述而获得。

虽然本文已显示和描述了本申请的优选的实施方案，但这样的实施方案仅通过实例的方式提供。应该理解，本文描述的本申请的实施方案的各种替代方案可用于实施本申请。本领域普通技术人员将意识到，许多变化、改变和取代是可能的而不背离本申请。意欲以下权利要求限定本申请的各方面的范围，并且从而覆盖这些权利要求及其等价物的范围内的方法和结构。

将要理解的是，如果本文提及任何先有技术出版物，则这样的参考文献不构成承认出版物形成本领域普通常识的一部分。本申请引用的所有文件，或部分文件(包括，但不限于，专利、专利申请、文章、书籍、手册和论文)为了任何目的，通过引用以其整体明确结合到本文中。

本文的百分比通过相对于萃取物或指定产物的重量的重量来表示，除非另外指明。

本发明的其它方面和优点将在以下示例性的实验部分中公开。

实施例

1. 精制青黛萃取物的制备和用于分析的分析方法

实施例1：精制青黛萃取物的制备

用于以下制备的青黛购自Delong Pharmaceutical (靛青2.62%和靛玉红0.284% (在实施例8A中描述的HPLC方法)和色胺酮0.0046% (在实施例8B中描述的HPLC方法))。

使500g青黛悬浮于10L乙酸乙酯中。在回流中搅拌该混合物2小时，且接着于75℃过滤。在减压下浓缩滤液，得到黑色固体。将粗萃取物在250mL己烷中搅拌并加热至回流1小时。冷却至室温后，过滤悬浮液以得到黑色残留物(粗萃取物)。

将0.50g黑色残留物在25mL己烷中再次回流1小时，并冷却至室温，接着过滤以得到精制萃取物，为深红色固体452mg。HPLC: 62.9%靛玉红，12.9%靛青，和0.53%色胺酮。

实施例2：精制青黛萃取物的制备

将用于实施例1的500g青黛悬浮于10L醇(乙醇)中。在回流中搅拌该混合物2小时，且接着于75℃过滤。在减压下浓缩滤液，得到黑色固体，将其在260mL己烷中搅拌并加热至回流1小时。冷却至室温后，过滤悬浮液以得到黑色残留物。

使0.80g黑色残留物在24mL醇(乙醇)中回流另外1小时，然后冷却至室温，接着过滤以得到精制萃取物，为深红色固体(538mg)。HPLC: 83.6%靛玉红，6.35%靛青，和0.75%色胺酮。

实施例3：精制青黛萃取物的制备

将用于实施例1的500g青黛悬浮于10L乙酸乙酯中。在回流中搅拌该混合物2小时，接着趁热过滤。在减压下浓缩滤液，得到黑色固体。将粗萃取物在250mL己烷中搅拌并加热至回流1小时。冷却至室温后，过滤悬浮液以得到黑色残留物。

使0.75g黑色残留物在22.5mL乙醇中回流1小时，并冷却至室温，接着过滤以得到精制萃取物，为深红色固体(538mg)。HPLC: 77.9%靛玉红，15.9%靛青，和0.56%色胺酮。

实施例4：精制青黛萃取物的制备

将用于实施例1的500g青黛悬浮于2.1L DMF中。于50℃搅拌混合物40分钟。冷却至20℃后，过滤悬浮液。在减压下浓缩滤液，得到黑色固体，将其在130mL己烷中搅拌并加热至回流1小时。冷却至20℃后，过滤悬浮液以得到黑色残留物。

用46.8 ml乙醇洗涤1.56g黑色残留物，并加热至回流1小时，然后冷却至20℃，接着过滤，得到精制萃取物(766mg)。HPLC: 66.3%靛玉红，9.76%靛青。

实施例5：精制青黛萃取物的制备

将用于实施例1的500g青黛悬浮于3L DMF中。于30℃搅拌该混合物1小时，且接着过滤。在减压下浓缩滤液，得到黑色固体，将其在230mL己烷中搅拌并加热至回流1小时。冷却至20℃后，过滤悬浮液以得到黑色残留物。

用59mL 85%乙醇(85% aq.醇)洗涤1.96g黑色残留物，并加热至回流1小时，接着趁热过滤，得到精制萃取物(1.02g)。HPLC: 69.4%靛玉红，18.7%靛青，和0.62%色胺酮。

实施例6：精制青黛萃取物的制备

在回流条件下，用2L乙醇92% (92%含水乙醇)萃取100g青黛2小时。完成后，在AF6滤器(Buchner)上趁热过滤混合物，以获得作为滤液的深蓝-红色溶液。将这种滤液在真空下浓缩至干燥，得到2.4 g干燥残留物。这种残留物用120 mL己烷在回流下洗涤1h。完成后，将该混合物冷却至室温22h，然后在真空下过滤，得到312.9mg深红色精制萃取物。

280mg的这种精制萃取物用15 mL乙醇92% (92%含水乙醇)在回流下洗涤1h。完成后，使该溶液冷却至室温，且接着过滤，在烘箱(80℃)中干燥1h30后，得到159 mg深红色/深紫红色精制萃取物(0.18%)；HPLC: 82.31%靛玉红，8.99%靛青，和0.81%色胺酮。

实施例7：微粉化步骤

在先前实施例获得的精制青黛萃取物的微粉化步骤用以下设备进行：

- 微粉磨机：螺旋喷射式粉碎机Diameter 200

- 进料器：该设备被用于粉末剂量给微粉磨机进料。该剂量由两个螺杆制得。该系统允许有规律的流动。

微粉化包括以空气射流射出粉末微粒。微粒的接触使其炸裂。

在微粉化期间，记录微粉化的以下参数：

- 环压力：6巴

- 注射器压力：3巴

- 粉末进料速度：25 kg/h

微粉磨机允许为圆柱形外壳-外壳周围的孔用于空气注入。

粉末被导入微粉磨机；微粒由于空气射流被推进。当微粒具有良好的尺寸时，它们被集中在微粉磨机的中心且它们被吸出。为避免被异物颗粒或设备的破片的任何污染，执行另外的筛分(筛子：700 μm)。

该步骤在微粉化之后和包装之前手动进行。

获得的匀质产物的粒度分析根据粒度分布(PSD)方法进行[分析规格：D99 ≤ 30μm]。

实施例8：用于分析的分析方法

A –反相HPLC方法：

一种同时定量靛青和靛玉红的新的反相HPLC方法基于欧洲药典(PharmacopoeiaVol.20, No.1, 2008年1月, P118-119.)、中国药典(2010版, P185)和文献(Chen LW,Liao W, Yang M. Jia DY, He P, Chen SM, Fu CM. Determination of indigo andindirubin in Indigo Naturalis by HPLC. West China Journal of PharmaceuticalSciences, 2008, 23(6), 714-715；Liu ZY, Su ZT, Gao YN, Yang M. Simultaneouslydetermination of indigo and indirubin in Indigo Naturalis by HPLC. ChinaPharmacist 2010, 13(3), 324-326)建立。

色谱系统(Agilent 1200系列)由G1322A除气器、G1211A泵、G1367B自动取样器、G1316A柱式加热炉和G1315B DAD检测器组成。其它设备包括SK7200H超声波装置(中国)和Milli-Q水纯化系统(USA)。

6批青黛从中国的3个供应商收集。靛青标准品购自Tokyo Chemical IndustryCo. (日本, >98%)。色胺酮购自Accela Co. (中国, 97%)。靛玉红在HutchisonMedipharma (HMP)合成和重结晶(>99%，HPLC)。

有机滤膜(0.45μm, 中国)、二甲基甲酰胺(DMF, 分析级)、甲醇(HPLC级)、甲酸(FA, HPLC级)、三乙胺(TEA, 分析级)和用Milli-Q水纯化系统纯化的超纯水用于实验。

DMF溶液的预处理：用干燥N2吹入500 mL DMF中半小时，然后加入0.5 mL TEA并混合，得到DMF溶液(含有0.1%TEA, 无氧)。这种DMF溶液被用于样品制备。

使50mg青黛悬浮于50mL DMF溶液中。在超声萃取10min后，通过0.45µm注射器滤器过滤悬浮液，以生成青黛的试验溶液。

使20mg精制萃取物(获自实施例2)悬浮于200mL DMF溶液。在超声萃取后，通过0.45 µm注射器滤器过滤悬浮液，以生成萃取物的试验溶液。

在Waters Symmetry C18柱(5μm, 3.9×150mm)上执行分离。流动相为65%甲醇(含有0.05% FA)。流速是1.0mL/min，持续15min且柱温度是25℃。注射体积是4μL。检测波长是289nm，以致靛青和靛玉红可同时测定。靛青和靛玉红可在一次注射中同时分析。靛青和靛玉红的典型的HPLC色谱图示于图1中。

B - 定量色胺酮的HPLC分析方法：

一种定量色胺酮的新的HPLC分析方法也已建立。样品浓度由于在青黛及其富集产物，精制萃取物两者中的低浓度的色胺酮而相应调整。分析于25℃，在Waters Symmetry C18柱(5μm, 3.9×150mm)上进行。流动相为甲醇(含有0.05% FA, 洗脱液B)和水(含有0.05% FA,洗脱液A)。梯度洗脱模式如下：50% B等度(12min), 50%-100% B (1min), 100% B等度(6min)和100%-50% B (1min)。流速是1.0mL/min且柱温度是25℃。注射体积是10μL。检测波长是254nm。

使400mg青黛悬浮于20mL DMF溶液中。在超声萃取20min后，通过0.45 µm注射器滤器过滤悬浮液，以提供青黛的试验溶液。

使15mg精制萃取物(获自实施例2)悬浮于20mL DMF溶液中。在超声萃取后，通过0.45 µm注射器滤器过滤悬浮液，以提供精制萃取物的试验溶液。

色胺酮、青黛和精制萃取物的典型的HPLC色谱图示于图2中。

实施例9：精制青黛萃取物的长期稳定性

依据实施例6制备的精制青黛萃取物已接受稳定性条件。制备的萃取物的HPLC特征如下：80.16%靛玉红；10.95%靛青；0.64%色胺酮。

在稳定性研究期间采用的贮存条件是在气候室(Piardi CC1400)中25℃ ±2℃和60% RH ± 5% RH。

根据GUIDELINE ON QUALITY OF HERBAL MEDICINAL PRODUCTS (CPMP/QWP/2819/00 rev 01)，性质属性必须符合限制[限制：靛玉红的含量(%干燥萃取物) = 65.0-85.0；靛青的含量(%干燥萃取物) = 5.0-15.0；色胺酮的含量(%干燥萃取物) ≤.5.0]。

标记物的含量变化必须不超过初始测定值的± 10%。

结果示于以下表1中。

表1：

1个月、2个月和3个月的HPLC指纹符合T0的指纹色谱图。因此，性质属性符合限制。靛青、靛玉红和色胺酮的含量变化不超过初始测定值的±10%的可接受的范围。

因此，根据本发明制备的精制青黛萃取物可于25℃和60% RH下稳定至少6个月。

2.精制青黛萃取物在生物化学和细胞测定中的体外评价

实施例10：体外测定和结果

A. 一般试剂：

DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Cat. No. D2650 Janus激酶1(JAK1), Lifetechnologies^TM, Cat. No. PV4774 Janus激酶1(JAK2), Life technologies^TM, Cat.No. PV4210 Janus激酶1(JAK3), Life technologies^TM, Cat. No. PV3855 CDK1, Lifetechnologies^TM, Cat. No. PV3292 CDK2, Life technologies^TM, Cat. No. PV3267CDK5, Life technologies^TM, Cat. No. PV3000 Z'-LYTE®激酶测定试剂盒 - 酪氨酸6肽, Life technologies^TM, Cat. No. PV4122 Z'-LYTE®激酶测定试剂盒 - Ser/Thr 12肽, Life technologies^TM, Cat. No. PV3673 Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM), Lifetechnologies^TM, Cat. No. C11965 RMPI-1640, Life technologies^TM, Cat. No.A10491 胎牛血清(FBS), Life technologies^TM, Cat. No. 10099141 EpiLife ®Medium, Life technologies^TM, Cat. No. M-EPI-500-CA HKGS, Life technologies^TM,Cat. No. S-001-5 重组人IL-2, Peprotech Inc, Cat. No. 200-02 重组人IL-6,Peprotech Inc, Cat. No. 200-06

重组人IL-3, Peprotech Inc, Cat. No. 200-03

重组人GM-CSF, Peprotech Inc, Cat. No. 300-03

重组人IL-22, Peprotech Inc, Cat. No. 200-22 重组人TNFα, R&D, Cat. No.210-TA-010 脂多糖(LPS), Calbiochem, Cat. No. 437650 抗-人CD3功能级® Purified(aCD3) (克隆：OKT3) eBioscience, Cat. No. 16-0037-85 抗-人CD28功能级®Purified (aCD28) (克隆：CD28.2), eBioscience, Cat. No. 16-02897-85 磷酸-STAT3(Y705)抗体(兔-抗-人), Cell Signaling Technology, Cat. No. 9145 磷酸-STAT5(Y694)抗体(兔-抗-人), Cell Signaling Technology, Cat. No. 9359 肌动蛋白抗体(小鼠-抗-人) Sigma-Aldrich, Cat. No. A1978 山羊抗-兔IgGAlexa 488, Lifetechnologies^TM, Cat. No. A11034 山羊-抗-兔IROYE 800CW, Li-COR Bioscience, Cat.No. 926-32211 山羊-抗-小鼠IROYE 800CW, Li-COR Bioscience, Cat. No. 926-32210人IFNγ ELISA试剂盒, R&D, Cat. No. DY285 人TNFα ELISA试剂盒, R&D, Cat. No.DY210 人IL-1β ELISA试剂盒, R&D, Cat. No. DY201 人IL-6 ELISA试剂盒, R&D, Cat.No. DY206 噻唑基蓝四唑鎓蓝(MTT), Sigma-Aldrich, Cat. No. M2128 CellTiter-Glo®发光细胞存活测定, Promega, Cat. No. G7572 CytoTox-ONE™均质膜完整性测定,Promega, Cat. No. G7891 萤光素酶测定, Promega, Cat. No. E4550 iBlot®Transfer Stack, Regular (硝化纤维素), Life technologies^TM, Cat. No. IB3010-01碘化丙锭, Sigma-Aldrich, Cat. No. P4170 核糖核酸酶A, Sigma-Aldrich, Cat. No.R6513 1XPBS缓冲液(1L): NaCl 8.0g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄-12H₂O 3.58g, KH₂PO₄ 0.24g,溶于1L MilliQ ddH₂O, pH调整至7.4 1xSDS加样缓冲液：50 mM Tris-HCl/pH8.8, 2%SDS, 10%甘油, 0.1%溴酚蓝，100 mM DTT。

B. 细胞和细胞系

HepG2，人肝细胞癌细胞系，购自上海生命科学研究院(SIBS) (上海，中国, Cat. No.TCHu 72)，在含有10% FBS的DMEM中培养。

于37℃、5% CO₂下，将TF1，人红白血病细胞系，购自美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection) (ATCC) (Manassas, VA, Cat. No. CRL-2003™)，在含有10% FBS和2ng/mL GM-CSF的RMPI-1640中培养。

PBMC：在肝素化管中收集来自健康成人供体的正常人血样。每个独立的实验使用来自单个健康供体的血液。单核细胞(PBMC)依据生产商建议的方案，使用Ficoll-PaquePlus试剂(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden, Cat. No. 17-1440-02)分离，并于37℃、5% CO₂下，在含有10% FBS的RMPI-1640中培养。

原代T细胞：单核细胞(PBMC)依据生产商建议的方案，使用Ficoll-Paque Plus试剂(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden, Cat. No. 17-1440-02)分离。然后细胞通过使用抗-CD3 (1µg/mL)和抗-CD28 (5µg/mL)激活3天，并在进行实验之前，于37℃、5% CO₂下，每2-3天在含有10% FBS和10ng/mL IL-2的RMPI-1640中扩增，持续2周。

HaCaT，一种人表皮角质化细胞系(得自第二军医大学(The Second MilitaryMedical University) (SMMU), 中国)，在含有10% FBS的DMEM中培养。

HEKa，从成人皮肤分离的人表皮角质化细胞，购自Life technologies^TM(Carlsbad, CA, USA, Cat. No. C-005-5C)，并于37℃、5% CO₂下，在含有HKGS的EpiLife®培养基中培养。

293/NFkB-Luc细胞系购自Panomics (Fremont, CA, Cat. No. RC0014)。其通过用pNFĸB-Luc和pHyg共转染至人胚胎肾293细胞中，接着由潮霉素选择而获得。细胞在含有10% FBS和100µg/mL潮霉素B (Life technologies^TM, Cat. No. 10687-010)的DMEM中培养。

C. 激酶测定

JAK1/2/3激酶测定使用重组人JAK1/2/3和Z'-LYTE®激酶测定试剂盒-酪氨酸6肽在体外进行。CDK1/2/5激酶测定使用重组人CDK1/2/5和Z'-LYTE®激酶测定试剂盒-Ser/Thr 12肽在体外进行。所有反应(20µL)通过加入在4% DMSO溶液中的2.5µL阳性对照品(CP-690550，用于JAK激酶测定，而星孢菌素(Staurosporine)用于CDK激酶测定)或试验物品(即，样品)、5µL激酶/肽底物混合物或磷酸-肽溶液、2.5µL ATP溶液(100µM)或1.33 x激酶缓冲液启动。混合384-孔测定板(Corning, Cat. No. 3575)并在室温孵育1小时。然后将5µL的显色溶液加入各孔，混合并在室温下孵育另外1小时。然后通过加入5µL终止试剂停止激酶反应，接着使用Perkin-Elmer Victor III (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston,MA)板读出仪记录450nm和520nm的荧光。

D. Acumen测定

对于IL-6诱发的STAT3磷酸化，将HepG2以每孔5.4x10³个细胞接种到96孔板中，在无血清DMEM培养基中于37℃, 5% CO₂下过夜。在与CP-690550或试验物品孵育30分钟后，通过加入100ng/mL人重组IL-6 (1:10)至各孔刺激细胞15分钟。

对于IL-3诱发的STAT5磷酸化，于37℃、5% CO₂，将TF-1以每孔1x10⁴个细胞接种于96-孔板3小时。在与CP-690550或试验物品孵育30分钟后，通过加入100ng/mL人重组IL-3(1:10)至各孔刺激细胞30分钟。

然后于室温下，将HepG2或TF1细胞在2%多聚甲醛中固定45分钟并在冰冷的甲醇中孵育30分钟。用PBS洗涤后，将细胞分别用抗-磷酸-STAT3 (Y705)或抗-磷酸-STAT5 (Y694)抗体于4℃下孵育过夜。加入山羊抗-兔IgG Alexa 488第二抗体90分钟，然后PBS洗涤。在含有7.5µM碘化丙锭和100µg/mL核糖核酸酶A的PBS中，在黑暗中孵育60分钟后，对细胞计数。在Acumen X3仪器(TPP Labtech, Hertfordshire SG8, UK)上读板。

E. 蛋白质印迹法

于37℃、5% CO₂下，将HEKa以2x10⁵个细胞/孔接种到6-孔板过夜。与试验物品一起孵育30分钟后，用100ng/mL IL-22刺激细胞30分钟。

处理后，在1xSDS加样缓冲液中收集样品。煮沸蛋白样品15分钟并于4℃以14,000离心10 min收集。使用上清液或于-80℃立即贮存。对于蛋白质印迹法分析，样品在10%Tris-HCL梯度电泳凝胶(Bio-Rad Laboratories)上分离。将凝胶印迹至iBlot® TransferStack, Regular (硝化纤维素)上，后者以5%脱脂奶粉封闭，且于4℃分别用抗-磷酸-STAT3(Y705)抗体或抗-肌动蛋白抗体探测过夜。然后将膜与适当的IDRye 800CW第二抗体一起孵育，接着使用Odyssey红外成像系统(Li-COR Bioscience, Lincoln, NE, USA)检测。

F. 报道基因测定

对于报道基因测定，将293/NFĸB-Luc以每孔4x10⁴个细胞接种于96-孔板过夜。在与穿心莲内酯(LGT)或试验物品一起孵育30分钟后，通过加入100ng/mL TNFα (1:10)至各孔刺激细胞6小时。细胞溶胞产物通过除去培养基并加入裂解缓冲液制备。将5x体积的萤光素酶测定试剂加入各孔，然后读板。使用Perkin-Elmer Victor III板读出仪(Perkin-ElmerLife Sciences, Boston, MA, USA)记录发光。

G. ELISA测定

原代T细胞以8x10⁴个细胞/孔接种于96-孔板。将试验物品加入到培养物中并于37℃、5% CO₂下孵育。30分钟后，将各孔中的细胞悬浮液转移至另一个用CD3 (1µg/mL)和CD28 (5µg/mL)包被的96-孔板中，并于37℃、5% CO₂下孵育22小时。除去培养基并于-80℃贮存直至被测定。按照制造商的指示，使用市售的ELISA试剂盒(R & D Systems)测定IFNγ浓度。

将PBMC以每孔3x10⁴个细胞接种到96-孔板。然后将试验物品加入培养物中并于37℃、5% CO₂下孵育。30分钟后，将1µg/mL LPS (1:10)加入培养物中。为了定量蛋白水平，将板孵育18小时。除去培养基并于-80℃贮存直至被测定。按照制造商的指示，使用市售的ELISA试剂盒(R & D Systems)测定TNFα、IL-1β和IL-6浓度。

H. MTT测定

将HaCaT以4x10⁴个细胞/孔接种到96-孔板过夜。然后将星孢菌素或试验物品加入培养物中并于37℃、5% CO₂孵育72小时。除去培养基后，使在96-孔板中的细胞暴露于100µL MTT(每孔0.5mg/mL，在含有10% FBS的DMEM中)，并于37℃、5% CO₂下孵育3小时。随后，移去上清液并将150µL DMSO加入各孔。在暗处孵育板10分钟并立即使用Multiskan MK3微板读出仪(Thermo Life Sciences, HK, 中国)记录在492 nm的吸光度。

I. 细胞存活测定

CellTiter-Glo®发光细胞存活测定试剂盒被用来研究细胞存活。将HEKa以1x10⁴个细胞/孔接种到96-孔不透明壁板过夜。然后将地蒽酚或试验物品加入培养物中并于37℃、5%CO₂下孵育48小时。用等于在各孔中存在的细胞培养基的体积的CellTiter-Glo®试剂裂解细胞，并混合内含物2分钟以诱导细胞裂解。在室温下孵育板10分钟以稳定发光信号。使用Perkin-ElmerVictor III板读出仪(Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA)记录发光。

J. LDH释放测定

乳酸脱氢酶(LDH)释放测定试剂盒被用来研究细胞毒性。将HEKa以4x10⁴个细胞/孔接种到96-孔不透明壁板过夜。然后将地蒽酚或试验物品加入培养物中并于37℃、5% CO₂下孵育24小时。制备上清液和细胞溶胞产物。将等于上清液或细胞溶胞产物体积的1x体积的CytoTox-ONE™试剂加入各孔，接着混合30秒并于25℃孵育10分钟。将等于上清液或细胞溶胞产物的50%体积的终止溶液加入各孔以终止反应，并使用SpectraMax M2 (MolecularDevices, Sunnyvale, CAL, USA)记录具有560nm的激发波长和590nm的发射波长的荧光。

K. TNFα-诱导的NFκB激活

促炎细胞因子和趋化因子在牛皮癣的发病机理中起着重要作用。NFκB清楚地为促炎细胞因子和趋化因子基因表达的最重要的调节子之一。因此，青黛(Qing Dai)及其精制萃取物对TNFα-依赖的NFκB激活的抑制效力在HEK 293/NFκB-Luc中研究。如于表1中所示，TNFα刺激NFκB-依赖的萤光素酶表达和用雷公藤糖苷(Tripterygium Glycoside)预处理细胞以浓度依赖性方式阻断NFκB激活。青黛精制萃取物在实验条件下对TNFα-依赖的NFκB激活具有微克/g活性(见表1)。

L. IC ₅₀ 测定

所有的IC₅₀值通过使用得自ID Business Solutions (Guildford, UK)的Xlfit™软件(2.0版本)测定。背景在仅用DMSO处理的细胞的培养物中定义，并对于IC₅₀的计算将其减去。

M. 结果

青黛精制萃取物的一些体外测定结果示于下表2中，其中青黛A获自DelongPharmaceutical: (靛青2.62%、靛玉红0.284%；色胺酮0.0046%)。

表2

** 青黛A：来自Delong Pharmaceutical的青黛：靛青2.62%、靛玉红0.284%；色胺酮0.0046%

3.精制青黛萃取物在动物模型中的体内评价

实施例11：体内测定和结果

A. 材料和方法

动物

BABL/c小鼠，雄性，体重19~22g，购自上海SLC动物中心室温：24±1℃ 室内相对湿度：40-70% 光循环：12-小时光照(8:00-20:00) 12-小时黑暗的荧光灯动物收养：4只小鼠/笼食物：自由接近食物(经照射，Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd., 中国) 水：自由接近当地供应的自来水(首先通过Molanimal超纯水处理机自市政府自来水过滤)

仪器

MJ Research PTC-200 Peltie热循环仪(Alpha UnitTM Block Assembly，用于PTCDNA EngineTM Systems) Applied BioSystems 7500实时PCR系统数显千分卡尺：Mitutoyo, 日本。精度：0.001mm

试剂

重组小鼠IL-22 (rmIL-22), Novoprotein (sinobio), Cat. C047, Lot. 0375351高容量cDNA逆转录试剂盒, Applied BioSystems, Part no.：4368813, Lot：0909069Thermo Scientific ABsolute SYBR Green Rox Mix, Thermo Scientific, Cat: AB-1163/A, Lot：0911/16

阳性对照

Protopic® (他克莫司, FK506), 0.1%软膏剂, Astellas Toyama Co., Ltd.Toyama Plant，H20100079, Lot：028680。

剂量方案

在诱发模型后1小时，将不同的浓度的试验样品、媒介，或0.1% FK506软膏剂以1%局部给予，然后从第1天至第11天每天给予，每天两次。给予试验物品的第一天被视为第0天。

给药途径

局部应用，b.i.d。

IL-22诱发的牛皮癣-样小鼠模型的建立

将20µL PBS，单独或者含有100或500ng重组小鼠IL-22 (eBiosience)，使用30-号针，每隔一天皮内注射给予麻醉小鼠的耳朵，持续11天。在第0天注射之前和此后没有注射的天数，测量耳的厚度。耳部测量在耳朵的中部使用数显千分卡尺(Mitutoyo)进行。

在最后IL-22处理后24小时，处死小鼠，并收集耳朵供进一步的分析。

组织学检查

在尸体解剖时收集耳朵，在10%缓冲的福尔马林磷酸盐中固定，以石蜡包埋，切片，并用苏木精/伊红(H&E)染色。显微镜切片通过损伤的数量和严重性分级。

统计方法

耳部厚度数据的结果表示为均值 ± S.E.M。耳部肿胀的AUC用从第0天至第11天的耳部厚度数据计算，并用JMP®软件通过重复-测量的ANOVA方法分析。细胞因子蛋白和基因表达数据用单向ANOVA评估，接着student’s t-检验用于事后分析(显著性水平设定为p <0.05)。

分组和剂量

见图3。

结果

一些青黛精制萃取物的一些体内测定结果示于表3。

表3

*青黛B：来自Qingfeng Pharmaceutical的青黛：靛青2.02%、靛玉红0.216%；色胺酮0.0032%。

Claims

1. 一种用于从青黛或从选自木蓝(Indigofera tinctoria L.)、马蓝(Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek (syn. Strobilanthes cusia (Nees))、蓼蓝(Persicaria tinctoria (Aiton) Spach. (syn. Polygonum tinctorium Aiton, P.tinctorium Lour.))和菘蓝(Isatis tinctoria L. (syn. Isatis indigotica Fort.))的一种或多种含靛青植物的叶子和/或茎制备精制萃取物的方法，其包括以下步骤：

a) 萃取步骤：用极性溶剂或中度极性溶剂萃取青黛或所述植物的叶子和/或茎，以获得萃取混合物，

b) 过滤步骤：过滤萃取混合物，以获得滤液，

c) 浓缩步骤：浓缩该滤液，以获得粗萃取物，

d) 洗涤步骤：用非-极性溶剂和任选地用第二极性溶剂洗涤粗萃取物，以获得洗涤混合物，和

e) 过滤步骤：过滤洗涤混合物，任选地在干燥步骤后获得精制萃取物。

2.权利要求1的方法，其中用于萃取步骤a)的溶剂选自二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、乙醇、二甲亚砜、二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基乙酰胺、丙酮、2-丁酮、乙腈、乙酸异丙酯、2-甲基四氢呋喃、甲基叔丁基醚、水、甲醇、氯仿、萜及其组合。

3.权利要求1或2的方法，其中用于萃取步骤a)的溶剂是有机溶剂，优选地选自二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、乙醇、二甲亚砜、二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基乙酰胺、丙酮、2-丁酮、乙腈、乙酸异丙酯、2-甲基四氢呋喃、甲基叔丁基醚、甲醇、氯仿、萜及其组合。

4.前述权利要求的任一项的方法，其中用于洗涤步骤d)的溶剂选自水、具有5-8个碳原子的烷烃、具有2-6个碳原子的醇及其组合。

5.前述权利要求的任一项的方法，其中洗涤步骤d)和过滤步骤e)执行至少一个循环，直至获得精制萃取物。

6.前述权利要求的任一项的方法，其中洗涤步骤d)和过滤步骤e)执行两个循环。

7.前述权利要求的任一项的方法，其中用于萃取步骤a)的溶剂是乙醇或含水乙醇，用于洗涤步骤d)的溶剂选自己烷、庚烷、水、乙醇及其组合，优选地，用于洗涤步骤d)的溶剂是己烷。

8.前述权利要求的任一项的方法，其中非-极性溶剂和第二极性溶剂被用于洗涤步骤d)，且它们优选地分别为己烷和乙醇。

9.一种由前述权利要求的任一项的方法获得的精制萃取物。

10.一种精制萃取物，其包含作为组分的靛玉红，且任选地包含靛青、色胺酮和青黛酮的一种或多种。

11. 一种精制萃取物，其包含作为组分的靛玉红，其量为精制萃取物的至少65% (w/w)，优选地为精制萃取物的65-90% (w/w)。

12. 权利要求10或11的任一项的精制萃取物，其还包含作为组分的靛青，优选其量为精制萃取物的0.1-15% (w/w)。

13. 权利要求10-12的任一项的精制萃取物，其还包含作为组分的色胺酮，优选其量为精制萃取物的0.1-5% (w/w)。

14. 权利要求10-13的任一项的精制萃取物，其还包含作为组分的青黛酮，优选其量为精制萃取物的0.1-5% (w/w)。

15. 权利要求10-14的任一项的精制萃取物，其中靛玉红、靛青、色胺酮和青黛酮的两种或更多种组分的量为精制萃取物的90%-99% (w/w)。

16.一种药用组合物，其包含权利要求10-15的任一项的精制萃取物和药学上可接受的载体。

17.依据权利要求10-15的任一项的精制萃取物，其用于抑制角质化细胞的增殖或分化，或抑制单核细胞浸润至真皮和表皮，或抑制导致增生血管的血管变化，或抑制内皮细胞上的粘附分子的上调。

18.依据权利要求17使用的精制萃取物，其用于治疗选自牛皮癣、炎性皮肤病况、甲真菌病、皮肤癌、异常角质化诱导的疾病、皮肤老化、脓疱性皮肤病和CTCL的疾病或病况。