JP2018510890A - インジゴ・ナチュラリス由来のエキス及びそれを調製する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、インジゴ・ナチュラリス等の1種又は複数種の植物原料からエキスを調製する方法、及びエキス自体に関する。本発明はまた、エキスを含む組成物、並びに医学又は化粧用途における組成物の使用に関する。

Description

本発明は、インジゴ・ナチュラリス(Indigo Naturalis)等の1種又は複数種の植物原料からエキスを調製する方法、及びそのエキス自体に関する。本発明はまた、エキスを含む組成物、並びに医学又は化粧用途における組成物の使用に関する。
乾癬のための従来の処置は、一般に、患者の年齢、性別、職業及び認知能力、病変の種類及び分布、過去の治療方法に対する患者の応答、並びに患者の他の病歴に従って設計される。乾癬のための主な治療方法には、局所治療、全身治療、生物製剤の注射及び光線治療が含まれる。局所治療のための組成物には、例えば、コルチコステロイド、アンスラリン(Margiton(登録商標)として利用可能)、コールタール(Polytar(登録商標)として利用可能)、カルシトリオール(Silkis(登録商標)として利用可能)、タザロテン(Tazorac(登録商標)として利用可能)、サリチル酸が含まれ、これらの組成物は、穏やかな症状を有する乾癬患者を処置するのに適している。例えば、メトトレキサート(MTX)、シクロスポリン及びレチノイドの経口製剤は、一般に、全身治療のために使用され、中程度から重症の症状を有する乾癬患者を処置するのに適している。生物製剤には、アレファセプト(Amevive(登録商標)として利用可能)、エファリズマブ(Raptiva(登録商標)として利用可能)、エタネルセプト(Enbrel(登録商標)として利用可能)及びアダリムマブ(Humira(登録商標)として利用可能)が含まれ、それらは、中程度から重症の症状を有する乾癬患者に注射するのに適している。光線治療、例えば紫外線B(UVB)光線治療、光化学治療、例えばソラレンと紫外線A(PUVA)は、重症の症状を有する乾癬患者を処置するのに適している。
しかし、更なる治療方法があることが望ましい。
欧州薬局方(Pharmeuropa Vol.20、No.1、2008年1月、118〜119頁) 中国薬局方(2010年度版、185頁) Chen LW、Liao W、Yang M. Jia DY、He P、Chen SM、Fu CM. Determination of indigo and indirubin in Indigo Naturalis by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences、2008年、23(6)、714〜715頁 Liu ZY、Su ZT、Gao YN、Yang M. Simultaneously determination of indigo and indirubin in Indigo Naturalis by HPLC. China Pharmacist 2010年、13(3)、324〜326頁
インジゴ・ナチュラリス、例えば青黛(Qingdai)は、インジゴ含有植物又はインジゴ生成植物の葉から調製された暗青色の粉末である。前記植物は、好ましくは、タイワンコマツナギ(Indigofera tinctoria L.)、リュウキュウアイ(Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek)(別名Strobilanthes cusia (Nees))、タデアイ(Persicaria tinctoria (Aiton) Spach.)(別名Polygonum tinctorium Aiton、P. tinctorium Lour.)及びタイセイ(Isatis tinctoria L.)(別名Isatis indigotica Fort.)からなる群から選択される。
インジゴ・ナチュラリス又は青黛の使用に伴って遭遇する欠点の1つは、それが皮膚上に暗色をもたらし、衣類上に染みを残すことである。青黛は、インジゴ・ナチュラリスの現在の名称である。これは、インジゴ含有又はインジゴ生成植物からNaOH又はKOH水溶液を用いて抽出され、インジゴ及びインジルビンが存在するアルカロイドを含む約5〜15%の有機化合物と、炭酸カルシウム及び水酸化カルシウム等の85〜95%の無機化合物の混合物に相当する。
別の欠点は、従来、インジゴ・ナチュラリス生成物においてインジゴ及びインジルビンだけが制御されることでありうる。
したがって、インジゴ・ナチュラリス由来、又はインジゴ含有若しくはインジゴ生成植物由来のエキスを、市場性のある薬物に開発して、インジゴ・ナチュラリスよりも色が薄いエキスを得、特徴付け、このようなエキスの成分の大部分を制御する必要性が、まだ満たされていない。より具体的には、色が薄いエキスを提供すると同時に、乾癬等の皮膚疾患又は障害の処置又は軽減のためにその有効性を維持又は増大することが、有利となるはずである。
本発明は、インジゴ・ナチュラリス又は青黛由来の活性な成分を保持する取り扱いやすい精製エキスを提供して、臨床的な有効性及び安全性を確保することによって、この問題を解決する。
本発明は、一つには、乾癬等の皮膚疾患又は障害の処置又は軽減のための、インジゴ・ナチュラリス由来、例えば青黛由来の、例えばインジルビン及びインジゴを含有するエキスを得る方法に取り組む。
一態様では、本発明は、インジゴ・ナチュラリス等の1種若しくは複数の植物原料、又は好ましくはタイワンコマツナギ、リュウキュウアイ(別名Strobilanthes cusia (Nees))、タデアイ(別名Polygonum tinctorium Aiton、P. tinctorium Lour.)及びタイセイ(別名Isatis indigotica Fort.)からなる群から選択される1種若しくは複数のインジゴ含有植物若しくはインジゴ生成植物の葉及び/若しくは茎から、エキスを調製する方法を提供する。この方法は、以下の工程：
a)抽出工程：インジゴ・ナチュラリス、又は上記で選択された1種若しくは複数の植物の葉及び/若しくは茎を、第1の極性溶媒又は中程度の極性溶媒で抽出して、抽出混合物を得る工程、
b)濾過工程：抽出混合物を濾過して、濾液を得る工程、
c)濃縮工程：濾液を濃縮して、粗製エキスを得る工程、
d)洗浄工程：粗製エキスを、無極性溶媒、及び任意選択により第2の極性溶媒で洗浄して、洗浄混合物を得る工程、並びに
e)濾過工程：洗浄混合物を濾過して、任意選択により例えば従来の乾燥方法による乾燥工程後に、精製エキスを得る工程
を含む。
本発明による方法では、精製エキスを得ることができ、このような精製エキスは、以下に定義される通りである。以下の説明では、用語「植物原料」は、インジゴ・ナチュラリス(例えば、市販の青黛)、又は好ましくはタイワンコマツナギ、リュウキュウアイ(別名Strobilanthes cusia (Nees))、タデアイ(別名Polygonum tinctorium Aiton、P. tinctorium Lour.)及びタイセイ(別名Isatis indigotica Fort)からなる群から選択されるインジゴ含有植物若しくはインジゴ生成植物の葉及び/若しくは茎を指し、これらは、収穫及び採取後に、例えば発酵によって処理することができる。
一部の実施形態では、抽出工程a)で使用される溶媒には、ジメチルホルムアミド(DMF)、酢酸エチル、エタノール(例えば85%エタノール等の水性エタノールを含む)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジクロロメタン(DCM)、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルアセトアミド(DMA)、アセトン、2-ブタノン、アセトニトリル、酢酸イソプロピル、2-メチルテトラヒドロフラン(MeTHF)、メチルtert-ブチルエーテル、水、メタノール、クロロホルム、テルペン(リモネン、p-シメン(cimene)等)、又はそれらの組合せが含まれうるが、それらに限定されない。好ましくは、溶媒は、酢酸エチル、MeTHF、エタノール又は水性エタノールでありうる。
更に、抽出工程a)は、1：5〜1：150(g/mL)の範囲、例えば1：5〜1：100の範囲、例えば1：6、1：15、1：20、1：30、1：50、1：100の植物原料の溶媒に対する比(すなわち、抽出される材料のグラムの溶媒のmLに対する比)で実施されうる。
特定の一実施形態では、抽出工程a)で使用される溶媒は、有機溶媒である。より好ましくは、溶媒は、ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジメチルアセトアミド、アセトン、2-ブタノン、アセトニトリル、酢酸イソプロピル、2-メチルテトラヒドロフラン、メチルtert-ブチルエーテル、メタノール、クロロホルム、テルペン及びそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、抽出工程a)は、濾過工程b)で濾過された残りの植物原料においてインジルビン含量(%w/w)が、実施例8Aに開示のHPLC方法によって測定して0.10%未満になるまで反復することができる。
他の一部の実施形態では、抽出工程a)は、例えば還流するまで加熱することによって実施される。
抽出工程a)の後、濾過工程b)を実施し、次に濾液を濃縮するための濃縮工程c)を実施して、粗製エキスを提供する。濾過工程b)は、熱い状態で実施することができる。
一部の実施形態では、洗浄工程d)は、精製エキス中のインジルビンの量(%w/w)が、実施例8Aに開示のHPLC方法によって測定して少なくとも55%(w/w)になるまで反復することができる。
一部の実施形態では、洗浄工程d)で使用される溶媒は、水、5〜8個の炭素原子を有するアルカン、2〜6個の炭素原子を有するアルコール及びそれらの組合せを含む群から選択される。例えば、溶媒には、ヘキサン、ヘプタン、エタノール、水又はそれらの組合せが含まれるが、それらに限定されない。例えば、洗浄工程d)において、2種以上の溶媒が使用される場合、ヘキサン又はヘプタン、及び水性エタノールが、順次又は同時に使用される。
一実施形態によれば、工程d)で使用される無極性溶媒は、ヘキサンである。
別の特定の実施形態によれば、工程d)は、無極性溶媒及び第2の極性溶媒を用いて実施される。好ましくは、第2の極性溶媒は、エタノールである。より好ましくは、工程d)で使用される無極性溶媒は、ヘキサンであり、第2の極性溶媒は、エタノールである。
他の一部の実施形態では、濃縮工程c)から得られた粗製エキスは、精製エキスが得られるまで以下の手順に少なくとも1サイクル供される。粗製エキスを、溶媒によって洗浄し(工程d))、濾過して(工程e))、精製エキスを得、その後、任意選択により乾燥工程を実施する。特定の一実施形態によれば、洗浄工程d)及び濾過工程e)は、1サイクルのみ実施され、精製エキスを得る。2つ以上のサイクルが適用される場合、洗浄のために同じ又は異なる溶媒を使用することができる。更に、粗製エキスを、溶媒を用いて還流状態で洗浄することができ、混合物を室温に冷却し、次に濾過して精製エキスを得、その後、任意選択により乾燥工程を実施することができる。
好ましい一実施形態では、2サイクルが実施される。特に、濃縮工程c)によって得られた粗製エキスを、無極性溶媒、好ましくはヘキサンで洗浄し(工程d)、濾過し(工程e)、その後、任意選択により乾燥工程を実施する。次に、ヘキサンエキスを、有機極性溶媒、好ましくはエタノールによって洗浄し(工程d)、次に濾過して(工程e)、精製エキスを得、その後、任意選択により乾燥工程を実施する。
任意選択により、微粒子化工程は、工程e)の後に実施し、それによって25〜35μm、好ましくは約30μmの粒径を有する精製エキスを提供する。
別の好ましい実施形態では、精製エキスが最終工程で微粒子化される場合、得られた粒子の99%は、30μm以下である。
別の態様では、本発明は、インジゴ・ナチュラリス由来の精製エキスを提供する。
本発明はまた、成分としてのインジルビンを、精製エキスの少なくとも55%(w/w)の量で含有する精製エキスを提供する。一部の実施形態では、インジルビンは、精製エキスの少なくとも60%、65%、70%、75%、80%又は85%(w/w)の量で存在する。例えば、インジルビンは、精製エキスの55〜90%(w/w)の量、例えば精製エキスの55〜60%、55〜65%、55〜70%、55〜75%、55〜80%、55〜85%、55〜90%、60〜65%、60〜70%、60〜75%、60〜80%、60〜85%、60〜90%、65〜70%、65〜75%、65〜80%、65〜85%、65〜90%、70〜75%、70〜80%、70〜85%、70〜90%、75〜80%、75〜85%、75〜90%、80〜85%、80〜90%、又は85〜90%(w/w)の量であってよい。
好ましくは、本発明は、成分としてのインジルビンを、精製エキスの少なくとも65%(w/w)の量で含有する精製エキスを提供する。
好ましくは、インジルビンは、精製エキスの65〜90%(w/w)の量である。
一部の実施形態では、精製エキスは、インジゴを成分として含有する。インジゴは、精製エキスの0〜15%(w/w)の量、例えば精製エキスの0.1〜15%、0.5〜15%、1〜15%、2〜15%、又は3〜15%(w/w)の量であってよい。
他の一部の実施形態では、精製エキスは、トリプタントリン(tryptanthrin)を成分として更に含有する。トリプタントリンは、精製エキスの0.01〜5%又は好ましくは0.1〜5%(w/w)の量、例えば精製エキスの0.01〜1%、0.05〜1%、0.1〜1%、0.1〜5%、0.5〜1%、又は0.5〜5%(w/w)の量であってよい。
更なる一部の実施形態では、精製エキスは、チンダイノン(qingdainone)を成分として更に含有する。チンダイノンは、精製エキスの0.1〜5%(w/w)の量、例えば精製エキスの0.1〜1%、0.1〜5%、0.5〜1%、又は0.5〜5%(w/w)の量であってよい。
更なる一部の他の実施形態では、精製エキスにおいて、2つ以上の前述のものを含む特徴的な成分は、精製エキスの少なくとも60%(w/w)、例えば65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%(w/w)、好ましくは少なくとも90%(w/w)となる。2つ以上の前述のものを含む特徴的な成分は、精製エキスの60〜99%(w/w)の量、例えば60〜95%、65〜95%、70〜95%、80〜95%、85〜95%、90〜95%、60〜99%、65〜99%、70〜99%、80〜99%、85〜99%又は90〜99%(w/w)の量、好ましくは90〜99%(w/w)の量である。
更なる別の態様では、本発明は、前述の精製エキス、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。組成物は、局所又は経口投与の形態である。
更なる別の態様では、本発明は、前述の精製エキス、及び化粧的に許容される担体を含む化粧用組成物を提供する。組成物は、局所投与の形態である。
更に別の態様では、本発明は、ケラチノサイトの増殖若しくは分化を阻害し、真皮及び上皮への単核細胞の浸潤を阻害し、過形成性血管をもたらす血管変化を阻害し、又は内皮細胞に対する接着分子の上方調節を阻害するための医薬又は化粧用組成物の調製における精製エキスの使用を提供する。この使用は、前述の組成物を、それを必要とする対象(例えばヒト)に投与することを含む。
更なる別の態様では、本発明は、乾癬、炎症性皮膚状態、爪甲真菌症、皮膚がん、異常角質化誘発性疾患、皮膚老化、膿疱性皮膚症、及び皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)からなる群から選択される皮膚疾患又は状態を処置又は軽減するための前述の組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、ケラチノサイトの増殖若しくは分化を阻害し、真皮及び上皮への単核細胞の浸潤を阻害し、過形成性血管をもたらす血管変化を阻害し、又は内皮細胞に対する接着分子の上方調節を阻害する方法であって、本発明の精製エキスを、それを必要とする細胞と接触させる工程を含む方法を提供する。この方法は、インビトロ又はインビボで適用されうる。
また更なる別の態様では、本発明は、皮膚疾患又は状態を処置する方法であって、有効量の本発明による精製エキスを、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。疾患又は状態は、乾癬、炎症性皮膚状態、爪甲真菌症、皮膚がん、異常角質化誘発性疾患、皮膚老化、膿疱性皮膚症及びCTCLからなる群から選択される。
一部の実施形態では、炎症性皮膚状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹又は重感染皮膚でありうる。皮膚老化(aging)は、皮膚の若返り法、瘢痕又は皮膚老化のための組織再生でありうる。異常角質化は、座瘡、魚鱗癬(ichtyosis)又は手掌角皮症でありうる。皮膚がんは、前がん性皮膚がん、例えば光線角化症(AK)、ボーエン病、皮膚がん、例えばSCC、BCC、NMSC、黒色腫及びHPV誘発性皮膚がんでありうる。
本発明の先の及び他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の図を参照することによって明らかとなろう。
インジゴ(A)及びインジルビン(B)の例示的なHPLCクロマトグラムである。 トリプタントリン(thryptanthrin)の例示的なHPLCクロマトグラム(A)及び青黛の例示的なHPLCクロマトグラム(B)である。 実施例2の精製エキスの例示的なHPLCクロマトグラム(C)である。 IL-22誘発性乾癬モデルにおける青黛由来のエキスのインビボ評価のための群及び投与を示す図である。5種の研究を設計し、それぞれ研究1〜5に概説した。研究1では、生理食塩水20μL中100ng及び500ngのIL-22、i.d.を、誘発のために使用した。研究2〜5では、生理食塩水20μL中500ngのIL-22、i.d.を、誘発のために使用した。 IL-22の皮内注射後の耳の炎症を示すグラフ及び図である。この研究では、マウスの耳に皮内注射し、注射と注射の合間の日に、耳の厚さを測定した。 IL-22を皮内注射した後の、耳の炎症に対する青黛由来のエキスの効果を示すグラフである。
本明細書で使用される場合、インジルビン、インジゴ、トリプタントリン、及びチンダイノンは、文献に言及されている通りの式を有し、より具体的には以下の構造を有する。
「極性溶媒」は、高い比誘電率及び高い双極子モーメントを有する溶媒を指し、その例として、水、アルコール、例えば2〜6個の炭素原子を有するアルコール(例えばエタノール)、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド(dimethylfomamide)(DMF)、及びジメチルスルホキシド(DMSO)が挙げられる。
「中程度の極性溶媒」は、中程度に高い比誘電率を有する溶媒を指し、その例として、酢酸エチル、ジクロロメタン(DCM)、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルアセトアミド(DMA)、アセトン、2-ブタノン、酢酸イソプロピル、1,4-ジオキサン、2-メチルテトラヒドロフラン(MeTHF)、メチルtert-ブチルエーテル(MTBE)が挙げられる。
「無極性溶媒」は、低い比誘電率を有する溶媒を指し、その例として、ジエチルエーテル、石油エーテル(PE)、トルエン及び5〜8個の炭素原子を有するアルカン、例えばヘプタン、ヘキサン、ペンタン又はシクロヘキサンが挙げられる。
「室温」は、18℃〜35℃を指す。
用語「乾癬」又は「乾癬疾患」は、当業者に周知のあらゆる種類の乾癬を指す。それには、慢性尋常性乾癬、滴状乾癬、乾癬性紅皮症、膿疱性乾癬、逆位乾癬(inverse psoriasis)(屈曲部乾癬(flexural psoriasis)としても公知)、爪乾癬、乾癬性関節炎が含まれるが、それらに限定されない。
用語「精製エキス」は、前記精製エキスを調製する方法で使用される水及び/又は溶媒を10%(w/w)未満含有する、固体、半固体又は油性エキス、好ましくは固体エキスを指す。精製エキスは、より好ましくは、インジゴ、インジルビン、トリプタントリン、及び/又はチンダイノンが存在し、好ましくは青黛又はインジゴ・ナチュラリスと比較してインジルビンが豊富なアルカロイドを含む活性成分の量が多いことによって特徴付けられる。より具体的には、本発明による精製エキスは、インジゴ、インジルビン、トリプタントリン、及び/又はチンダイノンを含む活性成分を、少なくとも60%(w/w)、又はより好ましくは70%(w/w)を超えて含む。
用語「粗製エキス」は、本明細書で使用される場合、精製エキスを調製する方法で使用される水及び/又は溶媒を15%(w/w)未満(例えば5〜15%、5〜10%)含有する、固体、半固体又は油性エキス、好ましくは固体、半固体エキスを指す。粗製エキスは、精製エキスよりも、青黛又はインジゴ・ナチュラリスと比較してインジルビンが豊富ではない。粗製エキスは、本発明による濃縮工程c)によって得られる。より具体的には、濃縮工程は、この方法で使用される水及び/又は溶媒を除去するために、濾液を濃縮器(例えば減圧において)に送り、それによってインジゴ、インジルビン、トリプタントリン、及び/又はチンダイノンを含む、エキス中に存在する活性成分を濃縮することによって実施される。
「1サイクル」は、本明細書で使用される場合、連続的に1回実施される洗浄工程d)及び濾過工程e)の2工程を指す。「2サイクル」は、本明細書で使用される場合、連続的に2回実施される洗浄工程d)及び濾過工程e)の2工程を指す。
用語「有効量」は、平均して患者に治療上の利益(例えば、疾患、障害又は症状の緩和、軽減又は治癒)をもたらす精製エキスの用量レベルを指す。
本発明は、インジゴ・ナチュラリスから、又は好ましくはタイワンコマツナギ、リュウキュウアイ(別名Strobilanthes cusia (Nees))、タデアイ(別名Polygonum tinctorium Aiton、P. tinctorium Lour.)及びタイセイ(別名Isatis indigotica Fort.)からなる群から選択される1種若しくは複数のインジゴ含有植物若しくはインジゴ生成植物の葉及び/若しくは茎から、精製エキスを調製する方法を提供する。
インジゴ・ナチュラリスは、タイワンコマツナギ、リュウキュウアイ(別名Strobilanthes cusia (Nees))、タデアイ(別名Polygonum tinctorium Aiton、P. tinctorium Lour.)及びタイセイ(別名Isatis indigotica Fort.)の葉及び茎、好ましくは葉から得られる。好ましくは、インジゴ・ナチュラリスは、タデアイ及び/又はリュウキュウアイの葉及び茎から得られる。
インジゴ・ナチュラリスは市販されているが(市販のインジゴ・ナチュラリスの例(植物/供給者)：リュウキュウアイ/Delong社、タイワンコマツナギ/KMA exports又はSam Vegetable Colours PVT社、タイセイ/Andrea Primavera又はBleu de Lectoure社、タデアイ/CouleurGarance又はEARL 4 saisons社)、当技術分野で一般に公知の方法によって、前述の植物の1種又は複数種の葉及び茎から製造することができる。これらの方法は、以下の通り概説することができる。タデアイ及び/又はリュウキュウアイの新しく収穫した茎及び葉を、外気中でプールに添加し、水をそのプールに添加して、茎/葉を覆う。数日間浸漬した後(26〜30℃)、茎/葉は腐敗していく。次に、撹拌しながら石灰ソーダを添加する。浸漬混合物の色が、緑色から濃い青紫色に変化したら、沈殿物を収集し、洗浄し(通常、水で2〜3回)、次に乾燥させて、インジゴ・ナチュラリス粉末を得る。
精製エキスは、以下からなる工程を含む本発明による方法によって調製することができる：a)(i)抽出溶媒、極性又は中程度の極性溶媒(例えばアルコール又は酢酸エチル)を、インジゴ・ナチュラリス粉末に添加して、混合物を得る工程、(ii)ある時間かけて(例えば、30分、1時間、2時間)、混合物を加熱し、撹拌する工程、b)(iii)加熱した混合物を、熱い状態で濾過して、不溶性副生成物を除去して、濾液を得る工程、c)(iv)濾液を濃縮して、粗製エキスを得る工程、d)(v)洗浄溶媒(例えば、水、又は無極性若しくは極性溶媒、又はそれらの混合物)を、粗製エキスに添加して、洗浄混合物を得る工程、(vi)ある時間かけて(例えば、30分、1時間、2時間)、洗浄混合物を加熱し、撹拌する工程、e)(vii)例えば室温(例えば18℃〜35℃)で洗浄混合物を濾過して、精製エキスを収集する工程、任意選択により(viii)残渣(すなわち、エキス)中のインジルビンの量(%w/w)が、実施例8Aに開示のHPLC方法によって測定して55%(w/w)超、好ましくは65%(w/w)超になるまで、工程(v)〜(vii)を反復する工程、任意選択により(ix)従来の方法に従って精製エキスを乾燥させる工程(例えば、風乾、凍結乾燥)。工程(v)及び(viii)における洗浄溶媒は、同じでも異なっていてもよい。
好ましい一実施形態では、精製エキスは、以下の工程：
a)インジゴ・ナチュラリスを、エタノールを用いて還流状態で2〜8時間かけて抽出する工程、
b)65℃以下の温度で混合物を濾過して、濾液を得る工程、
c)濾液を濃縮して、粗製エキスを得、溶媒及び溶媒中にまだ存在する最後に残った成分を完全に除去するために、前記粗製エキスを任意選択により濾過し(水の添加を伴う)、乾燥させる工程、
d)(i)粗製エキスを、ヘキサンで50℃以下の温度において15〜60分間洗浄する工程、
(ii)工程d)(i)で得られた混合物を室温で濾過して、生成物を得、それを任意選択によりエタノール及び水で洗浄する工程、
(iii)工程d)(ii)で得られた生成物を、還流状態においてエタノールで洗浄する工程、並びに
e)工程d)で得られた洗浄混合物を室温で濾過し、得られた生成物を80℃未満の温度で乾燥させて、エキスを得、それを任意選択により微粒子化する工程
を含む方法によって調製される。
別の好ましい実施形態では、最終工程で精製エキスが微粒子化される場合、粒径は、約99%が25〜35μmの範囲であり、好ましくは約30μmである。
本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変わる。「約」又は「およそ」は、当業者に明らかではないその用語が使用される場合、それが使用される文脈を踏まえた上で、特定の用語のプラス又はマイナス20%まで、好ましくは10%までを意味する。
インジゴ、インジルビン、トリプタントリン及びチンダイノン等の成分の含量は、実施例8に開示の通り、HPLC方法によって定量化されうる。
前述の方法は、取り扱いやすく、医薬又は化粧用組成物に更に製剤化することができる精製エキスを得ることを可能とする。更に、この方法は、豊富なインジルビンを含むエキスを提供する。こうして得られた精製エキスの成分の少なくとも60%(w/w)は、特徴付けられ、好ましくは少なくとも90%(w/w)は、そのうちの1種又は複数が、インジゴ、インジルビン、トリプタントリン及びチンダイノンからなる一覧から選択される。この方法から得られた精製エキスは、固体形態であるが、精製エキスの液体形態の調製は、固体精製エキスの簡単な溶解又は可溶化によって、取扱い又は製剤化の必要性に基づいて行うことができる。
この場合、精製エキスの液体形態は、以下からなる工程を含む本発明による方法によって調製することができる。a)(i)抽出溶媒、極性又は中程度の極性溶媒(例えばアルコール又は酢酸エチル)を、インジゴ・ナチュラリス粉末に添加して、混合物を得る工程、(ii)ある時間かけて(例えば、30分、1時間、2時間)、混合物を加熱し、撹拌する工程、b)(iii)加熱した混合物を、熱い状態で濾過して、不溶性副生成物を除去して、濾液を得る工程、c)(iv)濾液を濃縮して、粗製エキスを得る工程、d)(v)洗浄溶媒(例えば、水、又は無極性若しくは極性溶媒、又はそれらの混合物)を、粗製エキスに添加して、洗浄混合物を得る工程、(vi)ある時間かけて(例えば、30分、1時間、2時間)、洗浄混合物を加熱し、撹拌する工程、e)(vii)例えば室温(例えば18℃〜35℃)で洗浄混合物を濾過して、精製エキスを収集する工程、任意選択により(viii)残渣(すなわち、エキス)中のインジルビンの量(%w/w)が、実施例8Aに開示のHPLC方法によって測定して55%(w/w)超、好ましくは65%(w/w)超になるまで、工程(v)〜(vii)を反復する工程、(ix)こうして得られた精製エキスを、薬学的に許容される溶媒又は担体に可溶化する工程。工程(v)及び(viii)における洗浄溶媒は、同じでも異なっていてもよい。
本発明はまた、前述の方法によって、好ましくは植物エキス、インジゴ・ナチュラリスエキス、又は好ましくはタイワンコマツナギ、リュウキュウアイ(別名Strobilanthes cusia (Nees))、タデアイ(別名Polygonum tinctorium Aiton、P. tinctorium Lour.)及びタイセイ(別名Isatis indigotica Fort.)からなる群から選択されるインジゴ含有植物若しくはインジゴ生成植物の葉及び/若しくは茎由来のエキスから得ることができるエキスを提供し、前記得ることができるエキスは、成分としてのインジルビンを、精製エキスの少なくとも55%(w/w)の量、好ましくは少なくとも65%(w/w)の量で含む。精製エキスは、固体形態であり、前述の方法又は任意の他の適切な方法によって調製することができる。精製エキスは、インジゴ、トリプタントリン、及び/又はチンダイノンを更に含むことができ、これらは、インジルビンと一緒に、共抽出されうる。特に、複数成分を含有するエキスは、相乗効果をもたらすことができる。
本発明は更に、精製エキスを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、当業者に周知の技術を使用して、局所又は経口投与に適した剤形に製剤化することができる。医薬組成物は、薬物製造分野で広く用いられているもの等の、薬学的に許容される担体を更に含むことができる。例えば、薬学的に許容される担体は、1種又は複数種の以下の薬剤：溶媒、乳化剤、懸濁化剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、キレート剤、希釈剤、ゲル化剤、保存剤、滑沢剤、吸収遅延剤、リポソーム等を含むことができる。好ましくは、溶媒は、水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシ化又はプロポキシル化ジグリコール、環式ポリオール、ワセリン、植物油、及びこれらの溶媒の任意の混合物からなる群から選択される。好ましくは、医薬組成物は、皮膚、例えば乾癬に罹患している皮膚に直接適用されうる局所製剤に製剤化される。医薬組成物に適した局所製剤は、乳剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、パッチ剤、塗布剤、エアロゾル剤、スプレー剤、ローション剤、セラム剤、ペースト剤、フォーム剤、又は液滴剤でありうる。本発明の一実施形態では、医薬組成物は、本発明による精製エキスを、当技術分野で周知であり、一般に使用されるもの等の基剤と混合することによって、外用製剤に製剤化される。
一部の実施形態では、本発明による医薬組成物の投与量及び投与頻度は、以下の因子：処置を受ける疾患の重症度、投与経路、並びに処置を受ける対象の体重、年齢、身体状態及び応答に応じて変わりうる。更なる又は追加の実施形態では、精製エキスの量は、約0.001〜約1000mg/kg体重/日、例えば約0.01〜約500、300、又は100mg/kg体重/日の範囲である。
本発明はまた、精製エキスを含む化粧用組成物を提供する。化粧的又は皮膚科学的に許容される担体又は媒体を含む化粧用組成物は、局所適用に適合させた形態で存在しうる。「化粧的又は皮膚科学的に許容される」は、毒性、不耐性、不安定性、アレルギー反応等の危険性を伴わずに、皮膚又はヒトの皮膚付属器と接触させて使用するのに適した媒体を意味する。化粧用組成物では、精製エキスは、1種又は複数種の化粧的又は皮膚科学的に許容される溶媒、例えば水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシ化若しくはプロポキシル化ジグリコール、環式ポリオール、ワセリン、植物油、又はこれらの溶媒の任意の混合物において、既に可溶化されていてもよい。
前述の精製エキス及び組成物は、疾患又は状態の処置又は軽減において使用することができる。処置とは、対象を苦しめている病理学的状態と関連する症状を少なくとも軽減することを意味し、軽減は、広い意味で使用され、あるパラメータ、例えば処置を受ける病理学的状態と関連する症状、例えば皮膚炎、乾癬等の規模を少なくとも低減することを指す。したがって、処置はまた、病理学的状態又は少なくともそれと関連する症状が完全に阻害され、例えば生じないように防止されるか、又は停止、例えば終結させられ、したがって宿主が、もはや病理学的状態、又は少なくとも病理学的状態を特徴付ける症状に罹患しない状況を含む。したがって、処置は、疾患状態の治癒及び管理の両方を含む。したがって、前述のエキス及び組成物は、乾癬、炎症性皮膚状態、爪甲真菌症、皮膚がん、異常角質化誘発性疾患、皮膚老化、及び膿疱性皮膚症からなる群から選択される疾患又は状態の処置又は軽減において使用することができる。
本発明は更に、ケラチノサイトの増殖若しくは分化を阻害し、真皮及び上皮への単核細胞の浸潤を阻害し、過形成性血管をもたらす血管変化を阻害し、又は内皮細胞に対する接着分子の上方調節を阻害する方法であって、前述のエキス及び組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。
精製エキス及び組成物の有効性は、増殖若しくは分化、又は炎症の阻害におけるそれらの活性に関して、インビトロモデルによって評価することができる。例えば、インビトロ試験を、サイトカインシグナル伝達、STAT-3/STAT-1、MAPK、NFκBが関与する経路に対して実施することができる。
精製エキス及び組成物の有効性は、更に、疾患又は障害の処置におけるそれらの活性に関して、インビボモデルによって評価することができる。例えば、遺伝子導入及びノックアウトモデルを含めた遺伝子組換えマウスを試験することができる。
本願の新規な特徴を、添付の特許請求の範囲の特殊性と共に記載する。本願の特徴及び利点は、本願の原理が使用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明を参照することによって、より良好に理解されよう。
本願の好ましい実施形態を、本明細書に示し、記載してきたが、このような実施形態は、単に例示的に提示される。本明細書に記載の本願の実施形態に対する様々な代替形態を、本願の実施において用いることができると理解されたい。当業者は、本願から逸脱することなく、数々の変動、変更及び置換が可能であることを理解されよう。以下の特許請求の範囲は、本願の態様の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、並びにそれらの等価物は、特許請求の範囲によって保護されるものとする。
任意の従来技術の刊行物が本明細書で参照される場合、このような参照は、その刊行物が当技術分野における共通の一般知識の一部を形成することを承認するものではないと理解されたい。それに限定されるものではないが、特許文書、特許出願文書、記事、書籍、手引書、及び論文を含めた、本願に引用されているあらゆる書類又は書類の一部は、それらの全体を参照することによって、任意の目的で本明細書に明確に組み込まれる。
本明細書における百分率は、別段の指定がない限り、エキス又は特定の生成物の重量に対する重量によって表される。
本発明の更なる態様及び利点を、以下の例示的な実験部分に開示する。
1.精製インジゴ・ナチュラリスエキスの調製及び分析のための分析方法
(実施例1)
精製インジゴ・ナチュラリスエキスの調製
以下の調製で使用する青黛は、Delong Pharmaceutical社から得られる(インジゴ2.62%及びインジルビン0.284%(実施例8Aに記述されているHPLC方法)及びトリプタントリン0.0046%(実施例8Bに記述されているHPLC方法))。
青黛500gを、酢酸エチル10Lに懸濁させた。混合物を還流状態で2時間撹拌し、次に75℃で濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、暗色の固体を得た。粗製エキスをヘキサン250mL中で撹拌し、1時間加熱還流させた。室温に冷却した後、懸濁液を濾過して、暗色の残渣(粗製エキス)を得た。
暗色の残渣0.50gを、再びヘキサン25mL中で1時間還流させ、室温に冷却した後、濾過して、精製エキスを暗赤色の固体452mgとして得た。HPLC：インジルビン62.9%、インジゴ12.9%、及びトリプタントリン0.53%。
(実施例2)
精製インジゴ・ナチュラリスエキスの調製
実施例1で使用した青黛500gを、アルコール(エタノール)10Lに懸濁させた。混合物を還流状態で2時間撹拌し、次に75℃で濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、暗色の固体を得、それをヘキサン260mL中で撹拌し、1時間加熱還流させた。室温に冷却したら、懸濁液を濾過して、暗色の残渣を得た。
暗色の残渣0.80gを、アルコール(エタノール)24mL中で更に1時間還流させ、次に室温に冷却した後、濾過して、精製エキスを暗赤色の固体(538mg)として得た。HPLC：インジルビン83.6%、インジゴ6.35%、及びトリプタントリン0.75%。
(実施例3)
精製インジゴ・ナチュラリスエキスの調製
実施例1で使用した青黛500gを、酢酸エチル10Lに懸濁させた。混合物を還流状態で2時間撹拌し、次に熱い状態で濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、暗色の固体を得た。粗製エキスをヘキサン250mL中で撹拌し、1時間加熱還流させた。室温に冷却した後、懸濁液を濾過して、暗色の残渣を得た。
暗色の残渣0.75gを、エタノール22.5mL中で1時間還流させ、室温に冷却した後、濾過して、精製エキスを暗赤色の固体(538mg)として得た。HPLC：インジルビン77.9%、インジゴ15.9%、及びトリプタントリン0.56%。
(実施例4)
精製インジゴ・ナチュラリスエキスの調製
実施例1で使用した青黛500gを、DMF2.1Lに懸濁させた。混合物を50℃で40分間撹拌した。20℃に冷却したら、懸濁液を濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、暗色の固体を得、それをヘキサン130mL中で撹拌し、1時間加熱還流させた。20℃に冷却したら、懸濁液を濾過して、暗色の残渣を得た。
暗色の残渣1.56gを、エタノール46.8mlで洗浄し、1時間加熱還流させ、次に20℃に冷却した後、濾過して、精製エキス(766mg)を得た。HPLC：インジルビン66.3%、インジゴ9.76%。
(実施例5)
精製インジゴ・ナチュラリスエキスの調製
実施例1で使用した青黛500gを、DMF3Lに懸濁させた。混合物を30℃で1時間撹拌し、次に濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、暗色の固体を得、それをヘキサン230mL中で撹拌し、1時間加熱還流させた。20℃に冷却したら、懸濁液を濾過して、暗色の残渣を得た。
暗色の残渣1.96gを、85%エタノール(85%水性アルコール)59mLで洗浄し、1時間加熱還流させた後、熱い状態で濾過して、精製エキス(1.02g)を得た。HPLC：インジルビン69.4%、インジゴ18.7%、及びトリプタントリン0.62%。
(実施例6)
精製インジゴ・ナチュラリスエキスの調製
青黛100gを、還流条件において92%エタノール(92%水性エタノール)2Lで2時間かけて抽出した。完了したら、混合物を、熱い状態でAF6フィルタ(ブフナー)により濾過して、濃青色から赤色の溶液を濾液として得た。この濾液を真空下で還元して乾燥させて、乾燥残渣2.4gを得た。この残渣を、ヘキサン120mLにより還流状態で1時間かけて洗浄した。完了したら、混合物を2時間かけて室温に冷却し、次に真空下で濾過して、暗赤色の精製エキス312.9mgを得た。
この精製エキス280mgを、還流状態において92%エタノール(92%水性エタノール)15mLで1時間かけて洗浄した。完了したら、溶液を室温に冷却し、次に濾過して、オーブン(80℃)で1時間30分乾燥させた後、暗赤色/赤紫色の精製エキス159mgを得た(0.18%)。HPLC：インジルビン82.31%、インジゴ8.99%、及びトリプタントリン0.81%。
(実施例7)
微粒子化工程
先の実施例で得られた精製インジゴ・ナチュラリスエキスの微粒子化工程を、以下の機器を用いて実施する。
- 微粒子化装置：スパイラルジェットミル直径200
- 供給装置：この機器は、粉末を投入して微粒子化装置に供給するために使用される。投入は、2つのスクリューの働きで行われる。このシステムによって、規則的な流れが得られる。
微粒子化は、粉末粒子を空気ジェットで吐出させることにある。粒子同士が接触すると、それらが粉砕される。
以下の微粒子化パラメータを、微粒子化中に記録する。
- リング圧力：6バール
- 噴射器圧力：3バール
- 粉末供給流：25kg/時
微粒子化装置は、円柱状の筐体を有し、筐体周囲に、空気を噴射するための穴を有する。
粉末を微粒子化装置に導入すると、粒子は、空気噴射の働きで押し上げられる。粒子が良好なサイズを有する場合、粒子は微粒子化装置の中心に集まり、吸い込まれる。外部粒子又は機器の破片による任意の汚染を回避するために、追加のふるい分け(ふるい：700μm)を実施する。
この工程は、微粒子化の後、パッケージングの前に、手動で実施される。
得られた均質な生成物の粒度分布分析を、特定のサイズ分布(PSD)法に従って実施した[分析明細：D99≦30μm]。
(実施例8)
分析のための分析方法
A-逆相HPLC方法：
インジゴ及びインジルビンを同時に定量化するための新しい逆相HPLC方法を、欧州薬局方(Pharmeuropa Vol.20、No.1、2008年1月、118〜119頁)、中国薬局方(2010年度版、185頁)及び文献(Chen LW、Liao W、Yang M. Jia DY、He P、Chen SM、Fu CM. Determination of indigo and indirubin in Indigo Naturalis by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences、2008年、23(6)、714〜715頁;Liu ZY、Su ZT、Gao YN、Yang M. Simultaneously determination of indigo and indirubin in Indigo Naturalis by HPLC. China Pharmacist 2010年、13(3)、324〜326頁)に基づいて確立した。
クロマトグラフィーシステム(Agilent 1200シリーズ)は、G1322A脱気装置、G1211Aポンプ、G1367Bオートサンプラー、G1316Aカラムオーブン及びG1315B DAD検出器からなる。他の装置には、SK7200H超音波デバイス(中国)及びMilli-Q水精製システム(米国)が含まれる。
青黛の6つのバッチを、中国の3つの供給業者から収集した。インジゴ標準物は、東京化成工業株式会社から購入した(日本、>98%)。トリプタントリンは、Accela社から購入した(中国、97%)。インジルビンは、Hutchison Medipharma社(HMP)で合成し、再結晶化させた(HPLCで>99%)。
有機フィルタ膜(0.45μm、中国)、ジメチルホルムアミド(DMF、分析グレード)、メタノール(HPLCグレード)、ギ酸(FA、HPLCグレード)、トリエチルアミン(TEA、分析グレード)及びMilli-Q水精製システムで精製した超純水を、実験で使用した。
DMF溶液の前処理：DMF500mLに、乾燥N2を30分間吹き付け、次にTEA0.5mLを添加し、混合して、DMF溶液(0.1%TEAを含有し、酸素を含まない)を得た。このDMF溶液を、試料の調製に使用した。
青黛50mgを、DMF溶液50mLに懸濁させた。10分間の超音波抽出の後、懸濁液を、0.45μmのシリンジフィルターを介して濾過して、青黛の試験溶液を作製した。
精製エキス(実施例2から得た)20mgを、DMF溶液200mLに懸濁させた。超音波抽出の後、懸濁液を、0.45μmのシリンジフィルターを介して濾過して、エキスの試験溶液を作製した。
分離は、Waters Symmetry C18カラム(5μm、3.9×150mm)で行った。移動相は、65%メタノール(0.05%FAを含有する)であった。流速は、1.0mL/分で15分間であり、カラム温度は、25℃であった。注入体積は、4μLであった。検出波長は、インジゴ及びインジルビンを同時にアッセイできるように、289nmとした。インジゴ及びインジルビンを、1回の注入で同時に分析することができた。インジゴ及びインジルビンの典型的なHPLCクロマトグラムを、図1に示した。
B-トリプタントリンを定量化するためのHPLC分析方法
また、トリプタントリンを定量化するための新しいHPLC分析方法を確立した。青黛とその濃縮生成物である精製エキスの両方におけるトリプタントリンの濃度が低いので、試料濃度を調整するのがよい。分析は、Waters Symmetry C18カラム(5μm、3.9×150mm)により25℃で実施した。移動相は、メタノール(0.05%FAを含有、溶出剤B)及び水(0.05%FAを含有、溶出剤A)であった。勾配溶出プロファイルは、以下の通りであった。50%Bの均一濃度(12分)、50%〜100%B(1分)、100%Bの均一濃度(6分)及び100%〜50%B(1分)。流速は、1.0mL/分であり、カラム温度は、25℃であった。注入体積は、10μLであった。検出波長は、254nmであった。
青黛400mgを、DMF溶液20mLに懸濁させた。20分間の超音波抽出の後、懸濁液を、0.45μmのシリンジフィルターを介して濾過して、青黛の試験溶液を得た。
精製エキス(実施例2から得た)15mgを、DMF溶液20mLに懸濁させた。超音波抽出の後、懸濁液を、0.45μmのシリンジフィルターを介して濾過して、精製エキスの試験溶液を得た。
トリプタントリン、青黛及び精製エキスの典型的なHPLCクロマトグラムを、図2に示した。
(実施例9)
精製インジゴ・ナチュラリスエキスの長期安定性
実施例6に従って調製した精製インジゴ・ナチュラリスエキスを、安定状態にしておいた。調製したエキスのHPLCの特徴は、以下の通りである。80.16%インジルビン、10.95%インジゴ、0.64%トリプタントリン。
安定性の研究中に使用した保存条件は、気候室(Piardi CC1400)中、25℃±2℃及び60%RH±5%RHである。
GUIDELINE ON QUALITY OF HERBAL MEDICINAL PRODUCTS(CPMP/QWP/2819/00 rev 01)によれば、定性的属性は、規制に適合しなければならない[規制：インジルビン含量(乾燥エキス%)=65.0〜85.0、インジゴ含量(乾燥エキス%)=5.0〜15.0、トリプタントリン含量(乾燥エキス%)≦5.0]。
マーカーの含量の変動は、初期アッセイ値の±10%を超えてはならない。
結果を、以下のtable 1(表1)に示す。
1カ月、2カ月及び3カ月目のHPLCフィンガープリントは、T0におけるフィンガープリントクロマトグラムと適合する。したがって、定性的属性は、規制に適合する。インジゴ、インジルビン及びトリプタントリンの含量の変動は、初期アッセイ値の±10%の許容範囲を超えない。
したがって、本発明に従って調製した精製インジゴ・ナチュラリスエキスは、25℃及び60%RHで少なくとも6カ月間安定である。
2.生化学アッセイ及び細胞アッセイにおける精製インジゴ・ナチュラリスエキスのインビトロ評価
(実施例10)
インビトロアッセイ及び結果
A.一般試薬：
DMSO、Sigma-Aldrich社、ミズーリ州、セントルイス、カタログ番号D2650
ヤヌスキナーゼ1(JAK1)、Life technologies(商標)社、カタログ番号PV4774
ヤヌスキナーゼ1(JAK2)、Life technologies(商標)社、カタログ番号PV4210
ヤヌスキナーゼ1(JAK3)、Life technologies(商標)社、カタログ番号PV3855
CDK1、Life technologies(商標)社、カタログ番号PV3292
CDK2、Life technologies(商標)社、カタログ番号PV3267
CDK5、Life technologies(商標)社、カタログ番号PV3000
Z'-LYTE(登録商標)キナーゼアッセイキット-チロシン6ペプチド、Life technologies(商標)社、カタログ番号PV4122
Z'-LYTE(登録商標)キナーゼアッセイキット-Ser/Thr 12ペプチド、Life technologies(商標)社、カタログ番号PV3673
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、Life technologies(商標)社、カタログ番号C11965
RMPI-1640、Life technologies(商標)社、カタログ番号A10491
ウシ胎仔血清(FBS)、Life technologies(商標)社、カタログ番号10099141
Epilife(登録商標)培地、Life technologies(商標)社、カタログ番号M-EPI-500-CA
HKGS、Life technologies(商標)社、カタログ番号S-001-5
組換えヒトIL-2、Peprotech社、カタログ番号200-02
組換えヒトIL-6、Peprotech社、カタログ番号200-06
組換えヒトIL-3、Peprotech社、カタログ番号200-03
組換えヒトGM-CSF、Peprotech社、カタログ番号300-03
組換えヒトIL-22、Peprotech社、カタログ番号200-22
組換えヒトTNFα、R&D社、カタログ番号210-TA-010
リポ多糖(LPS)、Calbiochem社、カタログ番号437650
抗ヒトCD3 Functional Grade(登録商標)精製(aCD3)(クローン：OKT3) eBioscience社、カタログ番号16-0037-85
抗ヒトCD28 Functional Grade(登録商標)精製(aCD28)(クローン：CD28.2)、eBioscience社、カタログ番号16-02897-85
ホスホ(phospo)-STAT3(Y705)抗体(ウサギ-抗ヒト)、Cell Signaling Technology社、カタログ番号9145
ホスホ-STAT5(Y694)抗体(ウサギ-抗ヒト)、Cell Signaling Technology社、カタログ番号9359
アクチン抗体(マウス-抗ヒト)、Sigma-Aldrich社、カタログ番号A1978
ヤギ抗ウサギIgGAlexa 488、Life technologies(商標)社、カタログ番号A11034
ヤギ-抗ウサギIROYE 800CW、Li-COR Bioscience社、カタログ番号926-32211
ヤギ-抗マウスIROYE 800CW、Li-COR Bioscience社、カタログ番号926-32210
ヒトIFNγ ELISAキット、R&D社、カタログ番号DY285
ヒトTNFα ELISAキット、R&D社、カタログ番号DY210
ヒトIL-1β ELISAキット、R&D社、カタログ番号DY201
ヒトIL-6 ELISAキット、R&D社、カタログ番号DY206
チアゾリル青色テトラゾリウム青色(MTT)、Sigma-Aldrich社、カタログ番号M2128
CellTiter-Glo(登録商標)発光細胞生存率アッセイ、Promega社、カタログ番号G7572
CytoTox-ONE(商標)均質膜完全性アッセイ、Promega社、カタログ番号G7891
ルシフェラーゼアッセイ、Promega社、カタログ番号E4550
iBlot(登録商標)転写スタック、レギュラー(ニトロセルロース)、Life technologies(商標)社、カタログ番号IB3010-01
ヨウ化プロピジウム、Sigma-Aldrich社、カタログ番号P4170
リボヌクレアーゼA、Sigma-Aldrich社、カタログ番号R6513
1×PBSバッファー(1L)：NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4-12H2O3.58g、KH2PO40.24g、MilliQ ddH2O 1Lに溶解、pHを7.4に調整。
1×SDSローディングバッファー：50mMのTris-HCl/pH8.8、2%SDS、10%グリセロール、0.1%ブロモフェノールブルー、100mMのDTT。
B.細胞及び細胞株
Shanghai Institutes for Biological Sciences(SIBS)から購入したヒト肝細胞癌細胞株、HepG2(中国、上海、カタログ番号TCHu 72)を、10%FBSを含有するDMEM中で培養した。
American Tissue Culture Collection(ATCC)社(バージニア州、マナサス、カタログ番号CRL-2003(商標))から購入したヒト赤白血病細胞株、TF1を、10%FBS及び2ng/mLのGM-CSFを含有するRMPI-1640中、37℃で5%CO2を用いて培養した。
PBMC：健康な成人ドナーの正常ヒト血液試料を、ヘパリン処理した管に収集した。それぞれ独立な実験で、健康なドナー1人の血液を使用した。単核細胞(PBMC)を、Ficoll-Paque Plus試薬(Amersham Pharmacia Biotech社、スウェーデン、カタログ番号17-1440-02)を使用し、製造者によって推奨されているプロトコルに従って単離し、10%FBSを含有するRMPI-1640中、37℃で5%CO2を用いて培養した。
初代T細胞：単核細胞(PBMC)を、Ficoll-Paque Plus試薬(Amersham Pharmacia Biotech社、スウェーデン、カタログ番号17-1440-02)を使用して、製造者によって推奨されているプロトコルに従って単離した。次に、細胞を、抗CD3(1μg/mL)及び抗CD28(5μg/mL)を使用して3日間活性化させ、10%FBS及び10ng/mLのIL-2を含有するRMPI-1640中、37℃で5%CO2を用いて2週間、2〜3日毎に増殖させた後、実験を実施した。
中国の第二軍医大学(SMMU)から得たヒト表皮ケラチノサイト株、HaCaTを、10%FBSを含有するDMEM中で培養した。
Life technologies(商標)社(Carlsbad、米国、カリフォルニア州、カタログ番号C-005-5C)から購入した、成人の皮膚から単離されたヒト表皮角化細胞、HEKaを、HKGSを含有するEpiLife(登録商標)培地中、37℃で5%CO2を用いて培養した。
293/NFκB-Luc細胞株を、Panomics社(カリフォルニア州、フリーモント、カタログ番号RC0014)から購入した。細胞は、pNFκB-Luc及びpHygをヒト胚腎臓293細胞に同時形質移入した後、ハイグロマイシン選択を実施することによって得た。細胞を、10%FBS及び100μg/mLのハイグロマイシンB(Life technologies(商標)社、カタログ番号10687-010)を含有するDMEM中で培養した。
C.キナーゼアッセイ
JAK1/2/3キナーゼアッセイは、組換えヒトJAK1/2/3及びZ'-LYTE(登録商標)キナーゼアッセイキット-チロシン6ペプチドを使用してインビトロで実施した。CDK1/2/5キナーゼアッセイは、組換えヒトCDK1/2/5及びZ'-LYTE(登録商標)キナーゼアッセイキット-Ser/Thr 12ペプチドを使用してインビトロで実施した。すべての反応(20μL)を、4%DMSO溶液中、2.5μLの正の対照(JAKキナーゼアッセイではCP-690550及びCDKキナーゼアッセイではスタウロスポリン)又は試験物質(すなわち、試料)、5μLのキナーゼ/ペプチド基質混合物又はホスホ-ペプチド溶液、2.5μLのATP溶液(100μM)又は1.33×キナーゼバッファーを添加することによって開始した。384ウェルアッセイプレート(Corning社、カタログ番号3575)を混合し、室温で1時間インキュベートした。次に、展開溶液5μLを各ウェルに添加し、混合し、室温で更に1時間インキュベートした。次に、キナーゼ反応を、停止試薬5μLを添加することによって停止させた後、Perkin-Elmer Victor III(Perkin-Elmer Life Sciences社、マサチューセッツ州、ボストン)プレートリーダーを使用して、450nm及び520nmの蛍光のものを記録した。
D.Acumenアッセイ
IL-6誘発性STAT3リン酸化のために、HepG2を、96ウェルプレートに、無血清DMEM培地中1ウェル当たり5.4×103個の細胞で播種して、37℃、5%CO2で終夜置いた。CP-690550又は試験物質と共に30分間インキュベートした後、細胞を、100ng/mLのヒト組換えIL-6(1：10)を各ウェルに添加することによって15分間刺激した。
IL-3誘発性STAT5リン酸化のために、TF-1を、96ウェルプレートに1ウェル当たり1×104個の細胞で播種して、37℃、5%CO2で3時間置いた。CP-690550又は試験物質と共に30分間インキュベートした後、細胞を、100ng/mLのヒト組換えIL-3(1：10)を各ウェルに添加することによって30分間刺激した。
次に、HepG2又はTF1細胞を、2%パラホルムアルデヒド中、室温で45分間固定し、氷冷メタノール中で30分間インキュベートした。PBSで洗浄した後、細胞を、抗ホスホ-STAT3(Y705)又は抗ホスホ-STAT5(Y694)抗体と共にそれぞれ4℃で終夜インキュベートした。ヤギ抗ウサギIgG Alexa 488二次抗体を添加してから90分後に、PBSで洗浄した。細胞を、暗室中、7.5μMのヨウ化プロピジウム及び100μg/mLのリボヌクレアーゼAを含有するPBS中で60分間インキュベートした後に計数した。プレートを、Acumen X3機器(TPP Labtech社、Hertfordshire SG8、英国)で読み取った。
E.ウエスタンブロット
HEKaを、6ウェルプレートに2×105個の細胞/ウェルで播種し、37℃、5%CO2で終夜置いた。試験物質と共に30分間インキュベーションした後、細胞を、100ng/mLのIL-22で30分間刺激した。
処理後、試料を1×SDSローディングバッファーに収集した。タンパク質試料を、15分間煮沸し、14,000gで4℃において10分間遠心分離処理することによって収集した。上清を使用するか、又は-80℃ですぐに保存した。ウエスタンブロット分析のために、試料を、10%Tris-HCL勾配電気泳動ゲル(Bio-Rad Laboratories社)上で分離した。ゲルを、5%無脂肪乾燥乳中でブロックされた、iBlot(登録商標)転写スタック、レギュラー(ニトロセルロース)にブロットし、それぞれ抗ホスホ-STAT3(Y705)抗体又は抗アクチン抗体を使用して終夜4℃でプローブした。次に、膜を適切なIDRye 800CW二次抗体と共にインキュベートした後、Odyssey赤外画像システム(Li-COR Bioscience社、米国、ネブラスカ州、リンカーン)を使用して検出した。
F.レポーターアッセイ
レポーター遺伝子アッセイのために、293/NFκB-Lucを、96ウェルプレートに1ウェル当たり4×104個の細胞で播種して終夜置いた。アンドログラホリド(LGT)又は試験物質と共に30分間インキュベートした後、細胞を、100ng/mLのTNFα(1：10)を各ウェルに添加することによって6時間刺激した。細胞溶解液は、培地を除去し、溶解バッファーを添加することによって調製した。5×体積のルシフェラーゼアッセイ試薬を各ウェルに添加した後、プレートを読み取った。発光を、Perkin-Elmer Victor IIIプレートリーダー(Perkin-ElmerLife Sciences社、米国、マサチューセッツ州、ボストン)を使用して記録した。
G.ELISAアッセイ
初代T細胞を、96ウェルプレートに8×104個の細胞/ウェルで播種した。試験物質を培養物に添加し、37℃、5%CO2でインキュベートした。30分後、各ウェル中の細胞懸濁液を、CD3(1μg/mL)及びCD28(5μg/mL)で被覆した別の96ウェルプレートに移し、37℃で5%CO2を用いて22時間インキュベートした。培地を除去し、アッセイを行うまで-80℃で保存した。IFNγ濃度を、商業用ELISAキット(R & D Systems社)を使用して、製造者の指示に従って決定した。
PBMCを、96ウェルプレートに1ウェル当たり3×104個の細胞で播種した。次に、試験物質を培養物に添加し、37℃、5%CO2でインキュベートした。30分後、1μg/mLのLPS(1：10)を、培養物に添加した。タンパク質レベルの定量化のために、プレートを18時間インキュベートした。培地を除去し、アッセイを行うまで-80℃で保存した。TNFα、IL-1β及びIL-6の濃度を、商業用ELISAキット(R & D Systems社)を使用して、製造者の指示に従って決定した。
H.MTTアッセイ
HaCaTを、96ウェルプレートに4×104個の細胞/ウェルで播種して終夜置いた。次に、スタウロスポリン(Stausporine)又は試験物質を、培養物に添加し、37℃、5%CO2で72時間インキュベートした。培地を除去した後、96ウェルプレート中の細胞を、MTT100μL(1ウェル当たり10%FBSを含有するDMEM中0.5mg/mL)に曝露し、37℃、5%CO2で3時間インキュベートした。その後、上清を除去し、DMSO150μLを各ウェルに添加した。プレートを、暗室中で10分間インキュベートし、492nmにおける吸光度を、Multiskan MK3マイクロプレートリーダー(Thermo Life Sciences社、中国、香港)を使用してすぐに記録した。
I.細胞生存率アッセイ
CellTiter-Glo(登録商標)発光細胞生存率アッセイキットを使用して、細胞生存率を調査した。HEKaを、96ウェルの不透明壁プレートに1×104個の細胞/ウェルで播種して終夜置いた。次に、ジトラノール又は試験物質を培養物に添加し、37℃、5%CO2で48時間インキュベートした。細胞を、各ウェル中に存在する細胞培養培地の体積と等しいCellTiter-Glo(登録商標)試薬で溶解させ、内容物を2分間混合して、細胞溶解を誘発した。プレートを室温で10分間インキュベートして、発光シグナルを安定化した。発光を、Perkin-ElmerVictor IIIプレートリーダー(Perkin-Elmer Life Sciences社、米国、マサチューセッツ州、ボストン)を使用して記録した。
J.LDH放出アッセイ
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出アッセイキットを使用して、細胞傷害性を調査した。HEKaを、96ウェルの不透明壁プレートに4×104個の細胞/ウェルで播種して終夜置いた。次に、ジトラノール又は試験物質を培養物に添加し、37℃において5%CO2の下で24時間インキュベートした。上清及び細胞溶解液を調製した。上清又は細胞溶解液の体積に等しい1×体積のCytoTox-ONE(商標)試薬を、各ウェルに添加した後、30秒間混合し、25℃で10分間インキュベートした。上清又は細胞溶解液の50%体積に等しい停止溶液を、各ウェルに添加して反応を停止させ、SpectraMax M2(Molecular Devices社、米国、カリフォルニア州、サニーベール)を使用して、560nmの励起波長及び590nmの発光波長を有する蛍光を記録した。
K.TNFα誘発性のNFκB活性化
炎症促進性サイトカイン及びケモカインは、乾癬の病変形成において重要な役割を果たす。NFκBは、明らかに、炎症促進性サイトカイン及びケモカイン遺伝子発現の最も重要な調節因子の1つである。したがって、TNFα依存性NFκB活性化に対する青黛及びその精製エキスの阻害効力を、HEK293/NFκB-Lucにおいて調査した。Table 1(表1)に示されている通り、TNFαによって、NFκB依存性ルシフェラーゼ発現を刺激し、トリプテリジウム(Tripterygium)グリコシドでブロックされたNFκB活性化により、細胞を濃度依存方式で前処理した。インジゴ・ナチュラリス精製エキスは、実験条件で、TNFα依存性NFκB活性化に対してマイクログラム/gの活性を有していた(Table 1(表1)参照)。
L.IC50の決定
すべてのIC50値を、ID Business Solutions社(英国、ギルフォード)製のXlfit(商標)ソフトウェア(バージョン2.0)を使用することによって決定した。バックグラウンドを、DMSOだけで処理した細胞を含む培養物中で定義付け、IC50算出のために差し引いた。
M.結果
インジゴ・ナチュラリス精製エキスのいくつかのインビトロアッセイの結果を、以下のTable 2(表2)に示す。ここでインジゴ・ナチュラリスAは、Delong Pharmaceutical社から得たものである(インジゴ2.62%、インジルビン0.284%、トリプタントリン0.0046%)。
3.動物モデルにおける精製インジゴ・ナチュラリスエキスのインビボ評価
(実施例11)
インビボアッセイ及び結果
A.材料及び方法
動物
Shanghai SLC AnimalCenter社から購入したBALB/cマウス、雄性、体重19〜22g。
室温：24±1℃
室内の相対湿度：40〜70%
明サイクル：蛍光で12時間の明(8：00〜20：00)、12時間の暗
動物飼育：マウス4匹/ケージ
食餌：食餌は摂取自由(照射済み、Shanghai SLAC Laboratory Animal社、中国)
水：現地供給による水道水は摂取自由(最初に都市用水をMolanimal超純水機によって濾過した)
機器
MJ Research PTC-200 Peltierサーマルサイクラー(PTC DNA Engine(商標)システムのためのAlpha Unit(商標)ブロックアセンブリ)
Applied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステム
デジマチックマイクロメータキャリパー：日本、ミツトヨ社。精度：0.001mm
試薬
組換えマウスIL-22(rmIL-22)、Novoprotein社(sinobio)、カタログC047、ロット0375351
大容量cDNA逆転写キット、Applied Biosystems社、パート番号：4368813、ロット：0909069
Thermo Scientific ABsolute SYBR Green Rox Mix、Thermo Scientific社、カタログ：AB-1163/A、ロット：0911/16
正の対照
Protopic(登録商標)(タクロリムス、FK506)、0.1%軟膏、アステラス富山社、富山技術センター、H20100079、ロット：028680。
投与レジメン
異なる濃度の試験試料、ビヒクル、又は0.1%のFK506軟膏を、モデルを誘発して1時間後に1%で局所投与し、次に1日目から11日目まで、毎日1日2回投与した。試験物質の投与の初日を、0日目とみなした。
投与経路
局所適用、b.i.d.
IL-22誘発性乾癬様のマウスモデルの確立
単独の、又は組換えマウスIL-22(eBiosience社)100ng若しくは500ngを含有するPBS20μLの皮内注射を、30ゲージ針を使用して2日毎に11日間、麻酔下のマウスの耳に投与した。耳の厚さを、注射前の0日目及びその後注射のない日に測定した。耳の測定を、デジマチックマイクロメータキャリパー(ミツトヨ社)を使用して、耳の中心で行った。
最後のIL-22処置の24時間後、マウスを屠殺し、更なる分析のために耳を収集した。
組織学的検査
耳を剖検で収集し、10%緩衝化ホルマリンリン酸(buffered formalin phosphate)で固定し、パラフィンに包埋し、切片を作り、ヘマトキシリン/エオシン(H&E)で染色した。顕微鏡用の切片を、病変の数及び重症度によって類別した。
統計方法
耳の厚さデータの結果を、平均±S.E.Mとして表す。耳の膨潤のAUCを、0〜11日目の耳の厚さデータによって算出し、反復測定ANOVA法によって、JMP(登録商標)ソフトウェアを用いて分析した。サイトカインタンパク質及び遺伝子発現データを、一元配置ANOVAで評価した後、事後分析のためにスチューデントt試験を行った(有意性レベルは、p<0.05に設定した)。
群及び投与
図3を参照されたい。
結果
インジゴ・ナチュラリス精製エキスのいくつかのインビボアッセイの結果を、Table 3(表3)に示す。

Claims (18)

  1. インジゴ・ナチュラリスから、又はタイワンコマツナギ、リュウキュウアイ(別名Strobilanthes cusia (Nees))、タデアイ(別名Polygonum tinctorium Aiton、P. tinctorium Lour.)及びタイセイ(別名Isatis indigotica Fort.)からなる群から選択される1種若しくは複数のインジゴ含有植物の葉及び/若しくは茎から、精製エキスを調製する方法であって、
    a)抽出工程：インジゴ・ナチュラリス又はその植物の葉及び/若しくは茎を、極性溶媒又は中程度の極性溶媒で抽出して、抽出混合物を得る工程、
    b)濾過工程：抽出混合物を濾過して、濾液を得る工程、
    c)濃縮工程：濾液を濃縮して、粗製エキスを得る工程、
    d)洗浄工程：粗製エキスを、無極性溶媒、及び任意選択により第2の極性溶媒で洗浄して、洗浄混合物を得る工程、並びに
    e)濾過工程：洗浄混合物を濾過して、任意選択による乾燥工程後に精製エキスを得る工程
    を含む、方法。
  2. 抽出工程a)で使用される溶媒が、ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジメチルアセトアミド、アセトン、2-ブタノン、アセトニトリル、酢酸イソプロピル、2-メチルテトラヒドロフラン、メチルtert-ブチルエーテル、水、メタノール、クロロホルム、テルペン及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  3. 抽出工程a)で使用される溶媒が、好ましくはジメチルホルムアミド、酢酸エチル、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジメチルアセトアミド、アセトン、2-ブタノン、アセトニトリル、酢酸イソプロピル、2-メチルテトラヒドロフラン、メチルtert-ブチルエーテル、メタノール、クロロホルム、テルペン及びそれらの組合せからなる群から選択される有機溶媒である、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 洗浄工程d)で使用される溶媒が、水、5〜8個の炭素原子を有するアルカン、2〜6個の炭素原子を有するアルコール及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 洗浄工程d)及び濾過工程e)が、精製エキスを得るまで少なくとも1サイクル実施される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 洗浄工程d)及び濾過工程e)が、2サイクルで実施される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 抽出工程a)で使用される溶媒が、エタノール又は水性エタノールであり、洗浄工程d)で使用される溶媒が、ヘキサン、ヘプタン、水、エタノール及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは洗浄工程d)で使用される溶媒が、ヘキサンである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 無極性溶媒及び第2の極性溶媒が、洗浄工程d)で使用され、好ましくはそれぞれヘキサン及びエタノールである、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 請求項1から8のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、精製エキス。
  10. 成分としてのインジルビンと、任意選択によりインジゴ、トリプタントリン及びチンダイノンのうちの1種又は複数とを含む、精製エキス。
  11. 成分としてのインジルビンを、精製エキスの少なくとも65%(w/w)の量、好ましくは精製エキスの65〜90%(w/w)の量で含む、精製エキス。
  12. 成分としてのインジゴを、好ましくは精製エキスの0.1〜15%(w/w)の量で更に含む、請求項10又は11のいずれか一項に記載の精製エキス。
  13. 成分としてのトリプタントリンを、好ましくは精製エキスの0.1〜5%(w/w)の量で更に含む、請求項10から12のいずれか一項に記載の精製エキス。
  14. 成分としてのチンダイノンを、好ましくは精製エキスの0.1〜5%(w/w)の量で更に含む、請求項10から13のいずれか一項に記載の精製エキス。
  15. インジルビン、インジゴ、トリプタントリン及びチンダイノンのうちの2種以上の成分が、精製エキスの90%〜99%(w/w)の量で存在する、請求項10から14のいずれか一項に記載の精製エキス。
  16. 請求項10から15のいずれか一項に記載の精製エキス、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  17. ケラチノサイトの増殖若しくは分化を阻害し、又は真皮及び上皮への単核細胞の浸潤を阻害し、又は過形成性血管をもたらす血管変化を阻害し、又は内皮細胞に対する接着分子の上方調節を阻害するのに使用するための、請求項10から15のいずれか一項に記載の精製エキス。
  18. 乾癬、炎症性皮膚状態、爪甲真菌症、皮膚がん、異常角質化誘発性疾患、皮膚老化、膿疱性皮膚症、及びCTCLからなる群から選択される疾患又は状態の処置のための、請求項17に記載の精製エキス。
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