TW201642891A

TW201642891A - 中藥青黛萃取物及其製備方法

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Publication number: TW201642891A
Application number: TW105111116A
Authority: TW
Inventors: 伊莎貝拉卡迪諾; 洛朗尚塔拉; 菲利普安德烈斯; 林胤谷; 讓湯瑪斯皮爾遜; 安托萬比利; 盧瓦克勒布朗
Original assignee: 高德美公司
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2016-12-16
Also published as: EP3482763A1; RS58304B1; JP6820273B2; TWI732754B; US20190224264A1; US9861673B2; DK3209313T3; CA2981624A1; HRP20190088T1; BR112017021191A2; KR20170133497A; CN107427545A; JP2018510890A; AU2016245203A1; US20180099020A1; ES2709359T3; US10695391B2; HUE041308T2; BR112017021191B1; TR201901146T4

Abstract

本發明提供一種關於自一或多種植物原料，例如中藥青黛及其萃取物製備萃取物之製程。本發明亦關於一種包含該萃取物之組成物，以及組成物在醫藥或化妝品應用之用途。

Description

中藥青黛萃取物及其製備方法

本發明係關於一種用於自一或多種植物原料製備萃取物，例如中藥青黛(Indigo Naturalis)及其萃取物之製程。本發明亦關於一種包含該萃取物之組成物，以及在醫藥或化妝品應用中組成物的使用。

對於乾癬(psoriasis)的常規治療通常根據患者的年齡、性別、職業及認知能力、病灶的類型及分布、患者對先前治療方法的反應及患者的其他醫療史而設計。對於乾癬的主要治療方法包含局部治療、全身治療(systemic therapy)、生物性注射(injection of biologics)及光照療法。用於局部治療的組成物包含例如皮質類固醇、葸酚(anthralin)(購得如嗎爾宜唐®(Margiton®))、煤塔(coal tar)( 購得如保麗娜® (Polytar®)、促鈣三醇(calcitriol) (購得如施革欣®(Silkis®))、他札羅汀(tazarotene) (購得如類A酸®( Tazorac®))、水楊酸(salicylic acid)及適用於治療具有輕度症狀的乾癬患者之該組成物。例如胺甲喋呤(methotrexate (MTX))、環孢黴素(cyclosporine)及視黃醇類(retinoids)的口服製劑通常用於全身治療且適用於具有中度至重度症狀的患者。生物性包含阿法賽特(alefacept)(購得如愛美麗®(Amevive®))、伊法株單抗(efalizumab)(購得如瑞體膚®(Raptiva®))、伊納西普(etanercept)(購得如恩博®(Enbrel®))及阿達木單體(adalimumab)(購得如修美樂®(Humira®))及其適用於柱設至具有中度至重度症狀的乾癬患者之藥物。例如紫外光B(UVB)光照療法、如補骨脂素加紫外光A(psoralen plus ultraviolet A (PUVA))的光化學療法(photochemotherapy)之光照療法係適用於治療具有重度症狀的乾癬患者。

然而，亦期望其他的治療方法。

中藥青黛(Indigo Naturalis )，例如青黛(Qingdai)為一種自靛青植物(Indigo-bearing plants)或產靛青植物(Indigo-producing plants)的葉子製備的藍黑色粉末。該植物較佳為選自木藍(Indigofera tinctoria L . )、馬藍(Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek (syn. Strobilanthes cusia (Nees) )、蓼藍(Persicaria tinctoria (Aiton) Spach. (syn. Polygonum tinctorium Aiton, P. tinctorium Lour. ) 及菘藍(Isatis tinctoria L. (syn. Isatis indigotica Fort. ) 所組成的群組。

在遇上使用中藥青黛或青黛的缺點之一為其在皮膚上所產生的深色及其留在衣服上的染色。青黛(Qingda)為中藥青黛(Indigo Naturalis )的俗名。其以NaOH或KOH水溶液萃取自靛青植物或產靛青植物且相當於約5-15%有機化合物，其包含之中存在靛青(indigo)及靛玉紅(indirubin)的生物鹼、以及例如碳酸鈣(calcium carbonate)及氫氧化鈣(calcium hydroxide)的85-95 %無機化合物的混合物。

可能為傳統上的另一缺點為在中藥青黛產物中僅控制靛青及靛玉紅。

因此，對於在市售藥物中開發自中藥青黛或自靛青植物或產靛青植物的萃取物、對於獲得比中藥青黛的顏色更少的萃取物以及對於控制該萃取物的主要組成物及具有該萃取物的主要組成物的特徵之需求仍未被滿足。更具體而言，其將有利於提供一種顏色少的萃取物，同時維持或增加其用於治療或緩和例如乾癬的皮膚疾病或皮膚異常的功效。

本發明係藉由提供易於處理的精製萃取物，其保留自中藥青黛或青黛的活性成分來解決此問題，以確保其治療功效及安全性。

本發明的一部分係關於一種用於獲得用於治療或緩和例如乾癬的皮膚疾病或異常而自中藥青黛，例如自青黛，其中含有例如靛玉紅及靛青的萃取物之製程。

在一態樣中，本發明係提供一種用於自例如中藥青黛或一或多種靛青植物或產靛青植物，較佳為選自木藍、馬藍、蓼藍及菘藍所組成地群組的葉子及/或樹幹之一或多種植物原料製備萃取物之製程。製程包含下列步驟： a)萃取步驟：以第一極性溶劑或中度極性溶劑萃取中藥青黛或選自上述的一或多種植物的葉子及/或樹幹，以獲得萃取的混合物； b)過濾步驟：過濾萃取的混合物，以獲得濾液； c)濃縮步驟：濃縮濾液，以獲得粗萃取物； d)清洗步驟：以非極性溶劑、及任選地第二極性溶劑清洗粗萃取物，以獲得清洗混合物；以及 e) 過濾步驟：過濾清洗混合物，以任選地在例如根據用於乾燥的常規方法之乾燥步驟之後獲得精製萃取物。

根據本發明的製程允許獲得精製萃取物；該精製萃取物係定義如下。在下文說明書中，用語「植物原料(botanical raw material)」係指中藥青黛(例如，市售的青黛(Qingdai))、或較佳為選自木藍、馬藍、蓼藍及菘藍所組成地群組之靛青植物或產靛青植物的葉子及/或樹幹，在採收及收集之後，可藉由例如發酵進行處理。

在部分實施例中，用於a)萃取步驟的溶劑可包含，但不限於此，二甲基甲醯胺(dimethyl formamide (DMF))、乙酸乙酯(ethyl acetate)、乙醇(ethanol)(包含例如85%乙醇的乙醇水溶液(aqueous ethanol)、二甲基亞碸(dimethylsulfoxide (DMSO))、二氯甲烷(dichloromethane (DCM))、四氫呋喃(tetrahydrofuran (THF))、二甲基乙醯胺(dimethylacetamide (DMA))、丙酮、2-丁酮(2-butanone)、乙腈(acetonitrile)、乙酸異丙酯(isopropyl acetate)、2-甲基四氫呋喃(2-methyl tetrahydrofurane (MeTHF))、甲基叔丁基醚(methyltert -butyl ether)、水、甲醇、三氯甲烷(chloroform)、萜(terpene)(檸檬烯(limonene)、對異丙基甲苯(p-cimene)等)或其組合。較佳地，溶劑可為乙酸乙酯、MeTHF、乙醇或乙醇水溶液。

此外，a)萃取步驟可使植物原料對溶劑的比(即，公克的材料被萃取成mL的溶劑)在1:5至1:150(g/mL)的範圍下進行，例如自1:5至1:100的範圍，例如1:6、1:15、1:20、1:30、1:50、1:100。

在特定實施例中，在a)萃取步驟中使用的溶劑係為有機溶劑。更具體而言，溶劑選自二甲基甲醯胺、乙酸乙酯、乙醇、二甲基亞碸、二氯甲烷、四氫呋喃、二甲基乙醯胺、丙酮、2-丁酮、乙腈、乙酸異丙酯、2-甲基四氫呋喃、甲基叔丁基醚、甲醇、三氯甲烷、萜及其組合所組成之群組。

在部分實施例中，a)萃取步驟可被重複直到藉由例8A揭露的HPLC法測定在b)過濾步驟過濾的剩餘植物原料中的靛玉紅含量小於0.10%。

在部分另一實施例中，a)萃取步驟藉由加熱，例如直到回流。

a)萃取步驟隨後進行b)過濾步驟，且接著為用於濃縮濾液的c) 濃縮步驟，以提供粗萃取物。b)過濾步驟可趁熱執行。

在部分實施例中，d) 清洗步驟被重複直到藉由例8A揭露的HPLC法測定精製萃取物中的靛玉紅(% w/w)的含量為至少55% (w/w)。

在部分實施例中，d) 清洗步驟中使用的溶劑係選自包含水、具有5至8個碳原子的烷烴(alkane)、具有2至6個碳原子的醇類及其組合的群組。例如，該溶劑包含，但不限於此，己烷、庚烷、乙醇、水或其組合。例如，在d)清洗步驟中，在使用兩種或兩種以上溶劑的情況下，依序或同步使用己烷或庚烷及乙醇水溶液。

根據實施例，在d)步驟使用的非極性溶劑為己烷。

根據另一特定實施例，d)步驟以非極性溶劑與第二極性溶劑執行。較佳地，第二極性溶劑為乙醇。更加地，在d)步驟使用的非極性溶劑為己烷且第二極性溶劑為乙醇。

在部分其他實施例中，自c)濃縮步驟所獲得的粗萃取物進行下列過程至少一循環直到獲得精製萃取物：粗萃取物藉由溶劑清洗(d)步驟)及過濾(e)步驟)，任選地隨後進行乾燥步驟，以產生精製萃取物。根據特定實施例，d)清洗步驟及e)過濾步驟僅執行一循環，以獲得精製萃取物。當執行一循環以上時，可使用相同或不同的用於清洗的溶劑。此外，粗萃取物可在回流下以溶劑清洗，混合物可冷卻至室溫且接著過濾，任選地隨後進行乾燥步驟，以產生精製萃取物。

在較佳實施例中，執行兩個循環。具體而言，自c)濃縮步驟獲得的粗萃取物在較佳為己烷的非極性溶劑中清洗(d)步驟)及過濾(e)步驟)，任選地隨後進行乾燥步驟。接著，己烷萃取物藉由較佳為乙醇的有機極性溶劑清洗(d)步驟)且接著過濾(e)步驟)，任選地隨後進行乾燥步驟，以獲得精製萃取物。

任選地，微粒化步驟在e)步驟之後執行，因而提供具有在25與35 µm之間，較佳為約30 µm的粒徑的精製萃取物。

在另一較佳實施例中，當精製萃取物在最後步驟微粒化時，得到的粒子的99%等於或小於30 µm。

在另一態樣中，本發明提供一種自中藥青黛的精製萃取物。

本發明亦提供一種含有靛玉紅的精製萃取物，該靛玉紅作為精製萃取物的至少55% (w/w)的含量的成份。在部分實施例中，靛玉紅的含量存在於精製萃取物的至少60%、65%、70%、75%、80%或85% (w/w)。例如，靛玉紅的含量可為精製萃取物的55-90% (w/w)，例如精製萃取物的55-60%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、60-65%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、65-70%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、70-75%、70-80%、70-85%、70-90%、75-80%、75-85%、75-90%、80-85%、80-90%或85-90% (w/w)。

較佳地，本發明提供一種含有靛玉紅的精製萃取物，該靛玉紅作為精製萃取物的至少65%(w/w)的含量的成份。

較佳地，靛玉紅的含量為精製萃取物的65-90% (w/w)。

在部分實施例中，精製萃取物含有作為成分的靛青。靛青的含量可為精製萃取物的0-15% (w/w)，例如精製萃取物的0.1-15%、0.5-15%、1-15%、2-15%,或3-15% (w/w)。

在部分其他實施例中，精製萃取物進一步包含作為成分的色胺酮。色胺酮的含量可為精製萃取物的0.01-5%或較佳為0.1-5% (w/w)，例如，精製萃取物的0.01-1%、0.05-1%、0.1-1%、0.1-5%、0.5-1%或0.5-5% (w/w)。

在進一步部分實施例中，精製萃取物進一步包含作為成分的青黛酮。青黛酮的含量可為精製萃取物的0.1-5% (w/w)，例如，精製萃取物的0.1-1%、0.1-5%、0.5-1%或0.5-5% (w/w)。

在進一步部分實施例中，在精製萃取物中，包含上述的兩種或兩種以上表示精製萃取物的至少60%(w/w)，例如65%、70%、75%、80%、85%、90%或95% (w/w)，較佳為至少90%(w/w)。特徵成分，包含上述的兩種或兩種以上的含量為精製萃取物的60-99% (w/w)，例如60-95%、65-95%、70-95%、80-95%、85-95%、90-95%、60-99%、65-99%、70-99%、80-99%、85-99%或90-99% (w/w)，且較佳為90-99% (w/w)的含量。

在進一步另一態樣，本發明提供一種醫藥組成物，其包含上述的精製萃取物及藥學上可接受的載體。該組成物為局部給藥或口服給藥的形式。

在進一步另一態樣，本發明提供一種化妝品組成物，其包含上述的精製萃取物及化妝品上可接受的載體。該組成物為局部給藥的形式。

在更進一步另一態樣中，本發明一種在用於抑制角質細胞的增生或分化、抑制單核細胞浸潤至真皮及表皮、抑制造成增生血管的血管變化或抑制內皮細胞上的黏附分子上升的醫藥組成物或化妝品組成物的製備之精製萃取物的用途。該用途包含將上述組成物給藥需要其的對象(例如，人類)。

在進一步另一態樣中，本發明提供一種上述組成物用於選自由乾癬、發炎皮膚狀況、甲黴菌病 (onychomycosis)、皮膚癌、不正常角質化誘發疾病、皮膚老化、膿皰性皮膚病(pustulardermatosis)及皮膚T細胞淋巴瘤(Cutaneous T Cell Lymphoma (CTCL))所組成的群組之皮膚疾病或狀況的治療或緩和。

在另一態樣中，本發明提供一種用於抑制角質細胞的增生或分化、抑制單核細胞浸潤至真皮及表皮、抑制造成增生血管的血管變化或抑制內皮細胞上的黏附分子上升的方法，其包含將本發明的精製萃取物與需要其的細胞接觸之步驟。此方法可施加在體外或體內。

在更進一步另一態樣中，本發明提供一種用於皮膚疾病或皮膚狀況的治療之方法，其包含將根據本發明的精製萃取物的有效量給藥需要其的對象。該疾病或狀況係選自由乾癬、發炎皮膚狀況、甲黴菌病、皮膚癌、不正常角質化誘發疾病、皮膚老化、膿皰性皮膚病及CTCL所組成的群組。

在部分實施例中，發炎皮膚狀況可為異位性皮膚炎(atopic dermatitis)、濕疹(eczema)或重複感染皮膚(superinfected skin)。皮膚老化可為皮膚年輕化(skin rejuvenation)、對疤痕或皮膚老化的組織再生。不正常角質化可為痤瘡(acne)、魚鱗癬(ichtyosis)或掌蹠角化症(palmoplantar keratoderma)。皮膚癌可為癌前期(precancerous)皮膚癌，例如光化性角化症(Actinic Keratosis) (AK)、波恩氏病(Bowen’s disease)；皮膚癌，例如，SCC、BCC、NMSC；黑色素瘤及HPV誘發的皮膚癌。

如本文所使用，靛玉紅、靛青、色胺酮(tryptanthrin)及青黛酮(qingdainone)具有如文中所述的化學式，且更具體而言為下列結構。

「極性溶劑(polar solvent)」係指具有高介電常數及高偶極矩的溶劑；且例子包含水、醇類，例如2至6個碳原子的醇類(例如乙醇)、乙腈、二甲基甲醯胺(DMF)及二甲基亞碸(DMSO)。

「中度極性溶劑(moderately polar solvent)」係指具有適當的高介電常數的溶劑；且例子包含乙酸乙酯, 二氯甲烷(DCM)、四氫呋喃(THF) 、二甲基乙醯胺(DMA)、丙酮、2-丁酮、乙酸異丙酯、1,4-二[口咢]烷(1,4-dioxan)、2-甲基四氫呋喃(MeTHF)、甲基叔丁基醚(MTBE)。

「非極性溶劑(non-polar solvent)」係指具有低介電常數的溶劑；且例子包含二乙醚(diethyl ether)、石油醚(petroleum ether (PE))、甲苯(toluene)及5至8個碳原子的烷類，例如庚烷(heptane)、己烷(hexane)、戊烷(pentane)或環己烷(cyclohexane)。

「室溫(room temperature)」係指18°C-35°C。

用語「乾癬(psoriasis)」或「乾癬疾病(psoriasis disease)」係指所屬領域具有通常知識者已知的所有類型乾癬。其包含慢性斑塊性乾癬(chronic plaque psoriasis)、水滴狀乾癬(guttate psoriasis)、紅皮狀乾癬(erythrodermic psoriasis)、膿皰狀乾癬(pustular psoriasis)、皺褶型乾癬(inverse psoriasis)、(已知如屈曲性乾癬(flexural psoriasis))、指甲型乾癬(nail psoriasis)、乾癬性關節炎(psoriatic arthritis) ，但不限於此。

用語「精製萃取物(refined extract)」係指固態、半固態或油狀萃取物，較佳為固態萃取物，其含有小於10% (w/w)的於製備該精製萃取物製程中使用的水及/或溶劑。精製萃取物更佳為具有增加活性成分量的特徵，該活性成分包含其之中存在靛青、靛玉紅、色胺酮及/或中藥青黛，其較佳為與青黛(Qingdai)或中藥青黛相比富含靛玉紅的生物鹼。更具體而言，根據本發明的精製萃取物包含至少60%或60%以上，較佳為70%以上(w/w)的活性成分，其包含靛青、靛玉紅、色胺酮及/或青黛酮。

如本文所使用的用語「粗萃取物(crude extract)」係指固態、半固態或油狀萃取物，較佳為固態或半固態萃取物，其含有小於15% (w/w)(例如，5-15%、5-10%)的於製備精製萃取物製程中使用的水及/或溶劑。相對於青黛(Qingdai)或中藥青黛，粗萃取物含有的靛玉紅比精製萃取物少。粗萃取物係根據本發明的c)濃縮步驟而獲得。濃縮步驟更具體而言係藉由將濾液送至濃縮器(例如減壓)執行，以使製程中使用的水及/或溶劑移除，因而濃縮萃取物中存在的活性成分，其包含靛青、靛玉紅、色胺酮及/或青黛酮。

如本文所使用的「一次循環(one cycle)」係指依序執行一次的d)清洗步驟及e)過濾步驟的兩個步驟。如本文所使用的「兩次循環(two cycles)」係指依序執行兩次的d)清洗步驟及e)過濾步驟的兩個步驟。

用語「有效量(effective amount)」係指精製萃取物的劑量水平，其平均上對病患產生治療效益(例如，疾病、異常或症狀的改良、舒緩或治癒)。

本發明提供一種用於自中藥青黛或自較佳為選自木藍、馬藍、蓼藍及菘藍所組成之群組的一或多種的靛青植物或產靛青植物的葉子及/或樹幹製備的精製萃取物之製程。

中藥青黛係得自葉子及樹幹，較佳為得自木藍、馬藍、蓼藍及菘藍的葉子。較佳地，中藥青黛係得自蓼藍及/或馬藍的葉子及樹幹。

當中藥青黛為市售(市售中藥青黛的例子(植物/供應商)：馬藍/德隆(Delong)；木藍/KMA出口或Sam Vegetable Colours PVT Ltd；菘藍/Andrea Primavera或Bleu de Lectoure；蓼藍/ CouleurGarance或EARL 4 saisons)時，其可藉由所屬技術領域具有通常知識者已知的通常方法產自一或多種的上述植物的葉子及樹幹。該方法可概括如下：將新鮮採收的蓼藍及/或馬藍的樹幹及葉子加入至露天的池子，將水加入至池子以覆蓋樹幹/葉子。在浸泡數天(26-30 ºC)之後，將使樹幹/葉子腐爛。接著加入石灰鹼(lime soda)同時攪拌。當浸泡混合物的顏色自綠色轉變成深紫色時，收集沉澱物、清洗(通常以水清洗2~3次)，且接著乾燥以產生中藥青黛粉末。

精製萃取物可藉由根據本發明之製程製備，其包含由下列組成的步驟：a) (i)將萃取溶劑，極性或中度極性溶劑(例如酒精或乙酸乙酯) 加入至中藥青黛粉末，已產生混合物；(ii)加熱並攪拌該混合物一段時間(例如，30分鐘、1小時、2小時)；b) (iii)過濾加熱混合物，同時趁熱移除不溶性副產物以產生濾液；c) (iv)濃縮濾液以產生粗萃取物；d) (v)將清洗溶劑(例如，水、或非極性、或極性溶劑或其混合物)加入至粗萃取物以產生清洗混合物；(vi)加熱並攪拌清洗混合物一段時間(例如，30分鐘、1小時、2小時)；e) (vii)例如在室溫(例如，18°C-35°C)下過濾清洗混合物，以收集精製萃取物；任選地(viii)重複步驟(v)至(vii)，直到如藉由例8A中揭露的HPLC法測定，殘留物(即，萃取物)中的靛玉紅(% w/w)的量大於55% (w/w)，較佳為大於65% (w/w)，(ix)任選地根據常規方法(例如，空氣乾燥、冷凍乾燥)乾燥精製萃取物。在步驟(v)及(viii)中的清洗溶劑可為相同或不同。

在較佳實施例中，精製萃取物藉由包含下列步驟的製程製備：

a)以乙醇在2及8小時之間回流來萃取中藥青黛；

b) 在不低於65°C的溫度下過濾混合物，以獲得濾液；

c) 濃縮濾液，以獲得粗萃取物，為了完全移除溶劑及仍存在於溶劑中的最後成分，任選地(以額外的水)過濾該粗萃取物並乾燥；

d) (i)在15及60分鐘之間且不低於50°C的溫度下以己烷清洗粗萃取物，

(ii) 在室溫下過濾在步驟d) (i)獲得的混合物，以獲得產物，任選地以乙醇及水沖洗該混合物

(iii) 以乙醇回流清洗在步驟d) (ii)獲得的產物；以及

e) 在室溫下過濾在步驟d)獲得的清洗混合物，且在不低於80°C的溫度乾燥結果產物，以獲得任選地微粒化的萃取物。

在另一較佳實施例中，當精製萃取物在最後步驟微粒化時，約99%的粒徑在25至35 µm的範圍，較佳為約30 µm。

如本文所使用的「約(about)」或「約(around)」將以所屬技術領域中具有通常知識者所理解，且將對於全文其中使用該用語的部分範圍有所變化。若於全文其中使用的該用語對於所屬技術領域中具有通常知識者已知的的使用為不明確時，「約(about)」或「約(around)」將表示最多加減該特定用語的20%，較佳為10%。

例如靛青、靛玉紅、色胺酮及青黛酮的成分含量可藉由如例8所揭露的HPLC法進行定量。

上述製程使其可獲得精製萃取物，其為易於處理且可進一步配製成醫藥或化妝品組成物。此外，製程提供富含靛玉紅的萃取物。因此在選自由靛青、靛玉紅、色胺酮及青黛酮所組成的列出中的一或多個之中，具有獲得的精製萃取物的成分的至少60% (w/w)的特徵；較佳為至少90% (w/w)。儘管製程所獲得的精製萃取物為固態形式，但用於精製萃取物的液態形式的製備可基於處理或配製需要而藉由固態的精製萃取物的簡單溶解或溶解化製造。

在此情況下，液態形式的精製萃取物可根據本發明的製程製備，該製程包含由下列組成的步驟：a) (i)將萃取溶劑、極性或中度極性溶劑(例如，酒精或乙酸乙酯) 加入至中藥青黛粉末，以產生混合物；(ii)加熱並攪拌混合物一段時間(例如，30分鐘、1小時、2小時)；b) (iii)過濾加熱混合物，同時趁熱移除不溶性副產物以產生濾液；c) (iv)濃縮濾液以產生粗萃取物；d) (v)將清洗溶劑(例如，水、或非極性、或極性溶劑或其混合物)加入至粗萃取物，以產生清洗混合物；(vi)加熱並攪拌清洗混合物一段時間(例如，30分鐘、1小時、2小時)；e) (vii)例如在室溫(例如，18°C-35°C)下過濾清洗混合物，以收集精製萃取物；任選地(viii)重複步驟(v)至(vii)，直到如藉由例8A中揭露的HPLC法測定，殘留物(即，萃取物)中的靛玉紅(% w/w)的量大於55% (w/w)，較佳為大於65% (w/w)，(ix)溶解精製萃取物，因而獲得藥學上可接受的溶劑或載體。在步驟(v)及(viii)中的清洗溶劑可為相同或不同。

本發明亦提供藉由上述製程所獲得的萃取物，較佳為形成植物萃取物、中藥青黛萃取物或自較佳地選自由木藍、馬藍、蓼藍及菘藍所組成的群組之靛青植物或產靛青植物的葉子及/或樹幹的萃取物，可獲得的該萃取物包含靛玉紅，其作為精製萃取物的至少55% (w/w)，較佳為至少65% (w/w)的量的成分。精製萃取物係為固態形式且可藉由上述或任何其他適合的製程製備。精製萃取物可進一步包含靛青、色胺酮及/或青黛酮，其可與靛玉紅一起被共同萃取。尤其是，含有多成分的萃取物可提供偕同效應(synergistic effect)。

本發明進一步提供一種包含精製萃取物的醫藥組成物。醫藥組成物可利用所屬領域具有通常知識者已知的技術配製成用於局部或口服給藥的適合劑量形式。醫藥組成物可另外包含例如在藥物製造領域中廣泛採用的藥學上可接受的載體。例如，藥學上可接受的載體可包含下列一或多種的製劑：溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、結合劑、賦形劑、安定劑、螫合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤滑劑、吸收延緩劑、脂質體等。較佳地，溶劑係選自由水、甘油、乙醇、丙二醇(propylene glycol)、丁二醇(butylene glycol)、二丙烯甘醇(dipropylene glycol)、乙氧基化(ethoxylated)或丙氧基化二甘醇(propoxylateddiglycols)、環多元醇(cyclic polyol)、凡士林(petroleum jell)、蔬菜油及該溶劑的任意混合物所組成之群組。較佳地，醫藥組成物配製成局部配製，其可直接地施加在皮膚，例如患有乾癬的皮膚。適用於醫藥組成物的局部配製可為乳液、膠、軟膏、霜劑、貼劑、擦劑、霧劑(aerosol)、噴劑、洗劑、漿液(serum)、糊劑、泡沫劑或滴劑。在本發明的一實施例中，醫藥組成物係藉由將根據本發明的精製萃取物摻混例如所屬領域中已知及通常使用的基質配製成外用製劑。

在部分實施例中，根據本發明的醫藥組成物的劑量及給藥頻率可依據下列因素而改變：治療疾病的嚴重度、給藥途徑及治療對象的體重、年齡、身體狀況及反應。在進一步或其他實施例中，精製萃取物的量係在約0.001至約1000 mg/kg 體重/天，例如在約0.01至約500、300或100mg/kg 體重/天的範圍。

本發明亦提供一種包含精製萃取物的化妝品組成物。化妝品組成物可呈現適用於局部應用的形式，其包含化妝品或皮膚病學上可接受的載體或介質。「化妝品或皮膚病學上可接受(Cosmetically or dermatologically acceptable)」表示其進行與皮膚或人類皮膚附屬物接觸而不會構成毒性、不耐性、不穩定性、過敏反應等風險之適用於使用者的介質。在化妝品組成物中，精製萃取物可先在例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙烯甘醇、乙氧基化或丙氧基化二甘醇、環多元醇、凡士林、蔬菜油及該溶劑的任意混合物之一或多種化妝品或皮膚病學上可接受的溶劑中溶解。

上述精製萃取物及組成物可用於疾病或狀況的治療或減輕。藉由治療其至少表示與影響對象的病理狀況相關的症狀的減輕，其中用於廣義上的減輕係指至少降低例如與治療例如皮膚炎、乾癬等病理狀況相關的症狀之參數數值。因此，治療亦包含其中與例如避免發生的完全抑制、或例如終止的停止相關的病理狀況或至少症狀的情況，以使宿主不在遭受病理狀況或具有病理狀況的特徵之至少症狀。因此，治療包含治癒及管理疾病狀況兩者。因而，上述萃取物及組成物可用於選自由乾癬、發炎皮膚狀況、甲黴菌病、皮膚癌、不正常角質化誘發疾病、皮膚老化及膿皰性皮膚病所組成之群組的疾病或狀況之治療或減輕。

本發明進一步提供一種用於抑制角質細胞的增生或分化、抑制單核細胞浸潤至真皮和表皮、抑制造成增生血管的血管變化或抑制內皮細胞上黏附分子上升(upregulation)的方法，其包含將上述萃取物及組成物投予需要的對象。

精製萃取物及組成物的功效可藉由對於其抑制增生或分化或發炎的體外(in vitro )模式進行評估。例如，體外測試可在STAT-3/STAT-1、MAPK、NFκB參與途徑的細胞激素訊號上實施。

精製萃取物及組成物的功效可進一步藉由對於其治療疾病或異常的活性的體外模式評估。例如，可測試包含基因轉殖(transgenic)及基因剃除(knockout)模式的基因工程小鼠。

本申請的創新特徵於所附申請專利範圍中具體闡述。本申請的特徵及優點的較佳理解將藉由參照下列其中利用本申請的原理之闡述例示性實施例進行詳細說明而獲得。

儘管已顯示且在本文中描述本申請的較佳實施例，然而此實施例僅藉由例示的方式提供。應理解的是，本文所述的本申請的實施例的各種替代可在實施應用中採用。所屬領域具有通常知識者將理解的是在不脫離本申請而可進行各種變異、變化及替換。下列申請專利範圍意在定義本申請的態樣的範圍且因而涵蓋該申請專利範圍的範圍及其等效中的方法及結構。

將理解的是，在本文稱為任何先前技術出版物，此參照將不構成承認該出版物形成所屬領域通常知識的一部分。本申請引用的所有文件或部分的文件而不限於專利、專利申請、文章、書籍、手冊及條約其全部任何目的係明確併入於此做為參考。

本文百分比除非另外指定，係藉由重量相對於萃取物或特定產物的重量表示。

此外，本發明的態樣及優點將在下列例示性實驗部分揭露。

實驗

1. 精製中藥青黛萃取物的製備及用於分析的分析方法

例 1 ：精製中藥青黛萃取物的製備

作為用於下列製備的青黛購得自德隆製藥(靛青2.62%及靛玉紅 0.284%(在例8A中描述的HPLC法)及色胺酮 0.0046%(在例8B中描述的HPLC法)。

500g青黛懸浮在10L乙酸乙酯中。回流2小時下攪拌混合物，且接著在75ºC下過濾。將濾液進行減壓濃縮以產生黑色固體。將粗萃取物在250mL己烷中攪拌且加熱回流1小時。冷卻至室溫之後，過濾懸浮液以得到黑色殘留物(粗萃取物)。

將0.50g的黑色殘留物在25mL己烷中回流1小時之後，冷卻至室溫，接著藉由過濾以得到精製萃取物，其為452mg深紅色固體。HPLC：62.9%靛玉紅、12.9%靛青及 0.53%色胺酮。

例 2 ：精製青黛萃取物的製備

將在例1中使用的500g青黛懸浮在10L醇(乙醇)中。混合物在回流下攪拌2小時，且接著在75ºC下過濾。將濾液進行減壓濃縮以產生黑色固體，其在260mL己烷中攪拌且加熱回流1小時。一旦冷卻至室溫，過濾懸浮液以得到黑色殘留物。

0.80g的黑色殘留物在24mL酒精(乙醇)中回流一小時之後，接著冷卻至室溫，並隨後藉由過濾以得到精製萃取物，其為深紅色固體(538mg)。HPLC：83.6%靛玉紅、6.35%靛青及0.75%色胺酮。

例 3 ：精製青黛萃取物的製備

如例1使用的500g的青黛懸浮在10L乙酸乙酯中。將混合物在回流下攪拌2小時，且接著趁熱過濾。將濾液進行減壓濃縮以產生黑色固體。將粗萃取物在250mL己烷中攪拌且加熱回流1小時。在冷卻至室溫之後，將懸浮液過濾以得到黑色殘留物。

0.75g的黑色殘留物將在22.5mL乙醇中回流1小時，且冷卻至室溫，隨後藉由過濾以得到精製萃取物，其為深紅色固體(538mg)。HPLC：77.9%靛玉紅、15.9% 靛青及0.56%色胺酮。

例 4 ：精製青黛萃取物的製備

如例1使用的500g的青黛懸浮在2.1L DMF中。將混合物在50ºC下攪拌40分鐘。一旦冷卻至20ºC，將懸浮液過濾。將濾液進行減壓濃縮以產生黑色固體，其在130mL己烷中攪拌並加熱回流1小時。一旦冷卻至20ºC，將懸浮液過濾以得到黑色殘留物。

以46.8 ml 乙醇清洗1.56g的黑色殘留物，且加熱回流1小時，接著冷卻至20ºC，隨後藉由過濾以產生精製萃取物(766mg)。HPLC：66.3%、靛玉紅、 9.76%靛青。

例 5 ：精製青黛萃取物的製備

如例1使用的500g的青黛懸浮在3L DMF中。將混合物在30ºC下攪拌1小時，且接著過濾。將濾液進行減壓濃縮以產生黑色固體，其在230mL己烷中攪拌並加熱回流1小時。一旦冷卻至20ºC，將懸浮液過濾以得到黑色殘留物。

以59mL 85%乙醇(85% aq. 酒精)清洗1.96g的黑色殘留物，且接著加熱回流1小時，隨後藉由趁熱過濾，以產生精製萃取物(1.02g)。HPLC：69.4%靛玉紅、18.7% 靛青及0.62%色胺酮。

例 6 ：精製青黛萃取物的製備

在回流情況下以2L的乙醇92% (92% 含水乙醇)萃取100g青黛2小時。一旦完成，將混合物以AF6過濾器(Buchner)趁熱過濾，以獲得深藍紅溶液，其為濾液。此濾液在真空之下減少以乾燥而得到2.4 g的乾燥殘留物。此殘留物以120 mL的己烷在回流之下清洗1小時。一旦完成，混合物冷卻至室溫2小時接著在真空之下過濾，以產生312.9mg深紅色精製萃取物。

以15 m的乙醇92% (92% 含水乙醇)在回流下清洗280mg的此精製萃取物1小時。一旦完成，將該溶液冷卻至室溫，且接著過濾以在烘箱(80°C) 乾燥1h30之後，產生159 mg的深紅/勃艮第酒紅(burgundy)精製萃取物。(0.18%)；HPLC：82.31%靛玉紅、8.99%靛青及0.81%色胺酮。

例 7 ：微粒化步驟

自先前例示中獲得的精製青黛萃取物的微粒化步驟係以下列設備執行：

-微磨機(micronizer)：氣流粉碎Mill Diameter 200

-給料器：此設備用於粉末的配料以進給微磨機。該配料係由兩個螺桿所製造。此系統允許流動的規律性。

微粒化包括以空氣噴射射出粉末的微粒。微粒的接觸使其爆炸。

在微粒化期間，紀錄下列微粒化的參數：

-環壓力：6 巴(bar)

-注射器壓力：3巴(bar)

-粉末進給的流速：25 kg/h

微磨機可為圓柱形外殼-外殼周圍的孔用於空氣的注入。

粉末導入微磨機；微粒以空氣噴射推動。當微粒具有良好的尺寸時，其集中在微磨機的中心且其為無聲的。為了避免因其他異物或設備的破片汙染，執行額外的篩分(篩子：700 μm)。

該步驟在微粒化之後且包裝之前手動進行。

獲得的均質產物的粒度分析係根據粒度分布(particular size distribution (PSD))法進行[分析規格：D99 ≤ 30 μm]。

例 8 ：用於分析的分析方法

A - 反相HPLC法：

用於同步定量靛青及靛玉紅的新反相HPLC法係基於歐洲藥典(European Pharmacopoeia) (Pharmeuropa Vol.20, No.1, January 2008, P118-119.)、中國藥典(2010 Edition, P185)及文獻(Chen LW, Liao W, Yang M. Jia DY, He P, Chen SM, Fu CM. 藉由HPLC定義中藥青黛中的靛青及靛玉紅。West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, 23(6), 714-715；Liu ZY, Su ZT, Gao YN, Yang M. 藉由HPLC同步定義中藥青黛中的靛青及靛玉紅。China Pharmacist 2010, 13(3), 324-326)所建立。

層析系統(Agilent 1200系列)由G1322A除氣器、G1211A泵、G1367B自動注射器(autosampler)、G1316A管柱恆溫器(column oven)及G1315B DAD偵測器構成。其他設備包含SK7200H超音波裝置(中國)及Milli-Q水純化系統(USA)。

六批青黛收集自三個中國的供應商。靛青標準品購得自東京化成工業(Tokyo Chemical Industry Co.) (日本，＞98%)。色胺酮購得自Accela Co. (中國，＞97%)。靛玉紅在和記黃埔醫藥(Hutchison Medipharma (HMP))合成及再結晶(＞99%在HPLC)。

在實驗中使用有機過濾膜(0.45μm，中國)、二甲基甲醯胺(DMF，分析等級)、甲醇(HPLC等級)、甲酸(formic acid) (FA，HPLC等級)、三乙胺(triethylamine) (TEA，分析等級)及以Milli-Q水純化系統純化的超純水。

DMF溶液的前處理：以乾N2吹入500 mL的DMF半小時，接著加入0.5 mL TEA並混合以得到DMF溶液(含有0.1%TEA，無氧)。此DMF溶液用於樣品製備。

50mg的青黛懸浮於50mL DMF溶液。在超音波萃取10分鐘之後，將懸浮液經由0.45µm注射式過濾器(syringe filter)過濾，以產生青黛的測試溶液。

20mg的精製萃取物(獲得自例2)懸浮於200mL DMF溶液中。在超音波萃取之後，將懸浮液經由0.45µm注射式過濾器過濾，以產生萃取物的測試溶液。

分離係在Waters Symmetry C18管柱(5μm, 3.9×150mm)上執行。移動相係為65%甲醇(含有0.05% FA)。流速係為1.0mL/分鐘 15分鐘且管柱溫度係為25°C。注射量係為4μL。偵測波長係為289nm，以使靛青及靛玉紅可同步測定。靛青及靛玉紅可在一次注射中同步分析。靛青及靛玉紅的典型HPLC層析圖係如第1圖所示。

B -HPLC 分析法以定量色胺酮：

用於定量色胺酮的新HPLC分析法亦被建立。樣品濃度將因在青黛及其富含產物，精製萃取物兩者中色胺酮的濃度低因而進行調整。分析可在25°C下的Waters Symmetry C18管柱(5μm, 3.9×150mm)執行。移動相為甲醇(含有0.05% FA，洗出液B(eluent B))及水(含有0.05% FA，洗出液A)。梯度洗出概述如下：50% B等度(isocratic)(12分鐘)、50%至100% B(1分鐘)、100% B等度(6分鐘)及100%至50% B(1分鐘)。流速為1.0mL/min且管柱溫度為25°C。注射量為10μL。偵測波長為254nm。

400mg的青黛懸浮在20mL DMF溶液。在超音波萃取20分鐘之後，將懸浮液經由0.45µm注射式過濾器過濾，以提供青黛的測試溶液。

15mg的精製萃取物(獲得自例2)懸浮於20mL DMF溶液。在超音波萃取之後，將懸浮液經由0.45µm注射式過濾器過濾，以提供精製萃取物的測試溶液。

色胺酮、青黛及精製萃取物的典型HPLC層析圖如第2圖所示。

例 9 ：精製青黛萃取物的長期穩定性

根據例6製備的精製青黛萃取物提交穩定性狀況。製備萃取物的HPLC特徵如下：80.16%靛玉紅；10.95%靛青；0.64%色胺酮。

在穩定性研究期間使用的儲存狀況為25°C ± 2°C及60% RH ± 5% RH的氣候環境(Piardi CC1400)。

根據草藥藥品質量指南(GUIDELINE ON QUALITY OF HERBAL MEDICINAL PRODUCTS) (CPMP/QWP/2819/00 rev 01)，定量屬性必須符合限制[限制：靛玉紅的含量(%乾燥萃取物) = 65.0~85.0；靛青的含量(%乾燥萃取物) =5.0~15.0；色胺酮的含量(%乾燥萃取物) =£.5.0]。

指標物含量的變異必須不超過初始測定值的± 10%。

結果係如下列表1所示。

[表1]

1個月、2個月及3個月的HPLC圖譜與T0的圖譜層析圖符合。因此，定量屬性符合限制。靛青、靛玉紅及色胺酮的含量變異不超過初始測定值的± 10%的可接受範圍。

因此，根據本發明製備的精製青黛萃取物可在25°C 及60% RH下至少穩定6個月。

2. 精製青黛萃取 物在生化及細胞測定的體外評估

例 10: 體外測定及結果

A. 一般試劑：

DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Cat. No. D2650

Janus 激酶1(Janus kinase 1)(JAK1), Life technologies^TM , Cat. No. PV4774

Janus 激酶1 (JAK2), Life technologies^TM , Cat. No. PV4210

Janus 激酶1(JAK3), Life technologies^TM , Cat. No. PV3855

CDK1, Life technologies^TM , Cat. No. PV3292

CDK2, Life technologies^TM , Cat. No. PV3267

CDK5, Life technologies^TM , Cat. No. PV3000

Z'-LYTE®激酶測定套組-酪氨酸(Tyrosine) 6胜肽，Life technologies^TM , Cat. No. PV4122

Z'-LYTE®激酶測定套組 - Ser/Thr 12胜肽，Life technologies^TM , Cat. No. PV3673

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), Life technologies^TM , Cat. No. C11965

RMPI-1640, Life technologies^TM , Cat. No. A10491

胎牛血清(Fetal bovine serum) (FBS), Life technologies^TM , Cat. No. 10099141

EpiLife ® Medium, Life technologies^TM , Cat. No. M-EPI-500-CA

HKGS, Life technologies^TM , Cat. No. S-001-5

重組人類(Recombinant human )IL-2, Peprotech Inc, Cat. No. 200-02

重組人類IL-6, Peprotech Inc, Cat. No. 200-06

重組人類IL-3, Peprotech Inc, Cat. No. 200-03

重組人類GM-CSF, Peprotech Inc, Cat. No. 300-03

重組人類IL-22, Peprotech Inc, Cat. No. 200-22

重組人類TNFα, R&D, Cat. No. 210-TA-010

脂多醣體(Lipopolysaccharide) (LPS), Calbiochem, Cat. No. 437650

抗人類CD3功能等級®(Anti-Human CD3 Functional Grade®)純化的(aCD3) (殖株：OKT3) eBioscience, Cat. No. 16-0037-85

抗人類CD28功能等級®(Anti-Human CD28 Functional Grade®)純化的(aCD28) (殖株：CD28.2), eBioscience, Cat. No. 16-02897-85

磷-STAT3(phospo-STAT3)(Y705)抗體(兔抗人類(rabbit-anti-human)), Cell Signaling Technology, Cat. No. 9145

磷-STAT5 (Y694)抗體(兔抗人類), Cell Signaling Technology, Cat. No. 9359

肌動蛋白抗體(Actin antibody) (小鼠抗人類(mouse-anti-human)) Sigma-Aldrich, Cat. No. A1978

山羊抗兔(Goat anti-rabbit )IgGAlexa 488, Life technologies^TM , Cat. No. A11034

山羊抗兔IROYE 800CW, Li-COR Bioscience, Cat. No. 926-32211

山羊抗小鼠(Goat-anti-mouse) IROYE 800CW, Li-COR Bioscience, Cat. No. 926-32210

人類IFNγ ELISA Kit, R&D, Cat. No. DY285

人類TNFα ELISA Kit, R&D, Cat. No. DY210

人類IL-1β ELISA Kit, R&D, Cat. No. DY201

人類IL-6 ELISA Kit, R&D, Cat. No. DY206

Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue (MTT), Sigma-Aldrich, Cat. No. M2128

CellTiter-Glo®發光細胞存活率測定(Luminescent Cell Viability Assay), Promega, Cat. No. G7572

CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay, Promega, Cat. No. G7891

螢光酵素測定(Luciferase Assay), Promega, Cat. No. E4550

iBlot® Transfer Stack, Regular (硝化纖維(Nitrocellulose)), Life technologies^TM , Cat. No. IB3010-01

碘化丙啶(Propidium iodide), Sigma-Aldrich, Cat. No. P4170

核糖核酸酶A(Ribonuclease A), Sigma-Aldrich, Cat. No. R6513

1XPBS緩衝液(1L)：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na₂ HPO₄ -12H₂ O 3.58g、KH₂ PO₄ 0.24g溶解於1L MilliQ ddH₂ O，pH調整至7.4。

1xSDS樣品緩衝液(loading buffer)：50 mMTris-HCl/pH8.8、2% SDS、10%甘油、0.1%溴酚藍(bromophenol blue)、100 mM DTT。

B. 細胞及細胞株

HepG2：人類肝癌腫瘤細胞株(human hepatocellular carcinoma cell line)，購自上海生命科學研究院(Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS) (Shanghai，中國，Cat. No. TCHu 72))，並以含有10% FBS的DMEM進行培養。

TF1：人類紅白血病細胞株(human erythroleukemia cell line)，購自American Tissue Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, Cat. No. CRL-2003™)，並以含有10% FBS 及2ng/mL GM-CSF的RMPI-1640在37℃、具有5% CO₂ 的環境下進行培養。

PBMCs：自健康成年捐贈者的正常人類血液樣本收集在肝素管(heparinized tubes)中。每個獨立實驗使用自單一健康捐贈者的血液。單核細胞(Mononuclear cells (PBMCs))是根據製造商建議的操作規程利用Ficoll-Paque Plus試劑(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden, Cat. No. 17-1440-02)分離且以含有10% FBS的RMPI-1640在37℃、具有5% CO₂ 的環境下進行培養。

初代T細胞：單核細胞(PBMC)是根據製造商建議的操作規程利用Ficoll-Paque Plus試劑(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden, Cat. No. 17-1440-02)分離。接著，細胞利用抗CD3(1µg/mL)及抗CD28 (5µg/mL)進行活化3天，並在進行實驗之前，以每2~3天在含有10% FBS及10ng/mL IL-2的RMPI-1640在37℃、具有5% CO₂ 的環境下擴充的方式進行2週。

HaCaT：人類表皮角質株(human epidermal keratinocyte line)得自第二軍醫大學(Second Military Medical University (SMMU))，中國，以含有10% FBS的DMEM進行培養。

HEKa：分離自成年人皮膚的人類表皮角質細胞(human epidermal keratinocytes)，購自Life technologies^TM (Carlsbad, CA, USA, Cat. No. C-005-5C)且以含有HKGS的EpiLife ®培養基在37℃、具有5% CO₂ 的環境下進行培養。

293/NFkB-Luc細胞株，購自Panomics(Fremont, CA, Cat. No. RC0014)。其藉由將pNFĸB-Luc及pHyg共轉染至人類胚胎腎293細胞(human embryonic kidney 293 cell)，接著藉由濕黴素(hygromycin)挑選而獲得。細胞以含有10% FBS及100µg/mL濕黴素B(Life technologies^TM , Cat. No. 10687-010)的DMEM進行培養。

C. 激酶測定

JAK1/2/3激酶測定係利用重組人類JAK1/2/3及Z'-LYTE® 激酶測定套組-酪氨酸6胜肽執行。CDK1/2/5酶測定係利用重組人類CDK1/2/5及Z'-LYTE®激酶測定套組- Ser/Thr 12胜肽在體外執行。所有反應物(20µL)以加入2.5µL的在4% DMSO溶液中的正控制(用於JAK 激酶測定的CP-690550及用於CDK激酶測定的星形孢菌素(Staurosporine))或測試物(即，樣本)、5µL的激酶/胜肽基質混合物或磷-胜肽溶液(Phospho-Peptide solution)、2.5µL ATP溶液(100µM)或1.33 x激酶緩衝液而起始。在384孔測定盤(Corning, Cat. No. 3575)混合並在室溫下培養1小時。接著將5µL的發生液(Development Solution)加入至每個孔，混合並另在室溫下培養1小時。接著，激酶反應藉由加入5µL的中止試劑(Stop Reagent)中止，隨後利用Perkin-Elmer Victor III (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA)盤式分析儀(plate reader)紀錄450nm及520nm的螢光。

D. 尖頭測定(Acumen Assay)

對於誘發STAT3磷酸化的IL6，將HepG2以每孔5.4x10³ 個細胞植入至96孔盤，在無血清DMEM培養基中、37℃、5% CO₂ 下隔夜。在與CP-690550或測試物培養30分鐘之後，細胞藉由每孔加入100ng/mL人類重組IL-6 (1:10)刺激15分鐘。

對於誘發STAT5磷酸化的IL-3，將TF-1以每孔1x10⁴ 個細胞植入至96孔盤，在37℃、5% CO₂ 下3小時。在與CP-690550或測試物培養30分鐘之後，細胞藉由每孔加入100ng/mL人類重組IL-3 (1:10)刺激30分鐘。

接著，將HepG2或TF1細胞在室溫下在2%聚甲醛(paraformaldehyde)中固定45分鐘，且在冰冷的甲醛中培養30分鐘。以PBS清洗之後，將細胞分別在4°C下與抗磷STAT3 (Y705)或抗磷STAT5 (Y694)抗體進行隔夜培養。先以PBS清洗，再將山羊抗兔IgG Alexa 488二次抗體加入90分鐘。在黑暗中，將細胞以含有7.5µM碘化丙啶及100µg/mL核糖核酸酶A的PBS培養60分鐘之後進行計數。盤以Acumen X3儀器 (TPP Labtech, Hertfordshire SG8, UK)進行讀取。

E. 西方墨點轉漬法

將HEKa以2x10⁵ 個細胞/孔植入至6孔盤，在37℃、5% CO₂ 下隔夜。在與測試物培養30分鐘之後，細胞以100ng/mL IL-22刺激30分鐘。

在處理之後，樣本收集在1xSDS樣品緩衝液中。蛋白質樣品煮沸15分鐘並藉由在4°C下以14,000g離心10分鐘收集。使用上清液體或立即地儲存在-80°C。對於西方墨點轉漬法分析，將樣本以10% Tris-HCL梯度電泳膠(Bio-Rad Laboratories)分離。將膠轉漬於iBlot® Transfer Stack, Regular (硝化纖維)，其以5%脫脂奶粉阻斷且分別在4°C下利用抗磷STAT3 (Y705)抗體或抗肌動蛋白抗體探針隔夜。接著，將膜與適當的IDRye 800CW二次抗體培養，隨後利用Odyssey紅外線影像系統(Odyssey infrared imaging System) (Li-COR Bioscience, Lincoln, NE, USA)偵測。

F. 報導基因測定

對於報導基因測定，將293/NFĸB-Luc以每孔4x10⁴ 個細胞植入至96孔盤隔夜。在與穿心蓮內酯(Andrographolide (LGT))或測試物培養30分鐘之後，將細胞藉由每孔加入100ng/mL TNFα (1:10)刺激6小時。細胞裂解液藉由移除培養基且加入裂解緩衝液而製備。在進行讀盤之前，將5x量的螢光酵素測定試劑加入各孔。利用Perkin-Elmer Victor III盤式分析儀(Perkin-ElmerLife Sciences, Boston, MA, USA)紀錄發光。

G. ELISA測定

將初代T細胞以8x10⁴ 個細胞/孔植入96至孔盤。將測試物加入培養物且在37°C、5% CO₂ 下培養。在30分鐘之後，將各孔中的細胞懸浮液轉移至另一塗佈有CD3 (1µg/mL)及CD28 (5µg/mL) 的96孔盤且在37°C、具有5% CO₂ 下培養22小時。將培養基移除且儲存在-80°C直到進行測定。根據製造商的指示，利用商業ELISA套組(R & D Systems)定義IFNγ濃度。

將PBMCs以各孔3x10⁴ 個細胞植入至96孔盤。接著，將測試物加入培養物且在37°C、5% CO₂ 下培養。在30分鐘之後，將1µg/mL LPS (1:10)加入至培養物。對於蛋白質水平的定量，將盤培養18小時。將培養基移除且儲存在-80°C直到進行測定。根據製造商的指示，利用商業ELISA套組(R & D Systems)定義TNFα、IL-1β及IL-6濃度。

H. MTT測定

將HaCaT以4x10⁴ 個細胞/孔植入至96孔盤後隔夜。接著，將星形孢菌素(Stausporine)或測試物加入至培養物且在37°C、5% CO₂ 下培養72小時。在移除培養基之後，將96孔盤中的細胞暴露於各孔100µL的在含有10% FBS 的DMEM中的MTT(0.5mg/mL) 且在37°C、5% CO₂ 下培養3小時。接著，移除上清液且各孔加入150µL的DMSO。將盤在黑暗中培養10分鐘且立即利用Multiskan MK3微量盤式分析儀(microplate reader)(Thermo Life Sciences, HK，中國)紀錄在492 nm的吸光度。

I. 細胞存活率測定

CellTiter-Glo®發光細胞存活率測定套組用於研究細胞存活率。將HEKa以1x10⁴ 個細胞/孔植入至96孔不透明孔盤隔夜。接著，將地蒽酚(Dithranol)或測試物加入至培養物且在37°C、5% CO₂ 下培養48小時。將細胞以相當於各孔存在的細胞培養基的量的CellTiter-Glo®試劑進行裂解，且混合內容物2分鐘以誘發細胞裂解。將盤在室溫下培養10分鐘以穩定發光訊號。利用Perkin-ElmerVictor III盤式分析儀(Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA)紀錄發光。

J. LDH釋出測定

乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase) (LDH)釋出測定套組用於研究生物毒性。將HEKa以4x10⁴ 個細胞/孔植入至96孔不透明孔盤隔夜。接著，將地蒽酚或測試物加入至培養物且在37°C、5% CO₂ 下培養24小時。製備上清液及細胞裂解液。將相當於上清液或細胞裂解液的量的1x量的CytoTox-ONE™試劑加入至各孔，隨後藉由混合30秒且在25°C下培養10分鐘。將相當於上清液或細胞裂解液的50%量的中止溶液加入至各孔以中止反應，且利用SpectraMax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CAL, USA)紀錄具有560nm的激發波長及590nm的發射波長的螢光。

K. TNFα誘發的NFκB活性

促發炎細胞激素及化學激活素(chemokines)在乾癬的致病性上扮演重要的角色。NFκB明確為促發炎細胞激素及化學激活素基因表現的最重要調節子之一。因此，青黛及其精製萃取物在TNFα-依賴性NFκB活化(TNFα-dependent NFκB activation)上的抑制效力係在HEK 293/NFκB-Luc中進行研究。如表1所示，TNFα刺激的NFκB-依賴性螢光酵素表現及以雷公藤多苷(Tripterygium Glycoside)的預處理細胞以濃度依賴方式阻斷NFκB活化。中藥青黛精製萃取物具有微克/g活性在實驗狀況下對TNFα-依賴性NFκB活化。(見表1)。

L.IC₅₀ 測定

所有IC₅₀ 值利用ID Business Solutions (Guildford, UK)的Xlfit™軟體(version 2.0)定義。背景係以僅處理DMSO的細胞培養定義且在IC₅₀ 計算中扣除。

M. 結果

中藥青黛精製萃取物的部分體外測定結果於下文表2中所示，其中中藥青黛A係自德隆製藥獲得；(靛青2.62%；靛玉紅0.284%；色胺酮0.0046%)。

[表2] ** 中藥青黛A：自德隆製藥的中藥青黛：靛青2.62%；靛玉紅0.284%；色胺酮 0.0046%

3. 精製青黛萃取 物在動物模式中的體內評估

例 11: 體內測定及結果

A. 材料及方法

動物

BABL/c小鼠，雄性，體重19~22g，購自Shanghai SLC動物中心。室溫：24±1 °C

室內相對溼度：40-70%

光循環：用於12小時光照(8:00-20:00)，12小時黑暗的螢光燈

動物收容：4隻小鼠/籠

食物：自由攝取食物(irradiated, Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd.，中國)

水：自由攝取當地供應的自來水(首先自市府的水供應處以Molanimal超純水機器(ultrapure water machine)過濾)

儀器

MJ Research PTC-200帕耳帖熱循環儀(Peltier Thermal cycler)(Alpha UnitTM Block Assembly for PTC DNA EngineTM systems)

Applied Biosystems 7500 realtime PCR系統

數位型微米卡尺(Digimatic micrometer caliper)：Mitutoyo，日本，精準度：0.001mm

試劑

重組小鼠IL-22 (rmIL-22), Novoprotein (sinobio), Cat. C047, Lot. 0375351

高載量cDNA反轉錄套組(Reverse Transcription kit), Applied Biosystems, Part No.:4368813, Lot: 0909069

Thermo Scientific ABsolute SYBR Green Rox Mix, Thermo Scientific, Cat: AB-1163/A, Lot: 0911/16

正控制組

Protopic® (他克莫司(tacrolimus), FK506)、0.1%軟膏，Astellas Toyama Co., Ltd. Toyama Plant, H20100079, Lot: 028680。

劑量方案(Dosing Regimen)

在誘發模式之後，將不同濃度的測試樣本、載體或0.1%的FK506軟膏以1%的局部給藥1小時，且接著自第1天至第11天每日給予，每天兩次。測試物的給藥的第一天視為第0天。

給藥途徑

局部給藥，b.i.d。

IL-22誘發類乾癬(Psoriasis-Like)小鼠模式的建立

將20µL PBS，其為單獨或含有100或500ng重組小鼠IL-22 (eBiosience)的皮內注射利用30號針頭投予至麻醉小鼠的耳部每隔一天總共11天。在第0天注射之前及其之後沒有注射的天數測量耳部厚度。耳部測量是利用數位型微米卡尺(Mitutoyo)測量耳部的中心。

在最後IL-22處理之後24小時，將小鼠犧牲且收集耳部用於進一步分析。

組織學測試

解剖收集的耳部固定在10%緩衝福馬林磷酸鹽(formalin phosphate)，以石蠟包埋、切片及以蘇木素/伊紅(hematoxylin/eosin (H&E))染色。顯微切片係藉由病變的數量及嚴重度分級。

統計方法

耳部厚度數據的結果係以第0天至第11天的耳部厚度數據計算的耳部腫脹的平均± S.E.M. AUC來表示，且藉由以JMP®軟體的重複測量的ANOVA法分析。細胞激素蛋白及基因表現數據係以單向ANOVA且接著以用於事後分析(post-hoc analysis )的student’s t-test評估(顯著性水平設為p ＜ 0.05)。

群組及劑量

見第3圖。

結果

部分的中藥青黛精製萃取物的部分體內測定結果顯示於表3。

[表3] * 中藥青黛B: 自青峰藥廠(Qingfeng Pharmaceutical)的中藥青黛：靛青2.02%；靛玉紅0.216%；色胺酮0.0032%

無。

本發明之上述及其他特徵與優點將參照附圖並在下文中進行詳細描述而使其變得顯而易見。

第1圖係繪示(A)靛青及(B)靛玉紅的HPLC層析圖。

第2圖係繪示(A)色胺酮(thryptanthrin)、(B) 中藥青黛及(C)精製萃取物的例2的HPLC層析圖。

第3圖係在IL-22誘發乾癬的模式中對中藥青黛萃取物的體內(in vivo )評估的群組及劑量。五組研究分別設計及列出在研究1-5。在研究1中，皮內注射(i.d.) 100ng及500ng的IL-22的20µL生理食鹽水(saline)以用於誘發。在研究2-5中，皮內注射(i.d.) 500ng的IL-22的20µL生理食鹽水以用於誘發。

第4圖係繪示在皮內注射IL-22之後的耳部發炎。在研究中，小鼠的耳部進行皮內注射並在注射之間的天數測量耳部厚度。

第5圖係繪示在皮內注射IL-22之後，中藥青黛萃取物對耳部發炎的效果。

Claims

一種用於自中藥青黛或選自由木藍、馬藍、蓼藍及菘藍所組成之群組的一或多種靛青植物的葉子及/或樹幹製備一精製萃取物的製程，該製程包含下列步驟： a) 萃取步驟：以一極性溶劑或一中度極性溶劑萃取該中藥青黛或該靛青植物的葉子及/或樹幹，以獲得一萃取混合物； b) 過濾步驟：過濾該萃取混合物，以獲得一濾液； c) 濃縮步驟：濃縮該濾液，以獲得一粗萃取物； d) 清洗步驟：以一非極性溶劑及任選地以一第二極性溶劑清洗該粗萃取物，以獲得一清洗混合物；以及 e) 過濾步驟：過濾該清洗混合物，以任選地在一乾燥步驟之後獲得該精製萃取物。
如申請專利範圍第1項所述之製程，其中用於a)萃取步驟的溶劑係選自由二甲基甲醯胺、乙酸乙酯、乙醇、二甲基亞碸、二氯甲烷、四氫呋喃、二甲基乙醯胺、丙酮、2-丁酮、乙腈、乙酸異丙酯、2-甲基四氫呋喃、甲基叔丁基醚、水、甲醇、三氯甲烷、萜及其組合所組成之群組。
如申請專利範圍第1項或第2項所述之製程，其中用於a)萃取步驟的溶劑係為一有機溶劑，其較佳為選自由二甲基甲醯胺、乙酸乙酯、乙醇、二甲基亞碸、二氯甲烷、四氫呋喃、二甲基乙醯胺、丙酮、2-丁酮、乙腈、乙酸異丙酯、2-甲基四氫呋喃、甲基叔丁基醚、甲醇、三氯甲烷、萜及其組合所組成之群組。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之製程，其中用於d)清洗步驟的溶劑係選自由水、具有5至8個碳原子的烷烴、具有2至6個碳原子的醇及其組合所組成之群組。
如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之製程，其中d)清洗步驟及e)過濾步驟執行至少一循環直到獲得該精製萃取物。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之製程，其中d)清洗步驟及e)過濾步驟執行兩個循環。
如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述之製程，其中用於a)萃取步驟的溶劑為乙醇或乙醇水溶液，而用於d)清洗步驟的溶劑係選自由己烷、庚烷、水、乙醇及其組合所組成之群組，較佳地，用於d)清洗步驟的溶劑係為己烷。
如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之製程，其中在d)清洗步驟中使用該非極性溶劑及該第二極性溶劑，且較佳地該非極性溶劑及該第二極性溶劑分別為己烷及乙醇。
一種藉由如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之製程獲得之精製萃取物。
一種精製萃取物，其成分包含靛玉紅，並任選地包含靛青、色胺酮及青黛酮中的一或多種。
一種精製萃取物，其成分包含靛玉紅，其含量為該精製萃取物的至少65% (w/w)，較佳為該精製萃取物的65-90% (w/w)。
如申請專利範圍第10項或第11項所述之精製萃取物，其成分進一步包含靛青，其含量較佳為該精製萃取物的0.1-15% (w/w)。
如申請專利範圍第10項至第12項中任一項所述之精製萃取物，其成分進一步包含色胺酮，其含量較佳為該精製萃取物的0.1-5% (w/w)。
如申請專利範圍第10項至第13項中任一項所述之精製萃取物，其成分進一步包含青黛酮，其含量較佳為該精製萃取物的0.1-5% (w/w)。
如申請專利範圍第10項至第14項中任一項所述之精製萃取物，其成分中的靛玉紅、靛青、色胺酮及青黛酮中的兩個或兩個以上的含量係為該精製萃取物的90%-99% (w/w)。
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第10項至第15項中任一項所述之精製萃取物及一藥學上可接受的載體。
一種如申請專利範圍第10項至第15項中任一項所述之精製萃取物用於抑制角質細胞的增生或分化、或抑制單核細胞浸潤至真皮及表皮、或抑制造成增生血管的血管變化或抑制內皮細胞上黏附分子上升的用途。
如申請專利範圍第17項所述之精製萃取物的用途，其用於治療由選自乾癬、發炎皮膚狀況、甲黴菌病、皮膚癌、不正常角質化誘發疾病、皮膚老化、膿皰性皮膚病及CTCL所組成的群組之疾病或狀況。