KR20170133497A - 인디고 내추럴리스로부터의 추출물 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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KR20170133497A
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이사벨 까르디노
로랑 샹딸라
필리쁘 앙드레
인-쿠 린
장-또마 피에르송
앙뚜안 빌리
브로네 루아끄 르
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갈데르마 소시에떼아노님
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Abstract

본 발명은 인디고 내추럴리스와 같은 하나 이상의 식물성 원료로부터의 추출물을 제조하는 방법, 및 그 추출물 그 자체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 추출물을 포함하는 조성물뿐 아니라 상기 조성물의 의학적 또는 미용 적용 용도에 관한 것이다.

Description

인디고 내추럴리스로부터의 추출물 및 그의 제조 방법 {AN EXTRACT FROM INDIGO NATURALIS AND A PROCESS FOR PREPARING THE SAME}
본 발명은 인디고 내추럴리스 (Indigo Naturalis) 와 같은 하나 이상의 식물성 원료로부터 추출물을 제조하는 방법 및 추출물 그 자체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 추출물을 포함하는 조성물뿐 아니라 이 조성물의 의학적 또는 미용적 적용에서의 용도에 관한 것이다.
종래의 건선 치료법은 일반적으로 환자의 연령, 성별, 직업 및 인지 능력, 병변의 유형 및 분포, 이전 치료 방법(들) 에 대한 환자의 반응(들), 및 환자의 기타 병력에 따라 설계된다. 건선을 위한 주요 치료 방법은 국소 치료요법, 전신 치료요법, 생물학적 제제의 주입 및 광선요법을 포함한다. 국소 치료요법용 조성물에는 예를 들어, 코르티코스테로이드, 안트랄린 (Margiton® 로서 이용가능), 콜 타르 (Polytar® 로서 이용가능), 칼시트리올 (Silkis® 로서 이용가능), 타자로텐 (Tazorac® 로서 이용가능), 살리실산이 포함되고, 이들 조성물은 경증 증상의 건선 환자 치료에 적합하다. 예를 들어, 메토트렉세이트 (MTX), 사이클로스포린, 및 레티노이드의 경구 제제는 전신 치료요법에 통상 사용되고 중등도 내지 중증 증상의 건선 환자 치료에 적합하다. 생물학적 제제에는 알레파셉트 (Amevive® 로서 이용가능), 에팔리주마브 (Raptiva® 로서 이용가능), 에타네르셉트 (Enbrel® 로서 이용가능) 및 아달리무마브 (Humira® 로서 이용가능) 이 포함되고, 이들은 중등도 내지 중증 증상의 건선 환자에게 주입하기에 적절하다. 광선 요법, 예를 들어 자외선 B (UVB) 광선요법, 광화학치료요법, 예컨대 소랄렌 + 자외선 A (PUVA) 가 중증 증상의 건선 환자 치료에 적합하다. 그러나, 추가적인 치료 방법이 요구된다.
개요
인디고 내추럴리스, 예를 들어 칭다이 (Qingdai) 는 인디고(indigo)-함유 식물 또는 인디고-생성 식물의 잎에서 제조된 짙은 파란색의 분말이다. 상기 식물은 바람직하게 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 인디고페라 팅토리아 엘. (Indigofera tinctoria L.), 바피카칸투스 쿠시아 (니즈) 브레멕 (Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek) (동의어: 스트로빌안테스 쿠시아 (니즈) (Strobilanthes cusia (Nees)), 페르시카리아 팅토리아 (에이톤) 스파치. (Persicaria tinctoria (Aiton) Spach.) (동의어: 폴리고눔 팅토리움 에이톤 (Polygonum tinctorium Aiton), 피. 팅토리움 로우르. (P. tinctorium Lour.)) 및 이사티스 팅토리아 엘. (Isatis tinctoria L.) (동의어: 이사티스 인디고티카 포르트. (Isatis indigotica Fort.)).
인디고 내추럴리스 또는 칭다이의 사용으로 인해 생기는 단점들 중 하나는, 피부 상에 생성되는 어두운 색상이며, 이것은 의류에 얼룩을 남긴다. 칭다이는 인디고 내추럴리스의 현재 명칭이다. 이것은 NaOH 또는 KOH 수용액으로 인디고-함유 또는 인디고-생성 식물로부터 추출되며, 인디고 및 인디루빈 (indirubin) 이 존재하는 알칼로이드를 포함하는 유기 화합물 대략 5-15% 과 탄산칼슘 및 수산화칼슘과 같은 무기 화합물 85-95% 의 혼합물에 상응한다.
또 다른 단점은, 인디고 내추럴리스 산물에서 전통적으로, 오로지 인디고 및 인디루빈만이 제어된다는 것일 수 있다.
따라서, 인디고 내추럴리스로부터의, 또는 인디고-함유 또는 인디고-생성 식물로부터의 추출물을 시장성이 있는 약품으로 개발시키고, 인디고 내추럴리스보다 색이 진하지 않은 추출물을 수득하고, 이러한 추출물의 대부분의 성분을 특성화 및 제어하고자 하는 미충족된 요구가 여전히 남아있다. 더욱 구체적으로, 건선과 같은 피부 질환 또는 장애의 치료 또는 완화를 위해 그 효능을 유지 또는 증가시키면서 색이 진하지 않은 추출물을 제공하는 것이 유리할 것이다.
본 발명은 이러한 문제점을, 인디고 내추럴리스 또는 칭다이로부터의 활성 성분들을 보유하는 취급하기 용이한 정제된 추출물을 제공하여, 임상적 효능 및 안전성을 보증함으로써 해결한다.
본 발명은, 부분적으로, 결국 예를 들어 건선과 같은 피부 질환 또는 장애의 치료 또는 완화를 위해, 인디루빈 및 인디고를 함유하는 인디고 내추럴리스로부터, 예를 들어 칭다이로부터 추출물을 수득하는 방법을 다룬다.
한 양태에서, 본 발명은 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인디고-함유 식물 또는 인디고-생성 식물의 잎 및/또는 줄기, 또는 인디고 내추럴리스와 같은 하나 이상의 식물성 원료로부터 추출물을 제조하는 방법을 제공한다: 인디고페라 팅토리아 엘., 바피카칸투스 쿠시아 (니즈) 브레멕 (동의어: 스트로빌안테스 쿠시아 (니즈), 페르시카리아 팅토리아 (에이톤) 스파치. (동의어: 폴리고눔 팅토리움 에이톤, 피. 팅토리움 로우르.) 및 이사티스 팅토리아 엘. (동의어: 이사티스 인디고티카 포르트.). 이 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 추출 단계: 제 1 극성 용매 또는 적당하게 극성인 용매로, 상기 선택된 하나 이상의 식물의 잎 및/또는 줄기, 또는 인디고 내추럴리스를 추출하여, 추출의 혼합물을 수득하는 단계;
b) 여과 단계: 추출의 혼합물을 여과하여, 여과물을 수득하는 단계;
c) 농축 단계; 여과물을 농축하여, 조 (crude) 추출물을 수득하는 단계;
d) 세정 단계: 조 추출물을 무극성 용매, 및 임의로는 제 2 극성 용매로 세정하여, 세정 혼합물을 수득하는 단계; 및
e) 여과 단계: 예를 들어 통상의 건조 방법에 따라, 임의로 건조 단계 후 정제된 추출물을 수득하기 위해 세정 혼합물을 여과하는 단계.
본 발명에 따른 방법은 정제된 추출물을 수득할 수 있게 한다; 이러한 정제된 추출물은 이하에서 정의된 바와 같다. 하기의 설명에서, 용어 "식물성 원료"는 인디고 내추럴리스 (예를 들어, 시판중인 칭다이), 또는 바람직하게는 하기로부터 선택되는 인디고-함유 식물 또는 인디고-생성 식물의 잎 및/또는 줄기를 지칭하고: 인디고페라 팅토리아 엘., 바피카칸투스 쿠시아 (니즈) 브레멕 (동의어: 스트로빌안테스 쿠시아 (니즈), 페르시카리아 팅토리아 (에이톤) 스파치. (동의어: 폴리고눔 팅토리움 에이톤, 피. 팅토리움 로우르.) 및 이사티스 팅토리아 엘. (동의어: 이사티스 인디고티카 포르트), 수확 및 수거 후, 예를 들어 발효에 의해 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, 추출 단계 a) 에서 이용된 용매에는, 이에 제한되는 것은 아니나 하기가 포함될 수 있다: 디메틸 포름아미드 (DMF), 에틸 아세테이트, 에탄올 (수성 에탄올, 예컨대 85% 에탄올 포함), 디메틸술폭시드 (DMSO), 디클로로메탄 (DCM), 테트라히드로푸란 (THF), 디메틸아세트아미드 (DMA), 아세톤, 2-부타논, 아세토니트릴, 이소프로필 아세테이트, 2-메틸 테트라히드로푸란 (MeTHF), 메틸 tert-부틸 에테르, 물, 메탄올, 클로로포름, 테르펜 (리모넨, p-시멘, 등), 또는 그 조합물. 바람직하게, 용매는 에틸 아세테이트, MeTHF, 에탄올 또는 수성 에탄올일 수 있다.
추가로, 추출 단계 a) 는 용매에 대한 식물성 원료의 비 (즉, 용매 mL 로 추출되는 물질의 g) 가 1:5 내지 1:150 (g/mL), 예를 들어 1:5 내지 1:100, 예를 들어 1:6, 1:15, 1:20, 1:30, 1:50, 1:100 의 범위로 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, 추출 단계 a) 에서 이용된 용매는 유기 용매이다. 더 바람직하게, 용매는 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트, 에탄올, 디메틸술폭시드, 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 디메틸아세트아미드, 아세톤, 2-부타논, 아세토니트릴, 이소프로필 아세테이트, 2-메틸 테트라히드로푸란, 메틸 tert-부틸 에테르, 메탄올, 클로로포름, 테르펜 및 그 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 추출 단계 a) 는 실시예 8A 에 개시된 HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같이 여과 단계 b) 에서 여과된 나머지 식물성 원료 중 인디루빈 함량 (%w/w) 이 0.10% 미만이 될 때까지 반복될 수 있다.
일부 기타 구현예에서, 추출 단계 a) 는 예를 들어 환류할 때까지 가열로써 수행한다.
추출 단계 a) 다음에 여과 단계 b) 가 후속되고, 이어서 여과물을 농축하여 조 추출물을 제공하기 위해 농축 단계 c) 가 수행된다. 여과 단계 b) 는 고온 상태에서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 세정 단계 d) 는 실시예 8A 에 개시된 HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같이 정제된 추출물 중 인디루빈의 양 (% w/w) 이 적어도 55% (w/w) 가 될 때까지 반복될 수 있다.
일부 구현예에서, 세정 단계 d) 에서 사용된 용매는 물, 탄소수 5 내지 8 의 알칸, 탄소수 2 내지 6 의 알코올 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 용매에는 이에 제한되는 것은 아니나, 헥산, 헵탄, 에탄올, 물 또는 이들의 조합이 포함된다. 예를 들어, 세정 단계 d) 에서, 둘 이상의 용매가 사용되는 경우에 헥산 또는 헵탄 및 수성 에탄올은 순서대로 또는 동시에 이용된다.
구현예에 따르면, 단계 d) 에서 사용된 무극성 용매는 헥산이다.
또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 단계 d) 는 무극성 용매 및 제 2 극성 용매로 실시된다. 바람직하게, 제 2 극성 용매는 에탄올이다. 더욱 바람직하게, 단계 d) 에서 사용된 무극성 용매는 헥산이고, 제 2 극성 용매는 에탄올이다.
일부 기타 구현예에서, 농축 단계 c) 에서 수득된 조 추출물은, 정제된 추출물을 수득할 때까지 적어도 1 주기 동안 하기의 절차에 적용된다: 조 추출물을 용매로써 세정하고 (단계 d), 여과해 (단계 (e)) 정제된 추출물을 수득한 후, 선택적으로 건조 단계를 수행할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 세정 단계 d) 및 여과 단계 e) 가, 오직 1 주기로 수행되어 정제된 추출물이 수득된다. 1 회 초과의 주기가 적용되는 경우, 세정을 위해 동일 또는 상이한 용매가 사용될 수 있다. 또한, 조 추출물은 환류 하 용매로 세정될 수 있고, 혼합물은 실온으로 냉각되어진 후 여과되어 정제된 추출물을 수득할 수 있고, 이후 선택적으로 건조 단계가 행해질 수 있다.
바람직한 구현예에서, 2 주기가 수행된다. 특히, 농축 단계 c) 에 의해 수득된 조 추출물은 무극성 용매에서, 바람직하게는 헥산에서 세정되고 (단계 d) 여과된 후 (단계 e), 선택적으로 건조 단계를 거친다. 이어서, 헥산 추출물은 유기 극성 용매, 바람직하게는 에탄올에 의해 세정된 다음 (단계 d), 여과되어 (단계 e) 미정제된 추출물이 수득되고, 선택적으로는 후속하여 건조 단계가 진행된다.
임의로는, 미세화 (micronization) 단계가 단계 e) 이후에 행해져, 입자 크기가 25 내지 35 ㎛, 바람직하게는 약 30 ㎛ 인 정제된 추출물이 제공된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 정제된 추출물이 마지막 단계에서 미세화될 때, 수득된 입자의 99% 는 30 ㎛ 이하이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인디고 내추럴리스로부터 정제된 추출물을 제공한다.
본 발명은 또한, 정제된 추출물의 적어도 55% (w/w) 의 양으로 성분으로서 인디루빈을 함유하는 정제된 추출물을 제공한다. 일부 구현예에서, 인디루빈은, 정제된 추출물의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85% (w/w) 의 양으로 존재한다. 예를 들어, 인디루빈은 정제된 추출물의 55-90% (w/w) 의 양, 예를 들어 정제된 추출물의 55-60%, 55-65%, 55-70%, 55-75%, 55-80%, 55-85%, 55-90%, 60-65%, 60-70%, 60-75%, 60-80%, 60-85%, 60-90%, 65-70%, 65-75%, 65-80%, 65-85%, 65-90%, 70-75%, 70-80%, 70-85%, 70-90%, 75-80%, 75-85%, 75-90%, 80-85%, 80-90%, 또는 85-90% (w/w) 의 양일 수 있다.
바람직하게, 본 발명은 정제된 추출물의 적어도 65% (w/w) 의 양으로 성분으로서 인디루빈을 함유하는 정제된 추출물을 제공한다.
바람직하게, 인디루빈은 정제된 추출물의 65-90% (w/w) 의 양이다.
일부 구현예에서, 정제된 추출물은 성분으로서 인디고를 함유한다. 인디고는 정제된 추출물의 0-15% (w/w) 의 양, 예를 들어 정제된 추출물의 0.1-15%, 0.5-15%, 1-15%, 2-15%, 또는 3-15% (w/w) 의 양일 수 있다.
일부 기타 구현예에서, 정제된 추출물은 추가로 트립탄트린 (tryptanthrin) 을 성분으로서 함유한다. 트립탄트린은 정제된 추출물의 0.01-5% 또는 바람직하게 0.1-5% (w/w) 의 양, 예를 들어 정제된 추출물의 0.01-1%, 0.05-1%, 0.1-1%, 0.1-5%, 0.5-1%, 또는 0.5-5% (w/w) 의 양일 수 있다.
추가 일부 구현예에서, 정제된 추출물은 칭다이논을 성분으로서 추가로 함유한다. 칭다이논은 정제된 추출물의 0.1-5% (w/w) 의 양, 예를 들어 정제된 추출물의 0.1-1%, 0.1-5%, 0.5-1%, 또는 0.5-5% (w/w) 의 양일 수 있다.
추가 일부 구현예에서, 정제된 추출물에서, 상기 기재된 것들 중 2 종 이상을 포함하는 이들은 정제된 추출물의 적어도 60%(w/w), 예를 들어, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% (w/w), 바람직하게 적어도 90%(w/w) 를 나타낸다. 상기 기재된 것들 중 2 종 이상을 포함하는 특성화된 성분들은 정제된 추출물의 60-99% (w/w), 예를 들어 60-95%, 65-95%, 70-95%, 80-95%, 85-95%, 90-95%, 60-99%, 65-99%, 70-99%, 80-99%, 85-99% 또는 90-99% (w/w), 바람직하게 90-99% (w/w) 의 양이다.
추가 또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 정제된 추출물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이 조성물은 국소 또는 경구 투여용 형태이다.
추가 또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 정제된 추출물 및 미용적으로 허용가능한 담체를 포함하는 미용 조성물을 제공한다. 이 조성물은 국소 적용용 형태이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 각질형성세포의 증식 또는 분화를 저해하거나, 단핵 세포의 진피 및 표피로의 침윤을 저해하거나, 과다형성 혈관을 초래하는 혈관 변화를 저해하거나 또는 내피 세포에서의 부착 분자의 상향 조절을 저해하기 위한 약학적 또는 미용 조성물의 제조에서 정제된 추출물의 용도를 제공한다. 상기 용도는 바로 기술된 조성물을 이를 필요로 하는 대상체 (예, 인간) 에 투여하는 것을 포함한다.
추가 또 다른 양태에서, 본 발명은 건선, 염증성 피부 병태, 손발톱진균증, 피부암, 비정상적 각화 유도 질환, 피부 노화, 잔고름집 피부병 및 피부 T 세포 림프종 (CTCL) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 피부 질환 또는 병태의 치료 또는 완화를 위한 앞서 기재된 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 각질형성 세포의 증식 또는 분화를 저해하거나, 단핵 세포의 진피 및 표피로의 침윤을 저해하거나, 과다형성 혈관을 초래하는 혈관 변화를 저해하거나 또는 내피 세포 상 부착 분자의 상향조절을 저해하는 방법을 제공하며, 이는 본 발명의 정제된 추출물을 이를 필요로 하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 시험관 내 또는 생체 내 적용될 수 있다.
또한 추가의 또 다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명에 따른 정제된 추출물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 피부 질환 또는 병태의 치료 방법을 제공한다. 이 질환 또는 병태는 건선, 염증성 피부 병태, 손발톱진균증, 피부암, 비정상적 각화 유도 질환, 피부 노화, 잔고름집 피부병 및 CTCL 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 염증성 피부 병태는 아토피 피부염, 습진 또는 중감염 (superinfected) 피부일 수 있다. 피부 노화는 피부 회춘, 흉터를 위한 피부 재생 또는 피부 늙음일 수 있다. 비정상적 각질형성은 여드름, 비늘증 또는 손발바닥 각질피부증일 수 있다. 피부암은 전암성 피부암, 예를 들어 광선 각화증 (AK), 보엔병; 피부암, 예를 들어, SCC, BCC, NMSC; 흑색종 및 HPV 유도 피부암일 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 특징들과 장점들은 다음의 상세한 설명 및 첨부의 도면을 참조하면 명백해질 것이다.
도 1 : 인디고 (A) 및 인디루빈 (B) 의 예시적 HPLC 크로마토그램.
도 2: 트립탄트린 (A), 칭다이 (B) 및 실시예 2 의 정제된 추출물 (C) 의 예시적 HPLC 크로마토그램.
도 3: IL-22 유도 건선 모델에서 칭다이 추출물의 생체 내 평가를 위한 그룹 및 투약. 5 가지의 연구를 설계하여 각각 연구 1 ~ 5 에 개요하여 제시하였다. 연구 1 에서, 20㎕ 식염수 (saline) 중 100 ng 및 500 ng 의 IL-22 i.d. 를 유도에 사용했다. 연구 2 내지 5 에서, 20㎕ 식염수 중 500 ng 의 IL-22 i.d. 를 유도를 위해 사용했다.
도 4: 도면은 IL-22 의 피내 주입 후 귀 염증을 나타낸다. 이 연구에서, 마우스의 귀에 피내 주입하였고, 귀 두께를 주입 사이에서 날마다 측정했다.
도 5: 도면은 IL-22 의 피내 주입 후 귀 염증에 대한 칭다이 추출물의 영향을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 인디루빈, 인디고, 트립탄트린 및 칭다이논은 문헌에 언급된 화학식을 갖고, 보다 특히 하기의 구조를 갖는다.
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"극성 용매"는 높은 유전 상수 및 높은 쌍극자 모멘트를 갖는 용매를 지칭하고; 그 예에는 물, 알코올, 예를 들어 탄소수 2 내지 6 의 알코올 (예, 알코올), 아세토니트릴, 디메틸포름아미드 (DMF), 및 디메틸술폭시드 (DMSO) 이 포함된다.
"적당히 극성인 용매"란, 적당히 높은 유전 상수를 갖는 용매를 지칭하며; 그 예에는 에틸 아세테이트, 디클로로메탄 (DCM), 테트라히드로푸란 (THF), 디메틸아세트아미드 (DMA), 아세톤, 2-부타논, 이소프로필 아세테이트, 1,4-디옥산, 2-메틸테트라히드로푸란 (MeTHF), 메틸 tert-부틸 에테르 (MTBE) 이 포함된다.
"무극성 용매"란, 낮은 유전 상수를 가진 용매를 지칭하고; 그 예에는 디에틸 에테르, 석유 에테르 (PE), 톨루엔 및 탄소수 5 내지 8 의 알칸, 예를 들어 헵탄, 헥산, 펜탄 또는 시클로헥산이 포함된다.
"실온"이란, 18℃-35℃ 를 지칭한다.
용어 "건선" 또는 "건선 질환"은 당업자에게 익히 공지되어 있는 모든 종류의 건선을 지칭한다. 이것에는 이에 제한되는 것은 아니나, 만성 플라크 (plaque) 건선, 방울 건선, 홍색피부 건선, 고름물집 건선, 자리바꿈 건선 (또한 역위 건선으로 공지), 손톱 건선, 건선 관절염이 포함된다.
용어 "정제된 추출물"은 상기 정제된 추출물을 제조하는 방법에서 사용되는 물 및/또는 용매를 10% (w/w) 미만 함유하는, 고체, 반고체 또는 오일 추출물, 바람직하게는 고체 추출물을 지칭한다. 정제된 추출물은 더욱 바람직하게, 인디고, 인디루빈, 트립탄트린 및/또는 칭다이논이 존재하는 알칼로이드를 포함하는 증가량의 활성 성분을 특징으로 하고, 바람직하게는, 칭다이 또는 인디고 내추럴리스 와 비교시 인디루빈이 풍부하다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 정제된 추출물은 인디고, 인디루빈, 트립탄트린 및/또는 칭다이논을 비롯한 활성 성분을 적어도 60%, 보다 바람직하게 70 % (w/w) 초과로 포함한다.
본원에서 이용되는 바 용어 "조 추출물"은, 정제된 추출물을 제조하는 방법에서 사용되는 물 및/또는 용매를 15% (w/w) 미만 (예, 5-15%, 5-10%) 함유하는 고체, 반고체 또는 오일 추출물, 바람직하게 고체 또는 반고체 추출물을 지칭한다. 조 추출물은 칭다이 또는 인디고 내추럴리스와 비교할 때 정제된 추출물보다 인디루빈이 덜 풍부하다. 조 추출물은 본 발명에 따른 농축 단계 c) 에 의해 수득된다. 농축 단계는 더욱 특히 방법에서 사용되는 물 및/또는 용매를 제거하기 위해 여과물을 농축기 (예를 들어 감압에서) 에 보내고 이로써, 인디고, 인디루빈, 트립탄트린 및/또는 칭다이논을 비롯하여, 추출물 내 존재하는 활성 성분들을 농축시킴으로써 실시된다.
본원에서 이용되는 바 "1 주기"란, 연속해서 1 회 수행되는 세정 단계 d) 및 여과 단계 e) 의 두 단계를 지칭한다. 본원에서 이용되는 바 "2 주기" 란, 연속해서 2 회 실시되는 세정 단계 d) 및 여과 단계 e) 의 두 단계를 지칭한다.
용어 "유효량"이란, 평균적으로 환자에게 치료적 효과 (예를 들어, 질환, 장애 또는 증상의 개선, 완화 또는 완치) 를 부여하는 정제된 추출물의 투약 수준을 지칭한다.
본 발명은 인디고 내추럴리스로부터, 또는 하나 이상의 인디고-함유 식물 또는 인디고-생성 식물의 잎 및/또는 줄기로부터의 정제된 추출물을 제조하는 방법을 제공하며, 바람직하게는 상기는 인디고페라 팅토리아 엘., 바피카칸투스 쿠시아 (니즈) 브레멕 (동의어: 스트로빌안테스 쿠시아 (니즈), 페르시카리아 팅토리아 (에이톤) 스파치. (동의어: 폴리고눔 팅토리움 에이톤, 피. 팅토리움 로우르.) 및 이사티스 팅토리아 엘. (동의어: 이사티스 인디고티카 포르트.) 로 이루어진 군으부터 선택된다.
인디고 내추럴리스는, 인디고페라 팅토리아 엘., 바피카칸투스 쿠시아 (니즈) 브레멕 (동의어: 스트로빌안테스 쿠시아 (니즈), 　페르시카리아 팅토리아 (에이톤) 스파치. (동의어: 폴리고눔 팅토리움 에이톤, 피. 팅토리움 로우르.) 및 이사티스 팅토리아 엘. (동의어: 이사티스 인디고티카 포르트.) 의 잎 및 줄기, 바람직하게 잎으로부터 수득된다. 바람직하게, 인디고 내추럴리스는 페르시카리아 팅토리아 및/또는 바피카칸투스 쿠시아의 잎 및 줄기로부터 수득된다.
인디고 내추럴리스는 시중에서 입수 가능한 반면 (시중에서 입수가능한 인디고 내추럴리스의 예는 하기임 (식물/공급자) : 바피카칸투스 쿠시아/Delong; 인디고페라 팅토리아/KMA exports 또는 Sam Vegetable Colours PVT Ltd; 이사티스 팅토리아/Andrea Primavera or Bleu de Lectoure; 폴리고늄 팅토리움/CouleurGarance 또는 EARL 4 saisons); 이것은 당업계에 통상 공지되어 있는 방법에 의해 상기 식물들 중 하나 이상의 잎 및 줄기로부터 제조될 수 있다. 이들 방법은 하기와 같이 요약될 수 있다: 페르시카리아 팅토리아 및/또는 바피카칸투스 쿠시아의 새롭게 수확된 줄기 및 잎을, 야외 풀에 첨가하고, 물을 상기 풀에 첨가해 줄기/잎을 덮는다. 며칠간 담근 후 (26-30℃) 에는, 줄기/잎은 썩을 것이다. 이어서, 라임 소다를 교반하면서 첨가한다. 소킹 (soaking) 혼합물의 색이 녹색에서 짙은 보라색으로 변할 때, 침전물을 회수하고, 세정한 다음 (통상 물로 2-3 회) 건조시켜 인디고 내추럴리스 분말을 얻는다.
정제된 추출물을 하기로 이루어진 단계를 포함하는 본 발명에 따른 방법에 의해 제조될 수 있다: a) (i) 추출 용매, 극성 또는 적당히 극성인 용매 (예컨대, 알코올 또는 에틸 아세테이트) 를 인디고 내추럴리스 분말에 첨가하여 혼합물을 수득하는 단계; (ii) 혼합물을 일정 시간 동안 (예, 30 분, 1 시간, 2 시간) 가열 및 교반하는 단계; b) (iii) 고온 상태에서 가열된 혼합물을 여과하여 불용성 부산물을 제거해 여과물을 수득하는 단계; c) (iv) 여과물을 농축하여 조 추출물을 수득하는 단계; d) (v) 세정 용매 (예를 들어, 물 또는 무극성, 또는 극성 용매 또는 그 혼합물) 을 조 추출물에 첨가하여 세정 혼합물을 수득하는 단계; (vi) 세정 혼합물을 일정 시간 (예, 30 분, 1 시간, 2 시간) 동안 가열 및 교반하는 단계; e) (vii) 세정 혼합물을, 예를 들어 실온에서 (예, 18℃-35℃) 세정하여 정제된 추출물을 수집하는 단계; 선택적으로, (viii) 잔류물 중 인디루빈의 양 (% w/w) 이 실시예 8A 에 개시된 HPLC 방법에 의해 측정할 때 55% (w/w) 초과, 바람직하게 65% (w/w) 초과가 될 때까지 단계 (v) 내지 (vii) 를 반복하고, 임의로는 (ix) 통상의 방법 (예, 통풍, 동결건조) 에 따라 정제된 추출물을 건조시키는 단계. 단계 (v) 및 (viii) 에서 세정 용매는 상동 또는 상이할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 정제된 추출물은 하기 단계를 포함하는 공정에 의해 제조된다:
a) 에탄올로 2 내지 8 시간 동안 환류 하 인디고 내추럴리스를 추출하는 단계,
b) 혼합물을 65℃ 이상의 온도에서 여과하여 여과물을 수득하는 단계,
c) 여과물을 농축하여, 조 추출물을 수득하는 단계로서, 이때 상기 조 추출물은 용매 내 존재하는 마지막 성분 및 용매를 완전히 제거하기 위해 선택적으로 여과되고 (물 첨가로), 건조되는 단계,
d) (i) 조 추출물을 헥산으로, 50℃ 이상의 온도에서 15 내지 60 분 동안 세정하는 단계,
(ii) 단계 d) (i) 에서 수득한 혼합물을 실온에서 여과하여 생성물을 수득하고, 임의로는 이것을 에탄올 및 물로 린스하는 단계,
(iii) 단계 d) (ii) 에서 수득된 생성물을 에탄올로 환류 하 세정하는 단계, 및
e) 실온에서 단계 d) 에서 수득한 세정 혼합물을 여과하고, 80℃ 미만의 온도에서 수득한 생성물을 건조시켜 추출물을 수득하고, 이를 임의로 미세화하는 단계.
또 다른 바람직한 구현예에서, 정제된 추출물이 마지막 단계에서 미세화되는 경우, 입자 크기는 25 내지 35 ㎛, 바람직하게는 약 30 ㎛ 의 범위에서 약 99% 이다.
본원에서 이용되는 바, "약" 또는 대략"은, 당업자에게 자명할 것이며, 이는 이것이 사용되는 문맥에서 어느 정도 가변적일 것이다. 그것이 사용되는 문맥에서 당업자에게 분명하지 않은 용어가 사용되는 경우, "약" 또는 "대략" 은 특정 용어의 최대 플러스 또는 마이너스 20%, 바람직하게 10% 를 의미할 수 있다.
인디고, 인디루빈, 트립탄트린 및 칭다이논과 같은 성분의 함량은 실시예 8 에 개시된 HPLC 방법에 의해 정량화될 수 있다.
방금 기술된 방법은, 다루기 용이하고 약학적 또는 미용 조성물에서 추가로 제제화될 수 있는 정제된 추출물을 수득 가능하게 한다. 나아가, 본 방법은 풍부한 인디루빈을 가진 추출물을 제공한다. 그에 따라 수득된 정제된 추출물의 성분 적어도 60% (w/w) 가 바람직하게 적어도 90% (w/w) 가 특성화된다; 이들 중 하나 이상은 하기로 이루어진 목록으로부터 선택된다: 인디고, 인디루빈, 트립탄트린 및 칭다이논. 상기 방법에서 얻은 정제된 추출물은 고체 형태로 존재하지만, 정제된 추출물에 대한 액체 형태의 제조가 고체 정제된 추출물의 간단한 용해 또는 가용화에 의해 취급 또는 제형화 요구에 기초하여 행해질 수 있다.
이 경우, 정제된 추출물에 대한 액체 형태는 하기로 이루어진 단계를 포함하는 본 발명에 따른 방법에 의해 제조될 수 있다: a) (i) 추출 용매, 극성 또는 적당히 극성인 용매 (예컨대, 알코올 또는 에틸 아세테이트) 를 인디고 내추럴리스 분말에 첨가해 혼합물을 수득하는 단계; (ii) 일정 시간 동안 (예, 30 분, 1 시간, 2 시간) 혼합물을 가열 및 교반하는 단계; b) (iii) 고온 상태에서 가열된 혼합물을 여과하여 불용성 부산물을 제거해 여과물을 수득하는 단계; c) (iv) 여과물을 농축하여 조 추출물을 수득하는 단계; d) (v) 세정 용매 (예를 들어, 물 또는 무극성, 또는 극성 용매 또는 그 혼합물) 을 조 추출물에 첨가하여 세정 혼합물을 수득하는 단계; (vi) 세정 혼합물을 일정 시간 (예, 30 분, 1 시간, 2 시간) 동안 가열 및 교반하는 단계; e) (vii) 세정 혼합물을, 예를 들어 실온에서 (예, 18℃-35℃) 세정하여 정제된 추출물을 수집하는 단계; 선택적으로, (viii) 잔류물 중 인디루빈의 양 (% w/w) 이 실시예 8A 에 개시된 HPLC 방법에 의해 측정할 때 55% (w/w) 초과, 바람직하게 65% (w/w) 초과가 될 때까지 단계 (v) 내지 (vii) 를 반복하는 단계, (ix) 그에 따라 수득된 정제된 추출물을 약학적으로 허용가능한 용매 또는 담체에서 가용화하는 단계. 단계 (v) 및 (viii) 에서 세정 용매는 상동 또는 상이할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득가능한 추출물, 바람직하게는 식물 추출물, 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 인디고-함유 식물 또는 인디고-생성 식물의 잎 및/또는 줄기로부터의 추출물 또는 인디고 내추럴리스 추출물을 제공하고: 인디고페라 팅토리아 엘., 바피카칸투스 쿠시아 (니즈) 브레멕 (동의어: 스트로빌안테스 쿠시아 (니즈), 　페르시카리아 팅토리아 (에이톤) 스파치. (동의어: 폴리고눔 팅토리움 에이톤, 피. 팅토리움 로우르.) 및 이사티스 팅토리아 엘. (동의어: 이사티스 인디고티카 포르트.), 이때 상기 추출물은 인디루빈을 성분으로서 정제된 추출물의 적어도 55% (w/w), 바람직하게는 적어도 65% (w/w) 의 양으로 포함한다. 정제된 추출물은 고체 형태이고, 상기 기재된 방법 또는 임의의 기타 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 정제된 추출물은 추가로 인디고, 트립탄트린 및/또는 칭다이논을 포함할 수 있고, 이는 인디루빈과 함께 동시-추출될 수 있다. 특히, 다중 성분들을 함유하는 추출물은 시너지 효과를 제공할 수 있다.
본 발명은 추가로 정제된 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 당업자에게 익히 공지되어 있는 기술을 이용하여 국소 또는 경구 투여를 위한 적합한 투약 형태로 제형화될 수 있다. 약학적 조성물은 추가적으로 약물-제조 기술 분야에서 널리 사용되는 것과 같은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 담체는 하기 물질 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 용매, 에멀젼화제, 현탁화제, 분해제, 결합제, 부형제, 안정화제, 킬레이트제, 희석제, 겔화제, 보존제, 윤활제, 흡수 지연제, 리포솜 등. 바람직하게, 용매는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 물, 글리세롤, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 에톡실화 또는 프로폭실화 디글리콜, 시클릭 폴리올, 석유 젤리, 식물성 오일 및 이들 용매의 임의 혼합물. 바람직하게, 약학적 조성물은 피부, 예를 들어 건선을 앓고 있는 피부에 직접 적용할 수 있는 국소 제형으로 제형화된다. 약학적 조성물에 적합한 국소 제형은 에멀젼, 겔, 연고, 크림, 패치, 도포제, 에어로졸, 스프레이, 로션, 세럼, 페이스트, 폼 또는 방울일 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 약학적 조성물은, 본 발명에 따른 정제된 추출물을 당업자가 통상 이용하고 익히 공지되어 있는 것과 같은 염기와 혼합함으로써 외용제로 제형된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투약량 및 투여 횟수는 하기 인자에 따라 가변적일 수 있다: 치료될 질환의 중증도, 투여 경로 및 치료될 대상체의 체중, 연령, 신체적 상태 및 반응. 추가 또는 부가적인 구현예에서, 정제된 추출물의 양은 약 0.001 내지 약 1000 mg/kg 체중/일의 범위, 예를 들어 약 0.01 내지 약 500, 300, 또는 100mg/kg 체중/일이다.
본 발명은 또한 정제된 추출물을 포함하는 미용 조성물을 제공한다. 미용 조성물은 미용적으로 또는 피부과학적으로 허용가능한 담체 또는 매질을 포함하는 국소 적용용에 적합한 형태로 존재할 수 있다. "미용적으로 또는 피부과학적으로 허용가능한"이란, 독성, 불내성, 불안정성, 알레르기 반응 등의 위험을 야기하지 않고 피부 또는 인간 피부 부속기와 접촉하는 용도에 적합한 매질을 의미한다. 미용 조성물에서, 정제된 추출물은 하나 이상의 미용적으로 또는 피부과학적으로 허용가능한 용매, 예컨대 물, 글리세롤, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 에톡실화 또는 프로폭실화 디글리콜, 시클릭 폴리올, 석유 젤리, 식물성 오일 또는 이들 용매의 임의 혼합물에서 앞서 가용될 수 있다.
상기 정제된 추출물 및 조성물은 질병 또는 병태의 치료 또는 완화에 사용될 수 있다. 치료란, 대상체를 괴롭히는 병리학적 병태와 연관된 증상을 적어도 완화시키는 것을 의미하며, 이때 완화는 피부염, 건선 등과 같은 치료될 병리학적 병태와 연관된 매개변수, 예컨대 증상의 크기의 적어도 감소를 지칭하는 넓은 의미로 사용된다. 이와 같이, 치료는 또한 숙주가 더이상 병리학적 병태, 또는 그 병리학적 병태를 특징짓는 적어도 증상을 앓지 않게금, 병리학적 병태, 또는 적어도 이와 관련된 증상이 완전히 저해된 상황, 예를 들어 발생이 방지되거나, 정지되거나, 예를 들어 종료되는 상황을 포함한다. 이와 같이, 치료는 질환 병태를 치료 또는 관리하는 것 모두를 포함한다. 따라서, 상기 추출물 및 조성물은 건선, 염증성 피부 병태, 손발톱진균증, 피부암, 비정상적 각화 유도 질환, 피부 노화, 및 잔고름집 피부병으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태의 치료 또는 완화에 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로, 상기 추출물 및 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 각질형성 세포의 증식 또는 분화를 저해하거나, 단핵 세포의 진피 및 표피로의 침윤을 저해하거나, 과다형성 혈관을 초래하는 혈관 변화를 저해하거나 또는 내피 세포 상 부착 분자의 상향조절을 저해하는 방법을 제공한다.
정제된 추출물 및 조성물의 효능은 증식 또는 분화, 또는 염증을 저해하는데 이들의 활성과 관련하여 시험관 내 모델로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 시험은 사이토카인 시그널링, STAT-3/STAT-1, MAPK, NFκB 관련 경로에 대해 수행될 수 있다.
정제된 추출물 및 조성물의 효능은 질환 또는 장애 치료에서 이들의 활성과 관련하여 생체 내 모델로써 추가 평가될 수 있다. 예를 들어, 유전학적으로 조작된 마우스 (트랜스제닉 (transgenic) 및 녹아웃 (knockout) 모델 포함) 이 시험될 수 있다.
본 출원의 신규한 특징들은 첨부된 청구 범위에서 상세하게 설명된다. 본 출원의 특징 및 이점의 더 나은 이해는 본 출원의 원리가 이용되는 예시적인 실시예를 설명하는 하기의 상세한 설명을 참조함으로써 얻어질 것이다.
본 출원의 바람직한 구현예는 본원에서 나타내어지고 설명되어 있지만, 그러한 구현예는 단지 예시로서 제공된다. 여기서 기술된 본 출원의 구현예에 각종 변경이 본 출원을 실시하는데 이용될 수 있음은 자명하다. 당업자라면 본 출원에서 벗어나지 않고, 많은 변형, 변경 및 대체가 가능하다는 것을 알 것이다. 이하의 특허청구범위는 출원의 양태의 범위를 정의하고, 이들 특허청구범위의 범위 내에 있는 방법 및 구조 및 그 등가물이 이에 의해 커버되어야 하는 것이 의도된다.
임의의 선행 기술 문헌이 본 명세서에서 언급되는 경우, 이러한 참고 문헌은, 당해 기술 분야의 통상적인 지식의 일부를 그 문헌이 형성한다는 인정을 구성하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 제한 없이 특허, 특허 출원, 기사, 서적, 매뉴얼 및 논문을 포함하여 본 출원에 인용된 모든 문헌, 또는 그 문헌의 일부는 그 전문이 어떤 목적으로든 본 문서의 전체 내용에 참조로서 분명히 통합되어 있다.
본원에서 백분율은 달리 기술되지 않는다면, 추출물 또는 특정 생성물의 중량에 대한 중량을 나타낸다.
본 발명의 추가 양태 및 이점은 하기의 예시적인 실험 섹션에 개시될 것이다.
실시예
1. 정제된 인디고 내추럴리스 추출물의 제조 및 분석을 위한 분석적 방법
실시예 1: 정제된 인디고 내추럴리스 추출물의 제조
하기 제조에 사용된 바와 같은 칭다이를, Delong Pharmaceutical 로부터 수득한다 (인디고 2.62% 및 인디루빈 0.284% (실시예 8A 에서 기재된 HPLC 방법), 및 트립탄트린 0.0046% (실시예 8B 에서 기재된 HPLC 방법)).
500g 의 칭다이를 10L 에틸 아세테이트 중 현탁했다. 혼합물을 환류 하 2 시간 동안 교반한 다음 75℃ 에서 여과하였다. 여과물을 감압 하 농축하여 짙은 (dark) 고체를 수득하였다. 조 추출물을 250 mL 헥산 중 교반하고, 1 시간 동안 가열 환류하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 현탁물을 여과하여 짙은 잔류물 (조 추출물) 을 수득하였다.
0.50g 의 짙은 잔류물을 25 mL 헥산에 다시 1 시간 동안 환류하고, 실온으로 냉각시킨 다음 여과하여 정제된 추출물을 짙은 적색 고체 452mg 로서 수득하였다. HPLC: 62.9% 인디루빈, 12.9% 인디고, 및 0.53% 트립탄트린.
실시예 2: 정제된 인디고 내추럴리스 추출물의 제조
실시예 1 에서 사용되는 바와 같은 500g 의 칭다이를, 10 L 알코올 (에탄올) 중 현탁했다. 혼합물을 2 시간 동안 환류 하 교반한 다음 75℃ 에서 여과했다. 여과물을 감압 하 농축하여 짙은 고체를 수득하고, 이를 260mL 헥산에서 교반하고 환류 가열을 1 시간 하였다. 실온으로 냉각되게 하자 마자, 현탁물을 여과하여 짙은 잔류물을 수득했다.
0.80g 의 짙은 잔류물을 24mL 알코올 (에탄올) 에서 추가 한 시간 동안 환류한 다음 실온으로 냉각시킨 후 여과하여 정제된 추출물을 짙은 적색 고체 (538mg) 로서 수득했다. HPLC: 83.6% 인디루빈, 6.35% 인디고, 및 0.75% 트립탄트린.
실시예 3: 정제된 인디고 내추럴리스 추출물의 제조
실시예 1 에서 이용되는 바와 같은 500g 의 칭다이를, 10L 에틸 아세테이트 중 현탁했다. 혼합물을 환류 하 2 시간 동안 교반한 다음, 고온 상태에서 여과하였다. 여과물을 감압 하에서 농축하여 짙은 고체를 수득하였다. 조 추출물을 250mL 헥산에서 교반하고 1 시간 동안 가열 환류하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 현탁물을 여과하여 짙은 잔류물을 수득했다.
0.75g 의 짙은 잔류물을 1 시간 동안 22.5mL 에탄올 중 환류하고, 실온으로 냉각시킨 후 여과하여 정제된 추출물을 짙은 적색 고체 (538mg) 로서 수득했다. HPLC: 77.9% 인디루빈, 15.9% 인디고, 및 0.56% 트립탄트린.
실시예 4: 정제된 인디고 내추럴리스 추출물의 제조
실시예 1 에서 사용되는 바와 같은 500g 의 칭다이를, 2.1L DMF 중 현탁했다. 혼합물을 40 분 동안 50℃ 에서 교반했다. 20℃ 까지 냉각시키자마자, 현탁물을 여과했다. 여과물을 감압 하 농축하여 짙은 고체를 수득하고, 이를 130 mL 헥산 중 교반하고, 1 시간 동안 가열 환류했다. 20℃ 까지 냉각시키자마자, 현탁물을 여과해 짙은 잔류물을 수득했다.
1.56g 의 짙은 잔류물을 46.8 ml 에탄올로 세정하고, 1 시간 동안 가열 환류한 다음 20℃ 로 냉각시킨 후, 여과하여 정제된 추출물 (766mg) 을 수득했다. HPLC: 66.3%, 인디루빈, 9.76% 인디고.
실시예 5: 정제된 인디고 내추럴리스 추출물의 제조
실시예 1 에서 이용되는 바와 같은 500g 의 칭다이를, 3L DMF 중 현탁했다. 혼합물을 1 시간 동안 30℃ 에서 교반한 다음 여과했다. 여과물을 감압 하 농축하여 짙은 고체를 수득하고, 이를 230mL 헥산 중 교반하고, 1 시간 동안 환류 가열했다. 20℃ 로 냉각시키자마자, 현탁물을 여과하여 짙은 잔류물을 수득했다.
1.96g 의 짙은 잔류물을 59mL 85% 에탄올 (85% 수성 알코올) 로 세정하고, 1 시간 동안 가열 환류한 후 고온 상태에서 여과하여 정제된 추출물 (1.02g) 을 수득했다. HPLC: 69.4% 인디루빈, 18.7% 인디고, 및 0.62% 트립탄트린.
실시예 6: 정제된 인디고 내추럴리스 추출물의 제조
100g 의 칭다이를, 2 시간 동안 환류 조건 하에서 2L 의 에탄올 92% (92% 수성 에탄올) 로 추출했다. 완료되자마자, 혼합물을 고온 상태에서 AF6 필터 (Buchner) 상에서 여과하여, 짙은 청-적색 용액을 여과물로서 수득했다. 이 여과물을 진공 하 건조될 때까지 감소시켜, 2.4 g 의 건조 잔류물을 수득했다. 이 잔류물을 120 mL 의 헥산으로 1 시간 동안 환류 하 세정했다. 완료되자마자, 혼합물을 실온으로 2 시간 동안 냉각시킨 다음, 진공 하 여과시켜 312.9mg 의 짙은 적색 정제된 추출물을 수득했다.
280mg 의 상기 정제된 추출물을 15 mL 의 에탄올 92% (92% 수성 에탄올) 로 1 시간 동안 환류 하 세정했다. 완료되자마자, 용액을 실온으로 냉각시킨 다음 여과시켜 오븐에서 (80℃) 1h30 동안 건조시킨 후 159 mg 의 짙은 적색/진홍색 정제된 추출물을 수득하였다 (0.18%); HPLC: 82.31% 인디루빈, 8.99% 인디고, 및 0.81% 트립탄트린.
실시예 7: 미세화 단계
앞서의 실시예에서 수득한 정제된 인디고 내추럴리스 추출물의 미세화 단계는, 하기의 장치로 수행한다:
- 미세화기 (Micronizer): 스피랄 제트 밀 직경 200 (spiral jet Mill Diameter 200)
- 피더 (Feeder): 이 장치는 미세화기에 공급되는 분말의 투약을 위해 사용된다. 투약은 두 스크류 덕택에 행해진다. 이 시스템은 유동 규칙성을 허용한다.
미세화는 공기의 분사 (jet) 로 분말의 과립들을 투사하는 것으로 이루어진다. 과립의 접촉은 그 폭발을 허용한다.
미세화의 하기의 매개변수가 미세화 동안 기록된다:
- 링 압력: 6 bar
- 인젝터 압력: 3 bar
- 분말 공급 유량: 25 kg/h
미세화기는 원통형 인클로져 - 그 인클로져 주위의 홀 (공기 주입용) 을 허용한다.
분말을 미세화기에 도입한다; 과립은 공기의 분사 덕택에 추진된다. 과립들이 양호한 크기를 갖는 경우, 이들은 미세화기 중심에서 농축되고, 이들은 호흡한다 (breath). 이물질이나 장비 파손으로 인한 임의의 오염을 피하기 위해, 추가적인 체질 (체: 700 ㎛) 이 수행된다
이 단계는 미세화 후 및 포장 전에 수동적으로 수행된다.
얻어진 균질 생성물의 입도분석은, 특정 크기 분포 (PSD) 방법에 따라 실시되었다 [분석 규격: D99 ≤ 30 ㎛].
실시예 8: 분석을 위한 분석적 방법
A - 역상 HPLC 방법:
인디고 및 인디루빈을 동시에 정량화하는 새로운 역상 HPLC 방법을, European Pharmacopoeia (Pharmeuropa Vol.20, No.1, January 2008, P118-119.), Chinese Pharmacopoeia (2010 Edition, P185) 및 문헌 (Chen LW, Liao W, Yang M. Jia DY, He P, Chen SM, Fu CM. Determination of indigo and indirubin in Indigo Naturalis by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, 23(6), 714-715; Liu ZY, Su ZT, Gao YN, Yang M. Simultaneously determination of indigo and indirubin in Indigo Naturalis by HPLC. China Pharmacist 2010, 13(3), 324-326) 에 기초하여 확립했다.
크로마토그래피 시스템 (Agilent 1200 시리즈) 은 G1322A 탈기 장치 (degasser), G1211A 펌프, G1367B 오토샘플러, G1316A 컬럼 오븐 및 G1315B DAD 검출기로 이루어진다. 기타 장치는 SK7200H 초음파 장치 (China) 및 Milli-Q 정수 시스템 (USA) 을 포함한다.
칭다이의 6 개의 뱃치 (batch) 를 중국의 3 개의 공급 업체로부터 수집하였다. 인디고 표준은, Tokyo Chemical Industry Co. (Japan, >98%) 에서 구입했다. 트립탄트린은, Accela Co. (China, 97%) 에서 구입했다. 인디루빈은 Hutchison Medipharma (HMP) (>99%, HPLC) 에서 합성하고 재결정화하였다.
유기 필터 막 (0.45㎛, China), 디메틸 포름아미드 (DMF, 분석적 등급), 메탄올 (HPLC 등급), 포름산 (FA, HPLC 등급), 트리에틸아민 (TEA, 분석적 등급) 및 Milli-Q 정수 시스템으로 정제된 초순수 물을 실험에 이용했다.
DMF 용액의 전처리: 500 mL 의 DMF 를, 건조 N2 로 30 분 동안 불어 넣은 다음, 0.5 mL TEA 를 첨가하고, 혼합하여 DMF 용액 (0.1%TEA, 함유, 산소 부재) 을 얻었다. 이 DMF 용액을, 샘플 제조에 이용했다.
50mg 의 칭다이를, 50mL DMF 용액 중 현탁했다. 10 분 동안 초음파 추출 후, 현탁물을 0.45㎛ 시린지 필터를 통해 여과하여 칭다이 시험 용액을 생성하였다.
20mg 의 정제된 추출물 (실시예 2 에서 수득) 을, 200mL DMF 용액 중 현탁했다. 초음파 추출 후, 현탁물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하여 추출물의 시험 용액을 생성하였다.
분리는, Waters Symmetry C18 컬럼 (5㎛, 3.9×150mm) 상에서 수행했다. 이동상은 65% 메탄올 (0.05% FA 함유) 이었다. 유속은 15 분 동안 1.0 mL/분 이었고, 컬럼 온도는 25℃ 였다. 주입 부피는 4μL 였다. 검출 파장은 인디고 및 인디루빈을 동시에 검정할 수 있도록 289 nm 이었다. 인디고 및 인디루빈의 전형적인 HPLC 크로마토그램은 도 1 에 나타낸다.
B - 트립탄트린을 정량화하기 위한 HPLC 분석적 방법:
트립탄트린을 정량화하기 위한 새로운 HPLC 분석적 방법을 또한 확립했다. 샘플 농도는 칭다이와 이것이 풍부한 생성물인 정제된 추출물에서 트립탄트린의 낮은 농도로 인해 그에 따라 조절될 것이다. 분석은 25℃ 에서 Waters Symmetry C18 컬럼 (5㎛, 3.9×150mm) 상에서 수행했다. 이동상은 메탄올 ( 0.05% FA 함유, 용리액 B) 및 물 (0.05% FA 함유, 용리액 A) 이다. 구배 용리 프로파일은 하기와 같다: 50% B 등용매 (12min), 50% 에서 100% B (1min), 100% B 등용매 (6min) 및 100% 에서 50% B (1min). 유속은 1.0mL/min 이고, 컬럼 온도는 25℃ 였다. 주입 부피는 10μL 였다. 검출 파장은 254nm 였다.
400mg 의 칭다이를, 20mL DMA 용액 중 현탁하였다. 20 분 동안 초음파 추출 후, 현탁물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하여, 칭다이의 시험 용액을 제공했다.
15mg 의 정제된 추출물 (실시예 2 로부터 수득) 을, 20 mL DMF 용액 중 현탁했다. 초음파 추출 후, 현탁물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하여, 정제된 추출물의 시험 용액을 제공했다.
트립탄트린, 칭다이 및 정제된 추출물의 전형적인 HPLC 크로마토그램을 도 2 에 나타낸다.
실시예 9: 정제된 인디고 내추럴리스 추출물의 장기간 안정성
실시예 6 에 따라 제조된 정제된 인디고 내추럴리스 추출물을 안정성 조건에 제공하였다. 제조된 추출물의 HPLC 특성화는 하기와 같다: 80.16% 인디루빈; 10.95% 인디고; 0.64% 트립탄트린.
안정성 연구 동안 이용된 저장 조건은 기후실에서 (Piardi CC1400) 25℃ ± 2℃ 및 60% RH ± 5% RH 이다.
GUIDELINE ON QUALITY OF HERBAL MEDICINAL PRODUCTS (CPMP/QWP/2819/00 rev 01) 에 따라, 정성 속성은 한도를 준수해야 한다 [한도: 인디루빈의 함량 (건조 추출물%) = 65.0-85.0; 인디고 함량 (건조 추출물%) = 5.0-15.0; 트립탄트린 함량 (건조 추출물 %) ≤ 5.0.
마커의 함량 변화는 초기 분석 값의 ± 10% 를 초과해서는 안된다.
그 결과를 하기 표 1 에 나타낸다.
Figure pct00002
1 개월, 2 개월 및 3 개월에서의 HPLC 핑거프린트 (fingerprint) 는 T0 에서의 핑거프린트 크로마토그램에 따른다. 따라서, 정성 속성은 한도를 준수한다. 인디고, 인디루빈 및 트립탄트린의 함량 변화는 초기 검정값의 ± 10% 의 허용가능한 범위를 초과하지 않는다.
즉, 본 발명에 따라 제조된 정제된 인디고 내추럴리스 추출물은 25℃ 및 60% RH 에서 6 개월 이상 안정적이다.
2. 생화학 및 세포 검정에서 정제된 인디고 내추럴리스 추출물의 시험관 내 평가
실시예 10: 시험관 내 검정 및 결과
A. 일반적인 시약:
DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Cat. No. D2650
야누스 키나아제 (Janus kinase 1; JAK1), Life technologiesTM, Cat. No. PV4774
야누스 키나아제 1(JAK2), Life technologiesTM, Cat. No. PV4210
야누스 키나아제 1(JAK3), Life technologiesTM, Cat. No. PV3855
CDK1, Life technologiesTM, Cat. No. PV3292
CDK2, Life technologiesTM, Cat. No. PV3267
CDK5, Life technologiesTM, Cat. No. PV3000
Z'-LYTE®Kinase Assay Kit - 티로신 6 펩티드, Life technologiesTM, Cat. No. PV4122
Z'-LYTE®Kinase Assay Kit - Ser/Thr 12 펩티드, Life technologiesTM, Cat. No. PV3673
듈베코 개질 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM), Life technologiesTM, Cat. No. C11965
RMPI-1640, Life technologiesTM, Cat. No. A10491
소태아혈청 (Fetal bovine serum; FBS), Life technologiesTM, Cat. No. 10099141
EpiLife ®Medium, Life technologiesTM, Cat. No. M-EPI-500-CA
HKGS, Life technologiesTM, Cat. No. S-001-5
재조합 인간 IL-2, Peprotech Inc, Cat. No. 200-02
재조합 인간 IL-6, Peprotech Inc, Cat. No. 200-06
재조합 인간 IL-3, Peprotech Inc, Cat. No. 200-03
재조합 인간 GM-CSF, Peprotech Inc, Cat. No. 300-03
재조합 인간 IL-22, Peprotech Inc, Cat. No. 200-22
재조합 인간 TNFα, R&D, Cat. No. 210-TA-010
리포폴리사카라이드 (LPS), Calbiochem, Cat. No. 437650
항-인간 CD3 Functional Grade®Purified (aCD3) (Clone: OKT3) eBioscience, Cat. No. 16-0037-85
항-인간 CD28 Functional Grade®Purified (aCD28) (Clone: CD28.2), eBioscience, Cat. No. 16-02897-85
포스포-STAT3 (Y705) 항체 (토끼-항-인간), Cell Signaling Technology, Cat. No. 9145
포스포-STAT5 (Y694) 항체 (토끼-항-인간), Cell Signaling Technology, Cat. No. 9359
액틴 항체 (마우스-항-인간) Sigma-Aldrich, Cat. No. A1978
염소 항-토끼 IgGAlexa 488, Life technologiesTM, Cat. No. A11034
염소 항-토끼 IROYE 800CW, Li-COR Bioscience, Cat. No. 926-32211
염소-항-마우스 IROYE 800CW, Li-COR Bioscience, Cat. No. 926-32210
인간 IFNγ ELISA Kit, R&D, Cat. No. DY285
인간 TNFα ELISA Kit, R&D, Cat. No. DY210
인간 IL-1β ELISA Kit, R&D, Cat. No. DY201
인간 IL-6 ELISA Kit, R&D, Cat. No. DY206
티아졸릴 블루 테트라졸륨 블루 (Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue; MTT), Sigma-Aldrich, Cat. No. M2128
CellTiter-Glo®Luminescent Cell Viability Assay, Promega, Cat. No. G7572
CytoTox-ONE™Homogeneous Membrane Integrity Assay, Promega, Cat. No. G7891
Luciferase Assay, Promega, Cat. No. E4550
iBlot®Transfer Stack, Regular (Nitrocellulose), Life technologiesTM, Cat. No. IB3010-01
프로피듐 요오다이드, Sigma-Aldrich, Cat. No. P4170
리보뉴클레아제 A, Sigma-Aldrich, Cat. No. R6513
1XPBS 버퍼 (1L): NaCl 8.0g, KCl 0.2g, Na2HPO4-12H2O 3.58g, KH2PO4 0.24g, 1L MilliQ ddH2O 중 용해, 7.4 로 pH 조절
1xSDS 로딩 버퍼: 50 mMTris-HCl/pH8.8, 2% SDS, 10% 글리세롤, 0.1% 브로모페놀 블루, 100 mM DTT.
B. 세포 및 세포주
Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS) (Shanghai, China, Cat. No. TCHu 72) 에서 구입한, HepG2, 인간 간세포 암종 세포주를, 10% FBS 를 함유하는 DMEM 에서 배양했다.
American Tissue Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, Cat. No. CRL-2003™) 에서 구입한 TF1, 인간 적백혈병 세포주를, 5% CO2 와 함께 37℃ 에서 10% FBS 및 2ng/mL 의 GM-CSF 를 함유하는 RMPI-1640 에서 배양했다.
PBMC: 건강한 성인 기증자로부터의 정상적인 인간 혈액 샘플을, 헤파린화 튜브에서 수집하였다. 각각의 독립적인 실험은 한 명의 건강항 기증자의 혈액을 이용했다. 단핵 세포 (PBMCs) 를, 제작자가 권고하는 프로토콜에 따라 Ficoll-Paque Plus 시약 (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden, Cat. No. 17-1440-02) 을 이용하여 단리하고, 5% CO2 와 함께 37℃ 에서 10% FBS 를 함유하는 RMPI-1640 에서 배양하였다.
일차 T 세포: 단핵 세포 (PBMC) 를, 제작자가 권고하는 프로토콜에 따라 Ficoll-Paque Plus 시약 (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden, Cat. No. 17-1440-02) 을 이용하여 단리하였다. 이어서, 세포를, 항-CD3 (1㎍/mL) 및 항-CD28 (5㎍/mL) 을 이용하여 3 일 동안 활성화하고, 10% FBS 및 10ng/mL IL-2 를 함유하는 RMPI-1640 에서, 실험을 행하기 2 주 전 동안 2-3 일마다 5% CO2 와 함께 37℃ 에서 확장시켰다.
HaCaT, 인간 표피 각질형성세포주 (The Second Military Medical University (SMMU), China) 를, 10% FBS 를 함유하는 DMEM 에서 배양하였다.
Life technologiesTM (Carlsbad, CA, USA, Cat. No. C-005-5C) 에서 구입한, 성인 피부로부터 단리된 인간 표피 각질형성세포, HEKa 를, 37℃ 및 5% CO2 에서 HKGS 를 함유하는 EpiLife ® 배지에서 배양하였다.
293/NFkB-Luc 세포주를, Panomics (Fremont, CA, Cat. No. RC0014) 에서 구입했다. 이것은, 인간 배아 신장 293 세포 내로 pNFκB-Luc 및 pHyg 를 공동-트랜스펙션한 다음 히그로마이신 (hygromycin) 선택함으로써 수득되었다. 세포를, 10% FBS 및 100㎍/mL 히그로마이신 B (Life technologiesTM, Cat. No. 10687-010) 를 함유하는 DMEM 에서 배양했다.
C. 키나아제 검정
JAK1/2/3 키나아제 검정을, 재조합 인간 JAK1/2/3 및 Z'-LYTE®Kinase Assay Kit - 티로신 6 펩티드를 이용하여 시험관 내에서 수행했다. CDK1/2/5 키나아제 검정을 재조합 인간 CDK1/2/5 및 Z'-LYTE®Kinase Assay Kit - Ser/Thr 12 펩티드를 이용해 시험관 내에서 수행했다. 모든 반응 (20㎕) 은, 2.5㎕ 의 양성 대조군 (JAK 키나아제 검정을 위해서는 CP-690550 및 CDK 키나아제 검정을 위해서는 스타우로스포린) 또는 시험 품목 (즉, 샘플) 을 4% DMSO 용액, 5㎕ 의 키나아제/펩티드 기질 혼합물 또는 포스포-펩티드 용액, 2.5㎕ ATP 용액 (100μM) 또는 1.33 x 키나아제 버퍼에서 첨가함으로써 시작하였다. 384-웰 검정 플레이트 (Corning, Cat. No. 3575) 를 혼합하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 5㎕ 의 발색 용액을 각 웰에 첨가하고, 혼합하고 실온에서 추가 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 키나아제 반응을, 5㎕ 의 정지 시약을 첨가한 다음 Perkin-Elmer Victor III (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA) 플레이트 리더를 이용하여 450 nm 및 520 nm 형광을 기록함으로써 중단하였다.
D. 감각 (Acumen) 검정
IL-6 유도 STAT3 인산화를 위해, HepG2 를 37℃, 5% CO2 에서 하룻밤 무혈청 DMEM 배지에서 웰 당 5.4x103 세포로 96 웰 플레이트에서 파종하였다. CP-690550 또는 시험 품목과 함께 30 분 동안 인큐베이션 후, 100ng/mL 인간 재조합 IL-6 (1:10) 을 각 웰에 15 분간 첨가함으로써 세포를 자극시켰다.
IL-3 유도 STAT5 인산화를 위해, 37℃, 5% CO2 에서 3 시간 동안 웰 당 1x104 세포로 96-웰 플레이트에서 TF-1 를 파종하였다. 30 분간 CP-690550 또는 시험 품목으로 인큐베이션 후, 100ng/mL 인간 재조합 IL-3(1:10) 을 각 웰에 30 분 동안 첨가함으로써 세포를 자극시켰다.
이어서, HepG2 또는 TF1 세포를 45 분 동안 실온에서 2% 파라포름알데히드 중 고정시키고, 빙냉 메탄올에서 30 분간 인큐베이션하였다. PBS 로 세정 후, 세포를 항-포스포-STAT3 (Y705) 또는 항-포스포-STAT5 (Y694) 항체와 각각 4℃ 에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 염소 항-토끼 IgG Alexa 488 2차 항체를 90 분 동안 PBS 세정 전에 첨가하였다. 7.5 μM 프로피듐 요오다이드 및 100㎍/mL 리보뉴클레아제 A 를 함유하는 PBS 에서 60 분간 암실에서 인큐베이션한 후 세포를 계수하였다. 플레이트를 Acumen X3 기기 (TPP Labtech, Hertfordshire SG8, UK) 상에서 판독하였다.
E. 웨스턴 블롯
HEKa 를 37℃, 5% CO2 에서 하룻밤 2x105 세포/웰로 6-웰 플레이트에서 파종하였다. 30 분간 시험 품목과 인큐베이션 후, 30 분간 100ng/mL IL-22 으로 세포를 자극시켰다.
처리 후, 샘플을, 1xSDS 로딩 버퍼에서 수집하였다. 단백질 샘플을 15 분간 끓이고, 4℃ 에서 10 분 동안 14,000g 에서 원심분리로써 수집했다. 상청액을 이용하거나 또는 즉시 -80℃ 에서 보관했다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 샘플을 10% Tris-HCL 구배 전기영동 겔 (Bio-Rad Laboratories) 에서 분리하였다. 겔을 5% 무지방 분유에서 블로킹하고 4℃ 에서 하룻밤 항-포스포-STAT3 (Y705) 항체 또는 항-액틴 항체를 각각 이용하여 프로빙한 iBlot®Transfer Stack, Regular (Nitrocellulose) 에 블롯팅 (blotted) 하였다. 이어서, 멤브레인을 적절한 IDRye 800CW 이차 항체와 함께 인큐베이션한 후 Odyssey 적외선 이미징 시스템 (Li-COR Bioscience, Lincoln, NE, USA) 를 이용하여 검출하였다.
F. 리포터 검정
리포터 유전자 검정을 위해, 293/NFκB-Luc 를, 하룻밤 웰 당 4x104 세포로 96-웰 플레이트에서 파종하였다. 안드로그라폴리드 (Andrographolide; LGT) 또는 시험 품목과 함께 30 분간 인큐베이션 후, 100ng/mL TNFα(1:10) 를 각 웰에 6 시간 동안 첨가함으로써 세포를 자극시켰다. 세포 용해물을, 배지를 제거하고 세포용해 버퍼를 첨가함으로써 제조하였다. 5x 부피의 루시퍼라아제 검정 시약을, 플레이트 판독 전에 각 웰에 첨가했다. 발광 (luminescence) 을, Perkin-Elmer Victor III 플레이트 리더 (Perkin-ElmerLife Sciences, Boston, MA, USA) 를 이용하여 기록했다.
G. ELISA 검정
일차 T 세포를 8x104 세포/웰로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 시험 품목을, 배양물에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션하였다. 30 분 후, 각 웰 내 세포 현탁물을 CD3 (1㎍/mL) 및 CD28 (5㎍/mL) 로 코팅한 또 다른 96-웰 플레이트로 옮기고, 37℃, 5% CO2 에서 22 시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, 검정할 때까지 -80℃ 에서 보관했다. IFNγ 농도를, 시중의 ELISA 키트 (R & D Systems) 를 이용하여 제작자 지침에 따라 측정했다.
PBMC 를, 웰 당 3x104 세포로 96-웰 플레이트에서 파종했다. 이어서, 시험 품목을 배양물에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션했다. 30 분 후, 1㎍/mL LPS (1:10) 를 배양물에 첨가했다. 단백질 수준의 정량을 위해, 플레이트를 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, 검정할 때까지 -80℃ 에서 보관했다. TNFα, IL-1β 및 IL-6 농도는 시중의 ELISA 키트 (R & D Systems) 를 이용하여 제작자 지침에 따라 측정했다.
H. MTT 검정
HaCaT 를, 하룻밤 4x104 세포/웰로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 이어서, 스타우스포린 또는 시험 품목을 배양물에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 에서 72 시간 동안 인큐베이션하였다. 배지 제거 후, 96-웰 플레이트 내 세포를, 100㎕ 의 MTT (웰 당 10% FBS 를 함유하는 DMEM 에서 0.5mg/mL) 에 노출시키고, 3 시간 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션하였다. 후속해서, 상청액을 제거하고, 150㎕ 의 DMSO 를 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 암실에서 10 분 동안 인큐베이션하고, 492 nm 에서 흡광도를 Multiskan MK3microplate 리더 (Thermo Life Sciences, HK, China) 를 이용하여 즉시 기록하였다.
I. 세포 생존성 검정
CellTiter-Glo®Luminescent Cell Viability Assay Kit 를 이용하여, 세포 생존성을 조사하였다. HEKa 를, 하룻밤 1x104 세포/웰로 96-웰 불투명-벽 플레이트에 파종하였다. 이어서, 디트라놀 (Dithranol) 또는 시험 품목을 배양물에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 에서 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를, 각 웰에 존재하는 세포 배양 배지의 부피와 동일한 CellTiter-Glo®Reagent 로 세포용해시키고, 그 내용물을 세포용해를 유도하기 위해 2 분간 혼합하였다. 플레이트를 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 발광 신호를 안정화시켰다. 발광은 Perkin-ElmerVictor III 플레이트 리더 (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA) 를 이용하여 기록했다.
J. LDH 방출 검정
락테이트 데히드로게나아제 (LDH) 방출 검정 키트를 이용해 세포독성을 조사하였다. HEKa 를 하룻밤 4x104 세포/웰로 96-웰 불투명-벽 플레이트에 파종하였다. 이어서, 디트라놀 또는 시험 품목을 배양물에 첨가하고, 37℃ 에서 5% CO2 하 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액 및 세포용해물을 제조했다. 세포용해물 또는 상청액의 부피와 동일한 1x 부피의 CytoTox-ONE™ 시약을 각 웰에 첨가한 후 30 초간 혼합하고 25℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해물 또는 상청액 50% 부피와 동일한 스탑 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 멈추고, 560 nm 의 여기 파장 및 590 nm 의 방출 파장을 갖는 형광을 SpectraMax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CAL, USA) 을 이용하여 기록하였다.
K. TNFα-유도 NFκB 활성화
염증유발 (Pro-inflammatory) 사이토카인 및 케모카인은 건선의 발병에 중요한 역할을 한다. NFκB 는 분명히 염증유발 사이토카인 및 케모카인 유전자 발현의 가장 중요한 조절자 중 하나이다. 따라서, TNFα- 의존성 NFκB 활성화에 대한 칭다이 및 그것의 정제된 추출물의 저해성 효능을, HEK 293/NFκB-Luc 에서 조사하였다. 표 1 에 나타낸 바와 같이, TNFα 는 NFκB-의존성 루시퍼라아제 발현을 자극하고, 트립테리지움 글리코시드 (Tripterygium Glycoside) 로 전처리한 세포는 농도 의존적 방식으로 NFκB 활성을 블록킹하였다. 인디고 내추럴리스 정제된 추출물은 실험 조건에서 TNFα- 의존성 NFκB 활성화에 대한 활성 ㎍/g 을 가진다 (표 1 참고).
L. IC 50 결정
모든 IC50 값은, ID Business Solutions (Guildford, UK) 사의 Xlfit™software (version 2.0) 를 이용함으로써 결정하였다. 백그라운드는 오로지 DMSO 로만 처리된 세포를 갖는 배양물에서 정의되며 IC50 계산을 위해 감산되엇다.
M. 결과
인디고 내추럴리스 정제된 추출물의 일부 시험관 내 검정 결과를 하기 표 2 에 나타내었는데, 여기서 인디고 내추럴리스 A 는 Delong Pharmaceutical 로부터 얻었다: (인디고 2.62%, 인디루빈 0.284%; 트립탄트린 0.0046%).
Figure pct00003
3. 동물 모델에서 정제된 인디고 내추럴리스 추출물의 생체 내 평가
실시예 11: 생체 내 검정 및 결과
A. 재료 및 방법
동물
BABL/c 마우스, 수컷, 체중 19~22g, Shanghai SLC AnimalCenter 에서 구입.
실온 : 24 ± 1 ℃
실내 상대적 습도: 40-70%
조명 주기: 12-시간 명 (8:00-20:00), 12 시간 암을 위한 형광빛
동물 호스팅: 4 마리의 마우스/케이지
식량: 식량 무료 제공 (조사됨 (irradiate), Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd., China)
물: 지역 공급체로부터 수돗물을 무료로 제공 (처음에는 지방 자치제 상수도의 Molanimal 초순수에 의해 여과됨)
장치
MJ Research PTC-200 Peltier Thermal cycler (PTC DNA EngineTM 시스템을 위한 Alpha UnitTM Block Assembly)
Applied Biosystems 7500 실시간 PCR 시스템
디지매틱 (digimatic) 마이크로미터 캘리퍼스: Mitutoyo, Japan. 정확도: 0.001mm
시약
재조합 마우스 IL-22 (rmIL-22), Novoprotein (sinobio), Cat. C047, Lot. 0375351
고용량 cDNA 역전사 키트, Applied Biosystems, Part No.:4368813, Lot: 0909069
Thermo Scientific ABsolute SYBR Green Rox Mix, Thermo Scientific, Cat: AB-1163/A, Lot: 0911/16
양성 대조군
Protopic®(tacrolimus, FK506), 0.1% 연고, Astellas Toyama Co., Ltd. Toyama Plant, H20100079, Lot: 028680.
투약 요법
상이한 농도의 시험 샘플, 비히클 또는 0.1% 의 FK506 연고를 모델 유도 후 1 시간 후 1% 로 국소 투여한 다음 1 일부터 11 일까지 매일, 하루에 2 회 제공했다. 시험 품목의 투여 제 1 일을 day 0 로 간주하였다.
투여 경로
국소 적용, b.i.d.
IL-22 유도 건선-유사 마우스 모델의 확립
20㎕ PBS 의 피내 주입을 단독으로 하거나, 또는 100 또는 500ng 재조합 마우스 IL-22 (eBiosience) 를 함유하여, 11 일 동안 하루 걸러 30-게이지 니들을 이용하여 마취시킨 마우스의 귀에 투여했다. 귀 두께를 day 0 에 주입 전 측정하고, 이후 매일 주입 없이 측정했다. 귀 측정은 디지매틱 마이크로미터 칼리퍼스 (Mitutoyo) 를 이용하여 귀 중앙에서 행하였다.
마지막 IL-22 처리 후 24 시간 후, 마우스를 희생시키고, 귀를 추가 분석을 위해 수집했다.
조직 검사
귀를 해부하여 수집하고, 10% 완충된 포르말린 포스페이트에서 고정하고, 파라핀에 끼우고, 절편화하고, 헤마톡실린/에오신 (H&E) 으로 염색하였다. 미시적 절편은 병변의 개수 및 중증도에 따라 등급을 매겼다.
통계 방법
귀 두께 데이타 결과는, 평균± S.E.M 으로 표시하였다. 귀 팽창의 AUC 를, day 0 에서 day 11 까지의 귀 두께 데이타로 산출하고, JMP®software 를 이용하여 반복 측정된 ANOVA 법으로써 분석하였다. 사이토카인 단백질 및 유전자 발현 데이타는 일원분산분석법 (one-way ANOVA) 으로 평가한 후 사후 연구 (post-hoc) 분석을 위해 학생 t-검정 (student's t-test) 를 행했다 (유의 수준은 p < 0.05 에서 설정하였음).
그룹 및 투약
도 3 참조
결과
인디고 내추럴리스 정제된 추출물의 일부의 일부 생체 내 검정 결과를 표 3 에 나타내었다.
Figure pct00004

Claims (18)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 인디고페라 팅토리아 엘. (Indigofera tinctoria L.), 바피카칸투스 쿠시아 (니즈) 브레멕 (Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek) (동의어: 스트로빌안테스 쿠시아 (니즈) (Strobilanthes cusia (Nees)), 페르시카리아 팅토리아 (에이톤) 스파치. (Persicaria tinctoria (Aiton) Spach.) (동의어: 폴리고눔 팅토리움 에이톤 (Polygonum tinctorium Aiton), 피. 팅토리움 로우르. (P. tinctorium Lour.)) 및 이사티스 팅토리아 엘. (Isatis tinctoria L.) (동의어: 이사티스 인디고티카 포르트. (Isatis indigotica Fort.)) 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인디고(indigo)-함유 식물의 잎 및/또는 줄기로부터, 또는 인디고 내추럴리스 (Indigo Naturalis) 로부터의 정제된 추출물을 제조하는 방법:
    a) 추출 단계: 극성 용매 또는 적당하게 극성인 용매로, 인디고 내추럴리스 또는 상기 식물의 잎 및/또는 줄기를 추출하여, 추출의 혼합물을 수득하는 단계;
    b) 여과 단계: 추출의 혼합물을 여과하여, 여과물을 수득하는 단계;
    c) 농축 단계; 여과물을 농축하여, 조 (crude) 추출물을 수득하는 단계;
    d) 세정 단계: 조 추출물을 무극성 용매, 및 임의로는 제 2 극성 용매로 세정하여, 세정 혼합물을 수득하는 단계; 및
    e) 여과 단계: 임의로 건조 단계 후 정제된 추출물을 수득하기 위해 세정 혼합물을 여과하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 추출 단계 a) 에서 사용된 용매는 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트, 에탄올, 디메틸술폭시드, 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 디메틸아세트아미드, 아세톤, 2-부타논, 아세토니트릴, 이소프로필 아세테이트, 2-메틸 테트라히드로푸란, 메틸 tert-부틸 에테르, 물, 메탄올, 클로로포름, 테르펜 및 그 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 추출 단계 a) 에서 사용된 용매는 바람직하게는 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트, 에탄올, 디메틸술폭시드, 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 디메틸아세트아미드, 아세톤, 2-부타논, 아세토니트릴, 이소프로필 아세테이트, 2-메틸 테트라히드로푸란, 메틸 tert-부틸 에테르, 메탄올, 클로로포름, 테르펜 및 그 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된, 유기 용매인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 세정 단계 d) 에서 사용된 용매는 물, 탄소수 5 내지 8 의 알칸, 탄소수 2 내지 6 의 알코올 및 그 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 세정 단계 d) 및 여과 단계 e) 는 정제된 추출물을 수득할 때까지 적어도 1 주기로 수행되는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 세정 단계 d) 및 여과 단계 e) 는 2 주기로 수행되는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 추출 단계 a) 에서 사용된 용매는 에탄올 또는 수성 에탄올이고 세정 단계 d) 에서 사용된 용매는 헥산, 헵탄, 물, 에탄올 및 그 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 세정 단계 d) 에서 사용된 용매가 헥산인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 무극성 용매 및 제 2 극성 용매는 세정 단계 d) 에서 사용되고, 이들은 바람직하게 각각 헥산 및 에탄올인 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 정제된 추출물.
  10. 성분으로서 인디루빈 (indirubin), 및 임의로는 인디고, 트립탄트린 (tryptanthrin) 및 칭다이논 (qingdainone) 중 하나 이상을 포함하는 정제된 추출물.
  11. 정제된 추출물의 적어도 65% (w/w), 바람직하게는 정제된 추출물의 65-90% (w/w) 의 양으로 인디루빈을 성분으로서 포함하는 정제된 추출물.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 인디고를 성분으로서, 바람직하게는 정제된 추출물의 0.1-15% (w/w) 의 양으로 추가로 포함하는 정제된 추출물.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 트립탄트린을 성분으로서, 바람직하게는 정제된 추출물의 0.1-5% (w/w) 의 양으로 추가로 포함하는 정제된 추출물.
  14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 칭다이논을 성분으로서, 바람직하게는 정제된 추출물의 0.1-5% (w/w) 의 양으로 추가로 포함하는 정제된 추출물.
  15. 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 인디루빈, 인디고, 트립탄트린 및 칭다이논의 성분 중 2 종 이상이 정제된 추출물의 90%-99% (w/w) 의 양으로 존재하는 정제된 추출물.
  16. 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 정제된 추출물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  17. 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 각질형성세포의 증식 또는 분화를 저해하거나, 단핵 세포의 진피 및 표피로의 침윤을 저해하거나, 과다형성 혈관을 초래하는 혈관 변화를 저해하거나, 또는 내피 세포에서의 부착 분자의 상향 조절을 저해하기 위해 사용되는 정제된 추출물.
  18. 제 17 항에 있어서, 건선, 염증성 피부 병태, 손발톱진균증, 피부암, 비정상적 각화 유도 질환, 피부 노화, 잔고름집 피부병, 및 CTCL 로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태의 치료를 위해 사용되는 정제된 추출물.
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