KR101947126B1 - 감염의 치료 및 예방을 위한 식물 추출물 - Google Patents

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Abstract

산귀소르배 오피시날리스 ( Sanguisorbae officinalis ) 식물 추출물과, 아일란투스 알티씨마 ( Ailanthus altissima ) 식물 추출물, 갈라 로이스 갈누트 ( Galla rhois gallnut ) 식물 추출물, 글리시리자 글라브라 ( Glycyrrhiza glabra ) 식물 추출물, 레움 팔마툼 ( Rheum palatum ) 식물 추출물 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 (Scutellaria baicalensis ) 식물 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부가적인 식물 추출물을 포함하는 조성물이 개시된다. 아일란투스 알티씨마 식물 추출물 또는 아일란톤 (Ailanthone)을 포함하는 조성물이 또한 개시된다.

Description

감염의 치료 및 예방을 위한 식물 추출물{PLANT EXTRACTS FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF INFECTIONS}
본 발명은, 이의 일부 실시 양태에서, 식물 추출물에 관한 것이며, 보다 상세하게는, 비제한적으로, 만성 염증성 질환의 이차 감염을 비롯한 감염의 치료 또는 예방을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
아토피성 피부염 (AD)은 보편적인 만성 염증성 피부 질환으로, 평생 유병률은 어린이가 10% 내지 20%, 및 성인이 1% 내지 3%이다. 질환의 발생률은 특히 선진국에서 증가하고 있는 것으로 나타난다. AD는 정상적인 비-아토피성 개체에게는 무해한 환경적인 촉발인자에 대한 피부의 과민반응과 연관있으며, 피부의 소양증 (pruritus), 습진 병변 (eczematous lesion), 건조증 (xerosis) (건성 피부), 및 태선화 (lichenification) (피부 및 피부 자국 (mark)의 비후화)로 유형화된다. AD는 종종 박테리아, 바이러스 및 진균류의 병원균에 의한 피부 병변의 재발성 감염에 의해 악화된다 (예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스 ( Staphylococcus aureus) 콜로니화는 AD 환자 중 85% 내지 90%에서 발생함). 현재까지 AD 환자가 이용할 수 있는 이차 감염 치료법은 피부 장애를 치료하는 것이 아니라, 증상의 중증도 및 기간을 조절하는 것이다. 이들 치료법은 이차 감염을 치료하기 위한 항생제, 국소 코르티코스테로이드, 및 국소 칼시뉴린 (calcineurin) 저해제 (면역억제제)를 주로 포함한다. 이들 치료는 잠재적인 부작용으로 인해 특히 영아에게는 장기간 사용하는 것을 권고하지 않는다.
AD의 근본적인 생물학적 메커니즘은 충분히 파악되지 않았다. T 림프구, 비만 세포, 호산구, 랑게르한스 세포 및 케라티노사이트 등의, 면역 세포 및 상피 세포를 비롯한 몇 가지 세포 유형들이 관련 있는 것으로 보인다. 사이토카인 및 IgE를 포함한 다른 인자들도 또한 관련되어 있다. 다수의 초기 학술적 및 임상적 보고들에서 다수의 여러 가지 병리학적 메커니즘이 제안되었다. 한 가지 가능한 메커니즘은 랑게르한스 세포와 상호작용하는 TH2 세포의 증가를 수반하는 면역 결함으로, 인터루킨 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13의 생산이 증가한다. 이로 인해, IgE는 증가하고, 감마 인터페론의 수준은 감소한다. 다른 이론으로는, 각질층 (stratum corneum)의 장벽 기능에 결함이 생겨, 항원이 도입됨으로써, 여러 가지 염증성 사이토카인이 생산된다는 것이다.
최근, AD 환자에서의 높은 박테리아 감염에 대한 감수성이 선천적인 방어 메커니즘의 결함, 구체적으로는 β-디펜신 (β-defensin)으로 알려져 있는 항균 펩타이드의 낮은 발현성과 관련 있는 것으로 제안되었다. AD 병변 유래의 피부 생검에서, 염증에 의해 유도되는 항균 펩타이드가 불충분하게 적게 발현된 것으로 확인되었는데, 이는 AD 환자가 피부 감염에 취약하다는 것에 대한 가능성 있는 설명을 제공한다.
인간 β-디펜신 (hBD)을 비롯한 β-디펜신은 선천성 방어 메커니즘에 관여하는 천연의, 작은, 양이온성, 양친매성 분자이다. 피부에서, 이 펩타이드는 케라티노사이트에 의해 분비되며, 침범하는 미생물을 직접 죽이고 염증 반응을 변형시키는 데 있어서 중요한 역할을 한다. 이 펩타이드는 표적 미생물의 막을 파괴하거나 미생물 막에 침투하여, 세포내 기능을 방해한다. 이는 또한, 염증 및 면역 반응의 조절, 창상을 입은 부위나 감염/염증 부위로의 면역 또는 염증 세포의 화학적 유인, 혈관신생의 가속화 및 창상 치료의 촉진과 같은 부가적인 역할도 수행한다.
인간 β-디펜신-3 (hBD-3)는 그람-음성 유기체에 대한 활성 외에도, S. 아우 레우스 및 다른 그람-양성 박테리아에 대한 강력한 사멸활성을 나타낸다. 더욱이, hBD-3의 항균 활성은 생리학적 염 농도에서 유지된다. 그래서, 상피에서 hBD-3의 내인성 생산은 S. 아우레우스와 같은 병원균에 대한 박테리아 침범으로부터 피부 조직을 보호하기 위한 항균 보호막 (shield)을 제공할 수 있다.
인간 β-디펜신-2 (hBD-2) 및 인간 β-디펜신-3 (hBD-3) 발현을 비롯한 β-디펜신의 발현 조절은 복잡한 메커니즘으로; 이들의 발현은 미생물, TNF-알파 또는 IFN-감마에 의해 증가하며, 비만 세포 및 2형 헬퍼 T 세포에 의해 생산되는 사이토카인 (구체적으로는 IL-4 및 IL-13)에 의해 하향조절된다.
일차 케라티노사이트를 이용한 시험관내 연구에서, IL-4 및 IL-13 사이토카인의 발현이 β-디펜신의 발현을 저해하는 것으로 확인되었다 [Albanesi C. et al, J. Immunol. (2007) 179(2): 984-992]. 이러한 역 (inverse)의 상관관계는 인간 피부 생검에서도 나타났다 [Nomura I. et al, J. Immunol. (2003) 171(6), 3262-3269].
비만 세포 및 2형 헬퍼 세포에 의해 유도되는 IL-4 및/또는 IL-13 발현을 저해하는 몇 가지 허브 추출물이 이미 언급된 바 있다. 이들 추출물은 감미-당귀윰자 (Gammi-Danguieumja) 처방 (레흐만니아 글루티노사 ( Rehmannia glutinosa ), 안젤리카 기가스 ( Angelica gigas ) 등) [Na HJ. et al., Inflammation (2004) 28, 291-297], 플라보노이드 (flavonoid) (아바닌 (Avanin), 루테올린 (Luteolin), 아피게닌 (Apigenin), 피세틴 (Fisetin) 등) [Kawai, M. et al, Allergology International (2007) 56: 113-123], 아일란투스 알티씨마 ( Ailanthus altissima) (EAa) [Hua Jin, M. et al, Biol Pham Bult (2006) 29: 884-888], 글리 시리자 글라브라 L. ( Glycyrrhiza Glabra L.) (감초 뿌리 (Licorice root)) [Ram A et al., Int Immunopharacol. (2006) 6(9): 1468-77], 시미시푸가 라세오모사 (cimicifuga raceomosa ) [Kim CD et al., Immunopharmacol Immunotoxicol (2004) 26: 299-308] 및 시미시푸가 라세오모사 ( cimicifuga raceomosa ) [상기 Kim CD et al.]를 포함한다.
항-염증성 및 항-알레르기 특성을 포함하는 허브는 당해 기술분야에서 이미 기술된 바 있다. 이러한 것으로는 전통 중국 의학에서 피부의 습진 및 통증을 치료하는 것으로 알려져 있는 산귀소르바 오피시날리스 ( Sanguisorba officinalis ), 및 항-염증 특성을 포함하는 것으로 이미 언급된 바 있는 실리붐 마리아눔 (silybum marianum )을 포함한다.
미국 특허 제6235287 호는, 면역조절 및 통증 완화, 그리고 과민성 질환 및 자가면역 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제로서 사용하기 위한, 디테르펜 (diterpene) 뿐만 아니라 한 가지 이상의 디테르펜을 포함하는 식물 커쿠마 아마다 (Curcuma amada )의 추출물 또는 농축물을 개시하고 있다.
미국 특허 제6566405 호 및 제7252845 호는, 식물 알피니아 갈란가 (Alpinia galanga) (진기베라세애 (Zingiberaceae))에 존재하며, 바람직하게는 이로부터 유도될 수 있는, 테르페노이드 (terpenoid) 및 방향족 화합물을 포함하는 조성물을 개시하고 있다. 이들은 면역조절 측면에서 상승 효과를 나타내며, 과민성 반응을 상당히 억제한다. 그래서, 제6566405 호는 크론 질환, 궤양성 대장염, 류마티스 관절염 또는 건선과 같은 자가면역 장애, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 습진 또는 과민증과 같이 IgE에 의해 매개되는 알레르기 반응 및 병태의 치료 또는 예방을 위한, 뿐만 아니라 통증의 완화를 위한 상기 조성물의 용도를 고려한다.
미국 특허 제5466452 호는 습진 및 건선과 같은 피부 장애를 치료하기 위한 약학적 허브 조성물을 개시하고 있다. 구체적으로는 제5466452 호는, 증기 증류 및 달임 (decoction)에 의해 항-염증제, 부신피질 자극제 및 코티졸 보호제를 제공하는 허브 (예를 들어, 포텐틸라 치넨시스 ( Potentilla chinensis ), 레흐만니아 글루티노사 ( Rehmannia glutinosa ), 라딕스 패오니애 락티플로래 ( Radix paeoniae lactiflorae )/ 베이트치이 ( veitchii ), 딕탐누스 아우구스티폴리아 (Dictamnus augustifolia ), 글리시리자 우랄렌시스 ( Glycyrrhiza uralensis ), 레데보우리엘라 세스로이데스 ( Ledebouriella sesloides ), 트리불루스 테레스트리스 (Tribulus terrestris ), 로파테리 그라실레 ( Lopatheri gracile ), 쉬조네페타 테누 이폴리아 ( Schizonepeta tenuifolia ), 아케비아 트리폴리아타 ( Akebia trifoliata))의 추출물 또는 추출물들의 제조와, 이후 다당류 및/또는 자당 함량을 줄이기 위한 상기 추출물의 처리를 교시하고 있다.
미국 특허 제6676975 호는 습진 및 건선을 치료하기 위한 중국 허브 조성물을 개시하고 있다. 구체적으로는, 제6676975 호는 아토피 질환, 비-아토피성 습진 또는 건선의 치료에 적합한 물질에 관한 것이다. 이러한 물질은 하기 중국 허브: 라딕스 레데보우리엘라 ( Radix Ledebouriella ), 프룩투스 트리불리 ( Fructus Tribuli), 허바 포텐틸라 치넨시스 ( Herba Potentilla chinensis ), 카울리스 클레마티스 아르만디이 ( Caulis Clematis armandii ), 라딕스 레흐만니아 ( Radix Rehmannia), 라딕스 글리시리자 ( Radix Glycyrrhiza ), 라딕스 패오니아 루브라 (Radix Paeonia rubra ), 코텍스 딕탐니 라디시스 ( Cortex Dictamni radicis ), 허바 로파테리 ( Herba Lopatheri ), 스피카 쉬조네페태 ( Spica Schizonepetae )를 포함하는 혼합물의 냉동-건조된 전즙 (decoction)으로부터 추출할 수 있다.
미국 특허 제7,211,567 호는 (아토피성 피부염을 비롯한) I 형 알레르기를 예방 및 치료하기 위한 조성물을 개시하고 있다. 제7,211,567 호에서 교시된 조성물을 제조하는 데 필요한 아스트라갈린 (astragalin)은 아일란투스 알티씨마와 같은 임의의 아스트라갈린-함유 식물로부터 수득할 수 있다.
부가적인 배경기술로는 미국 특허 제6,143,498 호, 제6,329,340 호, 제6,335,318 호, 제6,420,116 호, 제6,911,577 호 및 제7,223,840 호 및 미국 특허 출원 제20060147442 호, 제20070104722 호 및 제20060036083 호를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물과, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물, 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물, 글리시리자 글라브라 식물 추출물, 레움 팔마툼 식물 추출물 및 스쿠텔라리아 바이 칼렌시스 식물 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부가적인 식물 추출물을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물 및 아일란투스 알티씨마 식물 추출물을 포함하는 조성물을 치료적 유효량으로 아토피성 피부염 (AD)의 치료 및/또는 예방이 필요한 대상에게 투여하여, 상기 대상에서 감염을 치료 및/또는 예방하는 단계를 포함하는, 아토피성 피부염 (AD)을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 아토피성 피부염 (AD)의 치료 및/또는 예방이 필요한 대상에서 상기 질환의 치료 및/또는 예방을 위한, 산귀 소르배 오피시날리스 식물 추출물 및 아일란투스 알티씨마 식물 추출물을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 갈라 로이스 갈누트 , 페우세 다눔 프래룹토룸 및 시미시푸가 라세오모사로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물의 식물 추출물을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물, 및 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물, 글리시리자 글라브라 식물 추출물, 레움 팔마툼 식물 추출물 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 식물 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부가적인 식물 추출물을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 약 0.01% 이상의 농도의 아일란톤 (Ailanthone) 및 미용학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 본 발명의 조성물을 치료적 유효량으로 대상에게 투여하여, 상기 대상에서 감염을 치료 및/또는 예방하는 단계를 포함하는, 감염의 치료 및/또는 예방이 필요한 대상에서 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 감염의 치료 및/또는 예방이 필요한 대상에서 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한, 본 발명의 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 어플리케이터 (applicator)와, 내부에 함유된 본 발명의 조성물을 포함하는 전달 시스템이 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량의 농도로 포함하는 단위 투약 형태가 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량의 농도로 포함하는 단위 투약 형태 (unit dosage form)가 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 글리시리자 글라브라 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량의 농도로 포함하는 단위 투약 형태가 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량의 농도로 포함하는 단위 투약 형태가 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량, 및 글리시리자 글라브라 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량의 농도로 포함하는 단위 투약 형태가 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량, 및 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량의 농도로 포함하는 단위 투약 형태가 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 아일란톤을 약 0.01% 중량/중량 이상의 농도로 포함하는 국소, 경구, 폐내 또는 안내 (ocular) 단위 투약 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 단위 투약 형태가 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, (a) 식물을 1배 내지 10배 부피의 물로 처리하여, 상기 식물의 추출물을 제조하는 단계; 및 (b) 마크로-다공성 (macroporous) 수지를 사용하여 식물 추출물의 유기 염 및/또는 중금속 및/또는 전분의 양을 감량하여, 식물 추출물에 존재하는 활성 성분의 함량을 높이는 단계를 포함하는, 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, (a) 제제를 세포와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 세포로부터 인간 베타-디펜신의 분비를 분석하는 단계를 포함하며, 상기 접촉 후의 베타-디펜신 분비의 상향조절이 상기 제제가 염증 조절제 특성을 가짐을 표시하는 것인, 염증 조절제 특성을 가진 제제를 동정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 레움 팔마툼 뿌리 추출물, 크니디움 몬니에리 ( Cnidium monnieri ) 열매 추출물, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물 및 디포타슘 글리시리제이트를 포함하는 미용학적 담체가 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따르면, 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물, 레움 팔마툼 뿌리 추출물, 크니디움 몬니에리 열매 추출물, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물 및 디포타슘 글리시리제이트를 포함하는 미용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물 및 글리시리자 글라브라 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물 및 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물 및 아일란투스 알티씨마 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물 및 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물 및 글리시리자 글라브라 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물 및 레움 팔마툼 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물, 글리시리자 글라브라 식물 추출물, 레움 팔마툼 뿌리 추출물, 크니디움 몬니 에리 열매 추출물 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 추출물을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 디포타슘 글리시리제이트를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 국소, 안내, 경구 또는 폐내 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 아일란톤의 농도는 약 0.01-1%이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 아일란의 농도는 약 0.01-5%이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물과 하나 이상의 부가적인 식물 추출물이 조합-제형 (co-formulation)으로 제형화된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물 및 하나 이상의 부가적인 식물 추출물은 개별 제형으로 제형화된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물의 식물 추출물의 각각의 농도는 0.01-10%의 범위이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물의 식물 추출물의 각각의 농도는 0.5-2%의 범위이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물의 식물 추출물의 각각의 농도는 1%이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물의 식물 추출물의 농도는 0.01-10%의 범위이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물의 식물 추출물의 농도는 0.5-2%의 범위이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물의 식물 추출물의 농도는 1%이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물은 아일란톤을 약 0.01% 이상으로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물은 아 일란티 라디시스 ( Ailanthi radicis ) 식물 추출물로 이루어진다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 아일란티 라디시스 식물 추출물은 극성 추출물이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 극성 추출물은 부틸 알코올 및 에틸 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 극성 용매를 사용해 추출된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 아일란티 라디시스 식물 추출물은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용해 추가로 정제된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 수성 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 수성 식물 추출물은 수지 크로마토그래피를 사용해 추가로 정제된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 수지 크로마토그래피는 마크로-다공성 수지를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 베타-디펜신을 포함하지 않는다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 약학 조성물이며, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물은 미용 조성물이며, 미용학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 미용학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 크림, 젤, 스프레이, 로션, 연고, 오일, 세정제 (wash), 샴푸, 비누 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태로 제형화된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 감염은 만성 염증으로 인한 이차적인 감염이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 감염은 아토피 질환, 접촉성 피부염, 화폐상 피부염 (nummular dermatitis), 방사선 피부염, 화상, 비-아토피성 습진, 욕창 (pressure sore), 눈 염증성 질환, 호흡기 염증성 질환, 천식, 위장 질환 및 구강 감염 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환과 관련 있다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 대상은 인간이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 치료적 유효량은 대상의 세포에서 Th2 타입 사이토카인의 분비를 하향조절하기 위한 것이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 Th2 타입 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 치료적 유효량은 대상의 세포에서 인간 베타-디펜신의 발현을 상향조절하기 위한 것이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 치료적 유효량은 항균 활성을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 어플리케이터는 접착 붕대, 비-접착 붕대, 수건 (wipe), 거즈 및 패드로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 단위 투약 형태는 아일란투스 알티씨마 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량의 농도로 더 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 단위 투약 형태는 글리시리자 글라브라 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량의 농도로 더 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 단위 투약 형태는 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량의 농도로 더 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 단위 투약 형태는 레움 팔마툼 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량의 농도로 더 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 단위 투약 형태는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 식물 추출물을 약 0.5% 중량/중량 내지 2% 중량/중량의 농도로 더 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 식물 추출물의 농도는 1% 중량/중량이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 아일란톤의 농도는 약 0.01-1% 중량/중량이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 단위 투약 형태는 접착 붕대, 비-접착 붕대, 수건, 거즈 및 패드로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 조성물, 전달 시스템 또는 단위 투약 형태는 세포외 기질 성분, 성장 인자, 호르몬, 혈관신생 인자, 응고 인자, 사이토카인 저해제, 케모카인 저해제, 효소, 신경전달물질, 비타민, 탄수화물, 이온, 철 킬레이트제, 지방산, 항균제, 항생제, 스테로이드 및 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 투여는 장기적으로 시행된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 투여는 하루에 1회 이상 시행된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 투여는 21일 이상 동안 시행된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 식물은 아일란투스 알티씨마 , 갈라 로이스 갈누트 , 페우세다눔 프래룹토룸 , 글리시리자 글라브라 , 시미시푸가 라세오모 사, 실리붐 마리아눔 , 산귀소르배 오피시날리스 , 레움 팔마툼 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 아일란투스 알티씨마는 아일란티 라디시스로 이루어진다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 활성 성분은 아일란톤, 메르소신 (Mersosin), 토오센다닌 (Toosendanin), 제너럴 진세노이드 (General Ginsenoide), 갈릭산 (Galic acid), 리퀴리틴 (Liquiritin), 프래룹토린 A (Praeruptorin A), 탄닌산 및 실리빈 (Silybin)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 식물은 아일란티 알티씨마를 포함하며, 상기 활성 성분은 아일란톤을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 제제는 식물 추출물 또는 이의 활성 성분을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 세포는 케라티노사이트 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 미용 조성물은 보습제 및 연화제 (emollient)를 더 포함한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적인 및/또는 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 당업자가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에서 기술되는 것들과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 양태의 시행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 물질을 후술한다. 상충하는 경우, 정의를 비롯한 본 발명의 명세서에 따른다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것일 뿐, 본질적으로 제한하려는 것은 아니다.
본 발명의 일부 실시 양태는 첨부된 도면을 참조하여 예시적인 방식으로만 기술되어 있다. 이제 도면에 대해 상세하게 구체적으로 참조하며, 본 발명의 실시 양태를 예시적으로 검토할 목적으로 예로서 특정한 사항들이 강조된다. 이러한 점에서, 당해 기술분야의 당업자는 도면에 나타난 상세한 설명으로써 본 발명의 실시 양태가 시행될 수 있는 방법을 알게 될 것이다.
도면에서:
도 1은 연속적으로 희석된 cDNA를 이용한 인간 베타-디펜신 3 및 GAPDH에 대한 표준 곡선을 도시한 선 그래프이다.
도 2는 무처리된 (untreated) HaCaT 케라티노사이트 세포 (n = 3)를 이용한, 인간 베타-디펜신 3의 실시간 PCR 분석을 도시한 선 그래프이다.
도 3A-D는 MTS 분석법에 의해 측정된 세포 생존성의 백분율을 도시한 그래프이다. KU812 세포를 허브 추출물 (나타낸 바와 같이 1%, 0.1% 또는 0.01%)과 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 피세틴 (Fisetin)을 100 μΜ, 10 μΜ 및 1 μΜ의 농도에서 측정하였다. 플레이트를 490 nm에서 판독하고, 세포 생존성을 무처리된 세포에 대한 백분율 (100% 생존성) ± SD로서 계산하였다. 시험 물질 동정은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
도 4A-G는 KU812 세포에서 허브 추출물에 의한 IL-13 발현의 저해를 도시한 그래프이다. KU812 세포를 본원 하기의 실시예 1에서 기술된 바와 같이 허브 추출물로 처리한 다음, IL-13 발현에 대해 세포 배양 상층액을 분석하였다. 값은 평균 IL-13 농도 (pg/ml) ± SD로서 나타낸다. 도 4A 시험 물질: 1 - 글리시리자 글라 브라; 2 - 사포쉬니코비아 디바리카타 ( Saposhnikovia divaricata ); 3 - 라딕스 트리프테리기이 빌포르디이 ( Radix Tripterygii wilfordii ); 4 - 시미시푸가 라세모 사 ( Cimicifuga racemosa ); 5 - 셀로시아 아르겐테아 ( Celosia argentea ); 6 - 황련 (Coptis) 뿌리. 측정 농도: 농도 1 - 1% (샘플 6의 경우 - 0.05%), 농도 2 - 0.1% (샘플 6의 경우 - 0.01%), 농도 3 - 0.01% (샘플 6의 경우 - 0.001%); 도 4B 시험 물질: 7 - 살비애 밀티오리재 ( Salviae miltiorrhizae ); 8 - 사우루루스 치넨 시스 잎 (Saururus Chinensis leaves); 9 - 칼렌둘라 오피시날리스 ( Calendula officinalis); 10 - 겐티아나 (Gentiana); 11 - 멘사 아쿠아티카 L ( Mentha aquatica L); 12 - 타락사쿰 오피시날레 ( Taraxacum officinale ). 측정 농도: 농도 1 - 1% (샘플 10의 경우 - 0.1%), 농도 2 - 0.1% (샘플 10의 경우 - 0.01%), 농도 3 - 0.01% (샘플 10의 경우 - 0.001%); 도 4C 시험 물질: 13 - 댑싸리 열매 (Broom Cypress Fruit); 14 - 아네마레나 아스포델로이데스 ( Anemarrhena asphodeloides); 15 - 스텔라리아 디코토마 L. var . 란세올라타 뿌리 ( Stellaria dichotoma Lanceolata Lanceolata Root ); 16 - 프리틸라리아 베르티실라타 (Fritillaria verticillata ); 17 - 실리붐 마리아눔; 18 - 악티니디아 폴리가마 (Actinidia polygama ). 측정 농도: 농도 1 - 1% (샘플 15의 경우 - 0.1%), 농도 2 - 0.1% (샘플 15의 경우 - 0.01%), 농도 3 - 0.01% (샘플 15의 경우 - 0.001%); 도 4D 시험 물질: 19 - 황벽 (Phellodendron); 20 - 사핀두스 무쿠로씨 ( Sapindus mukurossi); 21 - 라딕스 소포라 플라베센츠 ( Radix Sophora flavescents ); 22 - 산귀소르바 오피시날리스; 23 - 프룩투스 크니디이 ( Fructus Cnidii ); 24 - 카멜리 아 야포니카 ( Camelia japonica ). 측정 농도: 농도 1 - 1% (샘플 19 - 0.05%, 샘플 20 - 0.01%, 샘플 21 - 0.5%), 농도 2 - 0.1% (샘플 19 - 0.01%, 샘플 20 - 0.005%), 농도 3 - 0.01% (샘플 19, 20 - 0.001%). 도 4E 시험 물질: 25 - 스쿠텔 라리아 바이칼렌시스; 26 - 레움 팔마툼; 27 - 국화 (Chrysanthemum); 28 - 쇠비름속 식물 (Portulaca); A- 작약 수피 (Peony bark); B - 안젤리카 시넨시스 (Angelica sinensis ). 측정 농도: 농도 1 - 1% (샘플 27 및 28 - 0.1%), 농도 2 - 0.1% (샘플 27 및 28 - 0.05%), 농도 3 - 0.01%. 도 4F 시험 물질: C - 아스트라갈루스 멤브라나세우스 ( Astragalus membranaceus ); D - 에보디아 루태카르파 (Evodia rutaecarpa ); E - 폴리고눔 쿠스피다툼 ( Polygonum cuspidatum ); F - 리리 오페 플라티필라 ( Liriope platyphylla ); G - 스밀라시스 글라브래 ( Smilacis glabrae); H - 쿠르쿠마 론가 ( Curcuma longa ). 측정 농도: 농도 1 - 1% (샘플 D 및 H - 0.1%, 샘플 E 및 F -0.5%), 농도 2 - 0.1% (샘플 D - 0.05%, 샘플 H- 0.01%), 농도 3 - 0.01% (샘플 H - 0.001%). 도 4G 시험 물질: I - 인디고 (Indigo); J - 세멘 히드노카르피 하이나넨시 ( Semen Hydnocarpi hainanensi ). 측정 농도: I 및 J - 1%, 0.1% 및 0.01%. 피세틴: 100 μΜ, 10 μΜ 및 1 μΜ.
도 5는 hBD-3의 발현을 유의하게 증가시킨 허브 추출물 번호 136 및 137을 도시한 선 그래프이다 (화살표 참조).
도 6은 hBD-3의 발현을 유의하게 증가시킨 허브 추출물 번호 171을 도시한 선 그래프이다.
도 7은 hBD-3의 발현을 유의하게 증가시킨 허브 추출물 번호 194를 도시한 선 그래프이다.
도 8은 hBD-3의 발현을 유의하게 증가시킨 허브 추출물 번호 232 및 246을 도시한 선 그래프이다.
도 9는 hBD-3의 발현을 유의하게 증가시킨 허브 추출물 번호 362를 도시한 선 그래프이다.
도 10은 hBD-3에 대한 6가지의 허브 추출물의 자극 효과 (나타낸 바와 같음)를 도시한 막대 그래프이다.
도 11은 열수 (hot water) (HW), 50% EtOH 및 50% MtOH로 추출한 허브에 의한 hBD-3의 자극의 비교 (나타낸 바와 같음)를 도시한 막대 그래프이다.
도 12는 MTS 분석법에 의해 측정된 바와 같은 세포 생존성의 백분율을 도시한 막대 그래프이다. KU812 세포를 허브 추출물 (0.3%)과 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 490 nm에서 판독하고, 세포 생존성을 무처리된 세포에 대한 백분율 (100% 생존성) ± SD로서 계산하였다. 주목할 만하게도, 샘플 4 및 B - 시험 물질을 MTS 용액과 반응시킬 수 있음. 현미경 분석에서, 과도한 세포 증식 또는 세포독성에 대한 어떠한 사인도 나타나지 않았다. 시험 물질 동정은 하기와 같다: 1. 글리시리자 글라브라 ; 2. 시미시푸가 라세오모사 ; 3. 실리붐 마리아눔 ; 4. 산귀소르배 오피시날리스 ; A. 아일란투스 알티씨마 ; B. 갈라 로이스 갈누트 ; C. 페우세다눔 프래룹토룸.
도 13은 KU812 세포에서 허브 추출물에 의한 IL-13 발현의 저해를 도시한 막대 그래프이다. KU812 세포를 하기의 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 허브 추출물 (0.3%)로 처리한 다음, IL-13 방출에 대해 세포 배양 상층액을 분석하였다. 값은 평균 IL-13 농도 (pg/ml) ± SD로서 나타낸다. 시험 물질 동정은 하기와 같다: 1. 글리시리자 글라 브라; 2. 시미시푸가 라세오모사; 3. 실리붐 마리아눔; 4. 산귀소르배 오피시날리스 ; A. 아일란투스 알티씨마 ; B. 갈라 로이스 갈누트 ; C. 페우세다눔 프래룹토룸.
도 14A-E는 RT-PCR에 의해 측정되는 바와 같이 인간 베타-디펜신 3 (hBD-3)에 대한 허브 추출물의 자극 효과를 도시한 그래프이다. 각각의 허브 추출물을 베타-디펜신 자극 효과에 대해 측정하였으며 [도 14A-D: 도 14A는 hBD3의 발현에 대한 글리시리자 글라브라 (No. 1)의 직접적인 효과를 나타낸 것이다. 도 14B는 hBD3의 발현에 대한 시미시푸가 라세오모사 (No. 2)의 직접적인 효과를 나타낸 것이다. 도 14C는 hBD3의 발현에 대한 실리붐 마리아눔 (No. 3)의 직접적인 효과를 나타낸 것이며, 도 14D는 hBD3의 발현에 대한 산귀소르배 오피시날리스 (No. 4)의 직접적인 효과를 나타낸 것이다]; 도 14E는 hBD-3 발현에 대한 허브 추출물의 자극 활성의 결과를 요약한 것이다. 시험 물질 동정은 하기와 같다: 1. 글리시리자 글라 브라; 2. 시미시푸가 라세오모사 ; 3. 실리붐 마리아눔 ; 4. 산귀소르배 오피시날리스.
도 15A-C는 허브 추출물 간의 상승 효과를 도시한 막대 그래프이다. 허브 추출물을 IL-13 저해에 대한 상승 효과 (KU812 세포, ELISA) (도 15 A) 또는 베타-디펜신 3 자극 효과 (HaCaT 세포, RT-PCR) (도 15B-C)에 대해 측정하였다. 1% 아 일란티 라디시스 피층 (cortex) (도 15B) 또는 (1%) 갈라 로이스 (도 15C)와의 상승 효과에 대해 4가지의 허브 추출물을 측정하였다. 도 15A 시험 물질 동정은 하기와 같다: 1. 글리시리자 글라브라 ; 2. 시미시푸가 라세오모 사; 3. 실리붐 마리아 눔; 4. 산귀소르배 오피시날리스 . 도 15B 시험 물질 동정: 1%의 아일란투스 알티 씨마와 0.3%의, 1. 글리시리자 글라브라 ; 2. 시미시푸가 라세오모사 ; 3. 실리붐 마 리아눔; 4. 산귀소르배 오피시날리스. 도 15C 시험 물질 동정은 하기와 같다: 1%의 갈라 로이스 갈누트와 0.3%의, 1. 글리시리자 글라브라 ; 2. 시미시푸가 라세오 모사; 3. 실리붐 마리아눔 ; 4. 산귀소르배 오피시날리스.
도 16은 수지 크로마토그래피 전 (A-C)과 후 (1-3)에 허브 추출물의 IL-13 저해 활성을 도시한 막대 그래프이다. IL-13을 저해하는 능력에 대해 0.3%의 허브 추출물에서 측정하였다. 크로마토그래피 최적화 전과 후 각각에서의 시험 물질 동정: A, 1 - 아일란투스 알티씨마; B, 2 - 갈라 로이스 갈누트; C, 3 - 페우세다눔 프래룹토룸.
도 17A-B는 갈라 로이스 추출물 (No. 232)의 항균 활성을 도시한 사진들이다. 도 17A는 앰피실린-내성 E. 콜라이 (E. coli )에 대한 항균 활성을 나타낸 것이며; 도 17B는 S. 아우레우스에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 18은 담체 (다이아몬드로 표시함) 및 치료물 (산귀소르바 오피시날리스 및 아일란투스 알티씨마를 포함하는 조성물, 사각형으로 표시함)로 처리한 대상에서 시간에 따른 SCORAD 감소를 도시한 선 그래프이다 (제0, 제7, 제14 및 제21 일에 평가함).
도 19는 담체로 처리한 군에서 총 스코어에 미치는 SCORAD 성분 (범위, 심한 정도 및 주관적 증상 (subjective))의 효과를 도시한 선 그래프이다 (제7, 제14 및 제21 일에 평가함).
도 20은 치료군 (산귀소르바 오피시날리스 및 아일란투스 알티씨마를 포함하는 조성물, 제7, 제14 및 제21 일에 평가함)에서 총 스코어에 미치는 SCORAD 성분 (범위, 심한 정도 및 주관적 증상)의 효과를 도시한 선 그래프이다.
도 21은 담체 및 치료군 간의 비교를 도시한 선 그래프이다: 시간에 따른 심한 정도의 감소 (제0, 제7, 제14 및 제21 일에 평가함).
도 22는 담체 및 치료군 간의 비교를 도시한 선 그래프이다: 시간에 따른 주관적 증상의 스코어의 감소 (제0, 제7, 제14 및 제21 일에 평가함).
도 23은 담체군에서 증상의 개선을 나타내는 환자의 %를 도시한 막대 그래프이다 (제7, 제14 및 제21 일에 평가함).
도 24는 치료군에서 증상의 개선을 나타내는 환자의 %를 도시한 막대 그래프이다 (제7, 제14 및 제21 일에 평가함).
도 25는 21일간의 치료 후에 치료군 및 담체군에서 증상의 개선을 나타내는 환자의 %를 도시한 막대 그래프이다.
도 26은 담체군에서 소양증 및 수면 부족의 감소를 도시한 막대 그래프이다 (제7, 제14 및 제21 일에 평가함).
도 27은 치료군에서 소양증 및 수면 부족의 감소를 도시한 막대 그래프이다 (제7, 제14 및 제21 일에 평가함).
도 28은 담체군 및 치료군에서 21일 후에 소양증 및 불면증의 주관적인 평가의 개선을 도시한 막대 그래프이다.
도 29는 담체군 및 치료군에서 21일 후에 중증 및 비-중증 AD의 SCORAD 감소를 도시한 막대 그래프이다.
도 30은 담체군 및 치료군에서 피부 보습 (skin hydration) 및 경피 수분 손실도 (Transepithelial Water Loss; TEWL)를 도시한 막대 그래프이다.
도 31은 아일란티 라디시스로부터 연속적인 분획화를 도시한 흐름도이다.
도 32A-E는 HaCaT 세포로부터의 인간 베타-디펜신3 및 GAPDH (내부 발현 대조군 유전자)에 미치는 아일란티 라디시스의 물 추출물, 부틸 알코올 추출물 및 에틸 아세테이트 추출물의 효과를 도시한 선 그래프이다. 도 32A는 DEF3 및 GAPDH의 발현에 미치는 10 μl의 물 (대조군)의 효과를 도시한 것이며; 도 32B는 DEF3 및 GAPDH의 발현에 미치는 10 μl의 아일란티 라디시스 물 추출물의 효과를 도시한 것이며 ; 도 32C는 DEF3 및 GAPDH의 발현에 미치는 10 μl의 DMSO (대조군)의 효과를 도시한 것이며; 도 32D는 DEF3 및 GAPDH의 발현에 미치는 10 μl의 아일란티 라디시스 에틸 아세테이트 추출물의 효과를 도시한 것이고; 도 32E는 DEF3 및 GAPDH의 발현에 미치는 10 μl의 아일란티 라디시스 부틸 알코올 추출물의 효과를 도시한 것이다.
도 33은 아일란티 라디시스 부틸 알코올 추출물로부터 구배 HPLC에 의해 수득한 크로마토그램이다.
도 34는 25개의 분획 각각으로 처리한 후, DEF3의 발현에 대한 실시간 PCR 분석을 도시한 선 그래프이다.
도 35는 아일란티 라디시스 추출물 유래의 DEF3-자극 화합물의 NMR 스펙트럼이다.
도 36은 아일란티 라디시스 추출물 유래의 DEF3-자극 화합물의 NMR 스펙트럼이다.
도 37은 아일란티 라디시스 추출물 유래의 DEF3-자극 화합물의 NMR 스펙트럼이다.
도 38은 아일란티 라디시스 추출물 유래의 DEF3-자극 화합물의 NMR 스펙트럼이다.
도 39A-B는 아일란티 라디시스 추출물 유래의 DEF3-자극 화합물인 아일란트의 구조를 도시한 것이다.
본 발명은, 이의 일부 실시 양태에서, 식물 추출물에 관한 것이며, 보다 상세하게는, 비제한적으로, 만성 염증성 질환의 이차 감염을 비롯하여 감염의 치료 또는 예방을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 원리 및 조작은 도면 및 수반하는 상세한 설명을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시 양태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 이의 활용을 하기 상세한 설명에서 나타내거나 실시예에서 예시한 상세한 사항들에 본질적으로 제한하지 않음을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시 양태를 허용하거나 또는 여러 가지 방식으로 시행 또는 수행될 수 있다. 또한, 본원에 적용되는 구어 및 용어는 설명을 위한 것이며 제한적인 것으로 간주해서는 안 되는 것으로 이해해야 한다.
본 발명을 실시하던 중에, 본 발명자들은 아토피성 피부염 (AD)과 같은 만성 염증성 질환의 이차 감염의 관리를 비롯하여 감염을 치료 또는 예방하기 위한 것이며, 장기간 적용에 안전한 허브 추출물-기재의 조성물을 개발하게 되었다.
구체적으로는, 본 발명자들은 2형 헬퍼 T (Th2) 세포 사이토카인에 대해 저해 효과를 나타내면서, β-디펜신의 발현에 대해 자극 활성을 가지는 항-염증성 허브 추출물을 동정하였다.
이하에서 그리고 후술하는 실시예 부분에서 나타내는 바와 같이, 본 발명자들은 β-디펜신의 자극제로서 그리고 IL-13 생산의 저해제로서의 허브 추출물의 이중 효과를 처음으로 입증하였다. 본 발명자들은, 산귀소르배 오피시날리스 , 아일란투스 알티씨마 , 갈라 로이스 갈누트 , 글리시리자 글라브라 , 페우세다눔 프래룹토룸 및 시미시푸가 라세오모사로부터 수득한 추출물이 IL-13의 분비를 하향조절하면서도 β-디펜신 발현을 상향조절하는 데 효과적임을 구체적으로 확인하였다 (하기의 실시예 3-4 및 6-7을 참조). 본 발명자들은 β-디펜신의 자극 및 IL-13 생산의 저해에 대한 산귀소르배 오피시날리스와 아일란투스 알티씨마 또는 갈라 로이스 갈 누트의 상승 효과를 추가로 확인하였다 (하기 실시예 8을 참조). 더욱이, 본 발명자들은 S. 아우레우스 및 앰피실린-내성 E. 콜라이 둘 다에 대한 갈라 로이스 갈누 트의 항-박테리아 효과를 입증하였다 (하기 실시예 9를 참조). 본 발명자들은 아토피성 피부염에 대한, 산귀소르배 오피시날리스 뿌리 추출물, 아일란투스 알티씨 마 추출물 및 신규 제형화된 미용학적 담체를 포함하는 미용 조성물의 치료 효능을 임상 시험에서 추가로 확인하였다 (하기 실시예 10을 참조). 임상 시험의 결과는, 산귀소르배 오피시날리스 뿌리 추출물, 아일란투스 알티씨마 추출물 (치료군) 및 담체를 포함하는 조성물로 치료한 경도 내지 중증도의 아토피성 피부염에 앓고 있는 대상에서, 객관적인 및 주관적인 파라미터의 심한 정도 (도 21-22를 참조) 뿐만 아니라, 개별 증상의 심한 정도 및 증상을 앓고 있는 환자의 수에서 (표 15 및 도 25를 참조) 유의한 개선을 나타내었다. 담체 (21%)에 비해 치료군 (42%)의 우수한 활성은 특히 중증의 아토피성 피부염을 앓고 있는 대상에서 나타났다 (SCORAD> 50, 도 29를 참조). 부종 (oedema) (50%> vs. 27%), 삼출성 (oozing) (86% vs. 39%), 찰과상 (excoriation) (53% vs. 23%) 및 태선화 (53% vs. 28%)와 같이 중증의 아토피성 피부염을 특징으로 하는 증상은 담체군에 비해 치료군에서 더 크게 개선되었다 (표 15).
상기 결과는, AD 증상, 특히 중증의 AD 및 이차 감염과 관련된 증상에 대한, 치료군의 우수한 효과를 확실하게 나타내었다.
S. 아우레우스의 밀도는 감염의 임상적인 증상 없이 cm2 당 107 콜로니-형성 유닛까지 도달할 수 있는 것으로 이미 확인된 바 있다 [예를 들어, Goh et al. Int J Dermatol. (1997) 36(9): 653-7을 참조]. 따라서, 감염의 임상적인 증상은 임상 시험의 군에 등록된 대상 어디에서도 관찰되지 않았지만, 박테리아 콜로니화는 적어도 중증의 환자에서 존재할 가능성이 가장 높았다 (SCORAD >50). 이와 함께, 본 결과는, 베타-디펜신의 자극과 IL-13의 저해에 의한 AD의 이차 감염의 치료에서 담체 로션에 첨가되는 2가지의 허브 추출물 (즉, 산귀소르바 오피시날리스 및 아일란투스 알티씨마)의 능력을 입증한다. 베타 디펜신을 상향조절하고 IL-13을 하향조절하는 능력은, AD의 경우에서처럼, 만성 염증과 연관된 감염과 같은 감염을 치료하기 위한 플랫폼 (platform) 기술을 제공한다.
본 발명자들은, 아일란투스 알티씨마, 즉 이의 수피 (bark) 또는 근피 (root bark)에서, 즉 아일란티 라디시스에서 β-디펜신 3 (DEF3)의 발현을 유도하는 활성 성분을 아일란톤으로서 추가로 동정하였다 (하기 실시예 11 및 도 39A-B를 참조). 취합하면, 이들 결과는, 감염의 치료 및 예방을 위한 이들 허브 추출물 및 이들의 조합물의 치료적 및 미용적 가치를 입증해준다.
그래서, 본 발명의 일 측면에 따르면, 후술하는 식물 추출물 또는 이의 활성 성분을 포함하는 조성물을 각각 치료적 유효량으로 감염의 치료 및/또는 예방이 필요한 대상에게 투여하여, 상기 대상에서 상기 감염을 치료 및/또는 예방하는 단계를 포함하는, 감염의 치료 및/또는 예방이 필요한 대상에서 상기 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.
용어 "치료"는 질병 (질환, 장애 또는 상태)의 발병의 저해, 예방 또는 저지 및/또는 질병의 감소, 완화 또는 경감의 야기를 지칭한다. 당해 기술분야의 당업자는, 다양한 방법과 분석으로 질병의 발병을 분석할 수 있으며, 마찬가지로 다양한 방법과 분석으로 질병의 감소, 완화 또는 경감을 조사할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "감염"은, 병원성 미생물이 후속한 조직 염증 또는 손상을 야기하는 신체 일부 또는 조직의 병리학적인 의학 상태를 지칭한다. 본 발명의 조성물로 치료가능한 감염성 질환의 예에는 만성 감염성 질환, 아급성 (subacute) 감염성 질환, 급성 감염성 질환, 바이러스 질환, 박테리아 질환, 원생동물 질환, 기생충 질환, 진균류 질환, 미코플라즈마 질환 및 프리온 질환이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 상기 감염은 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아, 및/또는 P. 에어루지노사 (P. aeruginosa ), E. 콜라이 , 스트렙토코커스 피오게네스 ( Streptococcus pyogenes ), 스타필로코커스 아우레우스 ( Staphylococcus aureus) (예를 들어, 다중-내성 (multi-resistant) 스타필로코커스 아우레우스), 엔테로코커스 패시움 ( Enterococcus faecium ) (예를 들어, 반코마이신-내성 엔테로 코커스 패시움) 또는 효모 칸디다 알비칸스 ( Candida albicans )를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 병원성 미생물에 의해 야기된다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 상기 감염은 피부 감염 (예를 들어, 피부 창상)이다. 본 발명의 조성물로 치료를 받을 수 있는 피부 감염에는 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스에 의한 박테리아성 피부 감염, 예를 들어, 단순포진 바이러스 (Herpes Simplex Virus) 또는 대상포진 바이러스 (Herpes zoster Virus)에 의한 바이러스성 피부 감염, 진균류성 피부 감염 및 효모성 피부 감염이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
구체적인 실시 양태에 따르면, 본 발명은 아토피성 피부염의 이차 감염으로서 발생하는 것들과 같은 감염성 창상의 치료를 고려한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "창상 (wound)"은 광의적으로는, 여러 가지 방식 중 임의의 방식으로 시작되며 특징이 다양한, 피부 및 피하 조직 뿐만 아니라 내장기관의 손상 (예를 들어, 감염성 유기체에 의한 창상)을 지칭한다. 구체적인 예에는, 타박상, 찰과상, 화상, 일광화상, 절개 창상, 적출 창상, 수술 창상, 괴사성 근막염 (necrotizing fascitis), 궤양, 정맥 울혈 궤양 (venous stasis ulcer), 당뇨성 궤양, 욕창성 궤양 (decubitus ulcer), 아프타성 궤양 (aphthous ulcer), 욕창 궤양 (pressure ulcer), 병변, 반흔, 원형탈모증 (alopecia areata), 피부염, 알레르기 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 대장염 (colitis), 베를로크 피부염 (berloque dermatitis), 기저귀 피부염, 한포상 습진 (dyshidrotic dermatitis), 건선, 습진, 홍반 (erythema), 사마귀 (wart), 항문 사마귀, 혈관종, 체리 혈관종, 무좀 (athlete's foot), 이형성 모반 (atypical mole), 기저세포 암종, 베이트만 자반증 (Bateman's purpura), 수포성 유천포창 (bullous pemphigoid), 칸디다 (candida), 결절성 이륜 연골피부염 (chondrodermatitis helicis), 클라크 모반 (Clark's nevus), 단순성 포진 (cold sore), 콘딜로마 (condylomata), 낭종 (cyst), 다리에 질환 (Darier's disease), 피부섬유종 (dermatofibroma), 원판상 홍반성 루푸스 (Discoid Lupus erythematosus), 화폐상 습진 (nummular eczema), 아토피 습진, 한포상 습진, 수부 습진 (hand eczema), 다형 삼출성 홍반 (Multiforme erythema Nodosum), 포어다이스 병 (Fordyce's Condition), 목뒤 켈로이드성 모낭염 (Folliculitis Keloidalis Nuchae), 모낭염 (Folliculitis), 고리 육아종 (Granuloma Annulare), 그로버 병 (Grover's disease), 땀띠 (heat rash), 단순포진 (herpes simplex), 대상포진 (herpes zoster) (대상포진 (shingles)), 한선염 (Hidradenitis Suppurativa), 두드러기, 다한증 (Hyperhidrosis), 어린선 (Ichthyosis), 농가진 (Impetigo), 모공 각화증 (Keratosis Pilaris), 켈로이드 (Keloid), 각화극세포종 (Keratoacanthoma), 편평태선 (Lichen Planus), 편평태선모양각화증 (Lichen Planus Like Keratosis), 만성단순태선 (Lichen Simplex Chronicus), 경화태선 (Lichen Sclerosus), 림프종양 구진증 (Lymphomatoid Papulosis), 피부 루푸스 (Lupus of the skin), 라임병 (Lyme disease), 선상태선 (Lichen Striatus), 점액낭종 (Myxoid cyst), 균상식육종 (Mycosis Fungoides), 전염성 연속증 (Molscum Contagiosum), 사마귀 (Moles), 손발톱 곰팡이 (Nail Fungus), 당뇨병성 유지방 (Necrobiosis Lipoidica Diabeticorum), 화폐상 피부염, 손발톱갈림증 (Onychoschizia), 손발톱진균증 (Onychomycosis), 만성태선양 비강진 (Pityriasis Lichenoides), 장미색 비강진 (Pityriasis Rosea), 모공성 홍색 비강진 (Pityriasis Rubra Pilaris), 발바닥 사마귀, 옻중독 (Poison Ivy), 포이즌 오크 (Poison Oak), 한포진 (Pompholyx), 수염 가성모낭염 (PseudofoUiculitis Barbae), 항문소양증 (Pruritus Ani) 및 백색비강진 (Pityriasis Alba)이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
창상은 전형적으로 창상의 깊이에 따라 4가지 등급 중 하나로 분류된다: (i) 등급 I: 상피로 한정된 창상; (ii) 등급 II: 피부까지 확장된 창상; (iii) 등급 III: 피하 조직까지 확장된 창상; 및 (iv) 등급 IV (또는 전층 창상 (full-thickness wound)): 뼈 (예를 들어, 대전자 (greater trochanter) 또는 천골 (sacrum)과 같은 골 압력점 (bony pressure point))가 노출된 창상.
본원에서 사용되는 용어 "부분층 창상 (partial thickness wound)"은 등급 I 내지 III을 포함하는 창상을 지칭하며; 부분층 창상의 예에는 화상, 욕창, 정맥 울혈 궤양, 및 당뇨병성 궤양이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "깊은 창상 (deep wound)"은 등급 III 및 등급 IV 창상 둘 다를 포함하는 의미이다.
본원에서 사용되는 용어 "만성 창상"은 30일 이내에 치유되지 않는 창상을 지칭한다.
창상과 관련하여 용어 "치유"는 반흔 형성과 같이 창상을 복구하는 과정을 지칭한다.
구체적인 실시 양태에서, 본 발명의 일부 실시 양태의 조성물은 치유 과정을 촉진, 즉 가속화한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방"은 대상에서 질환, 장애 또는 상태가 발생하지 않도록 하는 것을 지칭한다. 일부 경우에, 상기 대상은 질환을 발병시킬 위험이 있을 수 있지만, 아직까지는 질환에 걸린 것으로 진단받지 않았다.
본 발명의 이러한 측면에 따라 치료될 수 있는 전형적인 대상은, 감염성 질환의 치료 또는 예방이 필요한, 수컷 또는 암컷의, 임의의 연령의 인간, 또는 말 (즉, 말과 (equine)), 소, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이, 낙타, 알파카, 라마 및 야크를 포함하나 이들로 한정되지 않는 가축과 같은 포유류를 포함한다.
본 발명은 1차 감염, 및 염증성 질환 (예를 들어, 만성 염증성 질환)의 결과로서 발생하는 2차 감염을 비롯하여 모든 유형의 감염의 치료를 고려한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "만성 염증성 질환"이라는 표현은, 지속적인 염증을 특징으로 하는 임의의 의학적인 병태를 지칭한다.
염증 관련 의학적인 병태의 예에는, 알레르기 질환, 염증성 호흡기 질환, 염증성 폐질환, 자가면역 질환, 염증성 악성 질환, 염증성 이식-관련 질환, 염증성 퇴행성 질환, 염증성 손상, 염증성 구강 질환, 염증성 안질환, 염증성 피부 질환, 과민성 관련 질환, 염증성 심혈관 질환, 염증성 선 (glandular) 질환, 염증성 위장 질환, 염증성 피부 질환, 염증성 간 질환, 염증성 신경 질환, 염증성 근골격 질환, 염증성 신장 질환, 염증성 전신 질환, 염증성 결합조직 질환, 염증성 종양, 괴사, 및/또는 염증성 이식-관련 질환이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
알레르기 질환의 예에는 천식, 두드러기, 심마진 (urticaria), 꽃가루 알레르기, 집먼지 진드기 알레르기, 독액 알레르기, 화장품 알레르기, 라텍스 알레르기, 화학물질 알레르기, 약물 알레르기, 곤충 교상 알레르기, 동물 비듬 알레르기, 쐐기식물 알레르기, 옻중독 알레르기, 아나필라틱 쇼크 (anaphylactic shock), 과민증, 알레르기 기도 염증 및 음식 알레르기가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 폐질환의 예에는, 천식, 알레르기 천식, 폐기종, 만성 폐색성 폐질환 및 기관지염이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 호흡기 질환의 예에는, (예를 들어, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumonia )에 의한) 급성 호흡기 감염이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 안질환의 예에는, (예를 들어, P. 에어루지노사 케라티티스 (P. aeruginosa keratitis )에 의한) 콘택트렌즈 노출이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 구강 질환의 예에는, 궤양성 병변이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
과민반응의 예에는, I형 과민반응, II형 과민반응, III형 과민반응, IV형 과민반응, 즉시 과민반응, 항체 매개 과민반응, 면역 복합체 매개 과민반응, T 림프구 매개 과민반응, 지연 유형 과민반응, 조력자 T 림프구 매개 과민반응, 세포독성 T 림프구 매개 과민반응, TH1 림프구 매개 과민반응, 및 TH2 림프구 매개 과민반응이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 심혈관 질환의 예에는, 폐쇄 질환, 동맥경화증, 심근경색, 혈전증, 베게너 육아종증 (Wegener's granulomatosis), 타카야수 동맥염 (Takayasu's arteritis), 가와사키 증후군 (Kawasaki syndrome), 항-인자 VIII 자가면역 질환, 괴사성 소장 혈관병증 (necrotizing small vessel vasculitis), 현미경적 다발성혈관염 (microscopic polyangiitis), 처그 스트라우스 증후군 (Churg and Strauss syndrome), 포시-면역 포칼 괴사성 사구체신염 (pauci-immune focal necrotizing glomerulonephritis), 반월상 사구체신염 (crescentic glomerulonephritis), 항인지질 증후군 (antiphospholipid syndrome), 항체 유도 심부전, 혈소판감소성 자반증 (thrombocytopenic purpura), 자가면역 용혈 빈혈 (autoimmune hemolytic anemia), 심장 자가면역 (cardiac autoimmunity), 샤가스병 (Chagas' disease), 및 항-조력자 T 림프구 자가면역이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 선 (grandular) 질환의 예에는, 췌장 질환 및 I형 당뇨병이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 위장 질환의 예에는, 대장염, 회장염, 크론병, 만성 염증성 장내 질환, 염증성 장 증후군, 만성 염증성 장 질환, 셀리악병 (celiac disease), 궤양, 위궤양, 소화성 궤양, 볼궤양 (buccal ulcer), 비인두 궤양 (nasopharyngeal ulcer), 식도궤양 (esophageal ulcer), 십이지장 궤양 (duodenal ulcer) 및 위장관 궤양이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 피부의 질환의 예에는, 여드름, 자가면역성 수포성 피부 질환, 심상성 천포창 (pemphigus vulgaris), 수포성 유천포창, 낙엽성 천포창 (pemphigus foliaceus), 접촉성 피부염 및 약물발진 (drug eruption)이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 간 질환의 예에는, 자가면역성 간염, 간경변 (hepatic cirrhosis), 및 담즙간경변 (biliary cirrhosis)이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 신경 질환의 예에는, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease) 및 중증 근무력증 (myasthenia gravis)이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 결합조직 질환의 예에는, 자가면역 근염 (autoimmune myositis), 1차 쇼그렌 증후군 (Primary Sjogren's syndrome), 평활근 자가면역 질환, 근염, 건염 (tendinitis), 인대 염증, 연골염 (chondritis), 관절 염증, 활액낭 염증 (synovial inflammation), 손목굴 증후군 (carpal tunnel syndrome), 관절염, 류마티스 관절염, 골관절염 (osteoarthritis), 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 골격 염증, 자가면역 귀 질환, 및 내이 (inner ear)의 자가면역 질환이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 신장 질환의 예에는, 자가면역성 간질성 신염 (autoimmune interstitial nephritis) 및/또는 신암이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 전신 질환의 예에는, 전신 루푸스 홍반, 전신 경화증 (systemic sclerosis), 패혈성 쇼크 (septic shock), 독성 쇼크 증후군 (toxic shock syndrome), 및 악액질 (cachexia)이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 이식-관련 질환의 예에는, 이식 거부, 만성 이식 거부, 아급성 (subacute) 이식 거부, 급성 이식 거부, 과급성 (hyperacute) 이식 거부, 및 숙주이식편대 질환이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 종양의 예에는 악성 종양, 양성 종양, 고형 종양, 전이성 종양 및 비-고형 종양이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 손상의 예에는, 찰과상, 타박상, 자상, 자창, 열상, 임팩트 운드 (impact wound), 뇌진탕, 좌상 (contusion), 열 화상, 동상, 화학적 화상, 일광 화상, 탈수 (desiccation), 방사선 화상, 방사능 화상, 연기 흡입, 근파열 (torn muscle), 당긴 근육 (pulled muscle), 힘줄파열 (torn tendon), 당긴 힘줄 (pulled tendon), 당긴 인대 (pulled ligament), 인대파열 (torn ligament), 과신전 (hyperextension), 연골파열 (torn cartilage), 골절 (bone fracture), 신경압박 (pinched nerve) 및 총상 (gunshot wound)이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
염증성 피부 질환의 예에는 피부 습진, 피부 궤양, 침대/욕창, 병변, 피부염 (예를 들어, 아토피성 피부염, 직업성 피부염), 옻중독, 여드름, 주사비 (rosacea) 및 두드러기가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 만성 염증성 질환은 아토피 질환, 접촉성 피부염, 화폐상 피부염, 방사선 피부염, 화상, 비-아토피성 습진, 욕창, 천식, 암, 눈염증성 질환, 호흡기 감염, 구강 감염 질환, 알레르기 기도 염증, 염증성 장 질환 (IBD), 크론병 또는 궤양성 대장염이다.
본 발명의 구체적인 실시 양태에 따르면, 만성 염증성 질환은 아토피성 피부염 (AD)이다.
증상과 상관없이, 식물 추출물을 포함하는 조성물, 또는 이를 포함하는 단위 투약 형태의 치료적 유효량이 대상에게 투여된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 추출물"은 식물 또는 이의 일부로부터 수득가능한 임의의 추출물을 지칭한다. 전형적으로, 상기 식물 추출물은 이의 활성 성분(들)을 포함한다.
그래서, 상기 식물 추출물은 열매, 열매의 외피 또는 껍질, 씨앗, 식물의 수피, 잎, 뿌리, 뿌리줄기, 근피 또는 줄기 또는 이들의 조합으로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 식물 추출물은 전형적으로, 아일란투스 알티씨마 , 시미시푸가 라 세오모사, 갈라 로이스 갈누트 , 글리시리자 글라브라 (감초), 페우세다눔 프래룹토룸 , 산귀소르배 오피시날리스 , 실리붐 마리아눔 , 사포쉬니코비아 디바리카타 , 라딕 스 트리프테리기이 빌포르디이 , 셀로시아 아르겐테아 , 황련 뿌리, 라딕스 살비애 밀티오리재, 사우루루스 치넨시스 ( Saururus Chinensis ) (예를 들어, 잎), 칼렌둘 라 오피시날리스 , 겐티아나 , 멘사 아쿠아티카 L, 민들레 뿌리/ 타락사쿰 오피시날 레, 댑싸리 열매, 아네마레나 아스포델로이데스 , 스텔라리아 디코토마 L. var . 란 세올라타. 뿌리, 프리틸라리아 베르티실라타 , 악티니디아 폴리가마 , 펠로덴드론 아무렌세 ( Phellodendron amurense ), 사핀두스 무쿠로씨 , 라딕스 소포라 플라레센츠 ( Radix Sophora flarescents ), 크니디움 몬니에리 ( Cnidium monnieri ), 카 멜리아 야포니카 , 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 , 레움 팔마툼 , 크리산테뭄 인디쿰 (Chrysanthemum indicum ), 포르툴라카 올레라세아 ( Portulaca oleracea ), 작약 수피, 안젤리카 시넨시스 , 아스트라갈루스 멤브라나세우스 뿌리, 에보디아 루태 카르파 열매, 폴리고눔 쿠스피다툼 , 스밀락스 글라브라 리조마 ( Smilax glabra rhizoma), 쿠르쿠마 론가 , 인디고 나투랄리스 ( Indigo naturalis ), 세멘 히드노카 르피 하이나넨시 , 트리프테리기이 빌포르디이 ( Tripterygii wilfordii ), 살비애 밀티오리재 , 카멜리아 야포니카 , 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 , 레움 팔마툼 , 페오니아 수프루티카사 ( Peonia suffruticasa ), 루비 프룩투스 ( Rubi fructus ), 리시마치애 포에눔그래시 허바 ( Lysimachiae foenumgraeci herba ), 아일란티 라디시스 코텍스 , 페우세다니 라딕스 ( Peucedani radix ), 테르미나리애 프룩투스 ( Terminariae fructus), 콥티디스 리조메 ( Coptidis rhizome ) 및 알비지애 코텍스 ( Albizziae cortex) 식물로부터 수득된다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 수성 추출물, 친수성 추출물, 비-극성 추출물 또는 극성 추출물이다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 산귀소르배 오피시날리 스로부터 수득된다.
구체적인 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 산귀소르바 오피시날리스 뿌리로부터 수득된다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 아일란투스 알티씨마로부터 수득된다.
일 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 아일란투스 알티씨마의 수피 또는 근피 (즉, 아일란티 코텍스 (Ailanthi Cortex))으로부터 수득된다. 따라서, 다른 실시 양태에 따르면, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물은 아일란티 라디시스 식물 추출물로 이루어진다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 갈라 로이스 갈누트로부터 수득된다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 글리시리자 글라브라로부터 수득된다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 레움 팔마툼으로부터 수득된다.
구체적인 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 레움 팔마툼 뿌리로부터 수득된다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터 수득된다.
구체적인 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리로부터 수득된다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 페우세다눔 프래룹토룸으로부터 수득된다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 상기 식물 추출물은 시미시푸가 라세오모사로부터 수득된다.
또한, 특정한 조합들도 고려된다. 이러한 것은 아래에 나열한다.
식물 추출물은 항-감염성 활성을 가진 것들과 같은 이들 활성 성분을 정제하기 위해 추가로 처리될 수 있다. 항-박테리아 활성 또는 살균 (bactericidal) 활성을 측정하는 방법은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있으며, 페이퍼 확산법 (paper diffusion), 디스크 확산법 (disk diffusion), 브로쓰 희석법 (broth dilution), 및 아가 (agar) 희석 항균 분석법 (이들 중 일부는 하기에 그리고 후술하는 실시예 부분에서 열거됨)이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 식물 추출물에 존재하는 활성 성분에는 아일란톤, 메르소신, 토오센다닌, 제너럴 진세노이드, 갈릭산, 리퀴리틴, 프래룹토린 A, 탄닌산 및 실리빈이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 활성 성분은 식물 추출물로부터 정제되거나 또는 합성되어 사용될 수 있다. 농도는 전술한 분석법으로 측정될 수 있으며, 하기 아일란톤에 제공되는 구체적인 범위는 다른 활성 성분에 대해서도 시행될 수 있다.
일 실시 양태에 따르면, 식물 추출물에서 활성 성분은 아일란톤이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아일란톤" 또는 11.베타.,20-에폭시- 1. 베타., 11. 알파., 12. 알파.-트리히드록시피크라사-3,13(21)-디엔-2,16-디온은 원용에 의해 삽입된 미국 특허 제4,665,201 호 및 제4,774,342 호에서 기술되는 바와 같은 "가죽나무 (tree of heaven)" (일본명 "신주 (Shinju)" 또는 "니와우루시 (Niwaurushi)"; 아일란투스 알티씨마, 스윙글 (Swingle), 시마루바세애 (Simarubaceae))의 수피에 포함된 화합물, 및 이의 유도체에 관한 것이다. 상기 용어는 자연 발생 (정제된 식물) 또는 합성 화합물에 관한 것이다.
일 실시 양태에 따르면, 식물이 아일란티 알티씨마를 포함하는 경우, 상기 활성 성분은 아일란톤을 포함한다.
다른 실시 양태에 따르면, 아일란티 알티씨마 식물 추출물은 아일란톤을 약 0.01% 이상, 약 0.05% 이상, 약 0.1% 이상, 약 0.25% 이상, 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 2.5% 또는 약 5% 이상 포함한다.
전술한 활성 성분의 각각의 범위가 구체적으로 고려된다 (예를 들어, 아일란톤은 0.01-5%, 0.05 -2.5%, 0.05-1%, 0.01-1%를 포함함).
일 실시 양태에 따르면, 아일란톤을 포함하는 조성물에는 셀룰로오스, 단백질 및 기타 이차 대사물과 같은 아일란더스 (Ailanthus) 물질이 없다.
식물 추출물은 전형적으로 극성 및 비-극성 추출물, 그리고 친수성 및 소수성 추출물로 구분된다.
그래서, 상기 식물 추출물은 비제한적인 예로서, 에틸 알코올 (에탄올), 부틸 알코올 (부탄올), 메탄올, 물 또는 프로판올과 같은 극성 용매 (즉, 극성 추출물)를 사용하여 정제될 수 있다. 본 발명의 극성 추출물은 예를 들어 1 - 10% 극성 용매, 10 - 20% 극성 용매, 20 - 30% 극성 용매, 30 - 40% 극성 용매, 40 - 50% 극성 용매, 50 - 60% 극성 용매, 70 - 80% 극성 용매, 80 - 90% 극성 용매 및 90 - 100% 극성 용매를 비롯하여, 임의의 %의 극성 용매를 포함할 수 있다.
대안적으로는, 상기 식물 추출물은 비제한적인 예로서, 이소옥탄과 같은 비-극성 용매 (즉, 비-극성 추출물)를 사용하여 정제될 수 있다. 본 발명의 비-극성 추출물은 예를 들어 1 - 10% 비-극성 용매, 10 - 20% 비-극성 용매, 20 - 30% 비-극성 용매, 30 - 40% 비-극성 용매, 40 - 50% 비-극성 용매, 50 - 60% 비-극성 용매, 70 - 80% 비-극성 용매, 80 - 90% 비-극성 용매 및 90 - 100% 비-극성 용매를 비롯하여, 임의의 %의 비-극성 용매를 포함할 수 있다.
전형적으로, 소수성 분자는 비-극성인 경향이 있어서, 다른 중성 분자 및 비-극성 용매를 선호하며, 대안적으로는, 친수성 분자는 극성인 경향이 있으며 물 및 다른 극성 성분에 의해 용해된다.
그래서, 본 발명의 식물 추출물은 수 (수성) 추출물 또는 알코올 추출물 (예를 들어, 부탄올, 에탄올, 메탄올, 헥산, 하이드로알코올, 예를 들어 Swanson RL et al., 2004, Biol. Bull. 206: 161-72를 참조)과 같은 극성 추출물 또는 비-극성 추출물 (예를 들어, 이소옥탄, 예를 들어, Ng LK and Hupe M. 2003, J. Chromatogr A. 1011 : 213-9; Diwanay S, et al, 2004, J. Ethnopharmacol. 90: 49-55를 참조)을 포함하여, 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
적용되는 정확한 용매와는 상관없이, 식물 추출물은 전형적으로, 식물 샘플 (예를 들어, 잎, 씨앗)을 소량의 액체 (예를 들어, 식물 샘플 2 mg 당 물, 알코올 또는 유기 용매 10 ml)와 함께 모르타르에 넣고, 막자를 사용해 상기 샘플을 완전히 분쇄함으로써 제조된다. 상기 식물 샘플을 완전히 분쇄한 경우, 분쇄된 식물 재료로부터 원심분리, 여과, 양이온-교환 크로마토그래피 등을 통해 식물 추출물을 분리하고, 필요한 경우 수집한 액체를 (농축 컬럼 등을 통해) 추가로 처리하고, 활성 성분을 친화성 크로마토그래피, 질량 크로마토그래피 등을 통해 상기 추출물로부터 분리할 수 있다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 아일란티 라디시스 식물 추출물을 수득하기 위한 예시적인 방법은 건조된 식물 샘플 (예를 들어, 아일란투스 알티씨마의 수피 또는 근피)을 끓는 물에 (예를 들어, 3시간 동안) 둔 다음, 선택적으로 열수 추출물을 -60 ℃, 감압에서 동결건조시키는 단계를 포함한다. 다음, 동결건조된 추출물을 H20, 에틸 아세테이트 (EtOAc) 또는 부틸 알코올 (n-BuOH)과 같은 극성 추출물로 재용해시킬 수 있다. 그런 다음, 수집한 식물 추출물을 필요한 경우 (농축 컬럼 등을 통해) 추가로 가공할 수 있으며, 활성 성분은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등을 통해 상기 추출물로부터 분리할 수 있다.
구체적인 실시 양태에 따르면, 본 발명의 식물 추출물은 수성 추출물이다. 정제된 (예를 들어, 식물 추출물에서 유기 염 및/또는 중금속 및/또는 전분의 농도가 감소된) 식물 추출물을 수득하기 위해, 수성 식물 추출물은 전형적으로, 마크로-다공성 수지와 같은 수지 크로마토그래피 또는 다른 크로마토그래피 방법을 사용해 추가로 정제된다.
그래서, 다른 실시 양태에 따르면, (a) 식물에 1배 내지 10배 부피의 물을 처리하여, 상기 식물의 추출물을 제조하는 단계; 및 (b) 마크로-다공성 수지를 사용하여 상기 식물 추출물에서 유기 염 및/또는 중금속 및/또는 전분의 양을 줄여서, 상기 식물 추출물에 존재하는 활성 성분의 함량을 높이는 단계를 포함하는, 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 식물 추출물은 또한, 예를 들어, Crodarom (Crodarom SAS, Chanac, France)과 같이 여러 많은 시중의 공급업체로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단일 식물 추출물을 포함할 수 있거나, 또는 여러 가지 식물 추출물을 포함할 수 있다.
그래서, 본 발명의 일 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 산귀소르배 오피 시날리스 식물 추출물과, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물, 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물 및 글리시리자 글라브라 식물 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부가적인 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 수성 식물 추출물을 포함하며, 상기 식물은 갈라 로이스 갈누트 , 페우세다눔 프래룹토룸 및 시미시푸가 라세오모사로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 산귀소르배 오피시날리 스 식물 추출물, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물 및 글리시리자 글라브라 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 산귀소르배 오피시날리 스 식물 추출물, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물 및 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 산귀소르배 오피시날리 스 식물 추출물 및 아일란투스 알티씨마 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 산귀소르배 오피시날리 스 식물 추출물 및 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 산귀소르배 오피시날리 스 식물 추출물 및 글리시리자 글라브라 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 산귀소르배 오피시날리 스 식물 추출물 및 레움 팔마툼 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 산귀소르배 오피시날리 스 식물 추출물 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 아일란투스 알티씨마 식물 추출물, 및 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물, 글리시리자 글라브라 식물 추출물, 레움 팔마툼 식물 추출물 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 식물 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부가적인 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 아일란투스 알티씨마 식물 추출물 및 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 아일란투스 알티씨마 식물 추출물 및 글리시리자 글라브라 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 아일란투스 알티씨마 식물 추출물 및 레움 팔마툼 식물 추출물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 아일란투스 알티씨마 식물 추출물 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 식물 추출물을 포함한다.
조성물의 식물 추출물의 각각의 농도는 다양할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 그래서, 상기 조성물의 식물 추출물의 각각의 농도는 약 0.01% 내지 10%, 0.05% 내지 9%, 0.1% 내지 8%, 0.15% 내지 7%, 0.2% 내지 6%, 약 0.25% 내지 5%, 약 0.3% 내지 4%, 약 0.4% 내지 3%, 약 0.5% 내지 2%, 약 1% 내지 2% 또는 약 0.1% 내지 1%의 범위일 수 있다.
구체적인 실시 양태에 따르면, 조성물의 식물 추출물의 농도는 약 0.5% 내지 2%일 수 있다. 다른 구체적인 실시 양태에 따르면, 조성물의 식물 추출물의 농도는 약 1%이다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 약 0.01% 이상의 농도의 아일란톤 및 미용학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
일 실시 양태에 따르면, 아일란톤을 포함하는 상기 조성물은 추가로 산귀소 르배 오피시날리스 식물 추출물을 본원에서 기술된 범위에서처럼 포함한다.
일 실시 양태에 따르면, 아일란톤을 포함하는 조성물은 예를 들어, 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물, 글리시리자 글라브라 식물 추출물, 레움 팔마툼 뿌리 추출물, 크니디움 몬니에리 열매 추출물 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물과 같은 부가적인 식물 추출물을 추가로 포함한다.
일 실시 양태에 따르면, 아일란톤을 포함하는 조성물은 디포타슘 글리시리제이트를 추가로 포함한다.
조성물의 아일란톤의 농도는 다양할 수 있는 것으로 이해하면 될 것이다. 따라서, 조성물의 아일란톤의 농도는 약 0.01% 내지 10%, 약 0.01% 내지 7%, 약 0.01% 내지 5%, 약 0.01% 내지 3%, 약 0.01% 내지 2%, 약 0.01% 내지 1%, 약 0.01% 내지 0.5%, 약 0.01% 내지 0.3%, 약 0.01% 내지 0.2% 또는 약 0.01% 내지 0.1%의 범위일 수 있다.
일 실시 양태에 따르면, 본 발명의 조성물은 국소, 경구, 안내 또는 폐내 (예를 들어, 흡입) 투여용으로 제형화될 수 있다. 다른 제형들은 후술하며, 본 발명의 범주에 존재한다.
본 발명의 조성물은 그 자체로, 또는 약학 조성물이나 미용 조성물로 대상에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학 조성물이나 미용 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학적 성분들이 포함된, 본원에서 기술된 활성 성분의 제조물을 지칭한다. 상기 조성물의 목적은 대상으로의 활성 성분 (예를 들어, 식물 추출물)의 투여를 용이하게 하는 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "활성 성분"은 의도하는 생물학적 효과 (즉, 감염의 치료 또는 예방)를 제공할 수 있는 식물 추출물 조성물을 지칭한다.
이후, 상호호환적으로 사용될 수 있는 "생리학적으로 허용가능한 담체" 및 "약학적으로 허용가능한 담체"라는 표현은, 대상에 유의한 자극을 주지 않으며, 투여된 활성 성분의 생물학적 활성 및 특성을 방해하지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다. 보강제는 이들 표현에 포함된다.
본원에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 활성 성분의 투여를 더욱 용이하게 하기 위해 조성물 (약학 조성물 또는 미용 조성물)에 첨가되는 불활성 성분을 지칭한다.
약물의 제형 및 투여 기술은 본원에 원용이 삽입된 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition에서 찾을 수 있다.
본 발명의 조성물의 각각은 조합-제형에 또는 개별 조성물 (예를 들어, 2개의 제형, 3개의 제형물)에 식물 추출물을 포함할 수 있다. 조합-제형화되지 않는 경우, 식물 추출물 조성물의 투여는 동시에 또는 연속적으로 시행될 수 있다.
임의의 경우, 상기 조성물은 많은 유형의 투여용으로 제형화될 수 있다.
적합한 투여 경로는 예를 들어, 근육내, 피하 및 수내 (intramedullary) 주입, 뿐만 아니라 척추강내 (intrathecal), 예를 들어 우심방강 또는 좌심방강 (ventricular cavity)으로의, 공통 관상동맥 (common coronary artery)으로의 직접 심실내, 심장내, 정맥내, 복강내, 비내, 또는 안내 주입을 비롯하여, 경구, 직장, 경점막, 특히 경비, 장내 또는 비경구 전달을 포함할 수 있다.
대안적으로는, 예를 들어, 활성 성분 (예를 들어, 식물 추출물) 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 환자의 조직 영역에 (예를 들어, 감염된 피부를 둘러싼 건강한 피부에) 직접 주입함으로써, 전신적인 방식보다 국소적으로 상기 조성물을 투여할 수 있다.
상기 조성물의 적합한 투여 경로는 예를 들어, 안내 (예를 들어, 눈), 국소 (예를 들어, 피부, 모발, 손발톱, 두피와 같은 케라틴성 조직), 경피, 피하, 폐내 및 경구 (예를 들어, 입) 투여를 포함할 수 있다.
일 실시 양태에 따르면, 본 발명의 조성물은 국소로, 폐내로 (예를 들어, 흡입을 통해), 경구로 또는 안내로 투여된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "경구 투여"라는 표현은 본 발명의 조성물을 예를 들어, 액체, 용액, 정제, 캡슐제 또는 엘릭셔의 형태로, 입으로 투여하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "피부 투여"라는 표현은 본 발명의 조성물을 신체의 표면, 즉, 피부, 두피, 모발, 손발톱 등에, 바람직하게는 감염의 영향을 받는 표면에 적용하거나 또는 펴 바르는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "경피 투여"라는 표현은 전신 투여를 위해 (예를 들어, 경피 패치를 통해 또는 경피 이식물에 의해) 피부를 가로질러 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 경피 투여는 전형적으로 감염 부위에 근접해서 시행되지만, 경피 투여는 당해 기술분야의 당업자가 적합하다고 생각하는 해부학적 위치 어느 곳에서든 시행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "피하 투여"라는 표현은 본 발명의 조성물을 피부 아래에 (즉, 피부에 완전히 묻혀 있어서, 예를 들어, 피하 이식물을 통해) 투여하는 것을 지칭한다. 피하 투여는 전형적으로 감염 부위에 근접해서 시행되지만, 피하 투여는 당해 기술분야의 당업자가 적합하다고 생각하는 해부학적 위치 어느 곳에서든 시행될 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 드라제화 (dragee-making), 연화 (levigating), 유화 (emulsifying), 캡슐화 (encapsulating), 포집화 (entrapping) 또는 동결건조 공정과 같은 당업계에 잘 공지된 공정에 의해 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 실시 양태에 따라 사용되는 조성물은, 활성 성분이 제조물로 가공되는 것을 용이하게 하는 미용학적으로 또는 약학적으로 사용될 수 있는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택되는 투여 경로에 좌우한다.
주입의 경우, 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 Hank's 용액, 링거액 (Ringer's solution), 또는 생리학적인 염 완충액과 같은 생리학적으로 융화성인 완충액에서 제형화될 수 있다. 경점막 투여의 경우, 벽을 투과하기 위한 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
경구 투여의 경우, 조성물은 활성 화합물을 당업계에 잘 공지된 담체 (예를 들어, 약학적으로 허용가능한 담체)와 조합함으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 이러한 담체는, 상기 조성물이 환자에 의해 경구로 섭취되는 정제, 환약, 당의정, 캡슐제, 겔제, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제형화될 수 있게 한다. 경구용 약물학적 제제는 고형 부형제를 사용하고, 제조된 혼합물을 선택적으로 분쇄하고, 과립의 혼합물을 가공하고, 바람직하다면 적합한 보조제를 첨가하여 정제 또는 당의정 코어를 수득하여 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 특히, 젖당, 자당, 만니톨, 또는 소르비톨을 비롯한 당 (sugar)과 같은 충전제; 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸스, 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸-셀룰로오스, 소듐 카르보메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 생리학적으로 허용가능한 중합체이다. 바람직하다면, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 알긴산나트륨과 같은 이의 염과 같은 붕해제가 첨가될 수 있다.
당의정 코어는 적합하게 코팅이 되어 제공된다. 이를 위해, 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티탄, 락커액 (lacquer solution) 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 선택적으로 포함할 수 있는 농축 당 용액이 사용될 수 있다. 정제 또는 당의정 코팅제를 동정하거나 또는 활성 화합물 용량을 다르게 조합하는 것을 특징화하기 위해, 염료 또는 안료가 첨가될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 조성물은 젤라틴으로 제조된 푸시-핏 캡슐 (push-fit capsule) 뿐만 아니라 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소화제 및 젤라틴으로 제조된 연성의, 밀봉된 캡슐을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 젖당과 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 선택적으로 안정화제와 활성 성분을 혼합하여 포함할 수 있다. 연성 캡슐에서, 활성 성분은 지방산 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 액체에서 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여용의 모든 제형은 선택되는 투여 경로에 적합한 용량이어야 한다.
볼 (buccal) 투여를 위해, 조성물은 통상의 방식으로 제형화된 정제 또는 론제지의 형태를 취할 수 있다.
비내 흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명의 일부 실시 양태에 따라 사용되는 활성 성분은 일반적으로, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소와 같은 적합한 추진제를 사용해 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 유닛은 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 디스펜서 (dispenser)에서 사용되는 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 젖당 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스 및 화합물의 분말 혼합물을 포함하도록 제형화될 수 있다.
본원에서 기술되는 조성물은 볼루스 주사 (bolus injection) 또는 지속적 주입 (continuos infusion)과 같은 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은, 선택적으로 보존제가 첨가된 앰플 또는 다용량 용기와 같은 단위 투약 형태로 존재할 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼일 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형제를 포함할 수 있다.
비경구 투여용 조성물은 수용성 형태의 활성 제제의 수용액을 포함한다. 부가적으로, 활성 성분의 현탁액은 적절한 유계 또는 수계 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 참깨 오일과 같은 지방산 오일, 또는 에틸 올레에이트, 트리글리세라이드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이, 현탁액의 점도를 높이는 성분을 포함할 수 있다. 선택적으로는, 상기 현탁액은 활성 성분의 용해도를 증가시켜 고농축 용액의 제조를 가능하게 하는 적합한 안정화제 또는 제제를 또한 포함할 수 있다.
다른 예로, 활성 성분은, 사용 전에 멸균된 피로젠-무 함유성 수계 용액과 같은 적정 비히클로 조성하기 위한, 분말 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 일부 실시 양태의 조성물은 또한, 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌제 베이스를 사용해, 좌제 또는 정체 관장기 (retention enema)와 같이 직장 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 일부 실시 양태의 맥락에서 사용하기에 적합한 조성물은, 원하는 목적을 달성하기에 효과적인 양의 활성 성분이 포함된 조성물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료적 유효량"이라는 표현은 감염의 예방 또는 치료에 효과적인 활성 성분 (즉, 전술한 바와 같은 식물 추출물 조성물 또는 이의 활성 성분)의 양을 지칭한다. 본 발명의 조성물의 치료적 유효량은 또한, 대상의 세포 (예를 들어, 호염기성 세포, 예를 들어, 후술하는 실시예 부분의 실시예 3 및 6을 참조)로부터 Th2 타입 사이토카인 (예를 들어, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 등)의 분비를 하향조절하는 데 효과적이다. 본 발명의 조성물의 치료적 유효량은 추가로, 대상의 세포 (예를 들어, 케라티노사이트 세포, 예를 들어, 후술하는 실시예 부분의 실시예 4 및 7을 참조)에서 인간 베타-디펜신 (예를 들어, 인간 베타-디펜신 3)의 발현을 상향조절 (예를 들어, 자극)하는 데 효과적이다. 아울러, 본 발명의 조성물의 치료적 유효량은 항-박테리아 활성 (예를 들어, S. 아우레우스 및 앰피실린-내성 E. 콜라이에 대한 항-박테리아 활성, 예를 들어, 후술하는 실시예 부분의 실시예 9를 참조)을 포함할 수 있다.
일 실시 양태에 따르면, 아일란톤의 치료적 유효량은 약 0.01% 이상, 약 0.05% 이상, 약 0.1% 이상, 약 0.25% 이상, 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 2.5% 이상, 또는 약 5% 이상, 또는 약 0.01% 내지 10%, 약 0.01% 내지 7%, 약 0.01% 내지 5%, 약 0.01% 내지 3%, 약 0.01% 내지 2%, 약 0.01% 내지 1%, 약 0.01% 내지 0.5%, 약 0.01% 내지 0.3%, 약 0.01% 내지 0.2% 또는 약 0.01% 내지 0.1% 범위의 농도를 포함한다.
치료적 유효량의 결정은 당해 기술분야의 당업자의 능력 범위 안에 있으며, 특히 본원에서 제공되는 상세한 개시내용에 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 제조물에 있어서, 치료적 유효량 또는 용량은 처음에 시험관내 분석법으로 추정될 수 있다. 예를 들어, 치료적 유효량은 예를 들어, PCR (예를 들어, 실시간 PCR)에 의해 세포 (예를 들어, 베타-디펜신을 발현하는 케라티노사이트 세포주)에서 인간 베타-디펜신의 상향조절된 (즉, 증가된) 발현을 분석함으로써, 시험관내에서 평가될 수 있다. 대안적으로는, 치료적 유효량은 예를 들어, 항체 (예를 들어, IL-13 특이적 단일클론 항체)에 의해 세포 (예를 들어, IL-13을 분비하는 호염기성 세포주)로부터 Th2 타입 사이토카인 (예를 들어, IL-13)의 하향조절된 (즉, 감소된) 분비를 분석함으로써, 시험관내에서 평가될 수 있다.
또한, 용량은 조직 배양 시스템 (예를 들어, 생체외 (ex-vivo) 시스템)에서 또는 동물 모델에서 바람직한 농도 또는 타이터 (titer)를 달성하기 위해 제형화될 수 있다. 이러한 정보를 사용하여, 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 치료적 유효량은 염증성 상태를 경험하고 있는 대상에서 조성물의 투여 전과 후에 염증의 수준을 [예를 들어, 일반혈액검사 (CBC)와 같은 혈액 테스트에 의해, 피부 창상의 관찰 등에 의해] 측정함으로써 시험관내에서 평가될 수 있다.
본원에서 기술된 활성 성분의 독성 및 치료적 효능은 표준 약학적 절차에 의해 시험관내에서, 세포 배양액 또는 실험 동물에서 측정될 수 있다. 이들 시험관내 및 세포 배양액 분석법 및 동물 연구로부터 수득한 데이타를 사용하여, 인간에게 사용할 투여량의 범위를 공식화할 수 있다. 상기 투여량은 적용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 다양할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로, 및 투여량은 환자의 상태를 보고 개개의 의사가 선택할 수 있다 (예를 들어, Fingl, E. et al. (1975), "The Pharmaceutical Basis of Therapeutics," Ch. 1, p. 1.을 참조)
상태 (예를 들어, 감염의 면적, 깊이 및 정도)의 중증도, 및 치료에 대한 대상의 반응성에 따라, 용량은 수일 내지 수주, 수개월 또는 수년간 지속하는 치료 또는 치유의 효과가 나타나거나 감염이 감퇴할 때까지의 치료 동안에, 1회 또는 다회의 투여일 수 있다. 대안적으로는, 상기 조성물은 감염이 발병할 위험이 있는 대상 (예를 들어, 만성 염증성 질환을 앓고 있는 대상)에서 감염의 발생을 예방하기 위해 투여된다. 상기 조성물은 감염의 발생을 예방하기 위해, 연장된 기간 (예를 들어, 수일, 수주, 수개월 또는 수년) 동안 투여될 수 있다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 본 발명의 조성물은 하루에 1회 이상 투여된다. 다른 실시 양태에 따르면, 상기 조성물은 하루에 2회, 하루에 3회 또는 그 이상 투여된다.
본 발명의 실시 양태에 따르면, 투여는 장기적으로 시행된다.
다른 실시 양태에 따르면, 투여는 약 10일 이상, 12일 이상, 14일 이상, 16일 이상, 18일 이상, 21일 이상, 24일 이상, 27일 이상, 30일 이상, 60일 이상, 90일 이상 시행된다.
물론, 투여되는 조성물의 양은 치료를 받는 대상, 질병의 중증도, 투여 방식, 처방하는 의사의 판단 등에 좌우할 것이다.
본 발명의 조성물은 단위 투약 형태로서 제형화될 수 있다. 이러한 형태에서, 제제는 단일 투여와 같이, 적절한 양의 활성 성분을 포함하는 단위 투약으로 세분된다. 상기 단위 투약 형태는 포장된 제제일 수 있으며, 앰플, 디스펜서, 접착 붕대, 비-접착 붕대, 수건, 아기 수건, 거즈, 패드 및 위생 패드와 같은 상기 포장은 분리된 양의 제조물을 포함한다.
본 발명의 교시에 따른 단위 투약 형태는 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 교시에 따른 단위 투약 형태는 추가로 아일란투스 알티씨마 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 교시에 따른 단위 투약 형태는 추가로 글리시리자 글라브라 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 교시에 따른 단위 투약 형태는 추가로 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 교시에 따른 단위 투약 형태는 추가로 레움 팔마툼 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 교시에 따른 단위 투약 형태는 추가로 스쿠텔라리아 바이칼렌시 스 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 교시에 따른 단위 투약 형태는 아일란투스 알티씨마 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 교시에 따른 단위 투약 형태는 글리시리자 글라브라 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 교시에 따른 단위 투약 형태는 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 교시에 따른 단위 투약 형태는 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량, 및 글리시리자 글라브라 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 교시에 따른 단위 투약 형태는 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량, 및 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물을 약 0.5 - 5% 중량/중량, 약 0.5 - 2% 중량/중량 또는 구체적인 실시 양태에 따르면 약 1% 중량/중량의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 교시에 따른 단위 투약 형태는, 아일란톤을 약 0.01% 중량/중량, 약 0.01-1% 중량/중량, 약 0.01-2% 중량/중량, 약 0.01-3% 중량/중량, 약 0.01-4% 중량/중량 또는 약 0.01-5% 중량/중량 이상의 농도로 포함하는 국소, 경구, 폐내 또는 안내 단위 투약 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 단위 투약 형태를 추가로 포함할 수 있다.
제제의 단위 투약 내 활성 화합물의 양은 특정 적용에 따라 달라지거나 조정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 바람직하다면, 활성 성분을 포함하는 단위 투약 형태를 하나 이상 포함할 수 있는, FDA가 승인한 키트와 같은 팩 또는 디스펜서 디바이스에 존재할 수 있다. 상기 팩은 예를 들어, 블리스터 팩 (blister pack)과 같이 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 디바이스는 투여에 대한 지침서를 동봉할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 디바이스는 약제의 제조, 용도, 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형태의 노티스 (notice)도 동봉할 수 있으며, 상기 노티스는 상기 기관이 인간 또는 동물 투여용 조성물의 형태를 승인하였음을 반영하는 것이다. 상기 노티스는 예를 들어, 처방 약물에 대해 또는 승인된 제품 삽입물에 관해 미국 식약청이 승인한 라벨 (label)을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체에서 제형화된 본 발명의 제조물을 포함하는 조성물은 추가로 후술하는 바와 같이, 제조된 후, 적절한 용기에 넣어지며, 지시된 증상의 치료에 대해 라벨링될 수도 있다.
본 발명의 조성물이 생체내에서 이용되기 때문에, 상기 조성물은 바람직하게는 예를 들어, 국가 식품 (National Food) (NF) 등급 이상, 일반적으로 분석 등급 이상, 및 바람직하게는 약학적 등급 이상의, 고순도이면서 잠재적으로 유해한 오염원은 실질적으로 존재하지 않는 조성물이다. 주어진 화합물이 사용 전에 합성되어야 하는 면에서, 이러한 합성 또는 후속하는 정제로써, 바람직하게는, 합성 또는 정제 과정 동안에 사용된 적이 있을 수 있는 잠재적으로 오염성의 독성 제제가 실질적으로 존재하지 않는 산물이 생성되어야 한다.
부가적인 인자들이 본 발명의 조성물 (즉, 전술한 바와 같은 식물 추출물)에 혼입될 수 있다. 이들에는, 세포외 기질 성분 (예를 들어, 비트로넥틴 (vitronectin), 라미닌 (laminin), 콜라겐, 엘라스틴), 성장 인자 (예를 들어, FGF 1, FGF 2, IGF 1, IGF 2, PDGF, EGF, KGF, HGF, VEGF, SDF-1, GM-CSF, CSF, G-CSF, TGF 알파, TGF 베타, NGF 및 ECGF), 성장 인자 [예를 들어, 에리스로포이에틴, 섬유아세포 성장 인자, 프라눌로사이트-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 및 과립구-거대세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)], 호르몬 (예를 들어, 인슐린, 성장 호르몬 (GH), CRH, 렙틴, 프로락틴 및 TSH), 혈관신생 인자 (예를 들어, 안지오게닌 및 안지오포이에틴), 응고 및 항응고 인자 [예를 들어, 인자 I, 인자 XIII, 조직 인자, 칼슘, vWF, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 피브로넥틴, 항트롬빈, 헤파린, 플라스미노겐, 저분자량 헤파린 클릭산 (Clixan), 고분자량 키니노겐 (HMWK), 프레칼리크레인 (prekallikrein), 플라스미노겐 활성자 저해제-1 (PAI1), 플라스미노겐 활성자 저해제-2 (PAI2), 유로키나아제 (urokinase), 트롬보모듈린 (thrombomoduline), 조직 플라스미노겐 활성자 (tPA), 알파 2-항플라스민 및 단백질 Z-관련 프로테아제 저해제 (ZPI)], 사이토카인 저해제 (예를 들어, 시클로스포린 A (Cyclosporin A); 알파-2-마크로글로불린, 펜타미딘 (Pentamidine), 펜톡시파일린 (Pentoxifylline), 덱사메타손), 케모카인 저해제 (예를 들어, 펩티드 3, NR58.3-14-3), 효소 (예를 들어, 엔도글리코시다아제, 엑소글리코시다아제, 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 펩티다아제, 리파아제, 옥시다아제, 데카르복실라아제 (decarboxylase), 수화효소 (hydrase), 콘드로이티나아제 (chondroitinase), 콘드로이티나아제 ABC, 콘드로이티나아제 AC, 히알루로니다아제 (hyaluronidase), 케라타나아제 (keratanase), 헤파라나아제 (heparanase), 헤파라나아제 스플라이스 변형체 (heparanase splice variance), 콜라게나아제 (collagenase), 트립신, 카탈라아제), 신경전달물질, 뉴로펩타이드 (예를 들어, 성분 P), 비타민 (예를 들어, D-비오틴, 콜린 클로라이드, 엽산, 미오-이노시톨 (Myo-inositol), 니아신아미드, D-판토텐산, 칼슘염, 피리독살.HCl, 피리독신.HCl, 리보플라빈, 티아민.HCl, 비타민 B12, 비타민 E, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 B1-6, 비타민 K, 비타민 A 및 비타민 PP), 탄수화물 (예를 들어, 포도당, 만노오스, 엿당 및 과당을 포함한 단당류/이당류/다당류), 이온, 킬레이트제 (예를 들어, Fe 킬레이트제, Ca 킬레이트제), 항산화제 (예를 들어, 비타민 E, 쿠아세틴 (Quarcetin), 과산화물 스캐빈저 (superoxide scavenger), 과산화물 디스뮤타아제 (Superoxide dismutase), H202 스캐빈저, 자유 라디칼 스캐빈저, Fe 스캐빈저), 지방산 (예를 들어, 트리글리세라이드, 인지질, 콜레스테롤, 유리 지방산 및 비유리 지방산, 지방산 알코올, 리놀레산, 올레산 및 리포산), 항생제 (예를 들어, 페니실린, 세팔로스포린 및 테트라사이클린), 아미노산 (예를 들어, 필수 및 비필수 아미노산 (A-Z) 특히 글루타민 및 아르기닌), 염 (예를 들어, 프루리바트 (prurivat) 염 및 황산염), 황산염 (예를 들어, 황산칼슘), 스테로이드 (예를 들어, 안드로겐, 에스트로겐, 프로게스타겐, 글루코코르티코이드 및 미네랄코르티코이드), 진통제, 마취제, 항-박테리아제, 항-효모제, 항진균제, 항-바이러스제, 프로-바이오틱제 (pro-biotic agent), 항-원생동물제 (anti-protozal agent), 항-가려움제 (anti-pruritic agent), 항-피부염제, 항-구토제, 항-염증제, 항-하이퍼케라토라이틱제 (anti-hyperkeratolyic agent), 지한제 (antiperspirant), 비듬제거제, 항히스타민제, 저산소증 유도성 인자 (예를 들어, HIF-1 알파 및 베타 및 HIF-2), 카테콜아민 (예를 들어, 에피네프린 및 노르에피네프린), 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 (예를 들어, 퓨린 및 피리미딘), 프로스타글란딘 (예를 들어, 프로스타글란딘 E2), 류코트리엔, 에리스로포이에틴 (예를 들어, 트롬보포이에틴), 프로테오글리칸 (예를 들어, 헤파란 설페이트, 케라탄 설페이트), 히드록시아파타이트 [예를 들어, 히드록시아파타이트 (Ca10(PO4)6(OH)2)], 합토글로빈 (Hp1-1, Hp2-2 및 Hp1-2), 과산화물 디스뮤타아제 (예를 들어, SOD 1/2/3), 산화질소, 산화질소 공여체 (예를 들어, 니트로프루시드 (nitroprusside), Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA, 글루타티온 퍼옥시다아제, 수화 화합물 (예를 들어, 바소프레신), 세포 (예를 들어, 혈소판), 세포 배지 (예를 들어, M199, DMEM/F12, RPMI, Iscovs), 혈청 (예를 들어, 인간 혈청, 태아 소 (calf) 혈청, 태아 소 (bovine) 혈청), 완충제 (예를 들어, HEPES, 중탄산나트륨), 세제 (예를 들어, Tween), 소독약, 허브, 열매 추출물, 식물 추출물 (예를 들어, 양배추, 오이), 꽃 추출물, 부가적인 식물 추출물, 플라비노이드 (예를 들어, 석류 쥬스 (pomegranate juice)), 스파이스, 잎 (예를 들어, 녹차, 카모마일), 폴리페놀 (예를 들어, 레드 와인), 꿀, 렉틴, 미세입자, 나노입자 (리포좀), 미셀, 탄산칼슘 (CaC03, 예를 들어, 침전된 탄산칼슘, 분쇄/분말화된 탄산칼슘, 알바카 (albacar), PCC, GCC), 방해석, 석회석, 크러시드 대리석 (crushed marble), 분쇄된 석회석, 석회, 및 백악 (예를 들어, 백색 백악, 샴페인 백악 (champagne chalk), 프렌치 백악 (french chalk))이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
구체적인 실시 양태에 따르면, 본 발명의 조성물은 베타-디펜신을 포함하지 않는다.
본 발명의 제형은 또한, 수소, 알킬기, 아릴기, 할로기, 히드록시기, 알콕시기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기, 아실기, 카르복실기, 카르보아미도기, 설폰아미드기, 아미노아실기, 아미드기, 아민기, 니트로기, 유기 셀레늄 화합물, 탄화수소, 및 환형 탄화수소를 포함하는 구성분 (ingredient), 성분, 원소, 및 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 제형은 벤졸 퍼옥사이드, 혈관수축제, 혈관확장제, 살리실산, 레티노산, 아젤라산, 락트산, 글리콜산, 요산 (pyreuric acid), 탄닌, 벤질리덴캄포 및 이의 유도체, 알파 하이드록시스 (hydroxysis), 계면활성제와 같은 성분들과 조합될 수 있다.
본 발명의 일부 실시 양태의 조성물은 활성 성분 (즉, 식물 추출물 본 발명의 조성물)의 생물학적 활성을 보존하고 이의 수명을 연장하면서, 상기 활성 성분의 (예를 들어, 프로테아제 활성에 대한) 안정성 및/또는 (예를 들어, 혈액, 소화액과 같은 생물학적 유체에서의) 용해도를 보존하는 폴리에틸렌글리콜 (예를 들어, PEG, SE-PEG)에 생물접합될 수 있다.
본원에서 개시된 약학적인 유효량의 제제 외에도, 본 발명의 이러한 측면의 조성물은 또한, 피부과적으로 또는 미용학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
"피부과적으로 허용가능한 담체 또는 희석제" 또는 "미용학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제"라는 표현은, 피부, 즉 케라틴 조직에 국소적으로 적용하기에 적합하며, 양호한 미용적 특성을 가지며, 본 발명의 활성제 및 임의의 다른 성분과 융화성이며, 포유류에서 사용 시 안정하고 비독성인 담체를 지칭한다.
본 발명의 담체 (예를 들어, 미용학적으로 허용가능한 담체, 약학적으로 허용가능한 담체)는 의학적인 상태 (예를 들어, 아토피성 피부염)의 치료에 일조하는 구성분 (예를 들어, 식물 추출물)을 포함할 수 있는 것으로 여겨질 것이다.
따라서, 본 발명의 일부 실시 양태의 담체는 하나 이상의 식물 추출물을 포함한다.
일 실시 양태에 따르면, 담체 내의 식물 추출물은 레움 팔마툼 뿌리 추출물, 크니디움 몬니에리 열매 추출물 및/또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물을 포함한다.
일 실시 양태에 따르면, 상기 담체는 디포타슘 글리시리제이트를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시 양태에 따르면, 미용학적 담체는 레움 팔마툼 뿌리 추출물, 크니디움 몬 니에리 열매 추출물, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물 및 디포타슘 글리시리제이트를 포함할 수 있다.
활성 성분 (예를 들어, 본 발명의 식물 추출물)의 경피 흡수를 증대시키기 위해, 디메틸설폭사이드, 디메틸아세타미드, 디메틸포름아미드, 계면활성제, 아존 (azone), 알코올, 아세톤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나 이들로 한정되지 않는 많은 제제 중 하나 이상이 약학 조성물이나 미용 조성물에 첨가될 수 있다.
본 발명의 조성물에 이용되는 담체는 여러 다양한 형태일 수 있다. 이들에는, 수-중-유, 유-중-수, 수-중-유-중-수, 및 실리콘-중-수-중 유 에멀젼을 포함하나 이들로 한정되지 않는 에멀젼 담체, 크림, 연고, 수용액, 로션, 비누, 페이스트, 에멀젼, 젤, 스프레이 또는 에어로졸이 포함된다.
본 발명에 따른 에멀젼은 일반적으로 본원에서 개시된 약학적 유효량의 제제 및 지질 또는 오일을 포함한다. 지질 및 오일은 동물, 식물, 또는 석유로부터 유래될 수 있으며, 천연 또는 합성 (즉, 인공적)일 수 있다. 적합한 에멀젼화제의 예는 예를 들어, 1973년 8월 28일에 Dcikert 등이 출원한 미국 특허 제3,755,560 호; 1983년 12월 20일에 Dixon 등이 출원한 미국 특허 제4,421,769 호 및 McCutcheon's Detergents and Emulsifiers, North American Edition, pages 317-324 (1986)에 기술되어 있으며, 전술한 문헌들은 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
상기 에멀젼은 또한, 케라틴 조직에 적용 시, 발포 (foaming)를 최소화하기 위해 소포제를 포함할 수 있다. 소포제는 고분자량 실리콘, 및 상기의 용도를 위해 당해 기술분야에 잘 공지된 다른 물질을 포함한다.
적합한 에멀젼은 바람직한 산물 형태에 따라, 광범위한 점도를 가질 수 있다.
본 발명의 조성물은 추가로 후술하는 바와 같이, 용액, 로션, 스프레이, 크림, 연고, 샐브 (slave), 젤, 오일, 세정제, 샴푸, 컨디셔너 등을 비롯하여, 피부 적용을 위한 약학 또는 미용 산업에 이용되는 여러 가지 형태 중 하나로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물이나 미용 조성물은, 처리된 피부 영역에 남으며, 쉽게 증발하지 않고/않거나, 또는 물로 헹구어서는 쉽게 제거되지 않으며, 그보다는 비누, 클렌저 및/또는 샴푸를 이용해 제거가능한 정도의 점성으로 제형화될 수 있다.
이러한 특성을 가진 조성물을 제조하는 방법은 당해 기술분야의 당업자에게 잘 공지되어 있으며, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990 (supra); and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed., Williams & Wilkins (1995)에 상세히 기술되어 있다.
로션 및 크림을 포함하나 이들로 한정되지 않는 본 발명의 조성물은 피부적으로 또는 미용학적으로 허용가능한 보습제 및/또는 연화제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "연화제"는 건조의 예방 또는 완화 뿐만 아니라 피부의 보호에 유용한 물질을 지칭한다. 매우 다양한 적합한 연화제가 알려져 있으며, 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 연화제로서 적합한 물질의 예를 많이 포함하고 있으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된, Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 1, pp. 3243 (1972)을 참조한다. 예시적인 연화제는 글리세린이다. 사용될 수 있는 부가적인 연화제에는, 미네랄 오일, 페트로라툼 (petrolatum) 등과 같은 탄화수소 오일 및 왁스, 올리브유, 팜유, 캐스터 오일, 옥수수유, 대두유 등과 같은 식물유 및 동물유 및 지방, 및 라놀린, 라놀린 오일, 라놀린 왁스, 라놀린 알코올 등과 같은 라놀린 및 이의 유도체가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 다른 연화제는, 미리스트산, 스테아르산, 이소스테아르산, 팔미트산 등과 같이 10개 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 지방산의 에스테르, 예컨대 메틸 미리스테이트, 프로필 미리스테이트, 부틸 미리스테이트, 프로필 스테아레이트, 프로필 이소스테아레이트, 프로필 팔미테이트 등을 포함한다. 다른 연화제는 스테아르산, 미리스트산, 라우르산, 이소스테아르산, 팔미트산 등을 포함하는 10개 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 지방산을 포함한다. 연화제는 또한, 세틸, 미리스틸, 라우릴, 이소스테아릴, 스테아릴 등과 같이 10개 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 지방산 알코올을 포함한다.
일 실시 양태에 따르면, 본 발명의 미용 조성물은 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물, 아일란투스 알티씨마 식물 추출물, 레움 팔마툼 뿌리 추출물, 크니디 움 몬니에리 열매 추출물, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물 및 디포타슘 글리시리제이트를 포함한다.
일 실시 양태에 따르면, 상기 미용 조성물은 보습제 및 연화제를 추가로 포함한다.
본 발명의 조성물은 또한, 예를 들어, 향기 및 피부 영양 인자로 조성물을 농후하게 하기 위해 첨가되는 부가적인 성분을 포함할 수 있다.
이러한 성분은 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서, 독성, 비융화성, 불안정성, 알레르기 반응 등을 유도하지 않으면서 인간 케라틴 조직에 사용하기에 적합한 것으로 선택된다. 또한, 이러한 선택적인 성분은, 본 발명의 활성 화합물의 이점을 불필요하게 변경하지 않는 한, 유용하게 제공된다.
CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition (1992)은 본 발명의 조성물에서 사용되기에 적합한, 피부 케어 산업에서 보편적으로 사용되는 비-한정적인 매우 다양한 미용 성분들을 기술하고 있다. 이들 성분 부류의 예에는, 마모제, 흡수제, 미용 성분 예컨대 방향제, 안료, 착색/착색제, 정유, 피부 오일, 스킨 센세이트 (skin sensate), 수렴제 등 (예를 들어, 정향유, 멘톨, 장뇌 (camphor), 유칼립투스 오일, 유제놀 (eugenol), 멘틸 락테이트, 위치 하젤 디스틸레이트 (witch hazel distillate)), 항-여드름제, 안티케이킹제 (anti-caking agent), 소포제, 항균제 (예를 들어, 요오도프로필 부틸카르바메이트), 항산화제, 결합제, 생물학적 첨가제, 완충제, 벌킹제 (bulking agent), 킬레이트제, 화학적 첨가제, 착색제, 미용 수렴제, 미용 살생제, 변성제, 약물 수렴제, 외부 마취제, 피막 형성제 또는 물질, 예를 들어, 조성물의 피막-형성 특성 및 직접성 (substantivity)을 보조하기 위한 중합체 (예를 들어, 에이코센 (eicosene) 및 비닐 피롤리돈의 공중합체), 불투명화제, pH 조정제, 분사제, 환원제, 교환수지 (sequestrant), 피부-컨디셔닝제 (예를 들어, 교질화제 (miscellaneous) 및 수분차단제 (occlusive)를 비롯한 보습제), 피부 진정 및/또는 치유제 (예를 들어, 판테놀 및 유도체 (예를 들어, 에틸 판테놀), 알로에 베라, 판토텐산 및 이의 유도체, 알란토인, 비사볼롤 (bisabolol), 및 디포타슘 글리시피지네이트 (dipotassium glycyffhizinate)), 피부 치료제, 증점제, 및 비타민 및 이의 유도체가 포함된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 피부에 직접 적용될 수 있다. 대안적으로는, 시간을 두고 방출되는 방식으로 피부에 조성물을 방출하는 경피 패치와 같이 당해 기술분야에 공지된 여러 가지 경피 약물 전달 시스템에 의해 정상적인 피부 적용을 통해 전달될 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 다른 약물 전달 시스템은 가압 에어로졸 병, 이온영동치료법 (iontophoresis) 또는 초음파치료법 (sonophoresis)을 포함한다. 이온영동치료법은 피부 투과성을 증가시키고, 경피 전달을 촉진하기 위해 적용된다. 미국 특허 제5,667,487 호 및 제5,658,247 호는, 피부를 가로질러 치료제를 초음파-이온영동적으로 매개하여 수송하기에 적합한 이온초음파 장비를 개시하고 있다. 대안적으로는, 또는 추가로, 리포좀 또는 미셀은 전달 비히클로서 적용될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 광선/광 치료법 [예를 들어, 염증성 피부염을 위한 광 치료법] 및 항생제 치료법 (예를 들어, 국소 또는 전신)과 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는, 다른 현재 시행되는 치료법과 병용될 수 있음을 알게 될 것이다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, (a) 염증 조절제 특성을 가진 제제를 세포와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 세포로부터 인간 베타-디펜신의 분비를 분석하는 단계를 포함하는, 염증 조절제 특성을 가진 제제를 동정하는 방법이 제공되며, 이때, 상기 접촉 후의 베타-디펜신 분비의 상향조절은 상기 제제가 염증 조절제 특성을 가지고 있음을 나타내는 표시이다.
일 실시 양태에 따르면, 상기 제제는 식물 추출물 또는 이의 활성 성분을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상향조절"은, 세포로부터 베타-디펜신의 분비를 증가시키는, 세포에서 인간 베타-디펜신의 RNA 및/또는 단백질의 농도 또는 DNA 복사수의 증가를 지칭한다.
전형적으로, 인간 베타-디펜신의 농도는 식물 추출물로 처리되지 않은 세포에서의 이의 농도보다 증가한다. 바람직하게는, 발현의 상승을 검출하기 위해, 식물 추출물로 처리하지 않은 세포에서 인간 베타-디펜신의 농도의 측정을 함께 시행한다.
인간 베타-디펜신을 자연적으로 발현하거나, 또는 베타-디펜신을 발현하도록 유전자 조작된 세포는 인간 베타-디펜신 (예를 들어, 인간 베타-디펜신 3, 베타-디펜신 2 또는 베타-디펜신 1)의 상향조절된 (즉, 증가된) 발현을 분석하기 위해 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있음을 알게 될 것이다.
구체적인 실시 양태에 따르면, 상기 세포는 상피 세포 (예를 들어, 케라티노사이트 세포)이다.
인간 베타-디펜신 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 검출하기 위한 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법은 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있다.
그래서, 예를 들어, 노던 블롯 분석, 역전사 PCR (RT-PCR) [예를 들어, 준-정량적 (semi-quantitative) RT-PCR, 예를 들어, Light CyclerTM (Roche)을 사용하는 정량적 RT-PCR], RNA 제자리 혼성화 (in situ hybridization) (RNA-ISH), 제자리 RT-PCR 염색 및 [예를 들어, Affymetrix 마이크로어레이 (Affymetrix®, Santa Clara, CA)를 사용하는] 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 분석과 같은 RNA 검출 방법이 사용될 수 있다.
구체적인 실시 양태에 따르면, 실시간 PCR은 세포로부터 인간 베타-디펜신의 분비를 분석하기 위해 사용된다.
대안적으로는, 인간 베타-디펜신 아미노산 서열 (즉, 인간 베타-디펜신 단백질)의 존재 및/또는 수준은 면역복합체 [즉, 생물학적 샘플에 존재하는 인간 베타-디펜신 항원 (인간 베타-디펜신 아미노산 서열)과 인간 베타-디펜신 특이적 항체 간에 형성되는 복합체]의 형성을 통해 인간 베타-디펜신 특이적 항체를 사용해 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "약 (about)"은 ± 10%를 지칭한다.
용어 "~을 포함한다", "~을 포함하는", "~을 수반한다", "~을 수반하는", "~을 가지는" 및 이들의 활용형태는 "~을 포함하나 이들로 한정되지 않는"을 의미한다.
용어 "~로 이루어지는"은 "~을 포함하나 이에 한정되는"을 의미한다.
용어 "본질적으로 ~로 이루어지는"은, 조성물, 방법 또는 구조가 부가적인 구성분, 단계 및/또는 부분 (part)을 포함할 수 있지만, 단, 상기 부가적인 구성분, 단계 및/또는 부분이 청구하는 조성물, 방법 또는 구조의 기본적이고 신규한 특징을 실질적으로 변경하지 않음을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 문맥상 다르게 명시하지 않는 한, 복수형을 포함한다. 예를 들어, 용어 "하나의 화합물" 또는 "하나 이상의 화합물"은 이의 혼합물을 포함하여 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본 출원 전체를 통해, 본 발명의 여러 가지 실시 양태가 범위 형식 (range format)에서 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간략화를 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위에 고정된 한정으로서 주어져서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위에 관한 설명은 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 그 범위의 개개의 수치를 가지는 것으로 여겨져야 한다. 예를 들어, 1 내지 6이라는 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같이 구체적으로 개시된 하위범위 뿐만 아니라 그 범위의 개개의 숫자, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하는 것으로 여겨져야 한다. 이는 범위의 폭과는 상관없이 적용된다.
수치 범위가 본원에서 나타나 있으면 언제나, 나타낸 범위의 언급된 숫자 (분수 또는 정수)를 포함함을 의미한다. 첫번째 언급한 숫자와 두번째 언급한 숫자 "사이의 범위에 있는/범위"라는 표현은, 첫번째 언급한 숫자"부터" 두번째 언급한 숫자"까지의 범위에 있는/범위"와 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 첫번째 언급한 숫자와 두번째 언급한 숫자, 및 이 두 수 사이의 분수 및 정수 모두를 포함하는 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "방법"은, 화학적, 약물학적, 생물학적, 생화학적 및 의학적 분야의 실행자에게 공지되거나, 또는 이들에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 과정으로부터 쉽게 개발되는, 이러한 방식, 수단, 기술 및 과정을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 해당 업무를 달성하기 위한 방식, 수단, 기술 및 과정을 지칭한다.
명료하게 하기 위해 개개의 실시 양태의 문맥에서 기술된 본 발명의 소정의 특징은 단일 실시 양태에서도 함께 제공될 수 있는 것으로 이해한다. 반대로, 간략화를 위해 단일 실시 양태의 문맥에서 기술된 본 발명의 여러 가지 특징 또한, 따로 또는 적합한 하위조합으로 또는 본 발명의 다른 기술된 실시 양태에서 적합한 것으로 제공될 수 있다. 여러 가지 실시 양태의 문맥에서 기술된 소정의 특징은, 상기 실시 양태가 이들 구성원들 없이 이용이 불가능하지 않는 한, 이들 실시 양태의 필수적인 특징인 것으로 간주해서는 안 된다.
전술하고 하기 청구항에서 청구되는 바와 같이 본 발명의 여러 가지 실시 양태 및 측면들은 하기 실시예에서 실험적인 지지를 얻게 된다.
실시예
이제, 상기 상세한 설명과 함께 본 발명을 비-한정적으로 예시하는 하기 실시예를 참조한다.
일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법 및 본 발명에 이용되는 실험 과정은 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 완벽하게 설명되어 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)를 참조하며; 이용가능한 면역분석법은 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 설명되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521 호; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cell and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)를 참조하며; 이들은 원용에 의해 본원에 참조로서 삽입된다. 다른 일반적인 참조문헌이 상기 문헌을 통해 제공된다. 과정들은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있으며 독자의 편의를 위해 제공되는 것으로 생각된다. 포함된 모든 정보는 원용에 의해 참조로서 삽입되어 있다.
실시예 1
IL -13 저해의 평가에 적합한 시험관내 모델의 개발
재료 및 실험 과정
KU812 세포의 배양
KU812 세포 (인간 호염기성 세포, ATCC CRL-2099™)를, 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum; FBS), 및 50 μg/ml 젠타마이신 및 50 μg/ml 암포테리신 B 또는 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI를 사용해 배양 플라스크에 접종하였다. 접종된 세포를 37 ± 2 ℃, 5 ± 1% C02에서 배양하였으며, 충분한 수의 세포가 성장할 때까지 배양 배지를 1주에 2회 내지 3회 교환하였다.
(시험 재료의) 추출 방법
품질 조사 (원료의 구별 (differentiation) 및 인증 (authentification), 중금속 분석, 살충제 잔여물 체크 및 활성 성분 함량 분석)에 따라 허브를 선택하였다.
잘개 썬 허브 재료를 10배 부피의 물로 균질화하고, 교반하면서 80 ℃에서 2시간 동안 추출하였다. 동일한 과정으로 3회 반복하여 추출하였고, 3회의 추출물을 함께 혼합하였다. 균질물을 수집하고, 400-메시 스크린을 통해 여과하고, 농축시킨 다음 (80 ℃, 0.1 MPa), 10000 r/min에서 20분 동안 원심분리하였다.
상기 추출물을 마크로-다공성 수지에 의해 정제한 다음, 필요한 부피로 농축시켰다. 상기 추출물에 대한 품질 조사는 품질 기준 (자연적인 특징, 상대 밀도, pH 값, 중금속 분석, 미세물학적 분석법, 활성 성분 함량 측정)에 따라 분석하였다.
시험 재료 세포독성 프리스크린 ( Prescreen )- MTS 분석법
본 분석법에서 사용하기 위해, 페놀 레드가 포함되지 않은 세포 배양 배지 100 μl가 들어 있는 96-웰 플레이트에 세포를 접종하였다 (대략 웰 당 0.1 x 106 내지 0.2 x 106 세포). 다음, 세포 배양 배지에서 제조된 시험 재료 (100 μl)를 이의 최종 농도의 2배에서 각 웰에 첨가하여, 배양물의 최종 부피를 200 μl로 하였다. 플레이트를 37 ± 2 ℃ 및 5 ± 1% C02에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, MTS:PMS (Promega 사)가 20:1인 용액 20 μl를 각 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어 4시간 동안 더 두었다. 그런 다음, 상기 플레이트를 플레이트 판독기를 사용해 490 nm에서 판독하였다.
IL -13 방출 분석법
IL-13 방출 분석법에서 사용하기 전에, KU812 세포를 PBS가 무첨가된 PRMI 배지에서 2일 동안 배양하였다. 이 2일간의 인큐베이션 후, PBS가 포함된 RPMI를 IL-13 분석법에 사용하였다.
100 μl의 RPMI가 들어 있는 96-웰 플레이트에 KU812 세포를 접종하였다 (웰 당 대략 0.2 x 106 내지 0.3 x 106 세포). 다음, 세포 배양 배지에서 제조된 시험 재료 (100 μl)를 이의 최종 농도의 2배에서 각 웰에 첨가하고, 상기 세포를 37 ± 2 ℃ 및 5 ± 1% C02에서 대략 6시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 전처리 기간 후, PMA 및 이오노마이신 (ionomycin)을 포함하는 농축된 스탁 (stock) 용액 10 μl를 각 웰에 첨가하고 (배양물 중 최종 농도: 20 ng/ml PMA 및 1 μΜ 이오노마이신), 상기 플레이트를 37 ± 2 ℃ 및 5 ± 1% C02에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음, 상기 세포 배양 상층액으로 IL-13에 대해 분석하였다.
IL -13 ELISA ( RayBiotech )
일련의 표준물을 제조하고 (0 pg/ml 내지 40 pg/ml), 이들 표준물 중 각각의 100 μl를 96-웰 플레이트에 있는 2개의 웰에 (이중으로) 배분하였다. 이어서, 각각의 세포 배양 상층액 샘플 25 μl 및 희석제 B 100 μl를 부가적인 웰에 첨가하고 (상기 샘플을 희석제 B와 희석하여, IL-13의 각각의 수준을 표준 곡선의 범위에 나타냄), 상기 플레이트를 실온에서 2시간 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 일단 마지막의 세정액을 제거하고 나면, 바이오틴이 접합된 검출 항체 100 μl를 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 전술한 바와 같이 다시 세정하였다. 그런 다음, HRP-스트렙타비딘 (100 μl)을 각 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 일단 마지막의 세정액을 제거하고 나면, 기질 용액 (크로마겐 (chromagen)으로서 과산화수소 + 테트라메틸벤지딘) 100 μl를 각 웰에 첨가하였다. 일단 충분한 발색 수준에 도달하면, 정지 용액 (2 N 황산) 50 μl를 각 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 460 nm에서 판독하였다.
계산
세포 생존성 분석법 ( MTS 분석법)
시험 재료로 처리하지 않은 웰의 평균 흡광도를 측정하고, 이를 100% 생존성 (무처리군)을 나타내는 것으로 사용하였다. 다음, 이 값을 사용하여 시험 물질로 처리한 웰 (처리군)의 생존성을 하기 방정식을 이용해 측정하였다: ((처리군) / (무처리군)) x 100.
IL -13 ELISA 분석
IL-13 ELISA 분석법의 경우, 공지된 표준물에 대한 흡광도 값을 사용하여, 표준 곡선을 생성하였다. 다음, 비공지된 샘플의 값을 이 표준 곡선으로부터 측정하였다.
결과
세포성 분석법의 개발
본 발명자들은 KU812 인간 호염기성 배양 모델을 사용하여, IL-13 방출에 대한 효과를 발휘하는 허브 추출물의 능력을 평가하였다. 본원에서 사용되는 분석법 시스템에서, KU812 세포를 시험 물질로 대략 6시간 동안 전처리한 다음, 여전히 존재하는 시험 물질로 전처리하고, 세포를 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (phorbol myristate acetate; PMA) 및 칼슘 이오노포어 이오노마이신 둘 다로 자극하였다. PMA 및 이오노마이신의 첨가 후, 상기 세포를 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 세포 배양 상층액으로 IL-13 방출을 분석하였다.
모델 면역 세포: KU812 호염기성
사이토카인 IL-4 및 IL-13은 T 세포, 비만 세포 및 호염기성와 같은 많은 세포 유형에 의해 생성되었다. IL-4는 CD4+ T 세포로부터만 유래한다고 오랫동안 생각되어 왔지만, 최근 시험관내 연구에서는 인간 호염기성로 인해, IL-4 및 IL-13의 대부분이 말초혈액 백혈구에 의해 배양액에서 생성된다고 분명하게 밝혀진 바 있다 [Higa S. et al, J Allergy Clin Immunol (2003) 111 (6): 1299-1306]. 또한, 기관지 천식, 아토피성 피부염 및 아토피 비염과 같은 아토피 질환의 발병에 있어서 호염기성의 역할에 대한 증거가 증가하고 있다.
호염기성는 호염기성성 염료로 염색되는 세포질 과립을 포함하는 말초혈액 백혈구 중 작은 집단이다. 호염기성 및 비만 세포는 여러 생화학적 및 기능적 특성, 예를 들어, IgE에 대한 친화성이 높은 수용체의 발현, 및 활성화된 경우 히스타민 및 다른 매개체의 방출 능력을 공유한다. 성숙한 호염기성는 전형적으로 순환 혈액에서 발견되지만, 염증이 생긴 조직에서 발견될 수 있다. 반면, 비만 세포는 조직에서만 발견된다.
비만 세포 및 호염기성와 특이적 항원과의 가교로 인해, IgE 생성, TH2 분화 및 알레르기 염증과 관련하여 중요한 분자인 IL-4, IL-13, 및 IL-5와 같은 사이토카인 및 염증성 매개체가 방출된다.
이러한 정보를 근거로, 본 발명자들은 급성 전환기 (blast crisis)에 있는 호염기성 백혈병 환자로부터 구축한 인간 호염기성 세포주인 KU812 세포로 연구하기로 결정하였다.
KU812 분화
KU812 세포는 비성숙 호염기성 전구체 세포로서, 호염기성 분화에 대한 모델로도 작용한다. KU812 세포의 분화로 인해, 총 히스타민 함량 증가, 과립화 증가, 및 IgE에 대한 고-친화성 수용체의 발현을 비롯하여 여러 가지 변화가 일어난다.
여러 가지 인자들이 KU812 세포주를 호염기성-유사 세포로 분화시키는 것으로 나타났다 [Nilsson G. et al, Immunology (1994) 81 : 73-78; Fukuda T. et al, Blood (1987) 70: 612]. TNF-α, IL-6, IL-3, 및 IL-4를 비롯하여 여러 가지 사이토카인이 상기 세포주가 호염기성-유사 세포로 분화하도록 유도할 수 있다. KU812 세포가 소듐 부티레이트, 및 인간 T-세포주 Mo.3으로부터 조건화된 배지의 조합물과 함께 배양되는 경우, 분화가 나타났다. 또한, 아토피 환자의 배양된 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC)로부터 조건화된 배지는 KU812 세포의 분화를 유도한다. 이러한 효과를 유도하는 조건화된 배지 상층액의 인자(들)는 아직 특징화된 적이 없다. 또한, KU812 세포가 혈청이 포함되지 않은 조건에서 외인성 인자의 부재 하에 분화를 수행할 수 있는 것으로 나타난 바 있다.
본 발명자들은 모델 세포 유형으로서 KU812 인간 호염기성 세포를 사용하여, IL-13 발현을 저해하는 허브를 발견하였다. 분석을 위해 적절한 시스템을 보정하고자 하는 노력에서, 본 발명자들은 혈청이 포함되지 않은 조건에서 2일 후, KU812 세포가 IL-13을 높은 수준으로 발현하며 이는 아마도 상기 세포의 분화로 인한 것임을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 자극제 및 허브 추출물을 첨가하기 전에 혈청이 포함되지 않은 조건을 이용하기로 결정하였다.
사이토카인
디펜신 (hBD)은 상해 또는 염증 시, 인간 피부 케라티노사이트에 의해 생성되며, 비만 세포, 호염기성 및 2형 헬퍼 세포에 의해 생성되는 사이토카인에 의해 하향조절된다. AD 병변은 IL-4 및 IL-13의 발현 증가와 연관있는 것으로 잘 구축되어 있다 [Albanesi C. et al., J. Immunol. (2007) 179(2): 984 - 992]. 사이토카인은 hBD-2 및 hBD-3 mRNA 발현 둘 다를 억제한다 [상기 Albanesi C. et al.]. 그래서, IL-4 및 IL-13은 이들 병변에서 디펜신의 발현을 저하시킬 수 있다. 디펜신 발현의 이해를 높이기 위해, 본 발명자들은 KU812 인간 호염기성 세포에서 IL-4 및 IL-13 발현에 대한 허브 추출물의 저해 효과를 시험하였다.
IL-13의 기능은 IL-4의 기능과 상당히 중복되기 때문에, IL-13을 저해하는 성분은 보통 IL-4 발현도 저해한다. 따라서, 본 발명자들은 KU812 세포를 사용해 IL-4 발현에 대한 허브 추출물의 저해 효과를 시험하기로 결정하였다. 본 발명자들은 PMA 및 이오노마이신으로 자극한 후, IL-4가 거의 발현되지 않은 것으로 측정하였다 (데이타는 나타내지 않음). 문헌 조사에서, IL-3과 같은 인자를 프라이밍 (priming)함으로써 적용되는 일부 신호들은 IL-4보다는 IL-13의 생성을 선호한다고 밝혀져 있다 [Higa et al., J Allergy Clin Immunol (2003) 111(6): 1299-1306]. 따라서, 본 발명자들은 계속 IL-13 발현만 측정하였다.
양성 대조군
본 발명자들은 양성 대조군으로서 2개의 기질인 피세틴 및 덱사메타손을 사용하기로 선택하였다. A23187-자극된 KU812 세포에 의한 IL-4, IL-13 및 IL-5 mRNA 발현의 유도를 피세틴이 억제한다는 것은 이미 나타나 있다 [Higa et al (2003), supra]. 본 결과에서, 피세틴의 저해는 유의하였지만, 저해 백분율은 상대적으로 낮았다. 따라서, 본 발명자들은 높고 유의한 저해 백분율을 나타내는 양성 대조군으로서 덱사메탄손을 추가하였다. 덱사메타손은 염증을 감소시키고, T 세포 및 호염기성에 의한 IL-4 및 IL-13의 생성을 저해함으로써 면역 시스템을 억제하는 것으로 이미 나타났다 [Shimizu et al, Clin Exp Allergy (1998) 28(4): 497-503].
실시예 2
상피 세포 ( 케라티노사이트 : HaCaT 세포)를 사용한, 베타- 디펜신 발현에 대한 자극 활성에 대한 허브 추출물의 스크리닝
재료 및 실험 과정
케라티노사이트 세포주 ( HaCaT )
케라티노사이트 세포주를 사용하였다. 10% FBS (GIBCO) 및 항생제 (GIBCO)가 보충된 DMEM (GIBCO)을 사용하여 75 T-배양 플라스크에 HaCaT 세포를 접종하였다. 상기 세포를 5% C02 및 37 ℃에서 인큐베이션하였으며, 밀집도 (confluence) (플레이트 표면에 대한 성장 표면의 비율 %)가 약 90%에 도달하였을 때 배양 배지를 교환하였다. 추출물을 스크리닝하기 위해, 추출물 (0.3 ml)을 배양된 HaCaT 세포 (밀집도가 대략 90% 내지 95%)의 상층액에 첨가하고, 상기 세포를 48시간 동안 인큐베이션하였다.
인간 베타- 디펜신 3 발현의 실시간 PCR 분석
총 RNA 분리
TRIZOL (Invitrogen Life Technologies)을 제조업체의 권고에 따라 사용해 총 RNA를 분리하였다. RNA를 에탄올로 침전시키고, 디에틸 피로카르보네이트 H2O 중에 재현탁시켰다. HaCaT 세포의 RNA를 1회 재정제하여, 적절한 순도의 RNA를 수득하였다. RNA 농도는 분광광도계로 측정하고, RNA의 온전함 (integrity)을 아가로스 겔에서의 전기영동에 의해 확인한 후에만, 수득된 총 RNA를 총 cDNA로 전환시켰다.
실시간 PCR 분석
iScript cDNA 합성 키트 (Bio-Rad)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 200 ng의 정제된 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. GAPDH 발현과 함께 인간 베타-디펜신 3 발현을 AB Taqman MasterMix (Applied Biosystems, Part No.: 4369016, USA)로 분석하였다. 인간 베타-디펜신 3 및 GAPDH에 대한 프라이머는 Taqman Gene 발현 분석법용으로 개발된 프라이머였다.
ABI 실시간 PCR 7500 (Applied Biosystems)에서, 40 주기 (95 ℃, 30 s)와 이어서 부가적인 주기 (58 ℃, 30 s)로 증폭을 수행하였다. 데이타는 실시간 PCR 시스템 소프트웨어로 분석하였다. 각각의 추출물의 상대적인 발현을 계산하고, GAPDH 발현의 실시간 PCR에 대해 조정하였다 (GAPDH 정상화). 100-, 10-, 및 1-배 희석된 cDNA에서 수득된 발현 표준물은 각각의 실시간 PCR 실험에서 확인하였다 (도 1 참조). 무처리된 HaCaT 세포를 이용한 대조군 시험은, HaCaT 세포를 사용하는 이러한 실시간 PCR이 매우 민감하고 믿을만함을 보여주었다 (도 2 참조).
추출 방법
품질 조사 (원료의 구별 및 인증, 중금속 분석, 살충제 잔여량 체크 및 활성 성분 함량 분석)에 따라 허브를 선택하였다.
잘게 썬 허브 재료를 10배 부피의 물로 균질화하고, 80 ℃에서 교반하면서 2시간 동안 추출하였다. 상기 추출은 동일한 과정으로 3회 반복하였으며, 3개의 추출물을 함께 혼합하였다. 균질물을 수집하고, 400-메시 스크린을 통해 여과하고, 농축시킨 다음 (80 ℃, 0.1 MPa), 10000 r/min에서 20분 동안 원심분리하였다.
추출물을 마크로-다공성 수지에 의해 정제한 다음, 필요한 부피로 농축시켰다. 추출물에 대한 품질 조사를 품질 표준 (본래 특성, 상대 밀도, pH 값, 중금속 분석, 미생물학적 분석법, 활성 성분 함량 측정)에 따라 분석하였다.
결과
인간 베타-디펜신의 자극을 본 발명에 의해 시험하였으며, 이는 인간 베타-디펜신, 특히 이소형태 (isoform) 2 및 3이 인간 피부에서 중요한 항균 장벽으로 작용함을 보여주는 기존의 과학적 보고를 근거로 한 것이었다. 아토피성 피부염 환자의 피부에서 인간 베타-디펜신의 발현의 감소는, 스타필로코커스 아우레우스와 같은 아토피성 피부염-관련 미생물의 비정상적인 콜로니화를 야기한다. 두 가지 이소형태의 발현 감소가 아토피성 피부염과 관련 있지만, 여러 가지 최근의 과학적 보고에 의하면, 인간 베타-디펜신 이소형태 3이 아토피성 피부염의 발병에 있어 중요한 역할을 한다. 인간 베타-디펜신 이소형태 3은 광범위한 항균 활성을 가지며, 그 자체가 생리학적 농도에서 S. 아우레우스에 대해 강한 활성을 가지며 [Harder et al., Nature (1997) 387: 861; Harder et al, J Biol Chem (2001) 276: 5707-13], 한편 hBD-2는 S. 아우레우스를 죽이려면 LL-37의 존재를 필요로 한다 [Xuejun Chenba et al, J. Dermatol. Science (2005) 40(2), 123-132].
실시예 3
KU812 호염기성 세포를 사용한, IL -13 저해에 대한 허브 추출물의 스크리닝
재료 및 실험 과정
상기 실시예 1을 참조한다.
결과
MTS 결과
서로 다른 허브 추출물 (하기 표 1을 참조)을 사용하여, IL-13 저해 분석법에서 사용할 시험 물질의 안전한 농도 범위를 구축하였다. 시행된 MTS 분석법의 결과를 도 3A 내지 3D에 나타낸다. 값은 대조군 (무처리군)에 대한 생존성의 백분율을 나타낸다. 이들 값을 사용하여, IL-13 저해 분석법에서 사용되는 시험 물질에 대한 안전한 농도의 범위를 구축하였다. 시험 재료 동정은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
시험 재료 동정 및 분석
시험 재료 동정 허브 명칭 pH 값 증발 후 잔여량 (%) 총 미생물 계수
1 글리시리자 글라브라 (감초) 4.08 13.7 0
2 사포쉬니코비아 디바리카타 3.29 24.4 0
3 라딕스 트리프테리기이 빌포르디이 3.51 4.4 0
4 시미시푸가 라세모사 3.59 8 0
5 셀로시아 아르겐테아 4.79 2.4 0
6 황련 뿌리 3.27 13.3 0
7 라딕스 살비애 밀티오리재 3.31 31.2 0
8 사우루루스 키넨시스 (Saururus Chinensis) (잎) 2.42 17.2 0
9 칼렌둘라 오피시날리스 2.97 14.1 0
10 겐티아나 2.36 9 0
11 멘사 아쿠아티카 L 3.33 7.9 0
12 민들레 뿌리/ 타락사쿰 오피시날레 (Taraxacum officinale ) 3.31 12.1 0
13 댑싸리 열매 4.02 7.6 0
14 아네마레나 아스포델로이데스 2.57 21.6 0
15 스텔라리아 디코토마 L. var. 란세올라타. 뿌리 3.63 25.5 0
16 프리틸라리아 베르티실라타 3.68 6.1 0
17 실리붐 마리아눔 3.25 5.6 0
18 악티니디아 폴리가마 4.02 16.7 0
19 황벽- 물 추출물 5.06 16.34 0
20 사핀두스 무쿠로씨- 물 추출물 5.16 24.9 0
21 라딕스 소포라 플라레센츠 (Radix Sophora flarescents) - 물 추출물 4.15 22.35 0
22 산귀소르바 오피시날리스 (DiYu) - 물 추출물 4.02 21.28 0
23 프룩투스 크니디움 (Fructus Cnidium) 3.86 10.76 0
24 카멜리아 야포니카 2.94 25.3 0
25 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 - 물 추출물 3.54 23.24 0
26 레움 팔마툼 - 물 추출물 4.68 21.23 0
27 국화 - 물 추출물 3.96 22.49 0
28 쇠비름속 식물 - 물 추출물 4.87 26.75 0
A 작약 수피 2.78 17.9 0
B 안젤리카 시넨시스 3.06 29.1 0
C 아스트라갈루스 멤브라나세우스 뿌리 3.06 22.2 0
D 에보디아 루태카르파 열매 3.14 12.4 0
E 폴리고눔 쿠스피다툼 2.94 12.8 0
F 리리오페 플라티필라 2.9 23.6 0
G 스밀락스 글라브라 리조마 (Smilax glabra rhizoma) 2.71 6.9 0
H 쿠르쿠마 론가 4.17 5.9 0
I 인디고 나투랄리스 (Indigo naturalis) 9.23 0.1
J 세멘 히드노카르피 하이나넨시 4.14 2.7 0
IL -13 저해 결과
시험한 시험 재료 농도는 MTS 결과 (상기에 제시함)에 따라 측정하였다. IL-13 저해 분석법의 결과를 도 4A 내지 도 4G에 나타내고, 하기 표 2에 요약하며, 예를 들어, 글리시리자 글라브라, 시미시푸가 라세모사 및 실리붐 마리아눔을 비롯하여 여러 가지 허브 추출물이 IL-13 방출의 양을 유의하게 감소시키는 것으로 나타난다. 덱사메타손을 10 μΜ의 농도에서 양성 대조군으로서 사용하였다.
요약
본 발명자들은 KU812 세포를 사용하여 IL-4 발현에 대한 서로 다른 허브 추출물의 저해 효과를 시험하였다. 본 연구의 목적은, 상기 시험 물질이 PMA 및 이오노마이신으로 자극한 KU812 세포로부터의 IL-13 방출을 저해할 수 있는지 측정하는 것이었다. 예를 들어, 글리시리자 글라브라, 시미시푸가 라세모사 및 실리붐 마리아눔을 비롯한 여러 가지 허브 추출물은 IL-13 방출의 양을 유의하게 감소시키는 것으로 관찰되었다. 상기 허브 추출물에 의한 IL-13 저해의 백분율은 하기 표 2에 나타낸다.
KU812 세포에서 허브 추출물에 의한 IL-13 저해의 백분율
허브 명칭 번호 1% 0.01% 0.001%
글리시리자 글라브라 1 97.67% 43.22% -
트립테리기이 빌드포르디이 (Tripterygii wilfordii) 3 93.9% 53.34% 33.2%
시미시푸가 라세모사 (Cimicifuga racemosa) 4 96.76% 16.09% 0.3%
살비애 밀티오리재 7 76.58% - -
실리붐 마리아눔 17 98.65% 10.8% 1.2%
산귀소르바 오피시날리스 22 97.5% 31.9% -
카멜리아 야포니카 24 84.2% 8.85% -
스쿠텔라리아 바이칼렌시스 25 79% - -
레움 팔마툼 26 62.26% - -
페오니아 수프루티카사 (Peonia suffruticasa) A 76.98% - -
안젤리카 시넨시스 * B 18.74% - -
폴리고눔 쿠스피다툼 (Polygonum cuspidatum) E 18.74%
(농도 0.5%)		 - -
피스테인 (Fistein) ** 35.69% 17.3% 26.52%
덱사메타손 10 μΜ 52%
* 약간 환원 (유의하지 않음)
** 피스테인은 100 μΜ, 10 μΜ 및 1 μΜ의 농도에서 측정하였음.
실시예 4
인간 베타- 디펜신 3의 자극에 대한 허브 추출물의 스크리닝
재료 및 실험 과정
상기 실시예 2를 참조한다.
결과
400가지의 허브 추출물을 본 연구에서 시험하였다. GAPDH 정상화 전 또는 후에 이의 직접적인 효과를 고려한 경우, 이들 중 6가지의 허브 추출물만 인간 베타-디펜신-3 (hBD-3)에 대해 상당한 자극 효과를 나타내었다. 그래서, 시험한 허브 추출물 중 거의 대부분이 hBD-3 발현에 대해 유의한 효과를 나타내지 않았지만, 6가지의 허브 추출물은 도 5 내지 도 9에서 나타낸 바와 같이, 0.33%의 농도에서 측정한 경우 자극 효과를 나타내었다.
허브 추출물 번호 136 및 137은 도 5에서 나타낸 바와 같이, 각각 573 ± 48% 및 693 ± 182%의 자극 백분율을 나타내었다. 흥미롭게도, 번호 136은 루비 프룩투스 (Rubi fructus)로서 중국에서 자라고, 번호 137은 루비 프룩투스로서 한국에서 자란다. hBD-3의 자극 효과를 나타내는 허브 추출물은, 라이시마치애 포에 눔래시 허바 ( Lysimachiae foenumgraeci herba ), 아일란티 라디시스 코텍스 , 갈라 로이스, 페우세다니 라딕스 ( Peucedani radix ), 및 알비지애 코텍스 ( Albizziae cortex) (각각 번호 171, 194, 232, 246, 및 362)이다. hBD-3에 대한 이들 6가지 허브 추출물에 대한 자극 효과 및 통계 수치의 요약은 하기 표 3 및 도 10에 열거되어 있다 (동정한 6가지의 허브 추출물을 3회 시험하였고, 통계 평균값을 계산하였음).
hBD-3 발현에 대한 6가지 허브 추출물의 자극 효과에 대한 요약
번호 허브 명칭 제1 시험 (%) 제2 시험 (%) 제3 시험 (%) 평균 ± SD 생존성
136(*) 루비 프룩투스 524 575 619 573±48 하락
137(*) 루피 프룩투스 900 559 619 693±182 -
171 라이시마치애 포에눔래시 허바 831 702 1082 872±193 -
194 아일란티 라디시스 코텍스 868 1042 1420 1110±282 하락
232 갈라 로이스 1744 1203 1502 1483±271 하락
246 페우세다니 라딕스 2912 1859 1903 2225±596 하락
362 알비지애 코텍스 853 933 792 859±71 -
(*) 번호 136 및 137은 각각 중국 및 한국에서 자라는 동일한 식물임.
실시예 5
동정된 허브 추출물의 추출 과정 최적화
재료 및 실험 과정
허브 추출물로부터 활성 성분의 추출
추출에 보편적으로 사용되는 용매의 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 열수 (hot water), 50% EtOH, 또는 50% MtOH에서 지시된 허브 공급원을 추출하였다.
결과
hBD -3 자극에 대한 서로 다른 추출 용매의 비교
동정된 허브 추출물로부터 활성 성분을 추출하기 위한 더 효과적인 방식을 알아보기 위해, 본 발명자들은 선택된 허브에 의한 hBD-3 자극을 3가지 서로 다른 추출 용매를 사용해 비교하였다: 50% EtOH, 50% MtOH, 및 100% 증류수. 값을 각각의 용매의 대조군으로부터 정상화함으로써, 상기 자극을 계산하였다. 도 11에서 나타낸 바와 같이, 허브 추출물 번호 136, 137, 171, 194, 232, 246 및 362에 의한 인간 베타-디펜신 3 자극은 열수 추출물을 사용하는 경우 가장 높았다. 다른 용매 (50%의 EtOH 및 MtOH)도 상대적으로 높은 활성을 나타냈지만 물 추출보다는 낮았다 (65% 내지 95%).
실시예 6
KU812 호염기성 세포를 사용한, 베타- 디펜신 발현에 대한 자극 활성을 가진 허브 추출물의, IL -13 저해제로서의 활성에 대한 스크리닝
재료 및 실험 과정
전술한 실시예 1을 참조한다.
결과
1차 시험관내에서의 연구 이후, 본 발명자들은 (ELISA에 의해 측정된 바와 같이) IL-13 발현을 저해하는 10가지의 허브 추출물, 및 (RT-PCR에 의해 측정된 바와 같이) 베타-디펜신 3 발현을 자극하는 6가지의 허브 추출물을 발견하였다.
다음, 본 발명자들은 두 가지 범주에서 가장 유의한 활성을 나타낸 허브 추출물을 선택하였다. 독성을 나타낼 수 있는 허브 추출물 (예컨대 라딕스 트리프테리기이 빌포르디이) 또는 인간 적용에는 알려지지 않고 INCI 명칭을 가지고 있지 않는 허브 추출물 (예컨대 테르미나리애 프룩투스 (Terminariae Fructus))는 유의한 활성을 나타냈지만 생략하였다.
최종 허브 혼합물을 선택하기 위해, 본 발명자들은 IL-13 저해를 나타낸 허브 추출물을 베타-디펜신을 자극하는 능력에 대해, 그리고 디펜신 자극을 나타낸 허브 추출물은 IL-13 방출을 저해하는 능력에 대해 그 활성을 시험하였다. 발명자들은 또한, 두 분석법 (ELISA 및 RT-PCR) 모두에서 허브 추출물 간의 상승 효과를 측정하였다. (하기 표 4에서 기술한 바와 같이) 7가지의 허브 추출물을 선택하였다.
허브 추출물
IL-13 저해를 나타내는 허브 추출물 베타-디펜신 자극을 나타내는 허브 추출물
글리시리자 글라브라 (감초) 부리 추출물 아일란투스 알티씨마 추출물
시미시푸가 라세오모사 (블랙 코호쉬 (black cohosh)) 갈라 로이스 갈누트 추출물 (갈라 키넨시스)
실리붐 마리아눔 페우세다눔 프래룹토룸 (페우세단티 라딕스)
산귀소르배 오피시날리스 (라딕스 산귀소르베에)
MTS 결과
1차 시험관내 연구에서 베타-디펜신 자극 활성을 나타낸 허브 추출물 (상기 실시예 4 및 표 4를 참조)을 이용해 MTS 분석법에서 세포 생존성을 측정하여, IL-13 저해 분석법에서 사용하기에 안전한 시험 물질의 농도를 측정하였다. 시행한 MTS 분석법의 결과는 도 12에 나타낸다. 값은 대조군 (무처리군)에 대한 생존성의 백분율을 나타낸다.
IL -13 저해 결과
1차 시험관내 연구에서 베타-디펜신 자극 활성을 나타낸 허브 추출물 (상기 실시예 4 및 표 4를 참조)을 이용해 IL-13 방출을 저해하는 이들의 능력을 측정하였다. 시행한 IL-13 저해 분석의 결과는 도 13에 나타내고, 아일란투스 알티씨마 및 갈라 로이스 갈누트 둘 다 IL-13 저해 활성을 나타내는 것으로 나타난다. 시험한 시험 물질의 농도는 각각 MTS 결과에 상응하였다 (0.3%). 덱사메타손을 10 μΜ의 농도에서 양성 대조군으로서 사용하였다.
요약
본 연구의 목적은, 케라티노사이트 세포에서 베타-디펜신 발현을 자극하는 것으로 밝혀진 시험 물질이 PMA 및 이오노마이신으로 자극한 KU812 세포로부터 IL-13 방출을 또한 저해할 수 있는지 알아보는 것이었다. 허브 추출물인 아일란투스 알티씨마 및 갈라 로이스 갈누트는 유의한 IL-13 저해 활성을 나타내었다.
제1 연구에서 IL-13 저해를 나타낸 허브 추출물 중에서, 글리시리자 글라브 라 (감초) 및 산귀소르배 오피시날리스는 본 분석법에서도 가장 유의한 저해를 나타내었다.
실시예 7
IL -13에 대한 저해 효과를 가진 허브 추출물의 인간 베타- 디펜신 3 자극제로서의 이들의 활성에 대한 스크리닝
재료 및 실험 과정
전술한 실시예 2를 참조한다.
결과
제1 연구에서 유의한 IL-13 저해를 나타낸 (상기 실시예 3을 참조) 4가지의 허브 추출물 중에서, 2가지의 추출물, 즉 실리붐 마리아눔 및 산귀소르배 오피시날리스는 (RT-PCR에 의해 측정된) GAPDH 정상화의 전 및 후에 이들의 직접적인 효과를 고려한 경우, 인간 베타-디펜신-3 (hBD-3)에 대한 자극 효과도 나타내었다. 글 리시리자 글라브라 (감초) 및 시미시푸가 라세오모사 추출물은 어떠한 유의한 효과도 나타내지 않았다. 산귀소르배 오피시날리스 추출물은 베타-디펜신 자극에 대해 가장 유의한 자극 효과를 나타내었다 (도 14A-D). 그 값은 도 14E 및 하기 표 5에 요약되어 있다.
hBD3에 대한 허브 추출물의 효과 (GAPDH 정상화 후)
시험 샘플 대조군 번호 1 번호 2 번호 3 번호 4
발현 배수 1 0.072685 0 5.867937 27.43561
시험 물질 동정은 하기와 같다: 1. 글리시리자 글라브라 ; 2. 시미시푸가 라세오모사 ; 3. 실리붐 마리아눔 ; 4. 산귀소르배 오피시날리스.
요약
본 연구의 목적은 제1 연구에서 IL-13 방출을 저해하는 것으로 밝혀진 시험 물질 (상기 실시예 3을 참조)이 케라티노사이트 (HaCaT 세포)로부터의 베타-디펜신 3 발현을 또한 자극할 수 있는지 알아보는 것이었다. 제1 연구 (상기 실시예 3을 참조)에서, 4가지의 허브 추출물은 IL-13 방출의 양을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다. 이들 중에서, 실리붐 마리아눔 또한 베타-디펜신 3에 대한 자극 효과를 나타내었으며 (5.87 배), 산귀소르배 오피시날리스는 베타-디펜신 3에 대한 가장 유의한 자극 효과를 나타내었다 (27.4 배).
실시예 8
허브 추출물 간의 상승작용
재료 및 실험 과정
상기 실시예 1 및 2를 참조한다.
결과
허브 추출물 간의 상승 효과를, IL-13 저해 활성에 대해 ELISA 및 디펜신-3 자극 활성에 대해 RT-PCR로 측정하였다.
존재하는 시험 물질의 총 농도가 0.3%인 경우, 하기 허브 조합에서 IL-13 방출의 감소를 관찰하였다: 1 + 2 + 4 (1. 글리시리자 글라브라; 2. 시미시푸가 라세 오모사; 4. 산귀소르배 오피시날리스) 및 1 + 3 + 4 (1. 글리시리자 글라브라; 3. 실리붐 마리아눔; 4. 산귀소르배 오피시날리스). 그러나, 각각의 허브 추출물 단독의 저해와 비교해, 유의한 상승 효과는 나타나지 않았다 (도 15 A). 시험 물질의 농도를 (단독으로 또는 서로 조합한 경우) 0.01%로 감소시켰을 때, IL-13 방출의 유의한 감소가 관찰되지 않았다 (데이타는 나타내지 않음).
베타-디펜신 3의 자극에 대한 허브 추출물의 상승 효과를 도 15B 및 15C에 나타낸다. 산귀소르배 오피시날리스 추출물은 아일란투스 알티씨마 (도 15B)와, 그리고 갈라 로이스 갈누트 (도 15C)와 함께 상승 효과를 나타낸다.
요약
본 연구의 목적은, 시험 물질이 IL-13 저해 또는 베타-디펜신 3 자극 활성에 대한 상승 작용을 포함하는지 알아보는 것이었다. KU812 세포에서 IL-13 방출을 저해하는 능력에 대해 허브 혼합물을 시험하였다. 상기 혼합물은 IL-13 방출을 저해하였다. 케라티노사이트 HaCaT 세포에서 베타-디펜신 3 발현의 자극에 대해 측정한 경우, (1%) 아일란투스 알티씨마와 (0.33%) 산귀소르배 오피시날리스 간의 상승 작용이 나타났다. 아일란투스 알티씨마의 활성은 0.33% 산귀소르배 오피시날리스 추출물을 첨가한 경우에 2배 증가하였다.
(1%) 갈라 로이스와 (0.33%) 산귀소르배 오피시날리스 간에도 상승 작용이 관찰되었다. (1%) 갈라 로이스의 자극 활성은 산귀소르배 오피시날리스를 첨가한 경우 175%에서 280%로 증가하였다.
실시예 9
추출물 최적화
재료 및 실험 과정
활성 성분의 농후화 /수지 크로마토그래피
실시예 2에서 전술한 바와 같다.
IL -13 저해
실시예 1에서 전술한 바와 같다.
베타- 디펜신 자극
실시예 2에서 전술한 바와 같다.
허브 추출물의 항균 활성
S. 아우레우스 및 앰피실린-내성 E. 콜라이에 대한 항균 활성에 대해, 전술한 바와 같은 종이 확산 (paper diffusion) 항균 분석법을 이용해 허브 추출물을 스크리닝하였다. 즉, 25개의 선별된 허브 물 추출물 0.2 ml (2 mg/ml)을 종이 디스크 (paper disc)에 로딩하였다. 희석된 앰피실린을 0-50 μg/ml의 농도로 첨가하여, E. 콜라이 내성을 확인하였다. 상기 디스크를 S. 아우레우스 및 Amp-내성 E. 콜라이를 포함하는 아가 오버레이 (agar overlay)가 들어 있는 아가 플레이트에 로딩하였다. 디스크를 둘러싼 투명대 (transparent zone) (살해 영역 (killing zone))를 관찰함으로써, 항균 활성을 조사하였다.
결과
식물 추출물에서 활성 성분 농후화
본 발명에 의해 교시된 바와 같은 활성 성분의 농후화는, 허브 추출물의 활성 성분을 효과적으로 흡수하고, 농후하게 하고 정제하는 마크로-다공성 수지의 이점을 취한다. 이 과정은 유기 염 및 중금속을 제거하고 다량의 전분 또한 제거하여, 산물의 안정성을 개선하고, 산물의 반감기를 연장하며, 추출물의 활성을 더 양호하게 한다. 서로 다른 다공성 구조 파라미터 (기공 크기, 기공비, 및 비표면적) 및 서로 다른 극성 (비-극성, 약한 극성, 중간 극성, 및 강한 극성)의 수지를 사용한다.
추출물 농후화 - 수지 크로마토그래피
허브 추출물 효능은 활성 성분의 농도에 크게 좌우한다. 매우 농축시킨 추출물의 일반적인 생산은 침전 및 복잡한 표준화를 종종 초래하는 복잡한 방법이다. 한편, 수지 크로마토그래피는 불순물 (증발 후 잔여물)의 농도를 감소시키고, 치료와 관련된 활성 성분의 수준을 높게 하여, 높은 생물학적 효능 및 더 양호한 표준화를 가능하게 한다.
따라서, 본 발명자들은 IL-13 저해제 및/또는 디펜신 자극제로서 높은 효능을 나타내는 허브 추출물에 대해 마크로-다공성 수지를 사용하는 추출 방법을 개발하였다. 마커로서 선택된 허브 추출물 및 이의 활성 성분은 하기 표 6에 제시한다. 처음에 IL-13 저해제로서 발견된 허브 추출물은 전술한 시험관내 연구에서 수지 크로마토그래피에 의해 이미 최적화하고, 도 14A-E 및 15A-C에 제시한다.
허브 추출물 활성 성분 (마커)
허브 마커 (활성 성분)
아일란투스 알티씨마 코텍스 아일란톤, 메로신, 토우센다닌
시미시푸가 라세오모사 제너럴 진세노이드
갈라 로이스 갈누트 갈릭산, 탄닌산
글리시리자 글라브라 리퀴리틴
페우세다눔 프래룹토룸 프래룹토린 A
산귀소르배 오피시날리스 탄닌산
실리붐 마리아눔 실리빈
디펜신 자극제로서 및/또는 IL-13 저해제로서 높은 효능을 나타내는 허브 추출물의 최적화. 마커 및 수지 유형은 각 허브 추출물에 대해 선택하였다.
추출물 최적화 전과 후의 IL -13 저해
처음에 베타-디펜신 자극제로서 발견된 허브를 또한 수지 크로마토그래피를 사용해 최적화하고, IL-13 방출을 저해하는 이들의 능력을 검출하고 최적화 전의 추출물의 활성과 비교하였다. 수지 크로마토그래피를 이용한 최적화 전 및 후에 IL-13을 저해하는 허브 추출물 간의 능력을 비교한 것은 하기 도 16 및 표 7에 나타나 있다. 따라서 그 결과, 수지 크로마토그래피가 허브 추출물의 생물학적 활성을 (아일란투스 알티씨마 추출물에 대해서는 2배, 갈라 로이스 갈누트 추출물에 대해서는 1.13배 및 페우세다눔 프래룹토룸 추출물에 대해서는 36배) 증가시킨 것으로 나타난다.
크로마토그래피 최적화 전 및 후의 허브 추출물의 IL-13 저해 활성의 비교. 도 16에 따라 추출물 번호/표기가 나타나 있음.
허브 추출물 최적화 전의 IL-13 저해% 최적화 후의 IL-13 저해%
아일란투스 알티씨마 31.8% (A) 87% (1)
갈라 로이스 갈누트 83% (B) 93.6% (2)
페우세다눔 프래룹토룸 0.8% (C) 28.8% (3)
허브 추출물의 항균 활성
S. 아우레우스 및 앰피실린-내성 E. 콜라이에 대한 항균 활성에 대해 허브 추출물을 더 스크리닝하였다. 본 발명자들은 종이 확산 항균 분석법을 이용해, 25가지의 선별된 허브 추출물을 시험하였다. 우선, 희석된 앰피실린을 0-50 mg/ml의 농도로 첨가하여 E. 콜라이 내성을 확인하였다. 예상한 바와 같이, 앰피실린-내성 E. 콜라이는 50 mg/ml의 앰피실린으로 처리한 후에도 강한 생존성을 나타내었다. 다음, 허브 추출물이 존재하는 경우의 성장에 대해 S. 아우레우스 및 앰피실린-내성 E. 콜라이를 시험하였다 (하기 표 8 및 도 17A-B를 참조). 표 8 및 도 17A-B에서 나타낸 바와 같이, 갈라 로이스 갈누트 및 테르미나리애 프룩투스 ( Terminariae fructus) 추출물은 S. 아우레우스 및 앰피실린-내성 E. 콜라이 둘 다에 대해 강한 항균 활성을 나타내었으며, 한편, 콥티디스 리조매 ( Coptidis rhizome ) 추출물은 E. 콜라이에 의해서만 저해되었다.
허브 추출물의 항균 활성의 비교
번호 허브 명칭 S. 아우레우스에 대한 항균 활성 (Amp-내성) E. 콜라이에 대한 항균 활성
양성 대조군 50 ug/ml Amp ++++++ +
양성 대조군 5 ug/ml Amp ++++ -
양성 대조군 0.5 ug/ml Amp ++ -
음성 대조군 증류수 - -
번호 2 테르미나리애 프룩투스 ++ ++
번호 232 갈라 로이스 + +
번호 353 콥티디스 리조마 - +++
최종 허브 혼합물
IL-13 저해제로서 및/또는 디펜신 자극제로서 가장 유의한 활성을 나타내는 추출물을 최종 산물의 개발을 위해 선택하였다.
베타-디펜신에 대해 유의한 자극을 나타내는 허브 추출물은, 아일란투스 알 티씨마, 갈라 로이스 갈누트 및 페우세다눔 프래룹토룸이었다. 아일란투스 알티씨 마 및 갈라 로이스 갈누트는 둘 다 유의한 IL-13 저해 활성도 나타내었다.
1차 분석법에서 가장 유의한 IL-13 저해 활성을 나타낸 허브 추출물은, 글리 시리자 글라브라 , 시미시푸가 라세오모사 , 실리붐 마리아눔 및 산귀소르배 오피시날리스였다. 산귀소르배 오피시날리스는 또한 유의한 베타-디펜신 3 자극 활성을 나타내었으며, 뿐만 아니라 아일란투스 알티씨마 및 갈라 로이스 갈누트 추출물과 함께 상승 효과도 나타내었다.
그래서, 본 발명의 최종 허브 혼합물은 아일란투스 알티씨마 , 산귀소르배 오피시날리스, 글리시리자 글라브라 및 시미시푸가 라세오모사를 포함한다.
분석 인증서 ( Certificate of Analysis ; CoA )
최종 혼합물을 포함하는 허브 추출물로 분석 증명서 (CoA)를 작성하였다. 상기 허브 추출물의 주요 특성은 하기 표 9에 나타나 있다.
CoA는 마크로-다공성 수지 크로마토그래피를 사용한 추출물 최적화 후에 각각의 허브 추출물에 대한 활성 성분 (마커)의 값, 증발 후 잔여물, 및 pH를 나타낸다. 중금속은 모든 허브 추출물에 대해 ≤ 20 ppm의 값을 나타내었다. 미생물학적 시험을 각각의 추출물에 대해 수행하였으며, 총 계수는 < 102/g, 곰팡이 및 효모 < 102/g이었고, 살모넬라 ( Salmonela ) 및 E. 콜라이포름 (E. coliform )은 시험한 허브 추출물 모두에 대해 음성인 것으로 나타났다.
혼합물에서 최종 허브 추출물에 대한 CoA
시험의 성질 아일란투스 알티씨마 산귀소르배 오피시날리스 글리시리자 글라브라 시미시푸가 라세오모사
특징
-외양
-색상
-냄새
-25℃에서의 밀도, g/ml
-pH 값
끈적거리는 액체
짙은 갈색
특징적인 허브향
1.02

6.1
끈적거리는 액체
짙은 갈색
특징적인 허브향
1.04

5.4
끈적거리는 액체
짙은 갈색
특징적인 허브향
1.02

6.1
끈적거리는 액체
짙은 갈색
특징적인 허브향
1.02

5.7
시험
-중금속
-증발 후 잔여물
≤20 ppm
14.2%
<20 ppm
26.1%
<20 ppm
18.2%
<20 ppm
19.3%
HPLC 분석법 아일란톤/메르소신 0.75 mg/ml/토우센다닌 0.01 mg/ml 갈릭산 0.04 mg/ml/탄닌산 62.3 mg/ml 리퀴리틴 4.1 mg/ml 제너럴 진세노이드 51.6 mg/ml
미생물학적 시험
-총 플레이트 계수 <102/g <10/g <10/g <10/g
-효모 및 곰팡이 <102/g <10/g <10/g <10/g
-살모넬라 1 g 중 음성 1 g 중 음성 1 g 중 음성 1 g 중 음성
-E. 콜라이포름 1 g 중 음성 1 g 중 음성 1 g 중 음성 1 g 중 음성
제품 제형
본 발명자들은 선택된 허브 추출물/허브 추출물들의 혼합물을 포함하는 O/W 제형을 개발하였다. 허브 추출물 효능 외에도, 상기 제형은 아토피성 피부염 환자와 관련된 건성 피부에 보습을 주기 위해 개별되었으며, 따라서, 상기 제형은 연화제 및 보습제 성분도 포함하였다.
제품은 정상적인 피부에 유사한 수준인 대략 pH 5를 갖도록 설계되었다. 정상적인 피부 pH를 가지는 국소 제품은 각질층의 고유성 (integrity), 및 지질 라멜라의 형성 및 성숙을 지지한다. pH 값은 특히 스타필로코커스 아우레우스로 인한 콜로니화 및 피부 장벽 기능과 관련하여 아토피성 피부염 환자에서 중요한 역할을 한다.
실시예 10
임상 시험
재료 및 실험 과정
SCORAD
전술한 바와 같이, 습진 (SCORing 아토피성 피부염)의 범위 및 중증도를 평가하는 데 사용되는 임상적 툴 (tool)인 SCORAD 지수 (SCORAD INDEX)에 의해 AD의 정도를 평가하였다 [Oranje AP et al, Br J Dermatol. (2007) 157(4):645-8; Oranje AP, Curr Probl Dermatol. (2011) 41 : 149-55]. SCORAD는 치료가 효과적인지 알아보기 위해 치료 전 및 후에 피부과 의사가 전형적으로 사용하였다.
SCORAD의 파라미터는:
범위
범위를 측정하기 위해, 전형적으로 신체 도면에서 습진에 걸린 부위를 음영처리 (shade)하였다. 9의 규칙을 사용해 병에 걸린 면적 (A)을 하기와 같이 몸 전체의 백분율로서 계산하였다: 머리 및 목 9%, 상지 각각 9%, 하지 각각 18%, 배쪽 18%, 등 18% 및 생식기 부위, 각각의 손바닥 및 각각의 손등 1%.
각 면적에 대한 스코어를 더한다. 총 면적은 'A'이며, 최대 100%이다.
심한 정도 ( Intensity )
습진의 대표적인 영역을 선별한다. 이 영역에서, 하기의 증상인 붉어짐 (redness), 부기 (swelling), 삼출성/크러스팅 (crusting), 긁힌 자국 (scratch mark), 피부의 비후화 (태선화) 및 건조 (염증이 존재하지 않는 영역에서 평가함) 중 각각의 심한 정도를 없음 (0), 경미함 (1), 중간임 (2) 또는 중증임 (3)으로 나타내었다.
심한 정도의 스코어를 모두 더하면, 'B' (최대 18)가 된다.
주관적 증상
시각적 상사 척도 (visual analogue scale)를 이용해 환자 또는 친척 (relative)이 주관적인 증상 즉, 가려움 및 불면증을 각각 스코어링하며, 이때 0은 가려움 없음 (또는 불면증 없음)이며, 10은 상상할 수 있는 가장 심한 가려움 (또는 불면증)이다. 이들 스코어를 더하면 'C (최대 20)가 된다.
총 스코어
개인에 대한 SCORAD는 A/5 + 7B/2 + C이다.
임상 시험용 조성물
경미한 및 중간 정도의 AD 증상을 치료할 수 있도록 소양증을 감소시키는 허브 추출물 및 피부에 수분을 공급하는 보습제를 포함하는 산물인 담체를, 또는 담체 로션에 사용되는 성분들 외에도 2가지의 부가적인 허브 추출물인 산귀소르바 오피시날리스 뿌리 추출물 및 아일란투스 알티씨마 추출물을 포함하는 치료 로션을 임상 시험에 참여한 대상 (본원 하기에서 더 상세한 부분을 참조)에 처리하였다 (임상 시험에 사용한 예시적인 치료 로션 제형에 대해서는 표 10을 참조). 담체 로션은 또한 IL-13을 저해하는 2가지의 추출물을 포함한다.
예시적인 치료 바디 로션 제형
INCI 명칭 INCI 9th. Ed page no. CAS No.
아쿠아 1795 7732-18-5
페트로라툼 12th Ed. 1983 8009-03-8
글리세린 666 56-81-5
부티로스페르뭄 파르키이 (Butyrospermum Parkii)(쉐어 버터) 12th Ed. 365 68920-03-6
미네랄 오일 12th Ed. 1597 8012-95-1
카프릴/카프릭 트리글리세리드 252 65381-09-1
세테아릴 알코올 & 12th Ed. 476 8005-44-5
세테아릴 글루코시드 12th Ed. 479 -
세틸 알코올 &
스테아릴 아세테이트 & 12th Ed. 2663 822-23-1
올레일 아세테이트 & 12th Ed. 1719 693-80-1
아세틸화된 라놀린 알코올 12th Ed. 15 61788-49-6
세틸 알코올 12th Ed. 492 36653-82-4
세테아릴 에틸헥사노에이트 12th Ed. 478 -
세테아릴 알코올 12th Ed. 476 8005-44-5
디포타슘 글리시리제이트 545 68797-35-3
세라미드 3 & 12th Ed. 461 100403-19-8
세라미드 6 II & 12th Ed. 462 100403-19-8
세라미드 I & 12th Ed. 460 100403-19-8
피토스핑고신 & 12th Ed. 2014 544-62-1
콜레스테롤 & 12th Ed. 523 57-88-5
소듐 라우로일 락틸레이트 & 12th Ed. 2546 133557-75-0
카르보머 & 12th Ed. 429 9003-01-4
잔탄검 12th Ed. 2975 11138-66-2
글리세릴 스테아레이트 & 12th Ed. 1080 123-94-4
PEG-100 스테아레이트 12th Ed. 1944 9004-99-3
레움 팔마툼 뿌리 추출물 2067 90106-27-7
크니디움 몬니에리 열매 추출물 12th Ed. 626 484-12-8
스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물 12th Ed. 2444 94279-99-9
산귀소르바 오피시날리스 뿌리 추출물 84787-71-3
아일란투스 알티씨마 추출물 90131-67-2
데하이드로아세트산 & 12th Ed. 749 520-45-6
벤질 알코올 12th Ed. 271 100-51-6
수크로오스 스테아레이트 25168-73-4
디메티콘 12th Ed. 814 9006-65-9
펜타데카락톤 & 12th Ed. 1960 106-02-5
트리에틸 시트레이트 12th Ed. 2806 77-93-0
잔탄검 12th Ed. 2975 11138-66-2
포타슘 소르베이트 12th Ed. 2177 590-00-1
토코페릴 아세테이트 12th Ed. 2778 58-95-7
락트산 12th Ed. 1378 50-21-5
히알루론산 12th Ed. 1177 9004-61-9
대상
포함 기준 ( Inclusion Criteria ):
본 임상 시험에 참여하기 위한 포함 기준은 하기와 같았다: 18세 이상의 남성 및 여성; 아토피성 피부염의 진단은 Hanifm's 기준 (3가지 이상의 기본적인 특징 및 3가지 이상의 사소한 특징)을 충족시켜야 함; 본 발명자들의 견해에서, 아토피성 피부염은 지난 7일 동안 안정적인 것임; 최근 5일 이내에 새로 재발되지 않음; 21일 동안 매일 2회 이상 (각각 아침 및 저녁) 연구 산물을 적용할 수 있음; 연구 기간 동안 (이들의 일상적인 신체 위생 제품 (비누), 일일 목욕 및 샤워 횟수, 세탁하는 데 사용되는 세탁 세제 및 섬유 유연제를 포함하여) 자신들의 라이프스타일을 변경하지 않을 것에 동의한 대상들; 연구 기간 동안 시험 제품만을 사용할 것에 동의한 대상들, 및 고지에 입각한 동의서에 사인할 의지가 있었던 대상들.
제외 기준 ( Exclusion Criteria ):
본 임상 시험에 대한 제외 기준은 하기와 같았다: 감염된 아토피성 피부염 병변을 비롯하여 임상 평가를 방해할 만한 다른 피부 질환/상태를 가진 대상; 시험한 제형의 미용 제품 또는 임의의 성분에 알레르기를 일으킨 전적이 있는 대상; 제0 일로부터 이전 10일 이내에 아토피성 피부염을 위한 임의의 국소 또는 전신 면역조절제 (예컨대 피메크롤리무스 (pimecrolimus) 또는 타크롤리무스 (tacrolimus) 또는 스테로이드)를 수여받은 대상; 제0 일로부터 이전 28일 이내에 광선요법을 받은 대상; 제0 일로부터 이전 14일 이내에 임의의 실험적 치료법을 사용한 대상; 및 임신중이거나 수유중인 여성.
참여는 자발적이었다. 본 발명자들은 각 등록자에게 고지에 입각한 동의서 양식을 한 부씩 배포하였다.
연구 동안 대상은 스케쥴에 따른 클리닉 방문을 3회 수행하였다:
1. 스크리닝 평가/기준선 (제0 일)
2. 후속 방문 - 제7 일, 제14 일
3. 완료 방문 - 제21 일
(환자의 편의 (availability)로 인해 ±2 일간의 융통성을 허용하였음).
제7 일, 제14 일 및 제21 일 (±2 일)에, 평가를 위해 대상은 클리닉에 방문하였다. 하기 평가를 수행하였다: 범위, 부종, 홍반, 소양증, 태선화, 삼출성, 불면증 및 건조. 이들 측정을 기반으로, SCORAD를 계산하고, 이차 감염을 평가하였다.
제1 방문 및 최종 방문 시, TEWL 및 피부 수분 시험을 수행하였다.
본 연구는 임상 시험 관리 기준 (Good Clinical Practice; GCP)에 관한 규정을 충족시키는 국제 표준에 따라 수행하였다.
모든 환자에게 목적, 방법, 참여 이점, 잠재적인 유해사항, 및 데이타의 비밀보장에 관해 알려 주었다. 또한, 후보자들에게 어느 때든지 참여를 거부할 수 있음을 알려 주었다.
환자 평가
1차 결과 측정:
등급으로 매겨진 AD 증상을 포함한 SCORAD: 범위, 부종, 삼출성, 찰과상, 태선화, 홍반, 소양증, 건조 및 불면증 [시간의 틀 (time frame): 제0 일, 제7 일, 제14 일 및 제21 일].
2차 결과 측정:
1. TEWL 및 수분 시험 [시간의 틀: 제0 일 및 제21 일]
2. 이차 감염의 수 및 등급
3. 부작용 횟수 [시간의 틀: 제0 일, 제7 일, 제14 일 및 제21 일]
결과
기준선 인구통계학 및 AD 특징
총 50명의 대상이 본 연구에 참여하였다 (즉, 치료 로션으로 처리하는 30명의 대상을 포함하는 하나의 연구와 담체 로션으로 처리하는 20명의 대상을 포함하는 다른 연구, 즉 2가지의 연구를 동시에 수행하였으며, 하기 표 11의 요약을 참조). 21일 동안 30명의 환자에 치료 로션을 처리하고, 20명의 환자에게는 담체로 처리하였다. 평균 연령은 두 그룹 모두에서 유사하였다. 2개의 군 사이에 성별 차이가 있지만 (표 11), 기준선 AD 중증도는 SCORAD에 의해 측정한 바와 같이 2개의 군에서 유사하였다 (하기 표 12). 더욱이, 중증의 증상 (SCORAD> 50)의 AD 환자의 하위집단의 비율이 또한 2개의 군 모두에서 동일하였다 (담체군에서 25%, 및 치료군에서 26.7%) (하기 표 12를 참조).
2개의 군에서 인구통계학적 특징
특징 대조군 (담체군) 치료군 (치료군)
수 20 30
연령, y (SD) 45 (13) 48 (15)
여성, 수 (%) 5 (25) 28 (93)
남성, 수 (%) 15 (75) 2 (7)
SCORAD의 기준선 값
AD의 중증도 대조군 (담체군) 치료군 (치료군)
총 SCORAD
대상의 수 20 30
SCORAD (SD) 41 (12) 42 (12)
경미 내지 중간 정도의 SCORAD < 50
대상의 수 (%) 15 (75%) 22 (73.3%)
SCORAD (SD) 33 (9) 37 (9)
중증의 SCORAD > 50
대상의 수 (%) 5 (25%) 8 (26.7%)
SCORAD (SD) 53 (3) 57 (4)
SCORAD 결과의 분석
기준선 값과 비교해, 제14 일 및 제21 일에 담체군 및 치료군의 SCORAD 간에 유의한 차이 (둘 다에 대해 p<0.001)를 관찰하였으며 (도 18 참조), 이는 2개의 제조물 모두에 의한 AD 외양의 효율적인 감소를 나타낸다.
이들 군 간의 전체적인 SCORAD 차이를 발견하였다. 3주 후, 치료군의 평균 스코어는 담체군보다 약간 더 낮았다 (p=0.087). 그러나, 개별 파라미터에 의한 더 근접한 분석은 하기에 나타낸 바와 같이 유의한 변화를 나타낸다.
SCORAD 주 성분의 분석
시간에 따른 유의한 총 SCORAD 감소에 대한 분포에 대해 담체군 및 치료군에서 주 SCORAD 성분 (범위, 심한 정도, 주관적 증상)을 따로 시험하였다 (각각 도 19 및 20).
도 19의 그래프는 연구 동안에 담체군에서 범위 파라미터의 안정성을 나타낸다. 이 성분은 총 SCORAD 스코어의 변화에 영향을 미치지 않는다. 한편, 제14 일 및 제21 일에 심한 정도 및 주관적 증상의 파라미터의 변화는 기준선과 비교했을 때 매우 유의하였다 (각각 p<0.001 및 p<0.01).
동일한 결과를 치료군에서 수득하였다 (도 20 참조). 범위는 총 SCORAD 값의 변화에 기여하지 않았다. 심한 정도 및 주관적 증상의 파라미터는 기준선과 비교했을 때 제14 일 및 제21 일에 유의하게 감소하였다 (두 경우 모두 p<0.001).
심한 정도의 파라미터는 6가지 AD 증상의 스코어의 합이다. 심한 정도의 파라미터의 전체 차이, 및 특히 제21 일에 군들 간의 차이는 상당히 유의하였다 (도 21, p<0.01).
반대로, 대상에 의해 평가받은 바와 같이, 소양증 및 불면증 증상의 스코어 합으로 이루어진 주관적 증상의 파라미터에서 군들 간에는 차이가 관찰되지 않았다 (도 22).
취합하면, 이들 결과는, 제14 일 및 제21 일에 심한 정도 및 주관적인 파라미터의 변화가 그의 기준선과 비교했을 때 각 군에서 상당히 유의하였음을 나타낸다. 범위는 연구 동안에 두 개의 군 모두에서 안정적이었으며, 따라서, 총 SCORAD 감소의 유의성을 감소시킨다. 범위 파라미터에서 유의한 변화가 발견되지 않았지만, 측정된 영역의 각각에서 병변의 중증도는, 심한 정도의 파라미터의 감소에 의해 나타난 바와 같이, 유의하게 감소하였다.
21일 후에 군들 간의 비교로써, 치료 바디 로션으로 처리를 한 후, 심한 정도가 더욱 유의하게 감소한 것으로 나타났다 (도 21에서 담체군의 경우 32%에 비해 52%). 주관적 증상 파라미터의 상대적인 감소에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (도 22에서 담체군의 경우 42%에 비해 치료군의 경우 55%).
심한 정도의 개별 성분의 분석
개개의 심한 정도의 성분 (홍반, 부종, 삼출성, 찰과상, 태선화 및 건조)의 고해상 (higher resolution) 분석에서, AD 환자의 상당수가 두 가지 치료군 모두에서 증상이 유의하게 개선되었다. 상기 분석은 증상을 겪고 있는 대상으로부터 취한 데이타만을 근거로 하였다. 결과에서 나타난 바와 같이, 경미-중간 정도의 AD에서 2가지 보편적인 증상인 홍반 및 건조는 환자 중 70% 이상에서 개선되었다 (도 23).
삼출성, 찰과상, 태선화 및 건조의 스코어 간의 차이는 제21 일에 기준선과 유의하게 차이가 났다 (하기 표 13 참조, p<0.01). 홍반의 스코어는 또한 제14 일에 유의하게 개선되었다 (p<0.02).
담체군에서 개별 증상의 스코어의 변화 (평균%)
홍반 부종 삼출성 찰과상 태선화 건조
제7 일 0% 0% -3% 3% 3% 2%
제14 일 18%
P<0.02		 27% 17% 25% 15% 13%
제21 일 34%
P<0.001		 27% 39%
P<0.001		 23%
P<0.001		 28%
P<0.001		 34%
P<0.001
치료 바디 로션은 담체 바디 로션보다 더 효과적이었으며, 21일 후에 환자 중 70% 이상에서 모든 증상을 유의하게 감소시켰다 (도 24).
흥미롭게도, 이차 감염과 연관된 삼출성 증상은 대상 중 93%에서 86%까지 개선되었다 (하기 도 24 및 표 14 참조). 기준선에 대한 (versus) 제14 일과 제21 일의 스코어 간의 차이는 부종을 제외한 모든 증상에서 매우 유의하였으며 (p<0.001), 부종은 제21 일에만 유의하게 차이가 났다 (p<0.02).
치료군에서 개별 증상의 스코어의 변화 (평균%)
홍반 부종 삼출성 찰과상 태선화 건조
제7 일 0% 2% 16% 0% 3% 1%
제14 일 27%
P<0.001		 23% 52%
P<0.001		 22%
P<0.008		 22%
P<0.003		 26%
P<0.001
제21 일 37%
P<0.001		 50%
P<0.02		 %
P<0.001		 %
P<0.02		 %
P<0.001		 %
P<0.001
담체군과 치료군을 비교하면, AD 증상의 중증도에 대한 감소 효과가 치료 바디 로션에서 매우 탁월한 것으로 나타났다. 본 발명자들이 평가한 바와 같이, 상당히 더 많은 수의 AD 환자가 AD 증상의 개선을 경험하였다 (도 25).
치료군은 대조군인 담체군과 비교했을 때 삼출성이 상당히 높은 정도로 개선되었다 (하기 표 15 참조).
치료한 지 21일 후, 담체군과 치료군에서 증상의 심한 정도의 변화를 비교
홍반 부종 삼출성 찰과상 태선화 건조
담체군 34% 27% 39% 23% 28% 34%
치료군 37% 50% 86% 53% 53% 40%
P< NS 0.02 0.001 0.003 0.03 NS
따라서, 치료한 지 21일 후의 치료 바디 로션 : 담체의 가장 유의한 이점은 부종 (50% : 27%), 삼출성 (86% : 39%), 찰과상 (53% : 23%) 및 태선화 (53% : 28%)의 심한 정도의 감소로 나타났다 (표 15 참조).
주관적인 개별 성분의 분석
본 분석은 증상을 경험하였음을 나타내는 대상으로부터 취한 데이타만을 근거로 하였다.
환자의 수면 부족에는 영향을 미치지 않으면서, 담체 바디 로션에 의해 소양증의 유의한 감소 (p<0.001)가 유도된 것으로 관찰되었으며, 기준선에서 매우 낮았다 (평균=1.6) (도 26 참조).
치료군에서, 소양증 및 수면 부족의 감소에 유의성이 존재하였다 (도 27 참조, p<0.001). 더욱이, 수면 부족에 대한 기준선 평균 스코어는 담체군과 비교해 더 높았다 (평균=2.6).
비교한 경우, 21일 후, 2개의 군 간에 가려움증과 수면 부족의 감소 사이에 유의성이 발견되지 않았다 (도 28 참조). 치료군에서 수면 부족의 감소가 평균적으로 더 높았지만, 샘플 크기가 작아서 유의한 차이에 도달하는 데에는 한계가 있었다.
치료군 및 담체처리군 모두가 2개의 군 간에 유의한 변화 없이 소양증을 유의하게 감소시켰기 때문에, 따라서, 소양증을 감소시키는 로션의 능력은 주로 담체 활성만을 근거로 한 것으로 간주하였다.
중증 AD 의 치료 효과
SCORAD의 변화를 초기 방문 (baseline visit)에서 중증 (SCORAD>50) 및 비-중증 (경미 내지 중간 정도, SCORAD<50)의 상태를 가진 AD 환자의 하위집단에서 분석하였다.
경미 내지 중간 정도의 (SCORAD<50) AD 환자를 치료하는 로션의 효능을 비교하는 경우, 치료 바디 로션의 효능은 담체보다 35% 더 높았으며 (46% : 34%), 한편 전형적으로 이차 감염을 수반하는 중증의 AD (SCORAD>50)를 치료할 경우 치료 바디 로션의 효능은 담체보다 50% 더 높았다 (42% : 21%, 도 29 참조).
취합하면, AD 증상, 특히 중증의 AD와 이차 감염과 관련된 증상에 대한 치료 바디 로션의 탁월한 효과가 결과에 분명히 나타난다.
보습 수준
피부에 기계적 장벽을 제공하고 수분을 유지하는 로션의 능력에 대한 표시가 보습 수준이다. 하기 2가지 방법으로 보습 수준을 시험하였다:
TEWL- 피부를 통한 증발의 측정
피부 보습 - 피부에 유지된 액체의 양
제21 일에 초기 방문하여, 측정을 수행하였다.
결과를 보면, 2개의 군에서 피부 수분의 측정은 기준선과 제21 일에 유의한 차이가 났다 (도 30 참조, p<0.001). 2가지 로션 모두 동일한 정도로 피부 보습을 개선하였다.
실시예 11
아일란티 라디시스 로부터 인간 베타- 디펜신 3 자극 활성 성분 특징화
전형적인 생물분석법-가이디드 (guided) 분획화는 일반적으로, 천연 제품 화학 분야 연구에서 시간이 오래 걸리고 힘든 과정으로 인지되고 있다. 지난 세기 동안, 생물학적으로 그리고 약물학적으로 활성인 천연 제품을 추적하기 위한 더 효과적인 전략이, HLPC-결합된 활성 프로파일링을 비롯하여 분석 기술의 개선과 함께 개발되어 왔다. HLPC를 이용한 이 기술은 메커니즘 및 세포성 분석법에 직접 응용가능한 효율적인 최소화된 접근법으로서 인지되고 있다.
재료 및 실험 과정
HaCaT 세포 배양 : 인간 케라티노사이트 (HaCaT)를 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 항생제/항진균제 (페니실린 G, 스트렙토마이신, 암포테리신B)를 포함하는 DMEM 배지에서 37.0 ℃ 및 5% C02에서 배양하였다.
아일란티 라디시스 추출물의 제조 : 건조된 아일란티 라디시스를 끓는 물로 3시간 동안 추출하고, 열수 추출물을 감압에서 -60 ℃에서 동결건조하였다. 동결건조된 추출물을 H20에 현탁하고, 에틸 아세테이트 (EtOAc), 부틸 알코올 (n-BuOH)로 연속해서 분획화하였다. 모두 -20 ℃에 보관하였다.
실시간 PCR 분석
TRIzol 시약 (Invitrogen Life Technologies)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 케라티노사이트로부터 총 RNA를 추출하였다. Superscript II RNase H 역전사효소 (Invitrogen Life Technologies)를 사용해 oligo(dT)12-18 프라이머로 총 RNA 3 μg으로부터 제1 가닥 cDNA를 합성하였다. 아울러, cDNA에 상보적인 RNA를 제거하기 위해, 2 U의 RNase H (Invitrogen Life Technologies)를 반응 혼합물에 첨가한 다음, 37 ℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 실시간 정량적 PCR을 TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)를 사용해 실시하였다. 인간 베타 디펜신 3 mRNA의 증폭 및 검출은 실시간 PCR 시스템 (모델 7500; Applied Biosystems)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 분석하였다. 인간 베타-디펜신 3 프라이머/프로브 세트를 Applied Biosystems (Assays on-Demand, Hs0015557_ml)로부터 수득하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 50 ℃에서 2분 및 95 ℃에서 10분의 1회의 초기 단계에 이어서 95 ℃에서 15초간 40회 반복하고, 60 ℃에서 1분. IL-18 mRNA 농도를 정상화하기 위해, 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 전사 수준을 각 샘플에서 동시에 측정하고, GAPDH 전사체 수준을 근거로 한 정상화에 의해 상대적인 IL-18 전사체 수준을 보정하였다. GAPDH의 경우, 발명자들은 이미-개발된 분석법 (Applied Biosystems)을 이용하였다. 모든 실시간 PCR을 3회씩 중복하여 수행하였다. 유전자 발현의 변화를 무처리된 대조군에 대한 배수 증가 (fold increase)로서 기록하였다.
단계 분획화 ( serial fractionation ) : 아일란티 라디시스로부터의 단계 분획화를 도 31에서 기술한 바와 같이 수행하였다.
결과
허브 혼합물 중에서, 아일란티 라디시스 추출물은 인간 베타-디펜신 3 자극 활성이 강하기 때문에 처음부터 선택되었다. 따라서, 본 발명자들은 인간 케라티노사이트 세포주인 HaCaT에서 인간 베타 디펜신 3 (DEF3)의 자극을 유도하는 활성 성분을 전형적인 분획화 기술 및 HPLC-결합된 활성 프로파일링과 함께 실시간 PCR을 이용해 특징화하였다. 활성 성분의 분자 구조를 동정하기 위해, 질량 분석법 및 NMR 분석법을 이용하였다.
단계 I: 아일란티 라디시스 열수 추출물로부터 용매-기재의 3가지 유형의 분획 제조
아일란티 라디시스의 열수 추출물로부터, 제1 단계를 위해 3종류의 추출물, 즉 1. 아일란티 라디시스 물 추출물, 2. 아일란티 라디시스 부틸 알코올 추출물, 및 3. 아일란티 라디시스 에틸 아세테이트 추출물 (도 32A-E)을 제조하였다. 모든 분획을 동결건조하고, (아일란티 라디시스 물 추출물의 경우) 물 및 (아일란티 라디시스 부틸 알코올 추출물 및 에틸 아세테이트 추출물의 경우) DMSO에 10 mg/ml의 농도로 재용해시켰다. 처리 후, 각각의 추출물 10 μl를 배양 배지 3 ml 당 100 μg의 최종 농도로 6웰 플라스크에서 HaCaT 세포 배지에 48시간 동안 첨가하였다. 인간 베타-디펜신 3 mRNA의 변화를 실시간 PCR 분석에 의해 물 또는 DMSO 대조군에서 비교하였다.
모든 시험 군에서 (내부 대조군으로서) GAPDH 및 DEF3의 상대적인 발현 변화를 하기 표 16에 나타낸다. GAPDH와 DEF3 간에 상대적인 발현 변화를 비교한 경우, 아일란티 라디시스 에틸 아세테이트 추출물 및 아일란티 라디시스 부틸 알코올 추출물이 발현을 유의하게 증가시켰다.
아일란티 라디시스 열수 추출물로부터의 용매-기재 분획으로부터 DEF3의 상대적인 발현
군 GAPDH와 DEF3 간의 델타 Ct
(DEF3의 Ct - GAPDH의 Ct)		 대조군과 비교 시 발현 변화 (배수 (fold))
D.W.군 16.57 -
아일란티 라디시스 물 추출물 15.52 2(16.57-15.52)
DMSO 대조군 17.31 -
아일란티 라디시스 에틸 아세테이트 12.84 2(17.31-12.84)
아일란티 라디시스 부틸 알코올 12.8 2(17.31-12.23)
단계 II : 아일란티 라디시스 부틸 알코올 추출물로부터 HPLD -기재의 25가지 종류의 분획
동결건조한 산물 (49 g)을 EtOAc, n-BuOH, 및 H20로 연속해서 분획화하였다. n-BuOH (2.1 g)의 활성 추출물을 -20 ℃에 보관하였다. 활성 프로파일링을 위해,아일란티 라디시스 부틸 알코올 추출물 중 일부 (177 mg)를 하기 조건을 바탕으로 2분이라는 일정한 간격으로 준-분취용 HLPC를 이용해 분획화하였다: 0.1% HCOOH/10% MeOH를 포함하는 90% H20로 시작해서, 0.1% HCOOH/60% MeOH를 포함하는 40% H20로 50분 동안 4.0 ml/min의 유속으로 구배, 및 254 nm에서 UV 검출. 총 25가지의 분획을 수합하였다 (도 33 및 하기 표 17).
25가지의 분획 각각을 풀링 (pooling)하고, 동결건조하고, 10 mg/ml의 농도로 DMSO에 재용해시켰다. 처리 후, 각각의 추출물 10 μl를 배양 배지 3 ml 당 100 μg의 최종 농도로 6웰 플라스크에서 HaCaT 세포 배지에 48시간 동안 첨가하고, 인간 베타-디펜신 3 mRNA의 변화를 실시간 PCR 분석에 의해 물 또는 DMSO 대조군과 비교하였다.
아일란티 라디시스 부틸 알코올 추출물로부터의 HLPC-기재 25가지 분획의 수 및 중량
번호 각 분획의 순중량 (net weight)
1 0.4 mg
2 1.6 mg
3 0.7 mg
4 0.5 mg
5 0.8 mg
6 0.6 mg
7 1.7 mg
8 1.9 mg
9 0.6 mg
10 0.3 mg
11 0.6 mg
12 0.8 mg
13 0.8 mg
14 0.9 mg
15 0.6 mg
16 1.2 mg
17 0.2 mg
18 0.9 mg
19 0.9 mg
20 0.6 mg
21 1.6 mg
22 0.7 mg
23 0.9 mg
24 0.7 mg
25 0.3 mg
모든 시험 군에서 (내부 대조군으로서) GAPDH 및 DEF3의 상대적인 발현 변화를 하기 도 34에 나타낸다. GAPDH와 DEF3 간에 상대적인 발현 변화를 비교한 경우, 분획 번호 12는 인간 케라티노사이트 세포주인 HaCaT에서 DEF의 발현을 크게 증가시켰다.
단계 III : 분획 번호 12로부터 NMR 및 질량 분석법에 의한 구조 특징화 .
DEF 3-자극 화합물의 분리: n-BuOH 추출물로부터 활성 화합물을 분리하기 위해, 추출물의 분취물 (aliquot) (1.07 g)을 상기 활성 프로파일링과 동일한 HLPC 조건에서 반복적으로 분리하여, DEF3-자극 화합물을 포함하는 활성 분획을 수득하였다. 이 화합물을 구배 용매 시스템인, 0.1% HCOOH를 포함하는 80% H20/20% MeOH 내지 0.1% HCOOH를 포함하는 70% H20/30% MeOH에서 70분 동안 추가로 정제하였다 (tR: 24.70 min, 2.2 mg).
NMR 구조 분석: 1H, 13C, 및 2D-NMR 실험을 Varian VNMRS 600 MHz NMR 분광분석계를 이용해 기록하였다. 150 ㎕ 삼중-공명 마이크로플로우 크라이오제닉 프로브 (triple-resonance microflow cryogenic probe)를 사용하는 Varian ProStar HPLC 시스템에 연결된 (hyphenated) Varian VNMRS 600 MHz NMR 분광분석계 (1H: 600.006 MHz)에서 LC/1H NMR을 수행하였다. 1D1H NMR 스펙트럼을 정지-플로우 방식 및 연속-플로우 방식 둘 다에서 수득하였다. 정지-플로우 방식 1HNMR의 경우, HPLC 방법은 처음에 0.1% HCOOH를 포함하는 95% D20/5% ACN에서 수행하였고, 이어서 0.1% HCOOH를 포함하는 35% D20/65% ACN로 35분 동안 구배하였으며 (총 진행 시간: 45분), 이때 유속은 1.0 ml/분이고 UV 검출은 280 nm에서 이루어졌다. 샘플 (50 μl)을 SunFire™ C18 (5 ㎛, 4.6x 150 mm, Waters) 역상 컬럼에 주입하였다. 표준 WET1D 서열을 HOD, ACN, 및 HCOOH에서 1H 빈도수의 전-포화 (pre-saturation)를 위해 사용하였다. 획득 시간 (acquisition time)은 1.82초로, 33 K 시간 영역 지점 (time domain point)을 이용해 9 kHz 스윕 폭 (sweep width)에서 데이타를 수득하였다. 여러 가지 수의 스캔 (128-512)을 프로브 플로우 (probe flow) 세포에 있는 각 화합물의 상대적인 농도에 사용하였다. 1H NMR 스펙트럼은 ACN 공명 (1.96 ppm)을 참조로 하였다. 연속-플로우 LC-NMR 실험은, 유속이 0.2 mL/min이고 총 진행 시간이 180분이라는 점을 제외하고는 동일한 구배 조건에서 수행하였다. 1H NMR 스펙트럼은 크로마토그래피 용리 동안에 연속적으로 각각 32개 스캔에 의해 수집하였다.
1H NMR 스펙트럼은, δ 1.20 및 2.02에서 H-18 및 H-19 (각각 3H, s)의 메틸 양성자 신호 2가지를 보여주었으며, δ 6.06에서 올레핀 양성자 H-3 (1H, br s) 및 엑소메틸렌 양성자 H-21 (2H, s) 신호를 나타내었다. 3가지의 산화된 메틴 양성자 신호인 H-1, H-7 및 H-12를 각각 δ 4.26 (1H, s), 4.62 (1H, t, 2.4) 및 δ 3.89 (1H, s)에서 관찰하였다. 또한, δ 2.91 (H-5), 2.95 (H-9), 및 δ 2.84 (H-14)에서의 3가지의 메틴 양성자 신호를 δ 2.27, 2.14 (Η-6α 및 Η-6β), 2.65, 3.11 (Η-15α 및 Η-15β), 및 δ 3.99, 3.49 (Η-20α 및 Η-20β)에서의 3가지 메틸렌 양성자 신호와 함께 스펙트럼에 나타내었다. γ-락톤 및 α,β-불포화 카르보닐 신호를 각각 δ 170.6 (H-16) 및 197.6 (H-2)에서 수집하였다. 이의 HMBC 스펙트럼에서, H-19의 분리된 메틸은 C-1, C-5, 및 C-10의 3개의 카르보닐 탄소와 연관있는 것으로 나타났으며, 메틴 양성자 신호인 H-14는 C-10, C-12, C-13, C-15, 및 C-20의 탄소 신호와 장기적인 연관이 있는 것으로 나타났다. DEF3-자극 화합물의 1H, 13C, COSY 및 HMBC NMR 데이타는 표 18에 상세히 나타냈다. DEF3-자극 화합물의 NMR 스펙트럼은 도 35-38에 나타낸다. NMR 구조 분석을 바탕으로, 아일란티 라 디시스 추출물로부터의 DEF3-자극 화합물을 아일란톤으로 동정하였다 (도 39A-B).
Figure 112013068119227-pct00001
NMR 데이타는 MeOH-d4 (δ in ppm, J in Hz)에서 600 (1H) MHz에서 관찰하였다. 13C NMR 데이타는 HSQC 및 HMBC를 포함하는 2D NMR 실험에 의해 추론하였다.
본 발명은 이의 구체적인 실시 양태를 들어 기술되어 있지만, 당해 기술분야의 당업자라면 다수의 대안, 수정 및 변형이 자명할 것임은 명확하다. 따라서, 첨부된 청구항의 사상과 광범위한 범위에 해당하는 이러한 대안, 수정 및 변형을 모두 포괄하는 것으로 간주한다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 명시된 바와 같이, 동일한 수준으로 명세서에 그 전체가 포함된다. 아울러, 본 출원에서 임의 원용에 대한 인용 또는 표시는, 이러한 원용이 본 발명에 대한 선행 기술로서 유용함을 용인하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이는 섹션의 서문에서 사용되는 수준으로, 반드시 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

Claims (80)

  1. 산귀소르배 오피시날리스 (Sanguisorbae officinalis) 식물 추출물 및 아일란투스 알티씨마 (Ailanthus altissima) 식물 추출물을 치료적 유효량으로 포함하며, 상기 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물 및 아일란투스 알티씨마 식물 추출물이, 마크로-다공성 (macroporous) 수지를 포함하는 수지 크로마토그래피를 사용해 정제된 수성 추출물인, 아토피성 피부염 (AD)을 치료 또는 예방하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 치료적 유효량이 세포에서 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Th2 타입 사이토카인의 분비를 하향조절하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 치료적 유효량이 세포에서 인간 베타-디펜신 (human beta-defensin)의 발현을 상향조절하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    갈라 로이스 갈누트 (Galla rhois gallnut) 식물 추출물, 글리시리자 글라브라 (Glycyrrhiza Glabra) 식물 추출물, 레움 팔마툼 (Rheum palmatum) 식물 추출물, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 (Scutellaria baicalensis) 식물 추출물, 페우세다눔 프래룹토룸 (Peucedanum praeruptorum) 식물 추출물, 시미시푸가 라세오모사 (Cimicifuga raceomosa) 식물 추출물, 및 실리붐 마리아눔 (Silybum marianum) 식물 추출물 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 치료적 유효량의 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물과, 0.01% w/w 이상의 농도의 아일란톤 (Ailanthone)을 포함하는, 아토피성 피부염 (AD)을 치료 또는 예방하기 위한 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 조성물이 갈라 로이스 갈누트 식물 추출물, 글리시리자 글라브라 식물 추출물, 레움 팔마툼 뿌리 추출물, 크니디움 몬니에리 (Cnidium Monnieri) 열매 추출물, 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 (Scutellaria baicalensis) 뿌리 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물 추출물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 0.5% w/w 내지 2% w/w 농도의 산귀소르배 오피시날리스 식물 추출물;
    0.5% w/w 내지 2% w/w 농도의 아일란투스 알티씨마 식물 추출물;
    0.01% w/w 이상의 농도의 아일란톤; 및
    0.5% w/w 내지 2% w/w 농도의, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물, 레움 팔마툼 뿌리 추출물 또는 이의 조합을
    포함하는, 아토피성 피부염 (AD)의 치료 또는 예방용 단위 투약 형태 (unit dosage form).
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