CN104231101B - 一种臭椿多糖制备方法及其在防治烟草病毒上的应用 - Google Patents

Abstract

一种臭椿多糖的制备方法及其在防治烟草病毒上的应用，其特征在于：所述臭椿多糖是以臭椿的茎皮为原料经水提醇沉制备而成。将本发明制得的臭椿多糖配制成水剂，施加到心叶烟上可以防治烟草花叶病毒。本发明的有益效果是，提供的一种具有防治烟草病毒作用的臭椿多糖的制备方法，以臭椿茎皮作为原料，原材料来源广泛，原料成本低；以水为提取试剂，无污染；提取过程简单、设备要求低、提取过程成本低；所制备的提取物对TMV具有体外抑制作用和侵染位点的抑制作用；提取物来源于植物，对人畜和环境安全性高，属于一种天然、绿色无污染的植物源抗病毒制剂。

Description

一种臭椿多糖制备方法及其在防治烟草病毒上的应用

技术领域

本发明属于烟草病害防治技术领域，涉及植物提取物的制备方法，具体是一种臭椿多糖的提取制备方法，以及对烟草病毒的防治作用。

背景技术

病毒病是烟草上发生最普遍、危害最严重的病害。2006年我国烟草病毒病发生面积240.63万亩，造成产量损失2810.72万公斤，产值损失25161.85万元，占病虫害总损失的37.7%。烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)在烟草上发生最普遍，我国各烟区均有发生，田间发病率一般在5%~20%。病毒的侵染造成烟草生理功能紊乱，化学成分失调，不但使烟叶产量严重下降，而且使烟叶的品质严重变劣，病毒病的发生越来越成为我国优质烟叶生产的一大障碍。由于病毒的绝对寄生性，病毒复制所需要的物质、能量、场所等完全由寄主提供，加上植物没有动物那样完整的免疫代谢系统，这就给高选择性的化学抗病毒制剂开发与植物病毒病的防治带来很大的困难，目前仍没有有效控制病毒病的药剂。

臭椿（Ailanthusaltissima(Mill.)Swingle）为枯木科臭椿属植物，我国大部分地区都有分布。臭椿根皮、茎皮和果实均为我国传统中药，具有除热，燥湿，涩肠，止血，杀虫、消炎等功效。在农业生产中，臭椿可以制备成为杀虫剂（贺春贵等.几种植物杀虫剂的初步研究，甘肃农业大学学报，1996,(3)：233~235；植物素杀虫剂,专利申请号:01128624.5）。研究发现，臭椿也具有防治植物病毒的作用，目前已有臭椿提取物制备抗病毒剂的研究和专利（沈建国等.臭椿抗烟草花叶病毒活性物质的提取及初步研究.中国生物防治.2007(4)；臭椿抗植物病毒剂及其制备方法,专利申请号:200510044113.2）。200510044113.2公布的臭椿抗植物病毒剂使用氯仿、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂作为提取剂，并提供了其制备方法。

植物多糖（Polysaccharide）又称植物多聚糖，是由十个以上单糖通过糖苷键聚合而成的一种天然生物大分子，其相对分子质量可达数万甚至数百万。研究发现植物多糖具有不同的生物学活性。已经证明植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等多种生物活性，而且具有毒副作用小和无残留等优点（TaoYW.TianGY.Studiesonthephysicochemicalproperties,structureandantitumoractivityofpolysaccharideYhPS-1fromtherootofCordalisyanhusuoWang[J].ChineseJournalofChemistry,2006,24(2):235-239.GeY.DuanYF,FangGZ,etal.StudyonbiologicalactivitiesofPhysalisalkekengivarfranchetipolysaccharide[J].JSciFoodAgric,2009,89(9):1593-1598.）。在植物病毒防治研究领域，关于多糖防治植物病毒的研究报道很少。研究发现，毛头鬼伞(Coprinuscomatus)真菌多糖具有抗烟草花叶病毒的活性，分离纯化得到的多糖组分CCP60a可以使TMV外壳蛋白的表达明显降低（吴艳兵,谢荔岩,谢联辉等.毛头鬼伞多糖CCP60a对TMV外壳蛋白的影响.植物资源与环境学报,2008,17(3):63-66.）。

植物多糖提取的经典方法是水提醇沉法（张智芳,林文庭,陈灿坤.植物多糖提取工艺的研究进展[J].海峡预防医学杂志,2008,14(3):18-20.），也就是采用热水浸提，再利用多糖不溶于有机溶剂的性质使用乙醇将多糖从提取液中沉淀出来。另外，由于植物组织中也含有大量的蛋白质，在多糖提取过程中，必须去除蛋白质。具体原理是利用蛋白质遇有机溶剂变性沉淀的特点，利用三氯乙酸或者Sevag试剂使多糖溶液中的蛋白质沉淀去除。迄今，已经有植物多糖提取方法的专利，如灵芝孢子多糖、制备方法和应用（专利申请号:CN201410020206.0），一种黄参多糖制备方法（专利申请号:CN200710307283.4）等，但还没有臭椿多糖制备方法以及防治植物病毒的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有防治烟草病毒作用的臭椿多糖的制备方法,本方法以臭椿为原料，以水作为提取剂，经过热水浸提，去除蛋白，乙醇沉淀，去除杂质等步骤制备得到臭椿多糖，经试验证明，臭椿多糖对TMV具有明显的体外抑制作用和侵染位点的抑制作用。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种臭椿多糖的制备方法，以臭椿的茎皮为原料经水提醇沉制备而成，具体步骤依次如下：

1）经过前处理的臭椿茎皮，置于20～60℃条件下烘干，之后将其粉碎至40目；

2）取步骤1所制备的臭椿粉，按照水：粉（体积/质量）=10～30：1，在50～90℃条件下提取1～4h，间歇搅拌。过滤，收集滤液，重复提取过程1次，合并2次滤液，将滤液减压浓缩至原体积的1/5～1/10；

3）加入0.2倍体积的Sevag试剂(氯仿：正丁醇=4：1)，剧烈振摇20min，静置20min，5000rpm离心l0min，小心收集水相，去除蛋白层。重复该步骤多次，直至无蛋白沉淀析出。

4）水相用蒸馏水透析36h，去除小分子有机物和无机盐。加入浓缩液2～5倍的乙醇，在-20℃～10℃条件下沉淀12～48h，使多糖沉淀并析出。5000rpm离心收集沉淀。

5）沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤两次，进行脱水并去除一些有机物污染。30～70℃干燥，研磨成粉备用。

在本发明中，步骤1）中所述的前处理是指洗涤、晾晒过程。步骤2）中的最佳提取温度为90℃，此温度下提取率最高。

将本发明制得的臭椿多糖用水配制成0.25%～0.75%的浓度，施加到心叶烟上可以防治烟草花叶病毒的侵染。其具体防治方法及计算方式如下：

1.体外抑制作用

选择健康、生长旺盛的6～8叶期心叶烟，右半叶摩擦接种多糖溶液与病毒等体积混合液（病毒终浓度为5μg/mL），左半叶接种蒸馏水与病毒等体积混合液作对照，每株接种4～5个叶片，每处理接种3株，3d后统计枯斑数目，以下列公式计算抑制率。

2.臭椿多糖对病毒侵染位点的抑制作用

配制浓度为0.5%mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL臭椿多糖溶液，涂抹到心叶烟的右半边叶上，左半边叶涂抹蒸馏水。分别在24h、48h、72h后，左右半边叶均接种病毒，病毒浓度为5μg/mL，每株接种4～5个叶片，每处理接种3株，3d后统计枯斑数目，以下列公式计算抑制率。

本发明的有益效果是，本发明提供的一种具有防治烟草病毒作用的臭椿多糖制备方法。以臭椿茎皮作为原料，原材料来源广泛，原料成本低；以水为提取试剂，无污染；制备过程简单、设备要求低、成本低；提取物对TMV具有体外抑制作用和侵染位点的抑制作用；提取物来源于植物，属于一种天然、绿色无污染的植物源抗病毒物质，而且对人畜和环境安全性高。

附图说明

图1为臭椿多糖制备工艺图。

图2为臭椿多糖浓度测定标准曲线图。

图3为半叶法测定臭椿多糖对烟草花叶病毒的体外抑制作用的实物对比图。（左半叶为对照，右半叶为处理）。

具体实施方式

本发明将结合实施例作进一步的描述，但并不是限制本发明。

实施例1：

臭椿水提取物的制备方法（提取工艺见图1）

1.将经过洗涤、晾晒处理的臭椿茎皮，置于室温下阴干，之后将其粉碎至40目；

2.称取步骤1所制备的臭椿粉30g，按照水：粉（体积ml/质量g）=10：1，在70℃条件下提取2h，间歇搅拌；过滤，收集滤液，重复提取过程1次，合并2次滤液，将滤液减压浓缩至原体积的1/5；

3.加入0.2倍体积的Sevag试剂(氯仿：正丁醇=4：1)，混合物剧烈振摇20min，静置20min，5000rpm离心l0min，小心收集水相，除去水层和试剂层交界处的变性蛋白质。重复多次，直至无蛋白沉淀析出。

4.水相使用蒸馏水透析36h，加入浓缩液4倍的乙醇，在-20℃～10℃条件下沉淀24h；5000rpm离心收集沉淀。

5.沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤两次，去除杂质。30℃干燥，研磨成粉备用。

6.使用时，多糖配制成0.5%的浓度。

实施例2：

臭椿水提取物的制备方法（提取工艺见图1）

1.将经过洗涤、晾晒处理的臭椿茎皮，置于室温下阴干，之后将其粉碎至40目；

2.称取步骤1所制备的臭椿粉30g，按照水：粉（体积ml/质量g）=20：1，在80℃条件下提取3h，间歇搅拌；过滤，收集滤液，重复步骤2）1次，合并2次滤液，将滤液减压浓缩至原体积的1/8；

3.加入0.2倍体积的Sevag试剂(氯仿：正丁醇=4：1)，混合物剧烈振摇20min，静置20min，5000rpm离心l0min，小心收集水相，除去水层和试剂层交界处的变性蛋白质。重复多次，直至无蛋白沉淀析出。

4.水相使用蒸馏水透析36h，加入浓缩液4倍的乙醇，在-20℃～10℃条件下沉淀24h；5000rpm离心收集沉淀。

5.沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤两次，去除杂质。30℃干燥，研磨成粉备用。

6.使用时，多糖配制成1.0%的浓度。

实施例3：

臭椿水提取物的制备方法（提取工艺见图1）

1.将经过洗涤、晾晒处理的臭椿茎皮，置于室温下阴干，之后将其粉碎至40目；

2.称取步骤1所制备的臭椿粉30g，按照水：粉（体积ml/质量g）=30：1，在90℃条件下提取4h，间歇搅拌；过滤，收集滤液，重复步骤2）1次，合并2次滤液，将滤液减压浓缩至原体积的1/10；

3.加入0.2倍体积的Sevag试剂(氯仿：正丁醇=4：1)，混合物剧烈振摇20min，静置20min，5000rpm离心l0min，小心收集水相，除去水层和试剂层交界处的变性蛋白质。重复多次，直至无蛋白沉淀析出。

4.使用蒸馏水透析36h，加入浓缩液4倍的乙醇，在-20℃～10℃条件下沉淀24h；5000rpm离心收集沉淀。

5.沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤两次，去除杂质。30℃干燥，研磨成粉备用。

6.使用时，多糖配制成1.5%的浓度。

实施例4：多糖含量测定

1.标准曲线制作。称取葡萄糖标准品0.1g，溶解后容量至100ml，分别吸取葡萄糖标准溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0m1容量至50ml。吸取上述标准溶液各2ml，加入6.0%苯酚试剂1m1，混匀。冰浴中加入浓硫酸5.0ml，混匀后冷却至室温，沸水浴中加热30min，冷却至室温，490nm测定吸光度。制定的标准曲线如图2，回归方程为：y=14.867x-0.0019,相关系数R²=0.9985。（参见图2）

2.多糖含量测定。将实施例1、2和3中提取的多糖配置成1mg/ml，取2ml，分别加入苯酚试剂、浓硫酸等，方法同标准曲线。490nm测定吸光度，每个样品测三次，读取吸光度取平均值，将所测吸光度值代入回归方程，计算得到实施例1、2、3中每种方法提取多糖浓度（表1）。根据公式：多糖提取率=提取物中多糖质量／原料质量，计算多糖提取率。

表1实施例中多糖提取率

	实施例1	实施例2	实施例3
				吸光度（A）	0.31	0.416	0.489
多糖浓度（mg/ml）	0.021	0.028	0.033
				多糖提取率	1.03%	1.42%	1.65%

实施例5：臭椿水提取物对烟草花叶病毒的防治作用测定

1.供试寄主和毒源

供试寄主：本氏烟(Nicotianaglutinosa)，在本单位繁殖，在光照培养箱内培养，培养条件为19～23℃。心叶烟生长至6～8叶期，进行试验。

供试毒源：烟草花叶病毒（TMV）普通株系，2011年采集自河南省襄城县烟田。经过心叶烟单斑分离后，在普通烟草中烟100上繁殖。采集发病明显的烟草叶片，参考罗朝鹏的方法（罗朝鹏，魏春阳,李乃会等.烟草普通花叶病毒抗血清的吸附纯化及应用.烟草科技,2012(10):77-80）提纯烟草花叶病毒并测定病毒浓度。

2.对烟草病毒防治作用测定

2.1臭椿多糖对烟草花叶病毒体外抑制作用。选择健康、生长旺盛的6～8叶期心叶烟，右半叶接种实施例1、2和3中稀释得到的多糖水溶液与病毒等体积混合液（（多糖终浓度分别为0.25%、0.5%和0.75%，病毒终浓度为5μg/mL），左半叶接种蒸馏水与病毒等体积混合液作对照。每株接种4～5个叶片，每处理接种3株，3d后统计枯斑数目。图3所示半叶法测定臭椿多糖对TMV的体外抑制效果，计算所得的抑制率如表2所示。可见随着臭椿水提取物浓度的增加，对TMV的体外抑制作用也增加，最高达到89.4%，抑制率很高。

表2臭椿多糖对TMV的体外抑制作用

多糖浓度	0.25%	0.50%	0.75%
				枯斑抑制率	62.4%	83.3%	89.4%

2.2臭椿多糖对烟草花叶病毒侵染位点的抑制作用

实施例1、2和3中稀释得到的臭椿多糖水溶液，加入等体积的蒸馏水（终浓度分别为0.25%、0.5%和0.75%），均匀涂抹到心叶烟的右半边叶上，左半边叶涂抹蒸馏水。24h、48h、72h后，左右半叶摩擦接种病毒，每株接种4～5个叶片，每处理接种3株，3d后统计枯斑数目，计算抑制率。结果显示，同一浓度，臭椿多糖在预处理48h后（表3），对TMV侵染的抑制效果最高。不同浓度，0.75%的多糖溶液对TMV侵染位点的抑制作用最强，其中48h的抑制率达到59.4%。说明臭椿多糖对TMV侵染位点具有抑制作用，而且抑制具有时效性，抑制率最高的时间是预处理48h后。

表3臭椿多糖对侵染位点的抑制作用

多糖浓度	24 h	48 h	72 h
				0.25%	32.7%	38.3%	30.6%
0.50%	48.1%	54.5%	42.4%
				0.75%	50.9%	59.4%	45.8%

Claims (4)

1.一种臭椿多糖的制备方法，其特征在于：以臭椿的茎皮为原料经水提醇沉制备而成，具体步骤依次如下：

1）经过前处理的臭椿茎皮，置于20～60℃条件下烘干，之后将其粉碎至40目；

2）取步骤1所制备的臭椿粉，按照水：粉=（10～30）ml：1g，在50～90℃条件下提取1～4h，间歇搅拌，过滤，收集滤液，重复提取过程1次，合并2次滤液，将滤液减压浓缩至原体积的1/5～1/10；

3）加入0.2倍体积的Sevag试剂，剧烈振摇20min，静置20min，5000rpm离心l0min，小心收集水相，去除蛋白层；

重复多次，直至无蛋白沉淀析出；

4）水相用蒸馏水透析36h，加入浓缩液2～5倍的乙醇，在-20℃～10℃条件下沉淀12～48h；5000rpm离心收集沉淀；

5）沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤两次，去除杂质，30～70℃干燥，研磨成粉备用。

2.根据权利要求1所述的臭椿多糖的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述的前处理是指洗涤、晾晒过程。

3.根据权利要求1所述的臭椿多糖的制备方法，其特征在于：步骤2）中的提取温度为90℃。

4.一种按照权利要求1-3任一项所述方法制备的臭椿多糖在防治烟草病毒上的应用，其特征在于：将臭椿多糖干粉用水配制成0.25%～0.75%的浓度，施加到心叶烟上防治烟草花叶病毒。