CN105707072B

CN105707072B - 一种螺旋藻多糖及其应用

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Publication number: CN105707072B
Application number: CN201410729758.9A
Authority: CN
Inventors: 刘启顺; 尹恒; 孙永欣; 陈玮; 王文霞
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2014-12-03
Publication date: 2018-08-21
Anticipated expiration: 2034-12-03
Also published as: CN105707072A

Abstract

本发明涉及富含葡萄糖的螺旋藻多糖及其在植物绿色农药和抗肿瘤药物中的应用。本发明以经营养调控得到的高糖螺旋藻为原料，经热水浸提法、絮凝剂除蛋白、浓缩、沉淀和冷冻干燥，得到一种水溶性高糖螺旋藻多糖，分子量在10～200kDa，其单糖组成主要为鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，其特点为单糖组成中，葡萄糖含量超过50％。该螺旋藻多糖可明显诱导植物抗病性，并对肿瘤具有明显的抑瘤效果，可作为一种生物农药和抗肿瘤药物。

Description

一种螺旋藻多糖及其应用

技术领域

本发明涉及到多糖及其生物活性研究，详细研究了一种经营养调控的高糖螺旋藻中的富含葡萄糖的螺旋藻多糖的生物活性及其应用，属于糖工程和糖生物学领域。

背景技术

随着农业的迅速发展，植物病害也越来越严重，极大影响了农业植物的产量。为了控制植物病害，主要采用化学杀菌剂和培育抗性品种等，但化学杀菌剂不仅能引起环境污染，还危机人类健康，而抗性新品种也由于选育时间长、耗资大、抗性易退化等原因而发展缓慢，所以安全、环保、快速的控制植物病害方法迫在眉睫。

已有研究结果表明，植物在长期进化过程中由于需要不断抵抗微生物的侵害，逐渐形成一系列复杂而行之有效的防御系统，当植物受到侵染，防御系统便得到启动，达到清除病菌保护自身目的。诱导机制比较复杂，主要在如下几方面：1、寄主的木质化反应；2、植保素增加；3、酚类物质积累；4、病程相关蛋白积累，如几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶等；防御酶系的变化，如过氧化物酶、多酚氧化酶等。相比其它病害防治方法，诱导抗病具有使用技术简单、抗病谱广、病原菌无耐药性且对环境无污染等优点。

目前已报道的具有诱导抗病性的寡糖类有寡聚半乳糖醛酸、壳聚糖、野菊多糖等，还未见螺旋藻多糖作为植物诱导子应用于农业植物抗病的报道。螺旋藻(Spirulinaplatensis)是单细胞藻类，属蓝藻门，生态分布广，易于培养，生长速度快，含有大量的生物活性物质，如碳水化合物、蛋白质和维生素等。本发明提供一种螺旋藻多糖用于植物抗病诱导剂，防治植物病害。

肿瘤是现代社会人类健康面临的重大问题，化学药物在抑制肿瘤方面取得重要进展，但是也有诸多不足，如耐药性、副作用等。从天然物质中发现和提取具有抗肿瘤活性的物质，一直是抗肿瘤药物研究的重点和热点。另外，从食疗角度和提高天然产物的开发深度来说，开发螺旋藻多糖的抗肿瘤活性也具有重要的意义。所以本发明则从经营养调控的高糖螺旋藻提取到一种新型螺旋藻多糖，提供其在抗肿瘤方面的活性应用，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从经营养调控的高糖螺旋藻提取的新型螺旋藻多糖，用于植物病害防控、壮苗及抗肿瘤药物的用途。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种富含葡萄糖的螺旋藻多糖，所述螺旋藻多糖为富含葡萄糖的螺旋藻多糖，所述的富含葡萄糖的螺旋藻多糖由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸9种单糖组成；其中葡萄糖含量超过50％。

其单糖组成摩尔比(以半乳糖醛酸的摩尔数为基数计算)为分别为鼠李糖：岩藻糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸＝2.2～2.8:1.4～1.7：1.4～1.6：1.5～1.7：1.1～1.6：2.6～2.8：68.4～73.3：1.0～1.1：1。分子量为10-100KDa。

所述的富含葡萄糖的螺旋藻多糖提取制备方法为：

将经营养调控得到的高糖螺旋藻进行高压均质破壁，并用热水浸提法提取多糖，絮凝剂除蛋白，再通过浓缩、沉淀和干燥，得到富含葡萄糖的螺旋藻多糖。

所述高压破碎工艺为：将螺旋藻粉与水按质量体积比1:10～50(g/ml)制备成悬浮液，经过高压均质机破碎，高压匀质的压力为40～120MPa，高压匀质次数为1～5次，得螺旋藻破碎液；

取上述螺旋藻破碎液，控制螺旋藻破碎液中螺旋藻与水质量体积比为1:10～50，在30～90℃热水浸提法提取螺旋藻多糖，浸提时间为2～6h，提取后3000～8000rpm离心5～20min，去除沉淀物，收集上清，得到多糖溶液；

所述絮凝剂除蛋白的絮凝剂为聚合硫酸铁、聚硅酸铁、聚硅酸硫酸铁、聚磷氯化铁或ZTC1+1的一种或两种以上混合物；使用前2～24h絮凝剂分别配制成质量浓度0.2～2％溶液，絮凝1～3h，絮凝剂溶液添加量分别为多糖溶液体积的1～5％(v/v)；絮凝后离心去除沉淀物，收集上清液；

絮凝离心后的上清液加热浓缩；浓缩为过程为：于上述提取液在40～70℃，转速40～120rpm的条件下旋转蒸发至原溶液体积的1/2～1/8；

沉淀过程为：于浓缩液中加入浓缩液2～8倍体积沉淀剂，沉淀剂为乙醇、丙酮、丁醇、2-丁醇的一种或者两种以上的混合物；然后3000～8000rpm离心5～30min，得到沉淀部分，将沉淀部分进行干燥，得到螺旋藻多糖。

所述絮凝剂絮凝除蛋白的过程，优选是将聚合硫酸铁、聚硅酸铁、聚硅酸硫酸铁或聚磷氯化铁的一种或两种以上混合物与ZTC1+1联合使用；使用前2～24h絮凝剂分别配制成质量浓度0.2～2％溶液，在絮凝时先添加聚合硫酸铁、聚硅酸铁、聚硅酸硫酸铁、聚磷氯化铁中的一种或两种以上混合物絮凝1～3h后，然后再添加ZTC1+1，絮凝1～3h；絮凝剂溶液每次添加量分别为多糖溶液体积的1～5％(v/v)；絮凝后离心去除沉淀物，收集上清液。

所述富含葡萄糖的螺旋藻多糖具有诱导植物抗病活性，所述的螺旋藻多糖可作为植物诱抗剂。

所述富含葡萄糖的螺旋藻多糖具有抗肿瘤活性，所述的螺旋藻多糖在制备抗肿瘤药物或保健食品中的应用。

本发明具有如下优点：

1本发明表明螺旋藻多糖具有诱导植物抗病性，来源天然，无副作用，可开发成植物绿色农药或食品添加剂。

2螺旋藻多糖原料为经过人工营养调控培养，其来源广泛、价格低廉，本发明有利于螺旋藻的综合利用并提高其附加值。

3该发明螺旋藻多糖具有明显抗肿瘤活性，有效率高，可用于新型抗肿瘤药物开发，且无毒副作用。

附图说明

图1.实施例1的螺旋藻多糖气相色谱图；

图2.实施例1的螺旋藻多糖红外光谱图；

其中：

图1中，a:鼠李糖b:岩藻糖c:阿拉伯糖d:木糖e:甘露糖f:半乳糖g:葡萄糖h:葡萄糖醛酸i:半乳糖醛酸低糖藻粉中9种单糖比例：4.1：1.4：1.4：2：1.3：6：22.8：1.4：1高糖藻粉中9种单糖比例：2.8：1.7：1.6：1.7：1.6：2.8：73.3：1.1：1。

图2中，a：普通螺旋藻多糖；b：制备的新型螺旋藻多糖。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐述具体实施方式，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 螺旋藻多糖的提取

1.取高糖螺旋藻藻粉10g，采用水作为提取液，搅拌溶解至螺旋藻充分溶胀(固液比1:30)，常温条件下高压匀质，压力为80MPa，连续3次。

2.高压匀质液用80℃热水浸提法提取螺旋藻水溶性多糖，浸提时间为4h，提取后6000rpm高速离心20min，去除沉沉物，收集上清。

3.采用絮凝剂除蛋白，絮凝剂为聚硅酸硫酸铁和ZTC1+1(A组分和B组分，由北京中科圣源生物技术有限公司生产)联用，用前24h分别配制成1％溶液，在絮凝时先后添加，絮凝剂添加量分别为多糖溶液体积的1％，3.5％(B组分)和2％(A组分)，絮凝时间为2h。

4.絮凝后采用高速离心去除沉淀物，收集上清后在60℃，转速80rpm的条件下旋转蒸发至原溶液体积的1/3，加入3倍体积95％乙醇，5000rpm离心15min，得到沉淀部分，最后直接进行干燥，得到螺旋藻水溶性固体，采用硫酸-苯酚法分析其多糖纯度为95％，多糖收率为90％。

5.采用高效凝胶过滤色谱法测定该多糖的相对分子质量为12、37、64、93和163KDa，采用气相色谱法测定其单糖组成及摩尔比为鼠李糖：岩藻糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸＝2.8：1.7：1.6：1.7：1.6：2.8：73.3：1.1：1。

实施例2 螺旋藻多糖的提取

1.取高糖螺旋藻藻粉10g，采用水作为提取液，搅拌溶解至螺旋藻充分溶胀(固液比1:40)，常温条件下高压匀质，压力为80MPa，连续3次。

2.高压匀质液用90℃热水浸提法提取螺旋藻水溶性多糖，浸提时间为4h，提取后6000rpm高速离心20min，去除沉沉物，收集上清。

3.采用絮凝剂除蛋白，絮凝剂为聚硅酸铁，絮凝剂添加量分别为多糖溶液体积的2％，絮凝时间为2h。

4.絮凝后采用高速离心去除沉淀物，收集上清后在60℃，转速80rpm的条件下旋转蒸发至原溶液体积的1/3，加入3倍体积95％乙醇，5000rpm离心15min，得到沉淀部分，最后直接进行干燥，得到螺旋藻水溶性固体，采用硫酸-苯酚法分析其多糖纯度为89％，多糖收率为91％。

5.采用高效凝胶过滤色谱法测定该多糖的相对分子质量为12、36、63、95和163KDa，采用气相色谱法测定其单糖组成及摩尔比为鼠李糖：岩藻糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸＝2.2:1.4：1.4：1.5：1.1：2.6：68.4：1.0：1。

实施例3 螺旋藻多糖诱导烟草抗烟草花叶病毒试验

(1)喷雾处理：将实施例1制备的螺旋藻多糖分别用水稀释得到浓度为0.1～0.5mg/mL的溶液，然后分别对六至八叶期的枯斑三生烟进行全株喷雾，设三个重复，每个重复三株；同时以同等浓度海带多糖作为对照，空白组用清水喷雾。

(2)病毒接种液的制备：病毒来源为本研究室保存普通株系，将感染烟草花叶病毒的普通烟的叶片去除主脉，与PBS(pH8.0,0.01mol/L)按1g/20mL混合，每20mLPBS加0.015g金刚砂，充分研磨叶片，得到接种液。

(3)接种：按步骤(1)方法喷雾处理枯斑三生烟植株72h后，用步骤(2)得到的接种液进行汁液摩擦接种(植病研究方法(第三版)，方中达，中国农业出版社)接种后立即用清水冲洗，温室中培养。

(4)枯斑抑制率计算：接种72h后调查枯斑三生烟叶片产生枯斑数量，枯斑抑制率计算公式如下：

X(％)＝(CK-Y)/CK×100

式中X为枯斑抑制率；CK为对照组叶片的平均枯斑数(个)；Y为螺旋藻多糖诱导处理后叶片的平均枯斑数(个)。

结果如表1所示，用0.5mg/mL螺旋藻多糖处理过的烟草对烟草花叶病毒的抑制率均在75％以上，效果明显优于同浓度下的海带多糖，

说明螺旋藻多糖能够明显诱导烟草对烟草花叶病毒产生抗性。

表1 螺旋藻多糖抗烟草花叶病毒的结果

组别	平均枯斑数	抑制率(％)
			空白组	122
海带多糖组	60	50.81
			螺旋藻多糖组	30	75.41

实施例4 螺旋藻多糖抗番茄叶灰霉病试验

将实施例1所得到的螺旋藻多糖配制成0.1mg/mL的螺旋藻多糖水溶液，然后将螺旋藻水溶液喷洒到已被灰霉病菌轻度感染的30cm高的番茄叶子上，每个处理重复3次。对照组为同等浓度的海带多糖，空白组用清水替代。3天后通过计量实验组与空白对照组的病斑面积比确定防治病的效果。结果见表2。

表2 螺旋藻多糖抗番茄灰霉病的结果

组别	病情指数(％)	抑制率(％)
			空白组	95.7
海带多糖组	25.6	73.25
			螺旋藻多糖组	19.8	79.3

由表2可见，同海带多糖水溶液相比，螺旋藻多糖水溶液在防治番茄灰霉病的效果上更好。

实施例5 螺旋藻多糖抗水稻白叶枯病的试验

将实施例1所得的螺旋藻多糖配成浓度为0.20mg/mL螺旋藻多糖水溶液。

1、将水稻种子播种于盛有稻田土壤的塑料盆内，每盆10粒种子，每个处理重复3次。

2、将水稻白叶枯病菌调节浓度至10⁸CFU/mL。

3、3个星期后，将螺旋藻水溶液喷洒到水稻幼苗上，每盆喷洒5mL，同时用同等浓度的壳聚糖水溶液作对照。空白组用等量灭菌蒸馏水喷洒。

4、风干后，将上述步骤2的菌液喷洒接种到步骤3中的水稻幼苗上，每盆喷洒5mL。

5、用塑料袋覆盖所有接种过的幼苗24h，在温室中培养，温度为28℃，相对湿度90％，每天光照16h黑暗8h交替培养。

6、接种后7d，观察和记录病害发生率和病斑的平均直径大小，全部试验重复3次。未接种白叶枯病病菌的水稻幼苗则未表现出病害症状。

试验结果表明，螺旋藻多糖水溶液处理的水稻其白叶枯病发病率和病斑直径显著低于空白组，并低于壳聚糖水溶液处理组(表3)。

表3 螺旋藻多糖抗水稻幼苗白叶枯病的结果

组别	病害发病率(％)	病斑直径(mm)
			空白组	86	32
壳聚糖组	50	20
			螺旋藻多糖组	45	17

实施例6 抗肿瘤试验

1、接种取对数生长期的人胃癌MKN45细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，加入96孔培养板中，每孔100μL。

2、培养与药物处理置37℃、5％CO₂孵箱中培养24h后，吸出培养液，分别加入不同浓度螺旋藻多糖溶液作为试验组，同时以400μg/mL环磷酰胺作为阳性对照组，空白组只加培养液，每个浓度3孔重复，继续培养48h。

3、呈色培养结束前4h，每孔加MTT溶液20μL，继续培养4h后吸弃上清液，然后加DMSO 200μL/孔，震荡溶解结晶物。

4、比色和计算酶标仪比色(570nm)，测吸光度值，并按以下公式计算生长抑制率：

细胞抑制率＝(1-给药组A值/对照组A值)×100％。

本发明中的螺旋藻多糖浓度为100～800μg/mL在体外产生对人胃癌MKN45细胞较明显的生长抑制，对胃癌MKN45细胞最大抑制率为45％，环磷酰胺对胃癌细胞抑制率为25％。

实施例7 抗肿瘤试验

1、接种取对数生长期的人宫颈癌(HELA)细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，加入96孔培养板中，每孔100μL。

细胞抑制率＝(1-给药组A值/对照组A值)×100％。

本发明中的螺旋藻多糖浓度为100～800μg/mL在体外产生对人宫颈癌(HELA)细胞有较明显的生长抑制，最大抑制率为75％，环磷酰胺对宫颈癌细胞抑制率为65％。

实施例8 抗肿瘤试验

1、接种取对数生长期的人结肠癌HT29细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，加入96孔培养板中，每孔100μL。

细胞抑制率＝(1-给药组A值/对照组A值)×100％。

本发明中的螺旋藻多糖浓度为100～800μg/mL在体外产生对人结肠癌HT29细胞最大抑制率为25％，明显高于环磷酰胺15％的抑制率。

Claims

1.一种富含葡萄糖的螺旋藻多糖的应用，其特征在于：所述富含葡萄糖的螺旋藻多糖具有诱导植物抗病活性，所述的螺旋藻多糖作为植物诱抗剂;

所述螺旋藻多糖为富含葡萄糖的螺旋藻多糖，所述的富含葡萄糖的螺旋藻多糖由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸9种单糖组成；其中葡萄糖含量超过50%；

以半乳糖醛酸的摩尔数为基数计算，其摩尔比为分别为鼠李糖：岩藻糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸=2.2~2.8: 1.4~1.7：1.4~1.6：1.5~1.7：1.1~1.6：2.6~2.8：68.4~73.3：1.0~1.1：1。

2.根据权利要求1所述的螺旋藻多糖的应用，其特征在于：所述螺旋藻多糖分子量为10-100KDa。

3.根据权利要求1或2所述的螺旋藻多糖的应用，其特征在于：所述的富含葡萄糖的螺旋藻多糖提取制备方法为：

4.根据权利要求3所述的螺旋藻多糖的应用，其特征在于：

所述高压破碎工艺为：将螺旋藻粉与水按质量体积比g/ml 1:10~50制备成悬浮液，经过高压均质机破碎，高压匀质的压力为40~120MPa，高压匀质次数为1~5次，得螺旋藻破碎液；

所述热水浸提法为：取上述螺旋藻破碎液，控制螺旋藻破碎液中螺旋藻与水质量体积比为1:10~50，在30~90℃热水浸提法提取螺旋藻多糖，浸提时间为2~6 h，提取后3000~8000rpm离心5~20 min，去除沉淀物，收集上清，得到多糖溶液；

所述絮凝剂除蛋白的絮凝剂为聚合硫酸铁、聚硅酸铁、聚硅酸硫酸铁、聚磷氯化铁或ZTC1+1的一种或两种以上混合物；使用前2~24 h絮凝剂分别配制成质量浓度0.2~2%溶液，絮凝1~3h，絮凝剂溶液添加量分别为多糖溶液体积v/v的1~5%；絮凝后离心去除沉淀物，收集上清液；

絮凝离心后的上清液加热浓缩；浓缩为过程为：于上述提取液在40~70℃，转速40~120rpm的条件下旋转蒸发至原溶液体积的1/2~1/8；

沉淀过程为：于浓缩液中加入浓缩液2~8倍体积沉淀剂，沉淀剂为乙醇、丙酮、丁醇、2-丁醇的一种或者两种以上的混合物；然后3000~8000 rpm离心5~30 min，得到沉淀部分，将沉淀部分进行干燥，得到螺旋藻多糖。

5.根据权利要求4所述的螺旋藻多糖的应用，其特征在于：

所述絮凝剂絮凝除蛋白的过程，是将聚合硫酸铁、聚硅酸铁、聚硅酸硫酸铁或聚磷氯化铁的一种或两种以上混合物与ZTC1+1联合使用；使用前2~24 h絮凝剂分别配制成质量浓度0.2~2%溶液，在絮凝时先添加聚合硫酸铁、聚硅酸铁、聚硅酸硫酸铁、聚磷氯化铁中的一种或两种以上混合物絮凝1~3h后，然后再添加ZTC1+1，絮凝1~3h；絮凝剂溶液每次添加量分别为多糖溶液体积v/v的1~5%；絮凝后离心去除沉淀物，收集上清液。