CN109400737A - 一种螺旋藻多糖的制备方法及其应用 - Google Patents

一种螺旋藻多糖的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物与新医药中轻工和化工生物技的天然产物有效成份的分离提取技术，涉及提取与应用领域，具体为一种螺旋藻多糖的提取方法及其在抗肿瘤方面的应用。本发明的制备步骤如下：1）将干燥的螺旋藻粉碎，过筛；2）加入氢氧化钠溶液，微波辅助提取；3）将提取液离心，滤液用稀盐酸调pH值；4）加三氯乙酸沉淀蛋白，收集滤液；5）向滤液中加入乙醇沉淀多糖，离心；6）将离心所得多糖真空干燥。本发明采用微波辅助的碱性溶液提取技术，节约提取时间，提高提取率；选用三氯乙酸沉淀蛋白，既可沉淀蛋白也可去除少量色素等杂质，提高纯度。采用该方法制备的螺旋藻多糖提取物对HeLa细胞的增殖具有明显的抑制作用。

Description

一种螺旋藻多糖的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物与新医药中轻工和化工生物技的天然产物有效成份的分离提取技术，涉及提取与应用领域，尤其涉及一种螺旋藻多糖提取物的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
螺旋藻是一类低等植物，属于蓝藻门颤藻科。螺旋藻富含优质蛋白质、多糖、矿物质及多种生物活性物质，且易消化吸收，堪称最佳天然绿色保健食品，被联合国粮农组织推荐为21世纪最理想的保健食品。螺旋藻多糖是从螺旋藻中分离提取的一种生物活性物质，具有促进细胞生长、提高免疫力、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗疲劳等功能，且无毒副作用。传统螺旋藻多糖的提取工艺复杂，提取率低，因此如何选取最佳的提取工艺成为本次专利研究重点。本发明结合传统工艺，采用碱性溶液辅助微波进行提取，节约了提取时间，提高了提取率。选用三氯乙酸沉淀蛋白和去除少量色素等杂质，并通过细化工艺参数提高多糖纯度。提取获得的螺旋藻多糖进行抗肿瘤活性实验，评价螺旋藻多糖提取物在抗肿瘤方面的作用。
发明内容
本发明提供了螺旋藻多糖提取物的制备方法与应用，本发明将传统工艺与现代工艺结合，细化工艺参数，在浸提时辅助微波提取，其工艺具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗小、有效成分收率高的特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种螺旋藻多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将螺旋藻于40℃烘干、采用万能粉碎机将其粉碎，过30目筛网，得到螺旋藻粉末；
（2）向螺旋藻粉末中加入氢氧化钠溶液，升温搅拌，微波辅助提取，得到提取液；
（3）将提取液离心，滤液用稀盐酸调节pH值；
（4）向滤液中加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白质，离心，再次向滤液中加入三氯乙酸溶液，离心，取滤液；
（5）向滤液中加入乙醇溶液，搅拌后离心，取沉淀物；
（6）将沉淀物真空干燥得螺旋藻多糖提取物。
优选的，所述步骤（2）中加入螺旋藻粉末与氢氧化钠溶液的料液体积比为1:10~1:15g/ml。
优选的，所述步骤（2）中采用的氢氧化钠溶液pH值为9.0~12.0。
优选的，所述步骤（2）中采用微波辅助氢氧化钠溶液进行提取，提取温度为70~90℃，提取功率400~600W，提取时间为1~3min。
优选的，所述步骤（3）中采用的稀盐酸浓度为10%，调节pH值至7.0。
优选的，所述步骤（4）中的滤液与三氯乙酸溶液的料液体积比为1:5~1:10。
优选的，所述步骤（4）中三氯乙酸溶液浓度为4%~6%。
优选的，所述步骤（5）中的滤液与乙醇溶液料液体积比为1:3~1:5。
优选的，所述步骤（5）中乙醇溶液浓度为70%~90%。
优选的，所述步骤（6）中的沉淀物采用真空干燥箱烘干，干燥温度40~60℃，干燥时间为18~32小时。
本发明操作简单易懂，与现有技术相比，本专利所述的一种螺旋藻多糖提取物的制备方法及其应用具有以下有益效果。本发明将传统工艺与现代工艺结合，采用碱性溶液作为提取液，在浸提时辅助微波提取，节约了提取时间，提高了提取率，减少了有机溶剂的使用量，节约了成本；纯化时选用三氯乙酸溶液，既可以沉淀蛋白，也可以去除色素等少量杂质，提高了多糖的纯度和质量。本发明制备的螺旋藻多糖提取物对肿瘤细胞的增殖具有较强的抑制作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明所作出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。
实施例一
准确称取干燥粉碎的螺旋藻粉末20g，按照料液体积比1:10g/ml加入pH值为9.0的氢氧化钠溶液，升温至70℃搅拌，微波辅助提取，提取功率400W，提取1min后离心，滤液用10%稀盐酸调节pH值至7.0；按照料液体积比1:5向滤液中加入浓度为4%的三氯乙酸溶液，搅拌1小时，离心，再向滤液中按照料液体积比1:5加入浓度为4%三氯乙酸溶液，搅拌1小时，离心，取滤液；按照体积比1:3向滤液中加入70%乙醇溶液，搅拌3小时，离心，将沉淀物置于40℃真空干燥箱中烘干，烘干18小时得多糖提取物，产品提取率为1.33%，纯度为89.3%。
实施例二
准确称取干燥粉碎的螺旋藻粉末20g，按照料液体积比1:15g/ml加入pH值为12.0的氢氧化钠溶液，升温至90℃搅拌，微波辅助提取，提取功率600W，提取1min后离心，滤液用10%稀盐酸调节pH值至7.0；向滤液中按照料液体积比1:10加入浓度为6%的三氯乙酸溶液，搅拌1小时，离心，再向滤液中按照料液体积比1:10加入浓度为6%三氯乙酸溶液，搅拌1小时，离心，取滤液；滤液中加入体积比为1:5的浓度为90%的乙醇溶液，搅拌3小时，离心，将沉淀物置于60℃真空干燥箱中烘干，烘干32小时得多糖提取物，产品提取率为1.41%，纯度为90.1%。
实施例三
准确称取干燥粉碎的螺旋藻粉末20g，按照料液体积比1:15g/ml加入pH值为10.0的氢氧化钠溶液，升温至80℃搅拌，微波辅助提取，提取功率500W，提取2min后离心，滤液用10%稀盐酸调节pH值至7.0；向滤液中按照料液体积比1:10加入浓度为5%的三氯乙酸溶液，搅拌1小时，离心，再向滤液中按照料液体积比1:10加入浓度为5%三氯乙酸溶液，搅拌1小时，离心，取滤液；滤液中加入体积比为1:4的浓度为70%的乙醇溶液，搅拌3小时，离心，将沉淀物置于50℃真空干燥箱中烘干，烘干24小时得多糖提取物，产品提取率为1.65%，纯度为91.6%。
实施例四
准确称取干燥粉碎的螺旋藻粉末20g，按照料液体积比1:10g/ml加入pH值为12.0的氢氧化钠溶液，升温至80℃搅拌，微波辅助提取，提取功率400W，提取3min后离心，滤液用10%稀盐酸调节pH值至7.0；向滤液中按照料液体积比1:10加入浓度为5%的三氯乙酸溶液，搅拌1小时，离心，再向滤液中按照料液体积比1:10加入浓度为5%三氯乙酸溶液，搅拌1小时，离心，取滤液；滤液中加入体积比为1:4的浓度为70%的乙醇溶液，搅拌3小时，离心，将沉淀物置于60℃真空干燥箱中烘干，烘干18小时得多糖提取物，产品提取率为1.53%，纯度为90.9%。
实施例五
准确称取干燥粉碎的螺旋藻粉末20g，按照料液体积比1:12g/ml加入pH值为10.0的氢氧化钠溶液，升温至80℃搅拌，微波辅助提取，提取功率500W，提取2min后离心，滤液用10%稀盐酸调节pH值至7.0；向滤液中按照料液体积比1:8加入浓度为5%三氯乙酸溶液，搅拌1小时，离心，再向滤液中按照料液体积比1:8加入浓度为5%三氯乙酸溶液，搅拌1小时，离心，取滤液；滤液中加入体积比为1:4的浓度为80%的乙醇溶液，搅拌3小时，离心，将沉淀物置于50℃真空干燥箱中烘干，烘干24小时得多糖提取物，产品提取率为1.73%，纯度为92.7%。
实施例1-5所得提取物的活性测试
培养HeLa细胞，将其分为正常组和螺旋藻多糖提取物组，取对数生长期的HeLa细胞，将细胞混悬液按每孔1× 104个细胞接种于96孔板中，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养24h后换无血清培养基，继续培养24h后，使细胞进入生长静止期。吸弃各孔培养基，正常组加入空白培养基，螺旋藻多糖提取物组加入含多糖提取物的培养基，继续培养，48h后取出 96 孔板，每孔加入CCK-8溶液20μL，继续孵育30min。酶标仪测定450nm处各孔的吸光值（A），计算抑制率，结果见表1。
表1螺旋藻多糖提取物对HeLa细胞增殖的影响（n=6）
由表1可以看出，螺旋藻多糖提取物对HeLa细胞的增殖具有明显的抑制作用。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种螺旋藻多糖提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将螺旋藻于40℃烘干、采用万能粉碎机将其粉碎，过30目筛网，得到螺旋藻粉末；
（2）向螺旋藻粉末中加入氢氧化钠溶液，升温搅拌，微波辅助提取，得到提取液；
（3）将提取液离心，滤液用稀盐酸调节pH值；
（4）向滤液中加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白质，离心，再次向滤液中加入三氯乙酸溶液，离心，取滤液；
（5）向滤液中加入乙醇溶液，搅拌后离心，取沉淀物；
（6）将沉淀物真空干燥得螺旋藻多糖提取物。
2.如权利要求1所述的一种螺旋藻多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中螺旋藻粉末与氢氧化钠溶液的料液体积比为1:10~1:15g/ml。
3.如权利要求1所述的一种螺旋藻多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中采用的氢氧化钠溶液pH值为9.0~12.0。
4.如权利要求1所述的一种螺旋藻多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中采用微波辅助氢氧化钠溶液进行提取，提取温度为70~90℃，提取功率400~600W，提取时间为1~3min。
5.如权利要求1所述的一种螺旋藻多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中采用的稀盐酸浓度为10%，调节pH值至7.0。
6.如权利要求1所述的一种螺旋藻多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中的滤液与三氯乙酸溶液的料液体积比为1:5~1:10。
7.如权利要求1所述的一种螺旋藻多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中三氯乙酸溶液的浓度为4%~6%。
8.如权利要求1所述的一种螺旋藻多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中的滤液与乙醇料液体积比为1:3~1:5。
9.如权利要求1所述的一种螺旋藻多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中乙醇溶液浓度为70%~90%。
10.如权利要求1所述的一种螺旋藻多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中的沉淀物采用真空干燥箱烘干，干燥温度40~60℃，干燥时间为18~32小时。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105707072A (zh) * 2014-12-03 2016-06-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种螺旋藻多糖及其应用

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丁守怡等: ""螺旋藻多糖对人宫颈癌Hela细胞体外生长的影响"", 《青岛大学医学院学报》 *
杨文杰等: ""螺旋藻多糖的水提与微波辅助提取的比较"", 《食品工业科技》 *
钱志刚: ""螺旋藻多糖提取新工艺研究"", 《淮海工学院学报（自然科学版）》 *

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