CN113248631B - 一种螺旋藻多糖及其在制备精华液中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种螺旋藻多糖及其在制备精华液中的应用，属于天然化妆品技术领域，一种螺旋藻多糖，其单糖组成为鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的摩尔比为1:8.74:2.82:5.25。本发明能够促进成纤维细胞的增殖，促进皮肤真皮层胶原蛋白合成，具有抑菌性和抗炎活性的作用的螺旋藻多糖，在蜂海绵骨针作用下，本发明螺旋藻多糖具有较高的渗透率，可应用于制备精华液。

Description

一种螺旋藻多糖及其在制备精华液中的应用
技术领域
本发明属于天然化妆品技术领域，具体涉及一种螺旋藻多糖及其在制备精华液中的应用。
背景技术
螺旋藻（Spirulina, SP）属是属于兰藻的微小藻，藻体呈螺旋状。这种兰藻没有核膜、核仁和线粒体，细胞小器官也不发达，它比同一藻纲中的绿藻小球藻在生物进化上是属于更原始的微生物。螺旋藻中含有丰富的蛋白质、维生素、叶绿素以及胡萝卜素、螺旋藻多糖和亚麻酸等营养物质，硒、锌等人体必需微量元素含量也非常丰富，其具有营养保健、预防疾病及辅助治疗的功效，是天然的保健食品和药源食物，其全面均衡的营养和极高的防病保健价值受到全世界众多科学家和国际组织的广泛关注和高度评价。螺旋藻多糖（Polysaccharides Spirulina platensis, PSI）是从螺旋藻中提取分离出来的水溶性的大分子多糖，是螺旋藻中碳水化合物存在的主要形式，约占干重的14-16%，并且螺旋藻细胞壁的主要构成组分也是多糖，其比纤维素更容易被人体消化及吸收利用，消化率高达80-86%。螺旋藻多糖具有抗福射、抗肿瘤和免疫调节的重要生理活性物质，其具有增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤和降低血糖等功能。因此，螺旋藻多糖是近些年来国内外海洋的研究开发热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够促进成纤维细胞的增殖，促进皮肤真皮层胶原蛋白合成，具有抑菌性和抗炎活性的作用的螺旋藻多糖，在蜂海绵骨针作用下，本发明螺旋藻多糖具有较高的渗透率，可应用于制备精华液。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种螺旋藻多糖，其单糖组成为鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的摩尔比为1:8.74:2.82:5.25。
本发明螺旋藻多糖能够促进成纤维细胞的增殖，促进人皮肤成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的合成，减少MMP-1的合成或者促进其水解，从而进一步抑制Col Ⅰ分解代谢，最终表现为促进皮肤真皮层胶原蛋白合成，延缓皮肤老化；本发明螺旋藻多糖还具有抑菌性和抗炎性；此外在蜂海绵骨针作用下，本发明螺旋藻多糖具有较高的渗透率，从而被皮肤吸收，并进入皮肤的表皮层和真皮层发挥作用。
在一个具体实施例中，螺旋藻多糖的重均分子量为8.39×104Da。
本发明还提供一种制备上述螺旋藻多糖的方法，包括以下步骤：
步骤S1：将螺旋藻加到蒸馏水中进行超声波提取，然后加入果胶酶浸提，固液分离，将获得的溶液浓缩，经乙醇醇沉过夜，固液分离，将获得的沉淀冷冻干燥，得螺旋藻粗多糖；
步骤S2：将步骤S1得螺旋藻粗多糖溶于蒸馏水中，利用Sevage试剂除蛋白后收集水层部分；
步骤S3：将步骤S2得水层部分进行透析，冷冻干燥得螺旋藻多糖组合物；
步骤S4：将步骤S3得螺旋藻多糖组合物溶解后进行上样至阴离子柱，依次用水、0.1M-0.3M氯化钠溶液和0.4M-0.6M氯化钠溶液洗脱，分别获得洗脱液I、洗脱液II和洗脱液III，将洗脱液冷冻干燥，分别获得SPSI、SPSII和SPSIII；
步骤S5：将步骤S4得SPSIII溶解后进行凝胶柱，用0.05M-0.15M氯化钠溶液洗脱，冷冻干燥，即得螺旋藻多糖。
在一个具体实施例中，步骤S1中，超声波提取功率为100-300W，时间为15-45min。
在一个具体实施例中，步骤S1中，果胶酶的加酶量为50-100U/g，浸提温度为40-60℃，时间为1-3h。
在一个具体实施例中，一种制备螺旋藻多糖的方法，包括以下步骤：
步骤S1：按重量份计，将4-8份螺旋藻加到100份蒸馏水中，搅拌均匀，在100-300W下超声波提取15-45min，然后按加酶量为50-100U/g加入果胶酶，在40-60℃下搅拌浸提1-3h，在3000-5000r/min离心5-15min，将获得的溶液在70-80℃下浓缩，经90-100%乙醇醇沉过夜，在3000-5000r/min离心5-15min，将获得的沉淀冷冻干燥，得螺旋藻粗多糖；
步骤S2：按重量份计，将0.5-2.0份步骤S1得螺旋藻粗多糖溶于100份蒸馏水中配成浓度为溶液，将该溶液中加入20-30份Sevage试剂，搅拌1-2h后静置，待溶液分层后，在3000-5000r/min离心5-15min，收集水层部分；
步骤S3：将步骤S2得水层部装入截留分子量为5000D透析袋中，透析48-96h，每12-24h换水1次并不时搅拌，透析完成后，冷冻干燥得螺旋藻多糖组合物；
步骤S4：将步骤S3得螺旋藻多糖组合物配成5-15mg/mL的溶液，上样至DEAE-52Cellulose阴离子柱，上样量为2mL，依次用水、0.1M-0.3M氯化钠溶液和0.4M-0.6M氯化钠溶液洗脱，流速为1-2mL/min，分别获得洗脱液I、洗脱液II和洗脱液III，将洗脱液分别在70-80℃下浓缩，然后再分别装入截留分子量为5000D透析袋中，透析48-96h，每12-24h换水1次并不时搅拌，透析完成后，冷冻干燥，分别获得SPSI、SPSII和SPSIII；
步骤S5：将步骤S4得SPSIII配成3-8mg/mL的溶液，上样至Sephadex G-100凝胶柱，用0.05M-0.15M氯化钠溶液洗脱，流速为0.2-1mL/min，将洗脱液在70-80℃下浓缩，然后再装入截留分子量为5000D透析袋中，透析48-96h，每12-24h换水1次并不时搅拌，透析完成后，冷冻干燥，即得螺旋藻多糖。
本发明还提供上述螺旋藻多糖衍生物，其为螺旋藻多糖的乙酰化衍生物。
本发明螺旋藻多糖的乙酰化衍生物不仅能提高螺旋藻多糖的生物活性，而且还对透明质酸酶的具有抑制作用，从而表现出一定的抗敏性。
在一个具体实施例中，乙酰化衍生物的取代度为0.31。
在一个具体实施例中，乙酰化衍生物的重均分子量为3.25×104Da。
本发明还提供上述螺旋藻多糖衍生物的制备方法，采用乙酸酐法对螺旋藻多糖进行乙酰化修饰。
在一个具体实施例中，螺旋藻多糖的乙酰化衍生物的制备方法，包括：
按重量份计，将0.3-0.8份螺旋藻多糖加入10份蒸馏水中充分溶解，调节pH至9.0-11.0，其间交替加入0.5-2.0份乙酸酐和0.3-0.6M氢氧化钠溶液，保持pH为9.0-11.0，反应1-2h后将反应液用蒸馏水透析48-96h，每12-24h换水1次并不时搅拌，透析完成后，冷冻干燥，即得螺旋藻多糖的乙酰化衍生物。
在一个具体实施例中，螺旋藻多糖衍生物的制备方法，在三氟乙醇存在下采用乙酸酐法对螺旋藻多糖进行乙酰化修饰。上述三氟乙醇的存在能够提高螺旋藻多糖衍生物的取代度和得率，使螺旋藻多糖的乙酰化衍生物表现出较佳的抗敏性。
在一个具体实施例中，螺旋藻多糖的乙酰化衍生物的制备方法，包括：
按重量份计，将0.3-0.8份螺旋藻多糖加入10份蒸馏水中充分溶解，再加入0.1-0.3份三氟乙醇，调节pH至9.0-11.0，其间交替加入0.5-2.0份乙酸酐和0.3-0.6M氢氧化钠溶液，保持pH为9.0-11.0，反应1-2h后将反应液用蒸馏水透析48-96h，每12-24h换水1次并不时搅拌，透析完成后，冷冻干燥，即得螺旋藻多糖的乙酰化衍生物。
本发明还提供上述螺旋藻多糖和/或其衍生物在制备皮肤外用组合物中的应用。
在一个具体实施例中，螺旋藻多糖在制备精华液中的应用。
本发明还提供上述一种精华液，含有上述螺旋藻多糖和/或其衍生物。
优选地，螺旋藻多糖在精华液中的含量为0.01-10wt%。
优选地，螺旋藻多糖衍生物在精华液中的含量为0.01-10wt%。
在一个具体实施例中，精华液还含有选自于以下提取物所组成的组的一种或多种：问荆提取物、金缕梅提取物、车前草提取物、螺旋藻提取物或蜀葵提取物。问荆提提取物极具穿透能力，抗炎镇定，促进修复，清除体内代谢产物，加强结缔组织，消肿镇痛；金缕梅提取物具有保湿、美白和抗菌抗氧化性，促进淋巴血液循环，调节内分泌；车前草提取物能够改善微循环，抗病毒，抗氧化，且含有大量维生素C和花青素，养颜美白；螺旋藻提取物能够一直细菌的生长，促进皮肤细胞的新城代谢；蜀葵提取物具有抗氧化、抗衰老的作用。
本发明具有如下有益效果：本发明螺旋藻多糖能够促进成纤维细胞的增殖，促进人皮肤成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的合成，减少MMP-1的合成或者促进其水解，促进皮肤真皮层胶原蛋白合成，延缓皮肤老化；本发明螺旋藻多糖具有抑菌性，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌、黑曲霉和黄曲霉均有一定的抑制作用；本发明螺旋藻多糖具有抗炎性，对小鼠巨噬细胞呼吸爆发具有较高的抑制率；本发明螺旋藻多糖在蜂海绵骨针作用下具有较高的渗透率，被皮肤吸收，并进入皮肤的表皮层和真皮层发挥作用。因此，本发明的目的在于提供一种能够促进成纤维细胞的增殖，促进皮肤真皮层胶原蛋白合成，具有抑菌性和抗炎活性的作用的螺旋藻多糖，在蜂海绵骨针作用下，本发明螺旋藻多糖具有较高的渗透率，可应用于制备精华液。
附图说明
图1为螺旋藻多糖的高效凝胶渗透色谱图；
图2为混合单糖标准品 PMP 衍生物色谱分离图；
图3为螺旋藻多糖PMP 衍生物色谱分离图；
图4为螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物对成纤维细胞增殖的影响；
图5为螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物的体外渗透率。
具体实施方式
本发明下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种制备螺旋藻多糖的方法，包括以下步骤：
步骤S1：按重量份计，将4-8份螺旋藻加到100份蒸馏水中，搅拌均匀，在200W下超声波提取30min，然后按加酶量为80U/g加入果胶酶，在50℃下搅拌浸提2h，在3500r/min离心12min，将获得的溶液在75℃下浓缩，经90-100%乙醇醇沉过夜，在3000-5000r/min离心5-15min，将获得的沉淀冷冻干燥，得螺旋藻粗多糖；
步骤S2：按重量份计，将1.0份步骤S1得螺旋藻粗多糖溶于100份蒸馏水中配成浓度为溶液，将该溶液中加入25份Sevage试剂，搅拌1h后静置，待溶液分层后，在3500r/min离心12min，收集水层部分；
步骤S3：将步骤S2得水层部装入截留分子量为5000D透析袋中，透析72h，每12h换水1次并不时搅拌，透析完成后，冷冻干燥得螺旋藻多糖组合物；
步骤S4：将步骤S3得螺旋藻多糖组合物配成10mg/mL的溶液，上样至DEAE-52Cellulose阴离子柱，上样量为2mL，依次用水、0.2M氯化钠溶液和0.5M氯化钠溶液洗脱，流速为1、mL/min，分别获得洗脱液I、洗脱液II和洗脱液III，将洗脱液分别在75℃下浓缩，然后再分别装入截留分子量为5000D透析袋中，透析72h，每12h换水1次并不时搅拌，透析完成后，冷冻干燥，分别获得SPSI、SPSII和SPSIII；
步骤S5：将步骤S4得SPSIII配成5mg/mL的溶液，上样至Sephadex G-100凝胶柱，用0.1M氯化钠溶液洗脱为单一峰，流速为0.5mL/min，将洗脱液在75℃下浓缩，然后再装入截留分子量为5000D透析袋中，透析72h，每12h换水1次并不时搅拌，透析完成后，冷冻干燥，即得螺旋藻多糖。
实施例2：
螺旋藻多糖的乙酰化衍生物的制备方法，包括：
按重量份计，将0.5份实施例1得螺旋藻多糖加入10份蒸馏水中充分溶解，调节pH至10.0，其间交替加入1.2份乙酸酐和0.5M氢氧化钠溶液，保持pH为10.0，反应1.5h后将反应液用蒸馏水透析72h，每12h换水1次并不时搅拌，透析完成后，冷冻干燥，即得螺旋藻多糖的乙酰化衍生物。
实施例3：
螺旋藻多糖的乙酰化衍生物的制备方法，包括：
按重量份计，将0.5份实施例1得螺旋藻多糖加入10份蒸馏水中充分溶解，再加入0.16份三氟乙醇，调节pH至10.0，其间交替加入1.2份乙酸酐和0.5M氢氧化钠溶液，保持pH为10.0，反应1.5h后将反应液用蒸馏水透析72h，每12h换水1次并不时搅拌，透析完成后，冷冻干燥，即得螺旋藻多糖的乙酰化衍生物。
实施例4：
螺旋藻多糖在制备精华液中的应用，精华液含有1wt%实施例1螺旋藻多糖。
实施例5：
螺旋藻多糖在制备精华液中的应用，精华液含有1wt%实施例2螺旋藻多糖的乙酰化衍生物。
实施例6：
螺旋藻多糖在制备精华液中的应用，精华液含有1wt%实施例3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物。
实施例7：
螺旋藻多糖在制备精华液中的应用，精华液含有0.8wt%实施例1螺旋藻多糖和0.5wt%实施例2螺旋藻多糖的乙酰化衍生物。
实施例8：
螺旋藻多糖在制备精华液中的应用，精华液含有0.8wt%实施例1螺旋藻多糖和0.5wt%实施例3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物。
试验例1：
1. 螺旋藻多糖的分子量测定
采用HPGPC法测定螺旋藻多糖的分子量
色谱条件如下：流动相为超纯水，柱温为35℃，进样量为20μL；运行时间为30min；流速为1.0mL/min；色谱柱为TSKgelG-4000PWXL凝胶柱，示差折光检测器检测，进样量20μL；色谱柱温箱(HT-330)，手动进样。
精密称取标准右旋糖酐Mw分别为180、2500、4600、7100、10000、21400、41100、84400、133800、2000000的10种标品，配成质量浓度为5mg/mL的标准溶液，经0.22μm的微孔滤膜过滤，取滤液为供试溶液。以保留时间RT为横坐标，标准品分子量对数值logMw为纵坐标，得出标准曲线，y=12.7315-1.10208x，R2=0.9972。
同时将待测螺旋藻多糖样品配置成5mg/mL溶液，经0.22μm滤膜，在相同条件下进样，根据样品出峰数目及峰的形状确定其纯度。
螺旋藻多糖的高效凝胶渗透色谱图见图1，可以看出，螺旋藻多糖的HPGPC色谱图中无明显杂峰，峰型呈单一对称，峰面积为97.02%，说明螺旋藻多糖组分的纯度较高；同时，螺旋藻多糖的出峰时间为7.085min，将其代入标准曲线中，根据曲线方程计算得出螺旋藻多糖的重均分子量为8.39×104Da。
2. 螺旋藻多糖的单糖组成分析
采用高效液相色谱法（HPLC）PMP柱前衍生测定螺旋藻多糖的单糖组成。
色谱条件：液相色谱柱为Agela Venusil XBP-C18（250mm×4.6mm, 5µm）；流动相A相为磷酸二氢钾缓冲液83%（pH=6.7），B相为乙腈17%，流速为1.0mL/min。进样量20μL，柱温为35℃，检测波长：250nm。螺旋藻多糖的水解：水解管中溶解5mg样品，加入3mL浓度为2mol/L的三氟乙酸溶解。120℃加热水解2h。待冷却转入圆底烧瓶，加入甲醇，取出残余的三氟乙酸。
PMP衍生单糖标准品：分别称取甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、鼠李糖对照品0.09、0.09、0.09、0.075、0.075、0.082、0.091g，将各单糖标准品称至同一个10mL离心管中，加5mL超纯水，溶解并混匀，至终浓度为100mM，即得混合对照品溶液。取1mL浓度为100mM的混合标准品，加入9mL超纯水，将混合样品稀释成10mM。置于20mL量瓶中加水溶解，并加至刻度，即得混合对照品溶液。取混合标品200µL至2mLEP管中，与240µL0.5MPMP及0.2mL0.3MNaOH溶液混合，充分振摇，放置恒温金属浴中，70℃、300r/min反应70min。然后冷却至室温，加入200µL0.3MHcl进行中和，加入1mL氯仿萃取，离心，弃去有机层，重复萃取3次，得上层水液，经0.22µm微孔滤膜过滤，备用。
PMP衍生螺旋藻多糖样品：取多糖水解液200µL，重复上述步骤，对比分析样品图。
图2为混合单糖标准品 PMP 衍生物色谱分离图，图3为螺旋藻多糖PMP 衍生物色谱分离图，从图2和图3可以看出，螺旋藻多糖的单糖组成为鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的摩尔比为1:8.74:2.82:5.25
3. 乙酰基取代度的测定
采用羟胺比色法测定乙酰化红枣多糖中的乙酰基含量并计算其乙酰基取代度。
准确配制10%氢氧化钠溶液和4%盐酸羟胺溶液，并按1:1比例混配，配好后立即量取2mL该混合液于具塞试管中。分别吸取一系列不同体积的α-D-五乙酰基葡萄糖标准溶液于试管中，边加边摇匀，并用蒸馏水补足混合液体积为2.5mL，混匀，室温条件下放置30min使反应充分进行。反应完毕后加入3mL酸醇混合液（35mL预冷70%高氯酸缓慢加入500mL容量瓶中，再用冷的无水甲醇定容至刻度）中和过量的碱。放置30min后再加入1.5mL 2%的高氯酸铁/高氯酸溶液，边加边摇直到变色后保持稳定，5min后于510nm处测定吸收值并以此做标准曲线。
测定螺旋藻多糖的乙酰化衍生物样品时，以一定浓度的乙酰化衍生物溶液代替α-D-五乙酰基葡萄糖标准溶液按以上方法进行测定，根据标准曲线计算乙酰基百分含量M并按照下式计算乙酰基取代度DS。
DS=162M/(4300-42M)
4. 螺旋藻多糖的乙酰化衍生物的分子量测定
同螺旋藻多糖的分子量测定。
螺旋藻多糖的乙酰化衍生物的分析见表1，可以看出，实施例3乙酰化衍生物的取代度和得率均高于实施例2，这说明三氟乙醇的存在能够提高螺旋藻多糖衍生物的取代度和得率，使螺旋藻多糖的乙酰化衍生物表现出较佳的抗敏性。
表1 螺旋藻多糖的乙酰化衍生物的分析
Figure 223702DEST_PATH_IMAGE001
试验例2：
螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物的生物活性
1. 螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物的对成纤维细胞增殖的影响
采用MTT 法测定，收集处于对数期成纤维细胞HSF，调整细胞悬液浓度，然后将细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL，细胞密度为104个/孔，边缘孔用无菌PBS填充；在37℃、5% CO2的培养箱中培养12h；分别加入不同浓度待测样品，在37℃孵育、5% CO2的培养箱中培养24h；每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4h；每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，在490nm处测量各孔的吸光值，与空白对照比较，计算细胞增殖率。
螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物对成纤维细胞增殖的影响见图4，图中S1为实施例1螺旋藻多糖，S2为实施例2螺旋藻多糖的乙酰化衍生物，S3为实施例3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物。从图4中可以看出，在20-2000μg/mL范围内，实施例1螺旋藻多糖和实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物均能促进成纤维细胞HSF的增殖，且实施例2-3乙酰化衍生物的增殖效果好于实施例1螺旋藻多糖。
2. 螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物对成纤维细胞中Col Ⅰ 和MMP-1含量的影响
收集处于对数期成纤维细胞HSF，调整细胞悬液浓度，然后将细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL，细胞密度为104个/孔，边缘孔用无菌PBS填充；在37℃、5% CO2的培养箱中培养12h；分别按200μg/mL加入待测样品，培养24h后，3000r/min离心20min，取上清液作待测样本。使用ELISA试剂盒（人Ⅰ型胶原蛋白酶联免疫试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；人基质金属蛋白酶-1酶联免疫试剂盒，购于ExCell公司）测定Col Ⅰ和MMP-1含量，标准品设置5个梯度浓度，在酶标包被板上分别设空白孔、标准孔和待测样品孔，每组设3个平行复孔，加样后经过温育、洗涤、显色及终止后，立即测定450nm波长处的OD值。根据以下公式计算排除试剂空白的影响:OD待测物=OD测定值-OD空白。以标准品的不同浓度作为X轴，对应的OD值为Y轴，绘制标准曲线，将样品孔的OD值代入方程计算得到Col Ⅰ、MMP-1含量。
螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物对成纤维细胞中Col Ⅰ和MMP-1含量的影响见表2，可以看出，实施例1螺旋藻多糖和实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物能够促进成纤维细胞HSF中Col Ⅰ的表达，且实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物的促进作用更明显；实施例1螺旋藻多糖和实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物能够抑制成纤维细胞HSF中MMP-1的表达，且实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物的抑制作用更明显。
表2 螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物对成纤维细胞中Col Ⅰ和MMP-1含量的影响
Figure 555589DEST_PATH_IMAGE002
3. 螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物的抑菌性测定
螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物溶液：分别用0.9%生理盐水配制浓度为20mg/mL的实施例1螺旋藻多糖和实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物溶液，经0.22µm微孔滤膜过滤除菌后，在4℃保存备用。
菌液：将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Monilia albicans）、黑曲霉（Aspergillus nige）、黄曲霉（Aspergillus flavus）菌种接入到已经备好的斜面试管中（15mm×150 mm）活化，220rpm摇床培养，细菌37℃下培养24h，真菌28℃下培养48h，在相应培养基中轻轻移取已活化菌种培养（细菌37℃下培养24h，真菌28℃下培养48h），待培养好之后稀释菌原液，测定其浓度，浓度控制在107-108cfu/mL。
准备好相应的平板培养基，移液枪移取150μL菌液于各对应平板上涂布均匀，再将牛津杯放在指定位置，在相应位置分别放入实施例1螺旋藻多糖溶液、实施例2乙酰化衍生物溶液、实施例3乙酰化衍生物溶液及无菌水各150μL，试验做3次重复。将加完受试液的平板放在对应条件下培养（细菌：37℃培养24h，霉菌：28℃培养48h），到培养时间后，取出平板，观察平板培养基上是否出现抑菌圈，若有抑菌圈（抑菌圈直径>8mm），则测量其抑菌圈直径大小，若没有则用“-”表示，抑菌圈直径越大说明其抑制效果越好。
螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物的抑制效果见表3，可以看出螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌、黑曲霉和黄曲霉均有一定的抑制作用，而实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物的抑菌效果优于实施例1螺旋藻多糖。
表3 螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物的抑制效果
Figure 562859DEST_PATH_IMAGE003
4. 螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物的抗炎性测定
收集处于对数期RAW 264.7 巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为2×108个/L，取 RAW264.7 细胞悬液 0.4mL，加入10μL 200μg/mL的待测样品溶液，空白对照加入等量蒸馏水，依次加入0.1mL luminol Luminol发光液，0.5μL 125μg/L PMA 工作液，连续测定 20min化学发光强度，每隔 1min 自动记录，得到化学发光强度的峰值PV。螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物对 PMA 刺激的 RAW 264.7 细胞的呼吸爆发的抑制率表示如下。
抑制率(%)=(1−样品PV/空白对照PV)×100%
螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物对小鼠巨噬细胞呼吸爆发的抑制作用见表4，可以看出螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物都具有较强的抗炎性，而实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物的抗炎性优于实施例1螺旋藻多糖。
表4 螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物对小鼠巨噬细胞呼吸爆发的抑制作用
Figure 478731DEST_PATH_IMAGE004
5. 螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物抑制透明质酸酶活性测定
采用 Elson-Morgan 改良法测定透明质酸酶活性的抑制率。
配制浓度为1mg/mL的实施例1螺旋藻多糖和实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物样品溶液，待用。取0.1mL浓度为0.25mmol/L的CaCl2溶液，加入0.5mL透明质酸酶溶液（1250U/mL），37℃保温20min；加入0.5mL样品溶液，继续37℃保温20min；加入0.5mL浓度为0.5g/L的透明质酸钠溶液，37℃保温30min，然后常温放置5min；之后加入体积为0.1mL浓度为0.4mol/L的NaOH溶液和0.5mL乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加热15min后立即用冷水冷却5min；加入埃尔利希试剂的体积为1mL，用体积为3mL的无水乙醇进行稀释，混匀，放置20min进行显色，用紫外可见分光光度计测定吸光值。
透明质酸酶抑制率=(1-(AC-AC0)/(A-A0))×100%
其中，AC为对照溶液吸光值（用醋酸缓冲液代替样品溶液），AC0为对照空白溶液吸光值（用醋酸缓冲液代替样品溶液及酶液），A为样品溶液吸光值，A0为样品空白溶液吸光值（用醋酸缓冲液代替酶液）。先在450nm~700nm 范围内扫描A液，以确定最大吸收波长。
螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物对透明质酸酶的抑制率见表5，可以看出，实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物对透明质酸酶活性的抑制率＞85%，而实施例3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物对透明质酸酶活性的抑制率大于实施例2，这说明螺旋藻多糖的乙酰化衍生物对透明质酸酶的具有抑制作用，从而表现出一定的抗敏性；而三氟乙醇的存在能够使获得的乙酰化衍生物表现出更佳的抗敏性。
表5螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物对透明质酸酶的抑制率
Figure 229650DEST_PATH_IMAGE005
6. 螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物的体外透皮实验
实施例1螺旋藻多糖和实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物
将猪皮皮下脂肪剔除并去除表面毛发，清洗后吸干多余水分，选择皮肤角质层屏障功能完好的皮肤，待用。用直径5cm的打孔器敲下猪皮，接收池内加入PBS并把猪皮用夹子固定，赶走接收池内气泡，用波形发生仪100mV、100Hz条件下测定猪皮电导，若电导小于5μA，说明皮肤角质层屏障功能完好。实验分为三组，实施例1螺旋藻多糖+骨针按摩组(S1)、实施例2螺旋藻多糖的乙酰化衍生物+骨针按摩组(S2)、实施例3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物+骨针按摩组(S3)、实施例1螺旋藻多糖对照组(CG1)、实施例2螺旋藻多糖的乙酰化衍生物对照组(CG2)、实施例3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物对照组(CG3)、空白组(CK)，每组设置三个平行样。其中，骨针按摩组：加入100μL含10mg蜂海绵骨针的PBS溶液，用电动按摩器以0.3N和300rpm按摩2min，按摩结束后PBS溶液冲洗猪皮表面3次，给药池内加入150μL 1mg/mL的待测样品溶液；对照组：给药池内加入150μL 1mg/mL的待测样品溶液；空白组：给药池内加入150μL 1×PBS。
将透皮池放入装有37°C流动水的Franz扩散池中，同时在接收池中放入磁力搅拌子，以600rpm的速度转动。透皮16h后取下猪皮，1×PBS溶液冲洗猪皮表面，接收池内各取1mL接收液，直径4.5cm打孔器敲下给药部位皮肤，置于剥离装置下，使用胶带剥离法将剥离胶带黏贴于猪皮表面，以2kg压力按压10s，依次剥离角质层，表皮层，真皮层，剥离后的胶带置于棕色玻璃瓶内，加入4mL甲醇-PBS混合液萃取，放置于28°C摇床中180rpm转速过夜。使用甲醇-PBS溶液与空白接收池液体，分别将1mg/mL的待测样品标准液稀释成浓度梯度10.0μg/mL、5.0μg/mL、1.0μg/mL、0.10μg/mL、0.05μg/mL和0.01μg/mL的溶液，测定荧光值并制作标准曲线。将各皮肤层和接收池中的萃取液于酶标仪（激发波长/发射波长=485/520nm）的条件下测定药物含量，将测定的荧光值代入标准曲线中计算，得到各皮层样本的样品浓度。
螺旋藻多糖及其乙酰化衍生物的体外渗透率见图5，可以看出，在蜂海绵骨针作用下，实施例1螺旋藻多糖和实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物均具有较高的渗透率，且实施例2-3螺旋藻多糖的乙酰化衍生物的渗透率大于实施例1螺旋藻多糖。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.一种螺旋藻多糖，其单糖组成为鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，所述鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的摩尔比为1:8.74:2.82:5.25。
2.根据权利要求1所述的一种螺旋藻多糖，其特征在于：所述螺旋藻多糖的重均分子量为8.39×104Da。
3.一种制备权利要求1或2所述的螺旋藻多糖的方法，包括以下步骤：
步骤S1：将螺旋藻加到蒸馏水中进行超声波提取，然后加入果胶酶浸提，固液分离，将获得的溶液浓缩，经乙醇醇沉过夜，固液分离，将获得的沉淀冷冻干燥，得螺旋藻粗多糖；
步骤S2：将所述步骤S1得螺旋藻粗多糖溶于蒸馏水中，利用Sevage试剂除蛋白后收集水层部分；
步骤S3：将所述步骤S2得水层部分进行透析，冷冻干燥得螺旋藻多糖组合物；
步骤S4：将所述步骤S3得螺旋藻多糖组合物溶解后进行上样至阴离子柱，依次用水、0.1M-0.3M氯化钠溶液和0.4M-0.6M氯化钠溶液洗脱，分别获得洗脱液I、洗脱液II和洗脱液III，将洗脱液冷冻干燥，分别获得SPSI、SPSII和SPSIII；
步骤S5：将所述步骤S4得SPSIII溶解后进行凝胶柱，用0.05M-0.15M氯化钠溶液洗脱，冷冻干燥，即得螺旋藻多糖。
4.根据权利要求3所述的制备螺旋藻多糖的方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述超声波提取功率为100-300W，时间为15-45min；所述果胶酶的加酶量为50-100U/g，浸提温度为40-60℃，时间为1-3h。
5.螺旋藻多糖衍生物，其为权利要求1或2所述螺旋藻多糖的乙酰化衍生物。
6.权利要求5所述的螺旋藻多糖衍生物的制备方法，采用乙酸酐法对螺旋藻多糖进行乙酰化修饰。
7.权利要求1所述的螺旋藻多糖在制备皮肤外用组合物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述螺旋藻多糖在制备精华液中的应用。
9.一种精华液，含有权利要求1所述的螺旋藻多糖。
10.根据权利要求9所述的精华液，其特征在于：所述精华液还含有选自于以下提取物所组成的组的一种或多种：问荆提取物、金缕梅提取物、车前草提取物、螺旋藻提取物或蜀葵提取物。
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