CN111484566A - 一种富硒桑黄多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种富硒桑黄多糖及其制备方法和应用，本发明通过在桑黄培养基中添加无机硒，利用桑黄菌丝体将无机硒有机化，提取得到富硒桑黄多糖。本发明利用微生物进行无机硒的有机转化，得到多糖促进伤口愈合。本发明提供了所述的富硒桑黄多糖在制备促进伤口愈合的药物中的应用，所述药物为液体、膏状体、凝胶、敷料或喷雾，所述伤口为开放性伤口。本发明的制备方法具有制备简单、成本低、提取效率高的优点。本发明制备出的富硒桑黄多糖可用于制备促进伤口愈合的药物，可显著提高伤口愈合速度。

Description

一种富硒桑黄多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种富硒桑黄多糖及其制备方法和应用。
背景技术
桑黄（Phellinus igniarius）是中国的传统中药，素有森林黄金之称。桑黄的主要活性成分有多糖、黄酮、萜类物质等，其中主要有效活性成分是多糖，约占 80%左右。在我国最早用于治疗痢疾、盗汗、脐腹涩痛、脱肛泻血，在日本最早被用为利尿剂。因为桑黄多糖具有良好的抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗衰老、无生物毒性等生理活性功效，成为了国内外学者在真菌研究领域的一个热点。
硒（selenium）是生命活动的必须元素。硒在动物体内的部分为谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等多种抗氧化酶活性中心必须组分，其余则是构成第21中必需氨基酸硒代半胱氨酸（Sec）形成硒蛋白。硒有着抗氧化、抗肿瘤、颉抗重金属、增强机体免疫力的作用。缺乏硒会导致克山病、血溶性贫血、大骨节病等多种病症，同时近几年研究发现，硒的存在可以有效预防心血管疾病、癌症、艾滋病、糖尿病等疾病。在自然界中硒主要分为无机硒和有机硒，相较于无机硒，有机硒有更高的吸收效率、更高的生物活性、更低的生物毒性。硒的有机化主要由两种，一种是人工合成，如硒化亚油酸、硒化脂多糖等，工艺复杂价格昂贵；另一种是生物转化，最早是利用酵母菌进行的。相比于人工合成，生物转化效率高、工艺简单、转化率高。
发明内容
本发明的目的是提供一种富硒桑黄多糖及其制备方法和应用，制备得到的富硒桑黄多糖可用于制备促进伤口愈合的药物，可显著提高伤口愈合速度。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种富硒桑黄多糖的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）将桑黄菌丝体打碎，接种到含有硒离子的液体培养基中培养，培养结束后分离菌丝体，洗涤、冷冻干燥，粉碎得到富硒菌丝体粉末；
（2）将富硒菌丝体粉末放入热水中，浸提，离心取上清液；
（3）向上清液中加入无水乙醇，醇沉过夜，离心，溶解于水中，加入Sevage试剂，震荡后静置分层，收集上层液，重复上述步骤，直至中间层的变性蛋白层消失；将上层液经旋转蒸发后，冷冻干燥，得到富硒桑黄多糖。
进一步的，所述步骤（1）中液体培养基中硒离子由Na2SeO3提供，所述硒离子浓度为2-200mg/L。
进一步的，所述步骤（1）中培养的条件为：在恒温摇床中，转速为100-180rpm，温度为27-36℃，培养时间6-10天。
进一步的，所述步骤（2）中富硒菌丝体粉末和热水的料液比为1：30-1：80，所述料液比中固体料的单位为g，液体的体积单位是mL。
进一步的，所述步骤（3）中上清液和无水乙醇的体积比为1：3~5，醇沉的温度为4~6℃。
本发明还提供了所述制备方法制得的富硒桑黄多糖。
本发明还提供了所述的富硒桑黄多糖在制备用于促进伤口愈合的药物中的应用。
进一步的，所述药物为液体、膏状体、凝胶、敷料或喷雾。
进一步的，所述喷雾包括富硒桑黄多糖和生理盐水，生理盐水中富硒桑黄多糖浓度为100-600μg/mL。
进一步的，所述伤口为开放性伤口。
进一步的，所述步骤（1）中液体培养基还包括马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁七水。
进一步的，所述浸提温度为70-100℃，浸提时间为1~4小时。
本发明还提供了所述的富硒桑黄多糖在制备化妆品中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：本发明采用桑黄菌丝体在含有硒离子的液体培养基中培养，将无机硒转变成有机硒，经过热提法和去蛋白的技术手段，得到富硒桑黄多糖。本发明的制备方法具有制备简单、成本低、提取效率高的优点。本发明制备出的富硒桑黄多糖可用于制备促进伤口愈合的药物，可显著提高伤口愈合速度。
附图说明
图1为各浓度多糖对HaCaT细胞MTT细胞毒性的示意图；
图2为不同时间多糖组和对照组的伤口创面图象；
图3为创伤后时间和伤口愈合率的关系图；
图4为创伤后12天和18天时伤口部位HE染色示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例提供了富硒桑黄多糖的制备方法，具体步骤如下：
（1）用匀浆器打碎桑黄菌丝体，并以每瓶100-1000μL接种量接种到含有不同浓度硒离子的液体PDA培养基（硒离子浓度为2-200mg/L，硒离子由Na2SeO3提供，PDA液体培养基/L：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁七水1g）中，每个梯度接种三瓶，容积为250ml的三角瓶中液体培养基的加入量为50-120ml。于恒温摇床100-180rpm，27-36℃发酵培养6-10天。发酵结束后分离各个浓度梯度的菌丝体，洗涤，冷冻干燥，称重，粉碎菌丝体，得到富硒菌丝体粉末。
（2）采用热水浸提法，将富硒菌丝体粉末放入热水中，料液比（g/mL）为1：30-1：80，浸提温度为70-100℃，浸提时间为1~4小时，重复浸提三次后合并浸提液，离心取上清液。
（3）向上清液中加入三倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉过夜，通过离心、无水乙醇洗涤后，溶解于适量双蒸水中，按2：1的体积比加入Sevage试剂（氯仿：正丁醇=5：1，v/v），充分震荡10分钟，重复震荡5次后静置分层，取上层液，按上述步骤重复加入Sevage试剂进行除蛋白处理，直至中间层的变性蛋白层消失。收集上层液，经旋转蒸发去除有机溶剂后，冷冻干燥获得脱蛋白的富硒桑黄多糖。
实施例2
1、细胞毒性试验：用人表皮永生化细胞株（HaCaT）对富硒桑黄多糖进行细胞毒性实验。每孔4000-6000的细胞，加入梯度浓度富硒桑黄多糖，孵育10-30h，之后加入MTT，2-6h后用DMSO进行显色，490nm处进行光度分析，计算细胞毒性。结果见图1，各浓度多糖对小鼠皮肤细胞无明显毒性。
2、动物实验：使用昆明小鼠进行富硒桑黄多糖促进伤口愈合的动物实验：3-5周龄昆明小鼠适应性饲养1-4周，去背部毛后，酒精消毒，用剪刀剪出直径为8mm圆形伤口，治疗组用富硒桑黄多糖浓度为100-600μg/mL的生理盐水，对照组用生理盐水，每次滴加10-60μL，每天涂抹1-4次。每三天用相机拍照，见图2、图3。三天伤口结痂，并没有出现伤口感染，此时伤口愈合效果接近。在六天后，多糖给药组尚酷面积明显减小，并比对照组早愈合3天，加速了伤口愈合。在12天和18天取伤口区域组织进行HE染色，见图4。HE染色结果显示，多糖组皮肤圆润，真皮层同时间更薄，炎性浸润较少，同时毛囊等皮肤附属器较快完成复原，胶原结构紧密。与皮肤伤口愈合结果相印证。本发明使用桑黄菌丝体将无机硒转化为有机硒，通过减少伤口部位活性氧，减轻炎症反应来促进小鼠伤口愈合。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种富硒桑黄多糖的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
（1）将桑黄菌丝体打碎，接种到含有硒离子的液体培养基中培养，培养结束后分离菌丝体，洗涤、冷冻干燥，粉碎得到富硒菌丝体粉末；
（2）将富硒菌丝体粉末放入热水中，浸提，离心取上清液；
（3）向上清液中加入无水乙醇，醇沉过夜，离心，溶解于水中，加入Sevage试剂，震荡后静置分层，收集上层液，重复上述步骤，直至中间层的变性蛋白层消失；将上层液经旋转蒸发后，冷冻干燥，得到富硒桑黄多糖。
2.根据权利要求1所述的富硒桑黄多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中液体培养基中硒离子由Na2SeO3提供，所述硒离子浓度为2-200mg/L。
3.根据权利要求1所述的富硒桑黄多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中培养的条件为：在恒温摇床中，转速为100-180rpm，温度为27-36℃，培养时间6-10天。
4.根据权利要求1所述的富硒桑黄多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中富硒菌丝体粉末和热水的料液比为1：30-1：80。
5.根据权利要求1所述的富硒桑黄多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中上清液和无水乙醇的体积比为1：3~5，醇沉的温度为4~6℃。
6.权利要求1~5所述的制备方法制得的富硒桑黄多糖。
7.权利要求6所述的富硒桑黄多糖在制备用于促进伤口愈合的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：所述药物为液体、膏状体、凝胶、敷料或喷雾。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述喷雾包括富硒桑黄多糖和生理盐水，生理盐水中富硒桑黄多糖浓度为100-600μg/mL。
10.权利要求6所述的富硒桑黄多糖在制备化妆品中的应用。
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