CN110950972B - 超声波辅助酶法提取的百尾参多糖、其方法及应用 - Google Patents

超声波辅助酶法提取的百尾参多糖、其方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110950972B
CN110950972B CN201911281242.1A CN201911281242A CN110950972B CN 110950972 B CN110950972 B CN 110950972B CN 201911281242 A CN201911281242 A CN 201911281242A CN 110950972 B CN110950972 B CN 110950972B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
ultrasonic
enzyme
centrifuging
temperature
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911281242.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110950972A (zh
Inventor
甘秀海
宋宝安
胡德禹
吴剑
张建
陈吉祥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guizhou University
Original Assignee
Guizhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guizhou University filed Critical Guizhou University
Priority to CN201911281242.1A priority Critical patent/CN110950972B/zh
Publication of CN110950972A publication Critical patent/CN110950972A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110950972B publication Critical patent/CN110950972B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
    • A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/40—Liliopsida [monocotyledons]
    • A01N65/42—Aloeaceae [Aloe family] or Liliaceae [Lily family], e.g. aloe, veratrum, onion, garlic or chives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/896—Liliaceae (Lily family), e.g. daylily, plantain lily, Hyacinth or narcissus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开了一种超声波辅助酶法提取的百尾参多糖、其方法及应用，是按质量份数取1份过60目筛后的百尾参粉末浸泡于15~50份的蒸馏水中并调pH值至3.5~7.0，于30~70℃下保温静置15~30 min；然后加入百尾参干粉质量0.1~10%的酶，于30~70℃下酶解0.5~3 h，得混合物；30~70℃下超声提取10~60 min；80~90℃下灭酶处理5~20 min；室温冷却，于3000~6000 rpm离心10~30 min，取上清液用旋转蒸发仪浓缩至1/2~1/5体积，然后加入4~5倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃下静置2~8h，5000~6000 rpm离心10~20 min，再经无水乙醇洗涤，冷冻干燥得到。本发明对肿瘤细胞具有毒性，对烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒较好的抑制活性，提取率高，提取时间短，节约能源，环保。

Description

超声波辅助酶法提取的百尾参多糖、其方法及应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体来说涉及超声波辅助酶法提取的百尾参多糖，同时还涉及该超声波辅助酶法提取的百尾参多糖的方法，及该超声波辅助酶法提取的百尾参多糖对肿瘤细胞毒性和抗病毒领域的应用。
背景技术
多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键连接形成的天然高分子聚合物，广泛存在于植物、动物及微生物中。它既是细胞的组成物质，又是调节各种生命活动的重要物质。研究发现植物多糖具有多种生理功能，如抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、抗凝血、降血糖、降血脂及调节免疫功能，并且对人体的毒副作用相对较小。多糖在医学领域的研究与应用越来越受到国内外专家学者的青睐，目前应用于临床的有香菇多糖、猪苓多糖、灵芝多糖、云芝多糖、黄芪多糖等。相关文献报道多糖还具有较好的抗植物病毒活性，如香菇多糖及其组合物具有较好的抗烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的活性，且具有诱导作物产生抗病力，抑制病毒侵染的作用，进而增加产量和提高品质的作用。因此，多糖已成为当前医药及农药研究的热点领域之一。
百尾参为百合科万寿竹属植物万寿竹(Disporum cantoniense(Lour.)Merr.)的根及根茎，为多年生草本植物，为苗族习用药材，是咳速停系列药物的主药，其味甘、淡，性平，具有润肺止咳、健脾消积的功效，用于虚损咳喘、痰中带血等症状。有关百尾参的研究主要集中在栽培方面，对其化学成分研究较少，主要含有甾体、酰胺及黄酮等成分；研究报道百尾参及其化学成分具有抗菌、抗氧化、抗炎镇痛及袪痰止咳等药理作用。
目前关于多糖提取工艺的研究极少，目前已公开的中国专利公开号CN104844720A，公开了“一种百尾参多糖的分离提取方法”，该方法是将干燥粉粹后的百尾参先用石油醚脱脂3h，再于高温下提取数次，每次数小时，最后用树脂脱色、Sevag试剂脱蛋白得到百尾参多糖；所得多糖具有较强的袪痰止咳及抗氧化活性。上述方法为百尾参多糖的开发提供了科学依据和实验基础，但是在工艺推广及工业化生产上仍存在以下不足：①传统水提法得率较低，且提取时间较长，能耗大，提取成本较高；②提取及纯化过程中使用大量的有机溶剂，带来了环境污染。
相对于传统水提法，使用酶处理超声辅助可在比较温和的条件下分解植物组织，破粹细胞，加速多糖的溶出，能快速提高得率。中国专利公开号CN101580553B，公开了一种酶法辅助提取蒺藜多糖的方法，该方法使用纤维素酶、木聚糖酶及果胶酶辅助提取蒺藜多糖，可使得率提高18-40.67％，纯度提高15-42％。中国专利公开号CN103319617A，公开了一种利用超声波协同酶法提取紫薯多糖的方法及应用，该方法利用超声波协同淀粉酶辅助提取紫薯多糖，可明显提高多糖的得率。中国专利公开号CN103145863A，公开了一种酶处理提取锁阳多糖的方法及锁阳多糖抗肿瘤制剂的制备，相对于传统方法，该方法可使多糖得率提高10-65％，多糖含量提高5-40％。中国专利公开号CN 104004108A，公开了一种酶解制备锁阳多糖的方法，该方法利用胃蛋白酶辅助提取锁阳多糖，可使多糖的得率提高95-273％。但尚未见到酶处理、超声处理或酶解超声辅助提取百尾参多糖对肿瘤细胞毒性、抗植物病毒活性的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种对肿瘤细胞具有毒性，对烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒具有较好的抑制活性，得率高，提取时间短，节约能源，环保的超声波辅助酶法提取的百尾参多糖。
本发明的另一目的在于提供该超声波辅助酶法提取的百尾参多糖的方法。
本发明的再一目的在于提供该超声波辅助酶法提取的百尾参多糖在肿瘤细胞毒性和抗植物病毒领域的应用。
本发明的一种超声波辅助酶法提取的百尾参多糖，是按质量份数取1份过60目筛后的百尾参粉末浸泡于15～50份的蒸馏水中并调pH值至3.5～7.0，于30～70℃下保温静置15～30min；然后加入百尾参干粉质量0.1～10％的酶，于30～70℃下酶解0.5～3h，得混合物；30～70℃下超声提取10～60min；80～90℃下灭酶处理5～20min；室温冷却，于3000～6000rpm离心10～30min，取上清液用旋转蒸发仪浓缩至1/2～1/5体积，然后加入4～5倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃下静置2～8h，5000～6000rpm离心10～20min，再经无水乙醇洗涤，冷冻干燥得到。
本发明的一种超声波辅助酶法提取百尾参多糖的方法，其包含以下步骤：
(1)将干燥的百尾参粉碎后过60目筛；
(2)按质量份数取1份过筛后的百尾参粉末浸泡于15～50份的蒸馏水中并调pH值至3.5～7.0，于30～70℃下保温静置15～30min；
(3)然后加入百尾参干粉质量0.1～10％的酶，于30～70℃下酶解0.5～3h，得混合物；
(4)将混合物置于超声仪中，30～70℃下超声提取10～60min，其功率为180～400W；
(5)然后置于80～90℃下灭酶处理5～20min，使酶制剂变性失活；
(6)灭酶处理后室温冷却，于3000～6000rpm离心10～30min，除去蛋白和多肽，上清液即百尾参多糖提取液；
(7)用旋转蒸发仪将百尾参多糖提取液浓缩至1/2～1/5体积，然后加入4～5倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃下静置2～8h沉淀多糖，5000～6000rpm离心10～20min，再经无水乙醇洗涤，冷冻干燥得到百尾参粗多糖。
上述的一种超声波辅助酶法提取百尾参多糖的方法，其中：步骤(3)中的酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、半乳糖苷酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和纤维素酶中的一种或两种(组分比例1：10～10：1)的混合物。
本发明的超声波辅助酶法提取的百尾参多糖在制备抑制肿瘤细胞药物和抗植物病毒药物中的应用。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术可知：本发明的方法先利用酶解预处理，之后进行超声波提取，增强多糖的溶出，提取结束后离心，收集上清液，浓缩后加入无水乙醇，静止后离心，再经收集液进行絮凝、洗涤纯化，除去蛋白等高分子杂质。本发明提高了百尾参多糖的得率，所得到的得率为18.9～28.6％，均高于目前文献报道的得率。本发明降低了提取温度，简化了纯化过程，不仅缩短了时间，还节约了能源，避免大量有机溶剂对环境的污染。本发明所得到的百尾参多糖48h对前列腺癌增生细胞(BPH-1)、大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株PC12、黑色素瘤细胞株WM9和人乳腺癌细胞株MCF-7对多种细胞株均表现出明显的毒性，可以作为抗肿瘤药物使用。本发明所得到的百尾参多糖经试验证明对烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒表现出较好的治疗和保护活性，可应用于田间防控植物病毒病。
具体实施方式
实施例1
一种超声波辅助酶法提取百尾参多糖的方法，包括以下步骤：
称取过60目筛的百尾参粉末5g，加入pH值为7.0的蒸馏水150mL于60℃下保温静置20min，再向浸泡后的样品中加入0.5g的α-淀粉酶，并于70℃下酶解3h，将混合物置于超声仪中，在70℃水浴及超声功率400W条件下超声提取60min，再将混合物置于90℃下灭酶处理20min，使酶制剂变性失活，之后冷却至室温，并于3000rpm离心10min，转移上清液，利用旋转蒸发仪将所得提取液浓缩至1/5体积，然后加入5倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃下静置8h沉淀多糖，于6000rpm离心20min，再次经无水乙醇洗涤，离心，经冷冻干燥得到百尾参粗多糖。
经多糖含量用苯酚-硫酸法定量测定，用公式计算得率：
得率(％)＝[测出的多糖重量/样品重量]×100％。
该方法百尾参多糖的得率为28.3％，多糖含量76.1％。
实施例2
一种超声波辅助酶法提取百尾参多糖的方法，包括以下步骤：
称取过60目筛的百尾参粉末5g，加入PH值为7.0的蒸馏水150mL于60℃下保温静置20min，再向浸泡后的样品中加入0.1g的β-淀粉酶，并于60℃下酶解2h，将混合物置于超声仪中，在60℃水浴及超声功率300W条件下超声提取15min，再将混合物置于95℃下灭酶处理10min，使酶制剂变性失活，之后冷却至室温，并于3500rpm离心10min，转移上清液，利用旋转蒸发仪将所得提取液浓缩至1/2体积，然后加入4倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃下静置4h沉淀多糖，于5000rpm离心10min，再次经无水乙醇洗涤，离心，经冷冻干燥得到百尾参粗多糖。
经多糖含量用苯酚-硫酸法定量测定，用公式计算得率，该方法百尾参多糖的得率为23.1％，多糖含量52.9％。
实施例3
一种超声波辅助酶法提取百尾参多糖的方法，包括以下步骤：
称取过60目筛的百尾参粉末5g，加入pH值为3.5的蒸馏水250mL于30℃下保温静置15min，再向浸泡后的样品中加入0.05g的半乳糖苷酶，并于30℃下酶解0.5h，将混合物置于超声仪中，在30℃水浴及超声功率180W条件下超声提取10min，再将混合物置于80℃下灭酶处理5min，使酶制剂变性失活，之后冷却至室温，并于3000rpm离心10min，转移上清液，利用旋转蒸发仪将所得提取液浓缩至1/5体积，然后加入5倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃下静置2h沉淀多糖，于5000rpm离心10min，再次经无水乙醇洗涤，离心，经冷冻干燥得到百尾参粗多糖。
经多糖含量用苯酚-硫酸法定量测定，用公式计算得率，该方法百尾参多糖的得率为18.9％，多糖含量91.7％。
实施例4
一种超声波辅助酶法提取百尾参多糖的方法，包括以下步骤：
称取过60目筛的百尾参粉末5g，加入pH值为7.0的蒸馏水150mL于50℃下保温静置20min，再向浸泡后的样品中加入0.1g的木瓜蛋白酶，并于50℃下酶解2h，将混合物置于超声仪中，在50℃水浴及超声功率300W条件下超声提取15min，再将混合物置于90℃下灭酶处理10min，使酶制剂变性失活，之后冷却至室温，并于3500rpm离心10min，转移上清液，利用旋转蒸发仪将所得提取液浓缩至1/2体积，然后加入4倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃下静置4h沉淀多糖，于5000rpm离心10min，再次经无水乙醇洗涤，离心，经冷冻干燥得到百尾参粗多糖。
经多糖含量用苯酚-硫酸法定量测定，用公式计算得率，该方法百尾参多糖的得率为21.1％，多糖含量72.1％。
实施例5
一种超声波辅助酶法提取百尾参多糖的方法，包括以下步骤：
称取过60目筛的百尾参粉末5g，加入pH值为5.0的蒸馏水150mL于50℃下保温静置20min，再向浸泡后的样品中加入0.25g的半纤维素酶，并于50℃下酶解2h，将混合物置于超声仪中，在50℃水浴及超声功率300W条件下超声提取15min，再将混合物置于90℃下灭酶处理10min，使酶制剂变性失活，之后冷却至室温，并于3500rpm离心10min，转移上清液，利用旋转蒸发仪将所得提取液浓缩至1/2体积，然后加入4倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃下静置4h沉淀多糖，于5000rpm离心10min，再次经无水乙醇洗涤，离心，经冷冻干燥得到百尾参粗多糖。
经多糖含量用苯酚-硫酸法定量测定，用公式计算得率，该方法百尾参多糖的得率为28.1％，多糖含量50.2％。
实施例6
一种超声波辅助酶法提取百尾参多糖的方法，包括以下步骤：
称取过60目筛的百尾参粉末5g，加入PH值为5.0的蒸馏水150mL于50℃下保温静置30min，再向浸泡后的样品中加入0.1g的纤维素酶，并于50℃下酶解2h，将混合物置于超声仪中，在50℃水浴及超声功率300W条件下超声提取15min，再将混合物置于85℃下灭酶处理10min，使酶制剂变性失活，之后冷却至室温，并于3500rpm离心10min，转移上清液，利用旋转蒸发仪将所得提取液浓缩至1/2体积，然后加入4倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃下静置4h沉淀多糖，于5000rpm离心10min，再次经无水乙醇洗涤，离心，经冷冻干燥得到百尾参粗多糖。
经多糖含量用苯酚-硫酸法定量测定，用公式计算得率，该方法百尾参多糖的得率为22.5％，多糖含量49.7％。
实施例7
一种超声波辅助酶法提取百尾参多糖的方法，包括以下步骤：
称取过60目筛的百尾参粉末5g，加入pH值为3.5的蒸馏水75mL于30℃下保温提取15min，将混合物置于超声仪中，在30℃水浴及超声功率180W条件下超声提取10min，再于90℃下加热处理5min，之后冷却至室温，并于3000rpm离心10min，转移上清液，利用旋转蒸发仪将所得提取液浓缩至1/5体积，然后加入4倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃下静置2h沉淀多糖，于5000rpm离心10min，再次经无水乙醇洗涤，离心，经冷冻干燥得到百尾参粗多糖。
经多糖含量用苯酚-硫酸法定量测定，用公式计算得率，该方法百尾参多糖的得率为18.0％，多糖含量28.5％。
试验例1：实施例1-7制得的百尾参粗多糖对肿瘤细胞的毒性试验
采用MTT法评价百尾参多糖对前列腺癌增生细胞(BPH-1)、大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株PC12、黑色素瘤细胞株WM9和人乳腺癌细胞株MCF-7的毒性，具体操作如下：
取对数生长期的肿瘤细胞于96孔板内，每孔100μL，静止培养12h后，以溶剂为阴性对照，5-氟尿嘧啶为阳性对照，向每孔内分别加入100μL不同浓度的多糖样品，每个浓度设3个平行，之后于37℃的CO2培养箱中培养48h,弃上清，再加入20μL5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h，吸去上清，再加入150μLDMSO，避光振荡10min，使之溶解，最后用酶标仪在570nm处测定各处理组中每孔的OD值，根据下式计算样品对肿瘤细胞的抑制率，并计算其IC50值。
抑制率＝(1-A/A0)×100％
式中A为样品组的吸光值；A0为空白组吸光值。
其中，各组三次重复，试验结果见表1
表1百尾参粗多糖对肿瘤细胞的抑制率IC50(μg/mL)
Figure BDA0002316808900000051
Figure BDA0002316808900000061
试验例2：实施例1-7制得的百尾参粗多糖对烟草花叶病毒(TMV)治疗和保护活性试验
采用半叶枯斑法法评价百尾参多糖对TMV治疗和保护活性，具体操作如下：
采用宋宝安方法(Song B A，Zhang H P，Wang H，Yang S，Jin L H，Hu D Y，Pang LL，Xue W.J.Agric.Food.Chem.2005,53,7886-7891.)，选取接种3周以上，TMV系统侵染寄主Nicotiana tabacum.L植株上部叶片，在磷酸缓冲液中匀浆，双层纱布过滤，8000g离心，经2次聚乙二醇处理，再离心，沉淀用磷酸缓冲液悬浮，即得到TMV的精提液体。用紫外分光光度计测定260nm波长的吸光度值，根据公式计算病毒浓度。
病毒浓度(mg/mL)＝(A260×稀释倍数)/E0.1％ 1cm 260nm
其中E表示消光系数，即波长260nm时，浓度为0.1％(1mg/mL)的悬浮液，在光程为1cm时的光吸收值。TMV的E0.1％1cm260nm是5.0。
百尾参粗多糖对TMV侵染的活体治疗试验:选长势一致的5-6叶期的心叶烟打顶，向全叶撒匀金刚砂，用排笔蘸取病毒汁液(6×10-3mg/mL)全叶接种病毒，自然晾干后用清水冲洗。待叶片干后，用毛笔在左半叶轻轻涂施药剂，右半叶涂施对应溶剂的浓度的溶剂作对照，6-7d后记录枯斑数，按公式计算治疗活性抑制率，试验结果见表2。
百尾参粗多糖对TMV侵染的活体保护试验:药剂对TMV侵染的活体保护作用：选长势一致的5-6叶期的心叶烟打顶，用毛笔在左半叶轻轻涂施药剂，右半叶涂施对应溶剂的浓度的溶剂作对照。24h后，向全叶撒匀金刚砂，用排笔蘸取病毒汁液(6×10-3mg/mL)全叶接种病毒，用清水冲洗，6-7d后记录枯斑数，按下列公式计算保护活性抑制率，试验结果见表2。
抑制率(％)＝(未施药枯斑数-施药枯斑数)/未施药枯斑数×100
其中，各组三次重复，试验结果见表2
表2百尾参粗多糖抗TMV活性(％)
Figure BDA0002316808900000062
试验例3：实施例1-7制得的百尾参粗多糖对黄瓜花叶病毒治疗(CMV)和保护活性试验
采用半叶枯斑法法评价百尾参多糖对CMV治疗和保护活性，具体操作如下：
采用周雪平(Zhou X P，Xu Z X，Xu J，Li D B，J.South Chin.Agric.Univ.1995,16,74-79.)方法，选取接种3周以上，CMV系统侵染寄主Nicotiana tabacum.L植株上部叶片，在磷酸缓冲液中匀浆，双层纱布过滤，8000g离心，经2次聚乙二醇处理，再离心，沉淀用磷酸缓冲液悬浮，即得到CMV的精提液体。整个实验在4℃下进行。用紫外分光光度计测定260nm波长的吸光度值，根据公式计算病毒浓度。
病毒浓度(mg/mL)＝(A260×稀释倍数)/E0.1％ 1cm 260nm
其中E表示消光系数，即波长260nm时，浓度为0.1％(1mg/mL)的悬浮液，在光程为1cm时的光吸收值。CMV的E0.1％ 1cm 260nm是5.0。
百尾参粗多糖对CMV侵染的活体治疗作用：选长势一致的5-6叶期的苋色藜打顶，向全叶撒匀金刚砂，用排笔蘸取病毒汁液(6×10-3mg/mL)全叶接种病毒，自然晾干后用清水冲洗。待叶片干后，用毛笔在左半叶轻轻涂施药剂，右半叶涂施对应溶剂的浓度的溶剂作对照，3-4d后记录枯斑数，按下列公式计算治疗活性抑制率，结果见表3。
百尾参粗多糖对CMV侵染的活体保护试验:选长势一致的5-6叶期的苋色藜打顶，用毛笔在左半叶轻轻涂施药剂，右半叶涂施对应溶剂的浓度的溶剂作对照。24h后，向全叶撒匀金刚砂，用排笔蘸取病毒汁液(6×10-3mg/mL)全叶接种病毒，用清水冲洗，3-4d后记录枯斑数，按下列公式计算保护活性抑制率，结果见表3。
抑制率(％)＝(未施药枯斑数-施药枯斑数)/未施药枯斑数×100
其中，各组三次重复，试验结果见表3
表3百尾参粗多糖抗CMV活性(％)
Figure BDA0002316808900000071
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种超声波辅助酶法提取的百尾参多糖，按质量份数取1份过60目筛后的百尾参粉末浸泡于15~50份的蒸馏水中并调pH值至3.5~7.0，于30~70℃下保温静置15~30 min；然后加入百尾参干粉质量0.1~10%的酶，于30~70℃下酶解0.5~3 h，得混合物； 30~70℃下超声提取10~60 min； 80~90 ℃下灭酶处理5~20 min；室温冷却，于3000~6000 rpm离心10~30min，取上清液用旋转蒸发仪浓缩至1/2~1/5体积，然后加入4~5倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃下静置2~8h，5000~6000 rpm离心10~20 min，再经无水乙醇洗涤，冷冻干燥得到；
其中所述的酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、半乳糖苷酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和纤维素酶中的一种或两种组分比例1：10~10：1的混合物。
2.一种超声波辅助酶法提取百尾参多糖的方法，其包含以下步骤：
（1）将干燥的百尾参粉碎后过60目筛；
（2）按质量份数取1份过筛后的百尾参粉末浸泡于15~50份的蒸馏水中并调pH值至3.5~7.0，于30~70℃下保温静置15~30 min；
（3）然后加入百尾参干粉质量0.1~10%的酶，于30~70℃下酶解0.5~3 h，得混合物；
（4）将混合物置于超声仪中，30~70℃下超声提取10~60 min，其功率为180~400 W；
（5）然后置于80~90 ℃下灭酶处理5~20 min，使酶制剂变性失活；
（6）灭酶处理后室温冷却，于3000~6000 rpm离心10~30 min，除去蛋白和多肽，上清液即百尾参多糖提取液；
（7）用旋转蒸发仪将百尾参多糖提取液浓缩至1/2~1/5体积，然后加入4~5倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃下静置2~8h沉淀多糖，5000~6000 rpm离心10~20 min，再经无水乙醇洗涤，冷冻干燥得到百尾参粗多糖;
其中：步骤（3）中的酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、半乳糖苷酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和纤维素酶中的一种或两种组分比例1：10~10：1的混合物。
3.如权利要求1所述的一种超声波辅助酶法提取的百尾参多糖或如权利要求2所述的一种超声波辅助酶法提取百尾参多糖的方法制备的百尾参多糖在制备抑制肿瘤细胞药物和抗植物病毒药物中的应用；其中所述的肿瘤细胞为前列腺癌增生细胞、肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞、黑色素瘤细胞和人乳腺癌细胞，所述的植物病毒为烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒。
CN201911281242.1A 2019-12-13 2019-12-13 超声波辅助酶法提取的百尾参多糖、其方法及应用 Active CN110950972B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911281242.1A CN110950972B (zh) 2019-12-13 2019-12-13 超声波辅助酶法提取的百尾参多糖、其方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911281242.1A CN110950972B (zh) 2019-12-13 2019-12-13 超声波辅助酶法提取的百尾参多糖、其方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110950972A CN110950972A (zh) 2020-04-03
CN110950972B true CN110950972B (zh) 2021-07-09

Family

ID=69981405

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911281242.1A Active CN110950972B (zh) 2019-12-13 2019-12-13 超声波辅助酶法提取的百尾参多糖、其方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110950972B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115572332B (zh) * 2022-08-31 2023-08-08 安徽中烟工业有限责任公司 一种烟叶活性多糖及其提取方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104844720A (zh) * 2015-06-19 2015-08-19 贵州师范学院 一种百尾参多糖的分离提取方法
KR101693632B1 (ko) * 2016-03-08 2017-01-06 나천수 윤판나물 추출물을 유효성분으로 하는 발모 또는 양모 촉진용 조성물
CN108904521A (zh) * 2018-09-04 2018-11-30 贵州师范学院 一种含百尾参多糖的抗肿瘤药物及其使用方法
CN109223819A (zh) * 2018-09-04 2019-01-18 贵州师范学院 百尾参多糖在用于免疫调节和抗肿瘤药物中的用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120064218A (ko) * 2010-12-09 2012-06-19 경희대학교 산학협력단 항염활성을 나타내는 윤판나물 추출물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104844720A (zh) * 2015-06-19 2015-08-19 贵州师范学院 一种百尾参多糖的分离提取方法
KR101693632B1 (ko) * 2016-03-08 2017-01-06 나천수 윤판나물 추출물을 유효성분으로 하는 발모 또는 양모 촉진용 조성물
CN108904521A (zh) * 2018-09-04 2018-11-30 贵州师范学院 一种含百尾参多糖的抗肿瘤药物及其使用方法
CN109223819A (zh) * 2018-09-04 2019-01-18 贵州师范学院 百尾参多糖在用于免疫调节和抗肿瘤药物中的用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"百尾参多糖的提取工艺及抗氧化性评价";曹剑锋等;《江苏农业科学》;20160913;第44卷(第08期);第343-346页 *
"百尾参多糖脱色脱蛋白工艺及其免疫活性研究";龙婷婷等;《生物资源》;20191030;第41卷(第5期);第458-465页 *
"百尾参抗炎有效组分的筛选及机制研究";董永喜等;《中国医刊》;20161101;第51卷(第11期);第99-101页 *
"红托竹荪百尾参复合多糖功能饮料的研制";蔡春城等;《贵州师范学院学报》;20190928;第35卷(第9期);第26-30页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110950972A (zh) 2020-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
He et al. Research progress on extraction, purification, structure and biological activity of Dendrobium officinale polysaccharides
CN112754956A (zh) 一种仙人掌多糖抗炎保湿面膜的配方及其制备方法
CN108042436B (zh) 蓝铜胜肽抗衰保湿精华霜
CN113150179A (zh) 一种金耳多糖提取制备工艺
CN103638089A (zh) 一种利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法
Ye et al. The structural characteristics, antioxidant and hepatoprotection activities of polysaccharides from Chimonanthus nitens Oliv. leaves
CN107412056B (zh) 一种含有圣罗勒提取物的洗涤用品及其制备
CN110950972B (zh) 超声波辅助酶法提取的百尾参多糖、其方法及应用
CN113893310A (zh) 一种高山植物发酵组合物及其制备方法和应用
WO2021082889A1 (zh) 一种含抗炎活性成分的组合物的环保制备方法和应用
CN110960629B (zh) 一种白及胶低损耗干燥方法
CN110959856A (zh) 一种低糖的龟苓膏及其制备方法
CN114250258A (zh) 一种特定结构褐藻寡糖的制备方法及其在诱导水稻抗病方面的应用
CN106190690A (zh) 一种覆盆子果酒
CN113621085A (zh) 一种蒲公英根多糖硫酸化修饰产物的制备方法及蒲公英根多糖硫酸化修饰产物的应用
CN112586735A (zh) 一种具活血美颜功效的三七复合酵素及其制备方法
Tsykalo et al. Investigation of the carbohydrates of Camelina sativa (L.) Crantz and Camelina microcarpa Andrz
CN107802715A (zh) 具有α‑葡萄糖苷酶抑制作用的荸荠提取物及其制备方法和应用
CN109168403A (zh) 一种提高小麦籽粒品质的种子处理方法
CN112891385B (zh) 一种熟三七及其制备方法
CN114425074B (zh) 一种抗病毒及增强免疫力的天然复合口服液及制备方法
CN116459306B (zh) 中药提取液、制备方法及其在口服液中的应用
CN115418321B (zh) 一种高产金丝桃苷的桑黄菌丝体液体发酵方法
CN116832073B (zh) 一种三七花提取物的制备方法
CN116333844B (zh) 一种三七花叶人参功能性配制酒/露酒的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant