CN109223819A - 百尾参多糖在用于免疫调节和抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种百尾参多糖在用于免疫调节和抗肿瘤药物中的用途，特别是提高机体的非特异性免疫方面的用途；百尾参多糖作为增效剂在抗肿瘤药物制备中的用途，该抗肿瘤药物包含有百尾参多糖增效剂、抗肿瘤活性成分以及药学上可接受的辅料。

Description

百尾参多糖在用于免疫调节和抗肿瘤药物中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及百尾参多糖在用于免疫调节和抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

百尾参(Disporμrn Cantoniense(Loμt.)Merr)为百合科(Liliaceae) 万寿竹属(Disporμm)植物万寿竹，药用部位为根及根茎，为苗族习用药材。其味甘、淡、性平、具备润肺止咳、健脾消积的功效，可用于治疗虚损咳喘、痰中带血、肠风下血、食积胀满等症状，是贵州百灵制药厂(安顺)“咳速停糖浆”中的主要药用植物。现代药理学研究表明，百尾参具有抗炎、镇痛、抑菌和止咳祛痰等药理活性，药用价值高。关于百尾参活性成分分离、药理活性等方面的研究有较多报道，其化学成分主要为多糖、黄酮类化合物、甾体类化合物以及脂肪酸类化合物和含氮类化合物等。

中国专利公开号CN 104844720 A，于2015年8月19日公开了一种百尾参多糖的分离提取方法，包括：(1)脱脂：将百尾参粉末与石油醚按料液比1:50在索氏提取器中，于50℃下回流脱脂3小时，得去脂百尾参粉末；(2)提取：向去脂后的百尾参粉末中添加蒸馏水，料液比为 1:20-80，于70-100℃下，提取1-4次，每次1-4小时，提取结束合并水提液；(3)分离：水提液用布氏漏斗抽滤，滤液与95％乙醇按1:3.5-4的比例醇沉，静置6-8h；3000-4000r/min离心15-20min，去掉上清液，沉淀用蒸馏水定容到500ml；(4)AB-8树脂脱色纯化、浓缩至原体积的1/3，得粗多糖液；(5)脱蛋白:粗多糖液按质量比3:1的比例加入氯仿和正丁醇的混合液，混合液中氯仿与正丁醇体积比为5:1，振摇后取上层清液，加入3-5倍体积的质量浓度为95％的乙醇，于4℃下静置24小时，然后通过3000-4000r/min离心15-20min得脱蛋白百尾参多糖；(6)洗涤，冷冻干燥即得。发明人曹剑锋等优化了其多糖的提取工艺，确定其多糖的提取率是15.68％；且证实了百尾参多糖具有显著体外抗氧化活性及止咳平喘作用。任朝辉等研究表明，百尾参水提取物具有镇咳平喘作用效果[安徽农业科学,2015]。关于百尾参多糖免疫调节及抗肿瘤作用未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供百尾参多糖在用于免疫调节和抗肿瘤药物中的用途。

本发明百尾参多糖在用于免疫调节和抗肿瘤药物中的用途。

上述的百尾参多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)脱脂：将百尾参粉末与石油醚按料液比1:50在索氏提取器中，于50℃下回流脱脂3小时，得去脂百尾参粉末；

(2)提取：向去脂后的百尾参粉末中添加蒸馏水，料液比为1:20-80，于70-100℃下，提取1-4次，每次1-4小时，提取结束合并水提液；

(3)分离：水提液用布氏漏斗抽滤，滤液与95％乙醇按1:3.5-4的比例醇沉，静置6-8h；3000-4000r/min离心15-20min，去掉上清液，沉淀用蒸馏水定容到500ml；

(4)AB-8树脂脱色纯化、浓缩至原体积的1/3，得粗多糖液；

(5)脱蛋白:粗多糖液按质量比3:1的比例加入氯仿和正丁醇的混合液，混合液中氯仿与正丁醇体积比为5:1，振摇后取上层清液，加入 3-5倍体积的质量浓度为95％的乙醇，于4℃下静置24小时，然后通过 3000-4000r/min离心15-20min得脱蛋白百尾参多糖；

(6)洗涤，冷冻干燥即得精制多糖；

(7)将此精制百尾参多糖进一步通过葡聚糖凝胶G-150凝胶柱分离，得到均一百尾参多糖。

上述的百尾参多糖在提高机体的非特异性免疫方面的用途。

上述的百尾参多糖作为增效剂在抗肿瘤药物制备中的用途。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：在辅助抗肿瘤方面，荷瘤动物辅助抗肿瘤功能活性评价结果显示，百尾参精制多糖联合5-氟尿嘧啶治疗组在整个试验周期内均展现出显著的抑制恶性肿瘤生长的功能，联合治疗组的疗效显著强于单独5-氟尿嘧啶化疗组，且能特异性逆转肿瘤生长及5-氟尿嘧啶单独化疗导致的免疫系统的异常，使其接近正常值。

百尾参多糖与化疗药联用具有抑制肿瘤增殖活性的作用，百尾参多糖对化疗药具有增效作用，且百尾参多糖体外细胞试验中工作浓度未见毒性，具有安全无毒的特征，可开发为用于抗肿瘤化疗药增效剂的抗肿瘤药物或预防保健品，具有临床应用前景。

因此，在有效剂量下的百尾参多糖单独使用，或与其他活性组分联合使用，试验证明，可以显著提高单核巨噬细胞株的吞噬能力，提高机体的非特异性免疫。百尾参多糖可应用于肿瘤预防及治疗药品的开发，也可应用于相关领域食品和保健品的开发等领域。

附图说明

图1为不同时间各组荷瘤小鼠体重变化。

具体实施方式

一种百尾参多糖的制备方法(即中国专利公开号CN 104844720 A方法)，包括以下步骤：

(1)脱脂：将百尾参粉末与石油醚按料液比1:50在索氏提取器中，于50℃下回流脱脂3小时，得去脂百尾参粉末；

(2)提取：向去脂后的百尾参粉末中添加蒸馏水，料液比为1:20-80，于70-100℃下，提取1-4次，每次1-4小时，提取结束合并水提液；

(3)分离：水提液用布氏漏斗抽滤，滤液与95％乙醇按1:3.5-4的比例醇沉，静置6-8h；3000-4000r/min离心15-20min，去掉上清液，沉淀用蒸馏水定容到500ml；

(4)AB-8树脂脱色纯化、浓缩至原体积的1/3，得粗百尾参多糖液；

(5)脱蛋白:粗百尾参多糖液按质量比3:1的比例加入氯仿和正丁醇的混合液，混合液中氯仿与正丁醇体积比为5:1，振摇后取上层清液，加入3-5倍体积的质量浓度为95％的乙醇，于4℃下静置24小时，然后通过3000-4000r/min离心15-20min得脱蛋白百尾参百尾参多糖；

(6)洗涤，冷冻干燥即得；

(7)将此百尾参多糖进一步通过葡聚糖凝胶G-150凝胶柱分离，得到均一百尾参多糖。

试验例1：百尾参多糖增强巨噬细胞株细胞吞噬中性红的能力

试验方法：腹腔巨噬细胞的制备，取2只清洁健康的小鼠，往它们的腹腔内注射6％无菌淀粉肉汤溶液0.5ml，三天后往腹腔里注射入4-5ml 预冷的PBS溶液，并反复轻揉小鼠腹部1-2min，颈椎脱臼处死小鼠，小心地拉起腹膜，用注射器芯吸出腹部渗出液，重复2-3次后合并渗出液， 1000g离心10min。收集巨噬细胞置于37℃,5％CO2条件下的CO₂培养箱中培养2小时，取出，去除非粘附性细胞，细胞计数，用RPMI1640完全培养液制成1×106/ml的细胞悬液。

取干净无菌的96孔细胞培养板在无菌超净台中，每空中加入巨噬细胞悬浮液100μl。设置空白对照组、转移因子组和试验组，空白对照组每孔里面加入100μl的PBS溶液，试验组每孔里面加入100μl的不同浓度百尾参多糖溶液(3.9、7.82、15.63、31.25、62.5、125μg/ml，每浓度设3个复孔)；转移因子组(最终浓度62.5μg/ml，设3个复孔)。然后放到37℃、5％CO₂的CO₂培养箱中培养2天后，去掉上清液，往每孔加入1％中性红生理盐水溶液100μl，置于CO₂培养箱中继续培养25min后，去掉上清液，然后用PBS溶液洗涤三遍，再往每孔中加入细胞溶解液200μl，放置室温下2-3小时后，在酶标仪490nm处测量每孔的OD值。测定百尾参多糖对巨噬细胞吞噬中性红活性的影响。

表1百尾参多糖对巨噬细胞吞噬中性红的能力影响

与空白组比较^*P<0.05,^**P<0.01，

试验结论:由表1可以看出，百尾参多糖在1-125μg/ml范围内都具有一定的增强巨噬细胞吞噬中性红的能力，且呈现一定的剂量依耐性，在给药剂量为125μg/ml时效果最佳，与空白组相比具有显著性差异。说明百尾参多糖可以显著提高单核巨噬细胞株的吞噬能力，从而提高机体的非特异性免疫。

试验例2：百尾参多糖增进小鼠脾淋巴细胞的增殖

试验方法：小鼠脾淋巴细胞的制备挑选2只健康清洁级昆明种雄性小鼠，颈椎脱臼处死，无菌取脾，取出脾脏后要去除结缔组织。倒少量的红细胞裂解液入无菌培养皿中，在红细胞裂解液中用注射器芯压迫脾脏细胞通过200目尼龙网制成单个脾细胞悬浮液。200g离心6分钟除去红细胞，再用无菌PBS溶液洗涤三次，细胞计数。用RPMI1640完全培养液制成1×106/ml的细胞悬液。MTT法测定脾细胞增殖取干净无菌的 96孔细胞培养板在无菌超净台中，往每孔中加入100μl的脾细胞悬浮液。设置空白对照组、转移因子组和试验组，空白对照组每孔里面加入100μl 的PBS溶液，试验组每孔里面加入100μl的不同浓度百尾参多糖溶液 (3.9、7.82、15.63、31.25、62.5、125μg/ml，每浓度设3个复孔)；转移因子组(最终浓度62.5μg/ml，设3个复孔)。然后放到CO₂培养箱中培养3天，培养箱条件设置为37℃、5％CO₂。在细胞培养结束前的4小时，再往每孔中加入10μl的MTT溶液继续培养到试验结束。取出后将上清液轻轻地倒掉，最后在每孔中加入二甲基亚砜150μl溶解甲瓒，在酶标仪 570nm处测量每孔的OD值。

表2百尾参多糖对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用

与空白组比较^*P<0.05,^**P<0.01，

试验例3：百尾参多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫增强作用

试验方法：挑选健康清洁级昆明种雄性小鼠(20±2g)60只，随机分为6组，阴性对照组(灌胃等体积的生理盐水)、环磷酰胺组 (100mg·kg-1)、香菇多糖对照组(20mg·kg-1)百尾参多糖大剂量组 (300mg·kg-1)、中剂量组(150mg·kg-1)、小剂量组(75mg·kg-1)各组连续灌药15天，每天一次。除正常对照组注射等量无菌蒸馏水外，其余小组每只小鼠腹腔内注射环磷酰胺(100mg·kg-1)，连续3天。最后一次灌胃的时候，小鼠禁食不禁水12小时，称重，并在摘眼球取血，收集血清。采用ELISA法测定小鼠血清中IL-2及TNF-α的含量。眼球取血后小鼠颈椎脱臼处死，第解剖小鼠,仔细剥离胸腺、脾脏、肾脏及肝脏后称重，测定脏器指数。

表3百尾参多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠体重及脏器指数的影响

与模型组比较^*P<0.05,^**P<0.01，

表4百尾参多糖对小鼠血清中细胞因子IL-2和TNF-α的影响

与模型组比较^*P<0.05,^**P<0.01，

试验结论：由表可以看出,模型组小鼠脾脏指数、胸腺指数与空白组相比具有极显著性差异,表明模型成功,而百尾参多糖给药组均能提高小鼠的脾脏指数和胸腺指数,且呈现一定的剂量依耐性,其中高剂量组效果最佳，与模型组相比具有显著性差异。结果表明，百尾参多糖可以提高小鼠的免疫力，具有开发为免疫保健品或者药品的潜力。

试验例4：百尾参多糖对s180-荷瘤小鼠抑瘤作用

本试验室通过建立小鼠s180-荷瘤模型，百尾参多糖(EPS)治疗及联合5-氟尿嘧啶(5-Fμ)治疗s180-荷瘤小鼠，研究EPS对s180-荷瘤的治疗作用以及多糖对化疗药物的辅助作用。

试验方法：培养小鼠s180肉瘤细胞株，取对数期细胞，PBS稀释至 5×10⁶个/mL。挑选健康清洁级昆明种雄性小鼠(20±2g)无菌条件下，取0.2ml的s180细胞接种于小鼠右前肢皮下，待接种处长出80-90mm³大小的肿瘤，荷瘤小鼠随机分为6组，分别为百尾参多糖高剂量组(600 mg/kg)，中剂量(300mg/kg)，低剂量组(150mg/kg)，5-Fμ(25mg/kg, 腹腔注射)，百尾参多糖(300mg/kg)+5-Fμ(25mg/kg，腹腔注射)联合用药组，荷瘤模型组(灌胃0.3ml生理盐水)。除模型组灌胃生理盐水, 其他多糖组灌胃对应剂量多糖,联合治疗组灌胃对应多糖的同时腹腔注射对应剂量5-Fu,每天一次，连续灌胃14d。治疗期间观察小鼠的精神、行动、毛色、进食量等状况，每天测量小鼠体重变化。末次给药后禁食 24h，最后一次称重后处死小鼠，剥去肿瘤组织，称重计算抑瘤率。

试验结果表明：肿瘤模型建立后，随着给药治疗的进行，组间出现不同程度的差异。模型组小鼠活动迟缓，精神低糜。多糖组小鼠毛色均匀有光泽，小鼠活动正常无异样，说明百尾参多糖对小鼠无不良影响。 5-Fμ组小鼠有些消瘦，但活动和摄食量较模型组比较灵活。联合给药组小鼠，体质较好，瘤体积也较小，活动较灵活。

由不同时间各组荷瘤小鼠体重变化的图1可知，小鼠接种移植瘤后小鼠体重均有不同程度的增加，但是第8-14天模型组小鼠体重比多糖组增长速率快。可能是s180肉瘤细胞在体内大量快速增殖所致。多糖各组与5-Fμ组相比，多糖各组体重增重略大于5-Fμ组，但差异不是很明显，联合用药组体重增长速度明显较其它用药组慢。灌胃后各组小鼠体重呈上升趋势。

表5 EPS及联合5-Fμ化疗对s180-荷瘤小鼠的治疗(n＝6,)

注：与模型组比较^*P<0.05,^**P<0.01，与阳性对照组比较^#P<0.05,^##P<0.01。

由表5表明，百尾参多糖各剂量组对小鼠s180肉瘤均有明显的抑制肿瘤生长的作用。除了低糖组抑瘤率小于30％之外其他几组均大于30％，高糖组的抑瘤率达到50.30％。联合用药组的抑瘤率为57.20％。百尾参多糖各组、5-Fu组与模型组相比较，瘤块重量都有一定程度的减轻。从试验结果来看，如表6所示单独使用5-Fμ组的抑瘤率较高，且对脾脏和胸腺有强的抑制作用，百尾参多糖与5-Fμ联合用药后，明显抑制了5-Fμ对免疫器官的抑制副作用，明显改善了5-Fμ对免疫器官的生长抑制作用。因此，百尾参多糖具有较强的抑制s180-荷瘤肿瘤生长的作用，并且可辅助化疗药物更有效的抑制肿瘤的生长。

表6百尾参多糖荷瘤小鼠免疫器官的影响(n＝6,)

注：与模型组比较^*P<0.05,^**P<0.01,与5-Fμ组比较^#P<0.05,^##P<0.01。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种百尾参多糖在提高机体的非特异性免疫方面的用途。

2.一种百尾参多糖作为增效剂在抗肿瘤药物制备中的用途。

3.如权利要求1或2所述的百尾参多糖的制备方法，包括以下步骤：

（1）脱脂：将百尾参粉末与石油醚按料液比1:50在索氏提取器中，于50℃下回流脱脂3小时，得去脂百尾参粉末；

（2）提取：向去脂后的百尾参粉末中添加蒸馏水，料液比为1:20-80，于70-100℃下，提取1-4次，每次1-4小时，提取结束合并水提取液；

（3）分离：水提液用布氏漏斗抽滤，滤液与95%乙醇按1:3.5-4的比例醇沉，静置6-8h；3000-4000r/min离心15-20min，去掉上清液，沉淀用蒸馏水定容到500ml；

（4）AB-8树脂脱色纯化、浓缩至原体积的1/3，得粗多糖液；

（5）脱蛋白:粗多糖液按质量比3:1的比例加入氯仿和正丁醇的混合液，混合液中氯仿与正丁醇体积比为5:1，振摇后取上层清液，加入3-5倍体积的质量浓度为95％的乙醇，于4℃下静置24小时，然后通过3000-4000r/min离心15-20min得脱蛋白百尾参多糖；

（6）洗涤，冷冻干燥即得精制多糖；

（7）将此精制百尾参多糖进一步通过葡聚糖凝胶G-150凝胶柱分离，得到均一百尾参多糖。