CN115569106A - 螺旋藻h11株系水提取物及其制备方法、应用和护肤品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了螺旋藻H11株系水提取物及其制备方法、应用和护肤品，涉及螺旋藻应用技术领域。该制备方法所用的螺旋藻为螺旋藻H11株系的保藏号为：CCTCC NO：M 2017772；该制备方法包括：对螺旋藻进行培养、采收后进行干燥，加入脱除用无水乙醇以初步脱色素和油脂，过滤得到藻体；将藻体重新分散在水中，热碱法浸提，过滤收集上清液，向上清液中加入醇沉用无水乙醇进行醇沉，过滤收集沉淀，烘干；接着进行洗涤和去蛋白处理后即得。本发明可以提高活性成分的提取率，减少提取物的色素及气味，更利于其作为化妆品修护剂的使用。本发明的护肤品可以促进组织的修复，降低经皮水分流失并增加皮肤弹性，改善皮肤特别是干皮的症状。
Description
技术领域
本发明涉及螺旋藻应用技术领域，具体而言，涉及螺旋藻H11株系水提取物及其制备方法、应用和护肤品。
背景技术
微藻太空育种是一种较为高效的人工育种方式，利用宇宙辐射、微重力和复杂电磁环境等因素对微藻的诱变作用，使微藻细胞发生遗传变异，一次性获得大量的突变株，然后从诱变株中筛选出生长速率快、生物量高、遗传性状稳定且具有开发价值的藻株。与传统育种相比，太空诱变育种的最大优势是变异机率高、变异范围广、育种周期短，可在相对较短时间内，创造出优质的种质资源。
对于申请号：201711461143.2中的螺旋藻(Spirulina platensis)H11株系，其保藏号：CCTCC NO：M 2017772。螺旋藻(Spirulina platensis)H11株系经太空育种并多次筛选获得，该藻株具有光合作用效率高、生长速率快、生物质产率高等优势。
食用螺旋藻能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，可以促进胶原蛋白形成，使皮肤更洁白和富有弹性。螺旋藻中的维它矿物质群，可以补充皮肤营养，使皮肤焕发光彩。螺旋藻所含有的γ-亚麻酸具有美白和抗皮肤老化的作用，它具有抗黑色素生成的作用，可作为增白化妆品的功能因子，也可以制成药膏治疗色素沉积。另外γ-亚麻酸还可以促进血液循环、湿润皮肤、延缓衰老。螺旋藻还可以抑制机体内自由基氧化反应，降低脂质过氧化作用。
但是鲜有螺旋藻外用于皮肤被报道的功效，从而导致螺旋藻应用于化妆品的范围亦有限。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供螺旋藻H11株系水提取物及其制备方法、应用和护肤品。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种螺旋藻H11株系水提取物的制备方法，其包括：
对螺旋藻进行培养、采收后进行干燥，制粉得到螺旋藻粉末；
对螺旋藻粉末加入脱除用无水乙醇，进行震荡过夜以初步脱色素和油脂，随后过滤得到藻体；
将所述藻体重新分散在水中，热碱法浸提，过滤收集上清液，重复2-4次，合并多次上清液，向所述上清液中加入醇沉用无水乙醇进行醇沉，过滤收集沉淀，将所述沉淀烘干后得到螺旋藻粗提取物；
将所述螺旋藻粗提取物进行洗涤至洗脱液颜色不再变深为止，然后重新溶解于水，得到粗提物水溶液；对所述粗提物水溶液进行去蛋白处理后得到螺旋藻H11株系水提取物。
第二方面，本发明提供一种螺旋藻H11株系水提取物，其是采用如前述实施方式任一项所述的螺旋藻H11株系水提取物的制备方法制备而成。
第三方面，本发明提供如前述实施方式所述的螺旋藻H11株系水提取物在制备护肤品中皮肤修复剂中的应用。
第四方面，本发明提供一种护肤品，其组分按质量百分数计包括：促渗剂：0.01-5％；保湿剂：0.01-20％；增稠剂：0.02-0.8％；PH调节剂：0.01-1％；防腐剂：0.01-0.15％；皮肤调理剂：0.01-5％；增溶剂：0.01-0.5％；皮肤美白剂：0.01-5％；芳香剂：0.005-0.5％；皮肤修护剂：0.01-20％，和余量的水；
其中，所述皮肤修护剂为前述实施方式所述的螺旋藻H11株系水提取物；所述促渗剂为双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯。
本发明具有以下有益效果：
本发明所选的螺旋藻H11株系提取物，其具有强皮肤修护能力，作为皮肤修护剂生产应用具有开发价值，同时在制备过程中，采用乙醇预处理，并采用热碱法进行水提，可以极大的提高活性成分的提取率，随后对螺旋藻粗提取物进行洗涤和去蛋白，可以显著减少提取物的色素及气味，更利于其作为化妆品修护剂的使用。本发明的护肤品，以螺旋藻H11株系提取物为皮肤修护剂，促进组织的修复，降低经皮水分流失并增加皮肤弹性，改善皮肤特别是干皮的症状。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实验例一提供的蔗糖标准曲线图；
图2为实验例三提供的受试物斑马鱼修复效果比较图；
图3为实验例三提供的受试物斑马鱼修复速率比较图；
图4为应用示例提供的皮肤经皮水分流失变化率比较图；
图5为应用示例提供的皮肤弹性量变化率比较图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请提供了一种螺旋藻H11株系水提取物，其是采用螺旋藻H11株系水提获得的。本发明的螺旋藻(Spirulina platensis)H11株系于2017年12月8日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，地址：中国.武汉.武汉大学；保藏中心保藏编号：CCTCC NO：M 2017772。螺旋藻H11株系的分类命名为Spirulina platensis SCSIO-44012-H11。
螺旋藻营养成分的特点是蛋白质含量高，而脂肪、纤维素含量低，并且还含有种类繁多的维生素，它是维生素B12和β-胡萝卜素含量最高的食品。此外，它还是所有食物中可吸收性铁质含量最高的，同时还发现它含有具有防癌、治癌作用的藻类蛋白，以及其他大量矿质元素和提高机体免疫力的生物活性物质。螺旋藻所含的类脂几乎全都是重要的不饱和脂肪酸类，胆固醇含量极微。螺旋藻含有全部人体必需氨基酸，赖氨酸含量高，与动植物源食品相比最接近联合国粮农组织的推荐标准，而且组成均衡人体对其吸收利用率特别高。螺旋藻富含人体所需的矿物质，包括钙、磷、镁、铁、钠、锰、锌、钾、氯等。
其制备方法包括如下步骤，
(1)培养。
对螺旋藻进行培养、采收后进行干燥，制粉得到螺旋藻粉末。
具体来说，对螺旋藻进行培养的方法包括：将螺旋藻接种于培养基中进行培养，培养过程中补充CO2将培养基的pH控制在9.0-9.5，每天定时搅拌，培养周期为4-5周，周期内平均温度为25-30℃，螺旋藻采收后进行冷冻干燥，制粉得到螺旋藻粉末；
优选地，培养基的组成包括：4-6g/L NaHCO3、0.3-0.8g/L NaNO3、0.01-0.03g/LK2HPO4、0.01-0.02g/L FeSO4·7H2O、0.06-0.10g/L Na2EDTA、1-2mL/L A5 solution、取南海海域上层海水为基质配制而成，同时补加去离子水将盐度控制在27-29‰。
本申请中，通过对螺旋藻H11株系进行培养，将培养的螺旋藻采收后进行冷冻干燥，低温条件进行干燥可以最大限度的保留藻体内活性物质不被破坏。
(2)初步脱色素和油脂。
对螺旋藻粉末加入脱除用无水乙醇，进行震荡过夜以初步脱色素和油脂，随后过滤得到藻体。其中，螺旋藻粉末和脱除用无水乙醇的体积比为1:23-28，振荡为摇床于40-50℃下以160-180rpm的转速进行振荡。
采用脱除用无水乙醇对螺旋藻粉末进行预先处理，可以初步的对藻体脱色素和油脂，为后续的提取奠定基础。
(3)提取活性成分。
将藻体重新分散在水中，热碱法浸提，过滤收集上清液，重复2-4次，合并多次上清液，向上清液中加入醇沉用无水乙醇进行醇沉，过滤收集沉淀，将沉淀烘干后得到螺旋藻粗提取物。
热碱法包括采用65-75℃的水浸提7-9h，并且在浸提时采用2.5wt％的NaOH调pH至11-12。上清液与醇沉用无水乙醇的体积比为1：3-5；
优选地，醇沉于4-6℃下进行醇沉10-15h。
本申请中采用热碱法进行提取，螺旋藻多糖含有较多的亲水性基团和硫酸基团，碱性溶液可加速有效成分进入溶剂，从而提高浸出率，缩短提取时间，同时可避免高温对提出成分的影响。同时，针对本申请中特定的螺旋藻H11株系，本申请提供的热碱法提取效果更佳。
(4)提纯。
将螺旋藻粗提取物进行洗涤至洗脱液颜色不再变深为止，然后重新溶解于水，得到粗提物水溶液；对粗提物水溶液进行去蛋白处理后得到螺旋藻H11株系水提取物。
采用丙酮对螺旋藻粗提取物进行洗涤；采用氯仿-正丁醇对粗提物水溶液进行去蛋白；氯仿-正丁醇中氯仿和正丁醇的混合体积比为4-5：1；粗提物水溶液和氯仿-正丁醇的体积比为1:1-1.2。
在对粗提物水溶液进行去蛋白处理时，在粗提物水溶液中加入氯仿-正丁醇混合溶液进行充分振摇，将游离蛋白变性成为不溶性物质，离心后分在两相中间，变性的蛋白质一般在两相交界处产生一条白色的带，8000rpm离心分离得到水相，重复上述步骤直至两项之间无明显白色的带出现，离心后得到螺旋藻H11株系提取物。采用此制备方法，可以显著减少提取物的色素和气味等，更适合应用于化妆品中，保证化妆品的质量。
进一步地，本申请还提供了上述螺旋藻H11株系水提取物在制备护肤品中皮肤修复剂中的应用；优选地，螺旋藻H11株系水提取物的加入量占护肤品的质量百分数为0.01-20％。
进一步地，本申请还提供了上述螺旋藻H11株系水提取物在制备清除DPPH自由基的试剂中的应用。
进一步地，本申请还提供了上述螺旋藻H11株系水提取物在制备组织修复的试剂中的应用。
皮肤的自我修护能力会随着年龄的增长而逐渐减弱。随着年龄的增加，机体保护机制下降，身体新陈代谢逐渐减慢，表皮中角质形成细胞更替时间延长，天然保湿因子，神经酰胺等含量下降，真皮中胶原纤维再生不明显，透明质酸含量下降。皮肤含水量降低，经皮水分流失增加，皮肤变得干燥，在面部某些特定部位开始出现皱纹等一系列干皮的症状。因此，改善组织的修护能力一直是预防和治疗皮肤老化的有力手段，也是其他许多化合物达到抗皮肤老化作用的重要途径。
本申请中，通过提取螺旋藻H11株系中的活性成分，利用其组织修复作用，减少皮肤的经皮水分流失和增加皮肤弹性，促进成纤维细胞的再生，从而恢复皮肤健康，改善皮肤特别是干皮的症状。
此外，本申请还提供了一种护肤品，其组分按质量百分数计包括：促渗剂：0.01-5％；保湿剂：0.01-20％；增稠剂：0.02-0.8％；PH调节剂：0.01-1％；防腐剂：0.01-0.15％；皮肤调理剂：0.01-5％；增溶剂：0.01-0.5％；皮肤美白剂：0.01-5％；芳香剂：0.005-0.5％；皮肤修护剂：0.01-20％，和余量的水；
其中，皮肤修护剂为上述螺旋藻H11株系水提取物；皮肤修护剂(螺旋藻H11株系水提取物)的用量为0.01-20％，优选用量为0.5-20％，更进一步优选用量为1-20％。其中，随着用量的增加，其皮肤修护性能增加，当增加至20％后，其增速减缓，基于对成本及效果的考虑，所添加的皮肤修护剂螺旋藻H11株系提取物含量为1-20％为优选方案。本申请提供的螺旋藻H11株系水提取物具有强组织修复能力、遗传稳定的特性，其生物质产率显著提高，皮肤修护能力显著增强。
促渗剂为双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯。采用双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯为促渗剂；双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯溶水溶油，能促进有效成分对毛发与皮肤的渗透，加强产品保湿、修护等功效。
本申请中，保湿剂包括但不限于二丙二醇、双丙甘醇、泛醇、丙二醇、丁二醇、山梨糖醇、泛醇、甘油、PEG/PPG-17/6共聚物、甘油聚丙烯酸酯、甘油聚醚-26、透明质酸钠中的一种或两种以上的组合。
增稠剂包括但不限于丙烯酸类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、羟乙基纤维素、黄原胶、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、卡波姆和丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物中的一种或两种以上的组合。
pH调节剂包括但不限于氨甲基丙醇、柠檬酸、柠檬酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、精氨酸等中的一种或两种以上的组合。
防腐剂可以包括但不限于苯氧乙醇、羟苯甲酯、苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、氯苯甘醚、羟苯丙酯中的一种或两种以上的组合。
皮肤调理剂包括但不限于尿囊素、红没药醇、石莼提取物、燕麦麸皮提取物、水解胶原蛋白、神经酰胺2、β-葡聚糖、海藻糖、褐藻提取物、北美金缕梅花水、白果槲寄生叶提取物、白茅根提取物、仙人掌提取物、对羟基苯乙酮、乳酸杆菌/大豆发酵产物提取物中的一种或两种以上的组合。通过添加皮肤调理剂，进一步为皮肤补充水分，并且可以缓解皮肤的敏感性。皮肤调理剂中有效成分，可以渗透到肌肤深处，被皮肤吸收，从而改善皮肤的状态。
增溶剂包括但不限于聚山梨醇酯-20、PEG-40氢化蓖麻油、PPG-26-丁醇聚醚-26、PEG-100硬脂酸酯和甘油硬脂酸酯的复合物、聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、聚丙烯酰胺和月桂醇聚醚-7和C13-14异链烷烃的复合物、甘油醇醚-25PCA异硬脂酸脂中的一种或两种以上的组合。
皮肤美白剂包括但不限于烟酰胺、天女木兰提取物、曲酸及其衍生物、熊果苷及其衍生物中的一种或两种以上的组合。通过添加皮肤美白剂，能够抑制酪氨酸酶的活性，从而起到优异的美白效果。
芳香剂可以是香精等。
本发明的护肤品，可以为水剂、乳液、膏霜、凝露等，采用所挑选的螺旋藻H11株系水提取物为皮肤修护剂，能够有效修复皮肤屏障，并增加皮肤弹性，进一步搭配双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯为促渗剂，有效促进肌肤对护肤品的吸收，进而有效提高皮肤的修复效果。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种螺旋藻H11株系水提取物，本实施例中螺旋藻为经过诱变的螺旋藻H11株系(藻种分类命名SCSIO 44012-H11，菌种保藏号：CCTCC NO：M 2017772，以下简称：诱变株H11)，对于诱变株H11，其搭载“实践十号”返回式卫星，在轨运行12天后返回地面。
其制备方法包括如下步骤：
(1)培养。
将保藏号为CCTCC NO：M 2017772的螺旋藻H11株系接种于装有培养基的体积为50L塑料桶中进行培养，培养过程中补充CO2将培养基的pH控制在9.0-9.5，每天定时搅拌，培养周期为4周，周期内平均温度为27℃，螺旋藻采收后进行冷冻干燥，制粉得到螺旋藻粉末；
培养基的组成包括：5g/L NaHCO3，0.5g/L NaNO3，0.02g/L K2HPO4，0.01g/LFeSO4·7H2O，0.08g/L Na2EDTA，1mL/L A5 solution，取南海海域上层海水为基质配制而成。通过补加去离子水将盐度控制在28±1‰。
(2)初步脱色素和油脂。
称取干重为20g的螺旋藻粉末，以1：25的料液比添加500ml无水乙醇，摇床45℃，180rpm过夜震荡以初步脱色素和油脂，次日过滤收集藻体。
(3)提取活性成分。
将藻体重新分散在水(1:20)中，70℃的水浸提8h，并且在浸提时采用2.5wt％的NaOH调pH至11.5，上述混合物8000rpm离心收集上清。离心后沉淀重复提取三次，合并上清后加入4倍体积醇沉用无水乙醇，4℃下进行醇沉12h，离心收集沉淀，冷冻干燥得到螺旋藻H11株系粗提取；
(4)提纯。
将粗提物使用丙酮洗涤，直至洗脱液颜色不再变深为止，然后重新溶解于水，得到粗提物水溶液；
按照1:1的比例，在粗提物水溶液中加入氯仿-正丁醇混合液(4:1)进行充分振摇，8000rpm离心分离得到水相，重复上述步骤直至两项之间无明显白色的带出现，离心后得到螺旋藻H11株系水提取物。
实施例2
本实施例提供了一种螺旋藻H11株系水提取物，其制备方法包括如下步骤：
(1)培养。
将保藏号为CCTCC NO：M 2017772的螺旋藻H11株系接种于装有培养基的体积为50L塑料桶中进行培养，培养过程中补充CO2将培养基的pH控制在9.0-9.5，每天定时搅拌，培养周期为4周，周期内平均温度为27℃，螺旋藻采收后进行冷冻干燥，制粉得到螺旋藻粉末；
培养基的组成包括：5g/L NaHCO3，0.5g/L NaNO3，0.02g/L K2HPO4，0.01g/LFeSO4·7H2O，0.08g/L Na2EDTA，1mL/L A5 solution，取南海海域上层海水为基质配制而成。通过补加去离子水将盐度控制在28±1‰。
(2)初步脱色素和油脂。
称取干重为20g的螺旋藻粉末，以1：25的料液比添加480ml无水乙醇，摇床45℃，180rpm过夜震荡以初步脱色素和油脂，次日过滤收集藻体。
(3)提取活性成分。
将藻体重新分散在水(1:20)中，65℃的水浸提9h，并且在浸提时采用2.5wt％的NaOH调pH至12，上述混合物8000rpm离心收集上清。离心后沉淀重复提取三次，合并上清后加入3倍体积醇沉用无水乙醇，5℃下进行醇沉15h，离心收集沉淀，冷冻干燥得到螺旋藻H11株系粗提取；
(4)提纯。
将粗提物使用丙酮洗涤，直至洗脱液颜色不再变深为止，然后重新溶解于水，得到粗提物水溶液；
按照1:1.1的比例，在粗提物水溶液中加入氯仿-正丁醇混合液(4:1)进行充分振摇，8000rpm离心分离得到水相，重复上述步骤直至两项之间无明显白色的带出现，离心后得到螺旋藻H11株系水提取物。
实施例3
本实施例提供了一种螺旋藻H11株系水提取物，其制备方法包括如下步骤：
(1)培养。
将保藏号为CCTCC NO：M 2017772的螺旋藻H11株系接种于装有培养基的体积为50L塑料桶中进行培养，培养过程中补充CO2将培养基的pH控制在9.0-9.5，每天定时搅拌，培养周期为4周，周期内平均温度为27℃，螺旋藻采收后进行冷冻干燥，制粉得到螺旋藻粉末；
培养基的组成包括：5g/L NaHCO3，0.5g/L NaNO3，0.02g/L K2HPO4，0.01g/LFeSO4·7H2O，0.08g/L Na2EDTA，1mL/L A5 solution，取南海海域上层海水为基质配制而成。通过补加去离子水将盐度控制在28±1‰。
(2)初步脱色素和油脂。
称取干重为20g的螺旋藻粉末，以1：25的料液比添加500ml无水乙醇，摇床45℃，180rpm过夜震荡以初步脱色素和油脂，次日过滤收集藻体。
(3)提取活性成分。
将藻体重新分散在水(1:20)中，75℃的水浸提7h，并且在浸提时采用2.5wt％的NaOH调pH至11，上述混合物8000rpm离心收集上清。离心后沉淀重复提取三次，合并上清后加入5倍体积醇沉用无水乙醇，6℃下进行醇沉10h，离心收集沉淀，冷冻干燥得到螺旋藻H11株系粗提取；
(4)提纯。
将粗提物使用丙酮洗涤，直至洗脱液颜色不再变深为止，然后重新溶解于水，得到粗提物水溶液；
按照1:1.2的比例，在粗提物水溶液中加入氯仿-正丁醇混合液(5:1)进行充分振摇，8000rpm离心分离得到水相，重复上述步骤直至两项之间无明显白色的带出现，离心后得到螺旋藻H11株系水提取物。
对比例1
本对比例与实施例1基本相同，区别仅在于，本对比例中，选用的螺旋藻为钝顶螺旋藻野生株(Wild type,WT，以下简称：野生株WT)，实验所用野生株WT由中国科学院南海海洋研究所海藻资源与生物技术学科组藻种库提供。
对比例2
本对比例与实施例1基本相同，区别仅在于，本对比例中，步骤(3)的提取活性成分的方法与实施例1不同。具体来说，本对比例中，步骤(3)为：将藻体重新分散在水(1:20)中，70℃热水浸提12h，8000rpm离心收集上清。离心后沉淀重复提取三次，合并上清后加入4倍体积醇沉用无水乙醇，4℃下进行醇沉12h，离心收集沉淀，冷冻干燥得到螺旋藻H11株系粗提取。
对比例3
本对比例与实施例1基本相同，区别仅在于，本对比例中，步骤(3)的提取活性成分的方法与实施例1不同。具体来说，本对比例中，步骤(3)为：将藻体重新分散在水(1:20)中，300W超声破碎0.5h，70℃热水浸提8h，8000rpm离心收集上清。离心后沉淀重复提取三次，合并上清后加入4倍体积醇沉用无水乙醇，4℃下进行醇沉12h，离心收集沉淀，冷冻干燥得到螺旋藻H11株系粗提取。
对比例4
本对比例与实施例1基本相同，区别仅在于，本对比例中，步骤(3)的提取活性成分的方法与实施例1不同。具体来说，本对比例中，步骤(3)为：将藻体重新分散在水(1:20)中，微波功率300W，作用10min，8000rpm离心收集上清。离心后沉淀重复提取三次，合并上清后加入4倍体积醇沉用无水乙醇，4℃下进行醇沉12h，离心收集沉淀，冷冻干燥得到螺旋藻H11株系粗提取。
对比例5
本对比例提供一种诱变株H11螺旋藻醇提物，诱变株H11螺旋藻醇提物的获取参考已公开专利申请《螺旋藻H11株系提取物作为抗氧化剂的应用及其护肤品》CN 113925821A。
实验例一：活成成分测定。
通过蒽酮-硫酸法以表征对应诱变株H11和野生株WT中的活性物含量。测定活性物含量是通过测定其在630nm波长下吸光度，对比蔗糖标准曲线来得出。
具体的，活性物含量(当量)测定方法为：
取1mL螺旋藻提取物加入20mL体积具塞试管(取1mL蒸馏水做空白对照)，分别向各管加入1mL蒸馏水，然后按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其吸光度。
其中，蔗糖标准曲线的测定方法为：
将分析纯蔗糖在80摄氏度下(2h)烘至恒重，精确称取1.000g,加入少量水溶解，转入100ml容量瓶中，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容到刻度。精确吸取1％蔗糖溶液1ml转入100ml容量瓶，加水至刻度，得到100μg/mL蔗糖溶液。
准确量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的100μg/mL蔗糖标准液于20mL体积具塞试管，全部用去离子水补足至1mL，按照上述螺旋藻提取物测试方法进行标准曲线测定。以吸光度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。
进一步的，结合附图1及下表1，表1为蔗糖含量与吸光度关系对应表；附图1为蔗糖标准曲线图，以蔗糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
所得到的蔗糖的标准曲线方程为A＝0.0065X(A为吸光度，X为蔗糖含量)，线性系数R2＝0.997，表明蔗糖含量在0-100μg范围内线性关系良好。
表1.蔗糖含量与吸光度关系表
| 含量(μg) | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 吸光度 | 0 | 0.139 | 0.273 | 0.374 | 0.502 | 0.658 |
根据标准曲线计算，测定实施例1、对比例1-5的螺旋藻提取物中的活性物含量，测定结果请参阅表2。
表2.螺旋藻中活性物含量
| 示例 | 活性物含量(％干重) |
| 实施例1 | 19.6％ |
| 对比例1 | 4.0％ |
| 对比例2 | 4.3％ |
| 对比例3 | 10.8％ |
| 对比例4 | 5.6％ |
| 对比例5 | / |
从上表可以看出，诱变株H11螺旋藻提取物中活性物蔗糖当量为19.6％(干重)，野生株WT螺旋藻提取物中活性物蔗糖当量为4.0％(干重)；所筛选诱变株H11其活性物含量高于野生株螺旋藻，相对于野生型螺旋藻更具有价值，以便实现螺旋藻H11株系提取物作为皮肤修护剂的生产应用。同时对比例2-4提供的提取方法获得的活性物含量显著低于本申请的热碱法提取。对比例5获得的诱变株H11螺旋藻醇提物中不含多糖，诱变株H11螺旋藻醇提物中的主要活性物质是多酚，这也决定了诱变株H11螺旋藻的醇提物和水提物具有完全不同的应用。
实验例二：螺旋藻DPPH自由基清除能力测试
DPPH工作液的配制：0.0082g DPPH粉末溶于100mL乙醇，4℃避光保存。
检测受试物的抗氧化活性：取1mL DPPH工作液添加200μL受试物，避光反应30min，在波长为517nm处读数为A1。取1mLDPPH工作液添加200μL去离子水，避光反应30min，在波长为517nm处读数为A2。取1mL乙醇添加200μL受试物，避光反应30min，在波长为517nm处读数为A3，在本实施例中，同时采用抗坏血酸(即维生素C)、D-α-生育酚(即维生素E)和Trolox用来作为阳性对照。
其中，DPPH自由基的清除率计算公式为：清除率＝[(A2+A3-A1)/A2]*100％
表3.不同受试物对DPPH自由基的清除率
| 提取物 | 浓度(μg/mL) | DPPH清除率(％) |
| 对比例5 | 1.4 | 40.883 |
| 对比例5 | 2.8 | 64.109 |
| 实施例1 | 1.4 | 0.022 |
| 实施例1 | 2.8 | 0.031 |
| 抗坏血酸 | 6.66667 | 78.096 |
从上表可以看出，对比例5获得的诱变株H11螺旋藻醇提物具有显著的DPPH清除率，而本申请实施例提供的诱变株H11螺旋藻水提物几乎不具备DPPH清除率，这也进一步证实了水提取和醇提物的活性成分和功效差异。
实验例三：螺旋藻组织修复能力测试
对螺旋藻提取物的组织修复性能进行测试，所采用的测试方法为斑马鱼幼鱼尾鳍损伤修复试验。
局部组织、细胞因致病因素导致损伤和死亡后，由邻近健康细胞再生来修补顶替，以恢复组织完整性。研究表明，斑马鱼的视网膜、脊髓、肾脏、心脏和鳍拥有强大的再生能力，鳍再生是研究组织修复的一种特别有效的模型。在鳍切断后的几个小时内，斑马鱼的主要鳍结构会迅速再生，在剪鳍或损伤后，损伤的斑马鱼尾鳍结构能够很快恢复到原来的大小。通过比较空白对照与受试物给药组斑马鱼胚胎尾鳍增长情况，可评价试验样品在皮肤受损的情况下是否有利于受损组织的重建，探究产品的修护功效。
随机挑选发育正常的72hpf(hour post-fertilization,hpf)斑马鱼幼鱼，0.02％三卡因麻醉后，切半尾鳍后，置于28℃生化培养箱孵育2h，体视显微镜下拍照记录，随后将斑马鱼幼鱼转移到48孔板中，每组20尾，每孔加入400μl的样品溶液，置于28℃生化培养箱孵育72h后，体视显微镜下拍照记家，并用Image J测量斑马鱼尾鳍前后生长情况。实验设置空白对照组和样品组，其中，浓度以活性成分蔗糖当量计，得到不同的受试物对斑马鱼尾鳍损伤修复的功效。测试结果请参阅图2、图3和表4。
表4.螺旋藻修复效果比较图
| 提取物(1mg/mL) | 修复速率(％空白对照) |
| 实施例1 | 134.8％ |
| 对比例1 | 102.1％ |
| 对比例5 | / |
基于此，在对比野生株螺旋藻，螺旋藻H11株系提取物的斑马鱼尾鳍损伤修复能力有显著提高，对比例5的醇提物无组织修复的功能。因此，将螺旋藻H11株系提取物作为皮肤修护剂具有广泛用途，其在制备护肤品中作为皮肤修护剂有巨大潜力。
应用示例
本发明提供了一种护肤品，其应用实施例及应用对比例配方占比按下表5所示构成。其中，在应用实施例1、应用实施例2及应用实施例3中，添加本发明实施例1提供的诱变株H11螺旋藻提取物作为皮肤修护剂，诱变株H11螺旋藻菌种保藏号：CCTCC NO：M 2017772，在应用对比例1-3中以对比例1提供的野生株WT螺旋藻提取物为对比例，同时以未添加诱变株H11、野生株WT螺旋藻提取物为空白对照组。
表5：护肤品配方占比
本实施例中上述配方的护肤品制备工艺为：
根据上表5中的紧致霜配方中各组分的含量(质量百分比)，并按照下述生产工艺步骤制备得到紧致霜。生产工艺步骤如下：
1、将A相原料加入油相锅，搅拌并加热至80-85℃，使之充分溶解；
2、将B相加入乳化锅，搅拌并加热到80-85℃，使之充分溶解；
3、将油相锅内油相物质慢慢抽到乳化锅，搅拌、均质、真空乳化，保持乳化锅温度为80-85℃；
4、降温至42℃，加入C相和D相搅拌均匀；
5、冷却至37℃，出料，静置24小时；
6、检验合格后，分装、包装，再检验，成品入库。
注：工艺中的A、B、C、D相分别为：
A相：肉豆蔻酸异丙酯、环聚二甲基硅氧烷、辛酸/癸酸甘油三酯、油醇芥酸酯、环己硅氧烷、聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、牛油果树果脂、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺和月桂醇聚醚-7和C13-14异链烷烃的复合物、C12-15醇苯甲酸酯、PEG-100硬脂酸酯和甘油硬脂酸酯的复合物、生育酚乙酸酯、油橄榄油不皂化物、甘油聚丙烯酸酯、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物、丁羟甲苯、羟苯甲酯、羟苯丙酯、香精；
B相：水、甘油、丙二醇、泛醇、甜菜碱、氨甲基丙醇、尿囊素、卡波姆、氯化锰；
C相：聚乙二醇-90M、丁二醇；
D相：螺旋藻提取物(野生型或H11型)、烟酰胺、苯氧乙醇、乳酸杆菌/大豆发酵产物提取物、双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯。
其中，甘油、泛醇、甜菜碱、甘油聚丙烯酸酯、丁二醇为保湿剂；
肉豆蔻酸异丙酯、环聚二甲基硅氧烷、辛酸/癸酸甘油三酯、油醇芥酸酯、环己硅氧烷、牛油果树果脂、聚二甲基硅氧烷、C12-15醇苯甲酸酯、油橄榄油不皂化物是油脂；
聚乙二醇-90M、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物、卡波姆是增稠剂；
螺旋藻提取物(野生型或H11型)为皮肤修护剂；
聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、聚丙烯酰胺和月桂醇聚醚-7和C13-14异链烷烃的复合物、PEG-100硬脂酸酯和甘油硬脂酸酯的复合物是乳化剂；
神经酰胺2、乳酸杆菌/大豆发酵产物提取物、尿囊素、氯化锰是皮肤调理剂；
丙二醇、双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯是促渗透剂；
丁羟甲苯、生育酚乙酸酯是抗氧化剂；
苯氧乙醇、羟苯甲酯、羟苯丙酯是防腐剂；
氨甲基丙醇是pH调节剂；香精是芳香剂。
PEG-100硬脂酸酯和甘油硬脂酸酯的复合物，生产厂家，禾大公司，牌号：ARLACEL165；
聚丙烯酰胺和月桂醇聚醚-7和C13-14异链烷烃的复合物的生产厂家是赛比克公司，牌号为Sepigel 305。在本实施例中，对所得紧致霜进行皮肤经皮水分流失和皮肤弹性测试。
皮肤经皮水分流失的测试方法：经皮水分流失是体内水分通过角质层向外扩散的部分非显性蒸发，在人体实验中，检测经皮水分流失可以反映角质层屏障功能变化。完整的皮肤有完全的屏障功能，经皮水分流失值较低。当物理性、化学性和病理性因素损伤皮肤屏障，经皮水分流失值增高。这种变化的大小依赖于损伤的程度。当屏障恢复了，经皮水分流失值也随后降低。因此，观察经皮水分流失值的变化对于评估皮肤病的治疗、化妆品皮肤护理方法及预防方法的区别是非常有效的。
测试原理是将探头垂直放置于被测皮肤，测量从皮肤表面产生的水分蒸发梯度。探头由开放圆柱组成，包括两组自敏性的、处于皮肤表面不同位置的电热调节器。在两个点上，进行相对湿度和相对温度的测量，且计算相应的蒸汽压。在每一点随着梯度不同，蒸汽压不同，这与此部位水分蒸发丢失的速率直接相关，结果用g/(h·m2)表示。采用德国CK公司的探头Tewameter TM300对受试者进行皮肤经皮水分流失测定，通过测量产品使用前后经皮水分流失的变化来评估该产品对受试区域皮肤屏障的修复作用。
皮肤弹性的测试方法：测试原理是基于吸力和拉伸原理，在被测试的皮肤表面产生一个负压将皮肤吸进一个特定测试探头内，皮肤被吸进测试探头内的深度是通过一个非接触式的光学测试系统测得的。测试探头内包括光的发射器和接收器，光的比率(发射光和接收光之比)同被吸入皮肤的深度成正比，这样就得到了一条皮肤被拉伸的长度和时间的关系曲线。
采用德国CK公司的探头PVM600和皮肤弹性测量仪MPA580对受试者进行皮肤弹性的测定，选择参数R2作为比较指标(R2：无负压时皮肤回弹量与有负压时的最大拉伸量之比，比值越接近1，皮肤弹性越好)，共测量3次，取平均值；通过测量产品使用前后皮肤弹性值R2的变化来评估该产品对受试区域皮肤弹性的改善作用。
受试者人数为33人，试验周期为4周，试验选取应用实施例1-3的护肤品以及应用对比例1-3、空白对照组的护肤品作为测试样品，在受试者的前臂划分7个不同区域，每天早晚将上述空白对照组、应用对比例1-3及应用实施例1-3的护肤品涂抹于前臂内侧的不同区域，涂抹量约为2mg/cm2，且试验周期内每种测试样品的涂抹位置均保持不变，然后分别测定实验前和使用第1、2、4周时的受试区域的皮肤经皮水分流失和皮肤弹性，进而表征他们的变化率。
结合附图4及下表所示，其中表6为皮肤弹性变化率，皮肤弹性变化率比较图。
表6：皮肤经皮水分流失变化率
结合附图5及下表所示，其中表7为皮肤弹性变化率，皮肤弹性变化率比较图。
表7：皮肤弹性变化率
从图4、图5、表6和表7可以看出，在护肤品中加入螺旋藻提取物可以降低皮肤经皮水分流失，并提高皮肤弹性，起到改善皮肤作用。同时，随着螺旋藻提取物的用量增加，其效果增加。而对比加入野生株的螺旋藻提取物，本发明所采用螺旋藻H11株系提取物能在添加更少量情况下得到更好的效果，其效果随着添加量的增加上升，综合对比其成本及效果，螺旋藻H11株系提取物添加量在10％为较优实施方案。
综上所述，本发明所选的螺旋藻H11株系提取物，其具有强皮肤修护能力，作为皮肤修护剂生产应用具有开发价值，同时在制备过程中，采用乙醇预处理，并采用热碱法进行水提，可以极大的提高活性成分的提取率，随后对螺旋藻粗提取物进行洗涤和去蛋白，可以显著减少提取物的色素及气味，更利于其作为化妆品修护剂的使用。本发明的护肤品，以螺旋藻H11株系提取物为皮肤修护剂，促进组织的修复，降低经皮水分流失并增加皮肤弹性，改善皮肤特别是干皮的症状。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种螺旋藻H11株系水提取物的制备方法，所述螺旋藻为螺旋藻H11株系的保藏号为：CCTCC NO：M 2017772；其特征在于，其包括：
对螺旋藻进行培养、采收后进行干燥，制粉得到螺旋藻粉末；
对螺旋藻粉末加入脱除用无水乙醇，进行震荡过夜以初步脱色素和油脂，随后过滤得到藻体；
将所述藻体重新分散在水中，热碱法浸提，过滤收集上清液，重复2-4次，合并多次上清液，向所述上清液中加入醇沉用无水乙醇进行醇沉，过滤收集沉淀，将所述沉淀烘干后得到螺旋藻粗提取物；
将所述螺旋藻粗提取物进行洗涤至洗脱液颜色不再变深为止，然后重新溶解于水，得到粗提物水溶液；对所述粗提物水溶液进行去蛋白处理后得到螺旋藻H11株系水提取物。
2.根据权利要求1所述的螺旋藻H11株系水提取物的制备方法，其特征在于，所述热碱法包括采用65-75℃的水浸提7-9h，并且在浸提时采用2.5wt％的NaOH调pH至11-12。
3.根据权利要求1所述的螺旋藻H11株系水提取物的制备方法，其特征在于，所述上清液与所述醇沉用无水乙醇的体积比为1：3-5；所述醇沉于4-6℃下进行醇沉10-15h。
4.根据权利要求1所述的螺旋藻H11株系水提取物的制备方法，其特征在于，采用丙酮对所述螺旋藻粗提取物进行洗涤；采用氯仿-正丁醇对所述粗提物水溶液进行去蛋白；其中，所述氯仿-正丁醇中氯仿和正丁醇的混合体积比为4-5：1；所述粗提物水溶液和所述氯仿-正丁醇的体积比为1:1-1.2。
5.根据权利要求1所述的螺旋藻H11株系水提取物的制备方法，其特征在于，对所述螺旋藻进行培养的方法包括：将所述螺旋藻接种于培养基中进行培养，培养过程中补充CO2将所述培养基的pH控制在9.0-9.5，每天定时搅拌，培养周期为4-5周，周期内平均温度为25-30℃，螺旋藻采收后进行冷冻干燥，制粉得到螺旋藻粉末；
所述培养基的组成包括：4-6g/L NaHCO3、0.3-0.8g/L NaNO3、0.01-0.03g/L K2HPO4、0.01-0.02g/L FeSO4·7H2O、0.06-0.10g/L Na2EDTA、1-2mL/L A5 solution、取南海海域上层海水为基质配制而成，同时补加去离子水将盐度控制在27-29‰。
6.一种螺旋藻H11株系水提取物，其特征在于，其是采用如权利要求1-5任一项所述的螺旋藻H11株系水提取物的制备方法制备而成。
7.如权利要求6所述的螺旋藻H11株系水提取物在制备护肤品中皮肤修复剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述螺旋藻H11株系水提取物的加入量占所述护肤品的质量百分数为0.01-20％。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述护肤品包括水剂、乳液、膏霜或凝露。
10.一种护肤品，其特征在于，其组分按质量百分数计包括：促渗剂：0.01-5％；保湿剂：0.01-20％；增稠剂：0.02-0.8％；PH调节剂：0.01-1％；防腐剂：0.01-0.15％；皮肤调理剂：0.01-5％；增溶剂：0.01-0.5％；皮肤美白剂：0.01-5％；芳香剂：0.005-0.5％；皮肤修护剂：0.01-20％，和余量的水；
其中，所述皮肤修护剂为权利要求6所述的螺旋藻H11株系水提取物；所述促渗剂为双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯。
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