CN108420758A - 一种用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液及其制备方法。所述方法包括如下步骤：以忍冬花为原料，经预处理后得到长度小于预设值的忍冬花片；将制得的20～50份忍冬花片置于20～45℃的浸泡液中浸泡15～30分钟，所述浸泡液包括10～25份的复合酶制剂、1～5份醇类物质及40～100份水；将浸泡液和浸泡后的忍冬花片超声处理1～2小时，静止分层后分离得到上清液；采用装填有树脂填料的色谱层析柱纯水洗脱，去除杂质，获得的洗脱液即忍冬花植物提取液。本发明的制备方法提取率高，制备的忍冬花植物提取液活性成份含量高，具天然防腐性能，使用时温和无刺激，具有美白和有效抵御紫外线辐射危害的功效。

Description

一种用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及忍冬花活性物质提取技术领域，尤其涉及一种用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液及其制备方法。
【背景技术】
忍冬花(金银花)为忍冬科多年生常绿缠绕植物的干燥花蕾或初开的花。其味苦、性寒，具有清热解毒、凉散风热、保肝利胆等功效，是传统的药食同源植物。具有对人体有利的植物活性成分，如绿原酸、异绿原酸、木犀草素等黄酮类化合物。黄酮类化合物具有较高的生物活性，如抗菌、抗病毒，增强机体免疫力，抗氧化及抗自由基、抗癌防癌，并且无毒无害。金银花的提取物可清热祛痘、促进细胞代谢，为肌肤提供营养，帮助肌肤排出毒素，令肌肤光滑润白。同时具有光谱防晒作用，对自由基有很强的清除作用、抗衰老，是理想的天然防晒剂。因此，忍冬花(金银花)的提取是近年来的研究热点。
目前，传统的黄酮提取方法包括有机溶剂提取法、固相萃取法、超临界萃取法、超声波提取法。CN103183615A公开了一种金银花绿原酸的提取方法及其制品，该提取方法以超微粉为原料，通过酒精浸泡1.5～3小时后，滤渣得到浸液，再将浸液冲入未饱和食盐水中浸泡1.5～3小时，经盐浸和脱盐处理，滤去沉渣得到滤液，调节滤液pH值为5.0～6.5，在55～85度条件下进行催化反应1.5～3小时，将催化反应后的溶液用乙酸乙酯萃取得到萃取液，将萃取液在真空条件干燥制得金银花绿原酸晶体原料，然后再高速分离离心制得金银花绿原酸晶体。CN1810763A公开了一种金银花绿原酸提取技术，该方法以金银花鲜花、鲜叶和鲜藤为原料，经打浆－醇沉－醇沉液膜分离－超临界CO2提取出活性物质绿原酸及附产物黄酮。上述忍冬花提取方法具有提取率低、工艺复杂和生产周期长的缺点。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液的方法，以克服现有技术存在的提取率低和忍冬花植物提取液功效性不高的技术缺陷。
为了达到上述目的，本发明提供一种用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)以忍冬花为原料，经预处理后得到长度小于预设值的忍冬花片；
(2)将步骤(1)制得的20～50份忍冬花片置于20～45℃的浸泡液中浸泡15～30分钟，所述浸泡液包括10～25份的复合酶制剂、1～5份醇类物质及40～100份水；
(3)将浸泡液和浸泡后的忍冬花片转移至超声波处理器中，在预设温度下超声处理1～2小时，静止分层后分离得到上清液；
(4)上清液采用装填有树脂填料的色谱层析柱纯水洗脱，去除杂质，获得的洗脱液即忍冬花植物提取液。
优选地，所述复合酶制剂包括按重量比为1：0.5～1.5)混合的第一酶制剂和第二酶制剂，所述第一酶制剂为纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶中的一种或两种以上的混合物，所述第二酶制剂为葡糖氧化酶和/或溶菌酶。
优选地，所述第一酶制剂为所述纤维素酶、所述果胶酶和所述木聚糖酶的混合物，且所述木聚糖酶、所述纤维素酶和所述果胶酶的重量比组成为1：(2～8)：(1～6)。
优选地，所述醇类物质和所述第一酶制剂的重量比为：1：(1～6)。
优选地，所述第二酶制剂为所述葡糖氧化酶和所述溶菌酶的混合物，且所述葡糖氧化酶和所述溶菌酶的重量比为1：(0.5～2)。
优选地，所述复合酶制剂还包括辅酶Q10。
优选地，所述醇类物质为1,2-己二醇、丁二醇、丙二醇、辛甘醇中的一种或两种以上的混合物。
优选地，所述步骤(3)中的预设温度为20～45℃。
本发明同时提供一种用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液，所述忍冬花植物提取液采用上文所述的忍冬花植物提取液的制备方法制备。
与相关技术相比，本发明提供的用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液及其制备方法具有以下有益效果：
一、本发明提供的忍冬花植物提取液利用复合生物酶特有技术，一方面避免了使用有毒性的有机溶剂，提高了忍冬花植物提取液的安全性，另一方面，采用酶法制备忍冬花植物提取液，忍冬花提取率高达85％～95％，活性成份黄酮的含量介于21～24mg之间，浓度介于0.42～0.48mg/mL，活性成份含量高，经测试，该忍冬花植物提取液温和无刺激，抗过敏能力强，能保持肌肤的柔滑水嫩，具有美白和有效抵御紫外线辐射危害的功效，可广泛应用于化妆品工业。
二、在第一酶制剂和醇类物质的共同作用下，全面破解植物细胞壁及细胞间质的密闭结构，忍冬花提取率高(85％～95％)；第二酶制剂能抑制菌斑形成，能够有效去除菌落种群，使提取的忍冬花植物提取液自身具防腐性能，延长了产品的使用寿命。
三、本发明的忍冬花植物提取液为可溶性液体，克服了粉末状忍冬花提取物在各类产品体系中的兼容应用的局限性。
【具体实施方式】
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一、以忍冬花为原料，经预处理后得到长度小于预设值的忍冬花片；
具体地，所述忍冬花选自广东区域忍冬花、湖北区域忍冬花、海南区域忍冬花、江苏区域忍冬花中的一种或多种，优选，采用广东区域忍冬花。
将忍冬花清洗干净后，剪成小片块，然后再使用榨汁机破碎，破碎后的忍冬花片的长度小于8mm。
步骤二、将步骤一制得的20～50份忍冬花片置于20～45℃的浸泡液中浸泡15～30分钟，所述浸泡液包括10～25份的复合酶制剂、1～5份醇类物质及40～100份水；
所述复合酶制剂包括按重量比为1：(0.5～1.5)混合的第一酶制剂和第二酶制剂，其中，所述第一酶制剂为纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶中的一种或两种以上的混合物，所述第二酶制剂为葡糖氧化酶和/或溶菌酶中的一种或两种。所述第一酶制剂用于全面破解植物细胞壁及细胞间质的密闭结构，提高忍冬花提取率，第二酶制剂能抑制菌斑形成，能够有效去除菌落种群，使提取的忍冬花植物提取液自身具防腐性能，延长了产品的使用寿命，且避免加入其他防腐剂使产生过敏现象。通过限定第一酶制剂和第二酶制剂的配比，使得采用该制备方法提取的忍冬花植物提取液不但活性成份含量高，功效性好，且不会产生过敏性。所述醇类物质为1,2-己二醇、丁二醇、丙二醇、辛甘醇中的一种或两种以上的混合物。
优选地，所述第一酶制剂为所述纤维素酶、所述果胶酶和所述木聚糖酶的混合物，且所述木聚糖酶、所述纤维素酶和所述果胶酶和的重量比组成为1：(2～8)：(1～6)；所述第二酶制剂为所述葡糖氧化酶和所述溶菌酶的混合物，且所述葡糖氧化酶和所述溶菌酶的重量比为1：(0.5～2)。当第一酶制剂采用所述纤维素酶、所述果胶酶和所述木聚糖酶的混合物，通过三者的复配可更进一步提高忍冬花的提取率，当第二酶制剂采用所述葡糖氧化酶和所述溶菌酶的混合物，通过二者的复配也可使得忍冬花植物提取液具有更好的防腐性能，延长产品的使用寿命。
优选地，所述醇类物质和所述第一酶制剂重量比为：1：(1～6)。通过进一步限定第一酶制剂和醇类物质的配比，可更全面的破坏植物细胞壁及细胞间质的密闭结构，获得较高提取率。
优选地，所述复合酶制剂还包括辅酶Q10。通过在复合酶制剂中加入辅酶Q10，可提高其在护扶品中应用时的功效。
优选地，所述醇类物质为丙二醇。
其中，纤维素酶与果胶酶能够使细胞壁或细胞间质中的纤维素、果胶等物质降解，破坏细胞壁的致密结构，引起细胞壁及细胞间质结构产生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从传质角度促使有效成分提取率提高。
木聚糖是植物半纤维素的重要组分，木聚糖结构复杂，完全降解需要多种酶的参与，而木聚糖酶是参与降解酶系中最重要的一种。木聚糖是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，木聚糖酶可以破碎植物细胞壁，提高养分的木聚糖降解为聚合度较低的小分子片段，破坏细胞壁的结构，将细胞壁束缚的营养物质释放出来。
葡糖氧化酶能有效快速分解葡聚糖，溶解菌斑，抑制菌斑形成，能够有效去除菌落种群。
溶菌酶是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活，因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，性质很稳定。
辅酶Q10是一种脂溶性抗氧化剂，能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能。同时能深入细胞，强化细胞新成代谢功能，活络细胞间紧实结合能力，另一方面在表皮层形成弹性的网状结构，确实修补因失水性造成的皱纹，并进而达到真正的保湿功效。
1,2-己二醇、丁二醇、丙二醇和辛甘醇均能够溶解一定的植物体成分，同时安全性好，具有各自的优良特性。如1,2-己二醇，能够高效长久保湿，还有着防腐杀菌的功效；丁二醇触感滑爽，性质稳定，可以获得更柔软的肤感；丙二醇的粘性和吸湿性好，无毒；辛甘醇具有一定的保湿与抗菌活性。
步骤三、将浸泡液和浸泡后的忍冬花片转移至超声波处理器中，在预设温度下超声处理1～2小时，静止分层后分离得到上清液；其中，分离方法可以为离心或过滤，所述预设温度为20～45℃。
一般情况下，为了减少制备工艺时间，超声处理的预设温度和浸泡的温度相同。
步骤四、上清液采用装填有树脂填料的色谱层析柱纯水洗脱，去除杂质，获得的洗脱液即忍冬花植物提取液。
本发明还提供一种用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液，所述忍冬花植物提取液采用上文所述的无防腐剂的忍冬花植物提取液的制备方法制备。
上文所述的忍冬花植物提取液可在护肤品中应用，一方面，可为肌肤提供营养，帮助肌肤排毒并保持肌肤光滑润白，另一面，具有光谱防晒作用，能有效抵御紫外线辐射危害。
一、采用实施例1至实施例10的方法制备忍冬花植物提取液，具体如下：
实施例1
将20份忍冬花清洗干净，剪成小片，使用榨汁机破碎；再加入40份水、10份复合酶制剂(纤维素酶3份、果胶酶2份、木聚糖酶1份、葡糖氧化酶2份、溶菌酶2份)和1份丙二醇置于20℃恒温水浴锅内浸泡15min；浸泡完成后再转移至超声波处理器中，在20℃下超声1h；静置分层，离心或过滤得到上清液；使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱，用水洗涤以除去杂质，收集的洗脱液即忍冬花植物提取液。
实施例2
将25份忍冬花清洗干净，剪成小片，使用榨汁机破碎；再加入50份水、14份复合酶制剂(纤维素酶4份、果胶酶3份、木聚糖酶1.5份、葡糖氧化酶3份、溶菌酶2.5份)和2.5份丙二醇置于20℃恒温水浴锅内浸泡15min；浸泡完成后再转移至超声波处理器中，在20℃下超声1h；静置分层，离心或过滤得到上清液；使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱，用水洗涤以除去杂质，收集的洗脱液即忍冬花植物提取液。
实施例3
将25份忍冬花清洗干净，剪成小片，使用榨汁机破碎；再加入50份水、13.5份复合酶制剂(纤维素酶2份、果胶酶4.5份、木聚糖酶1份、葡糖氧化酶3.5份、溶菌酶2.5份)和2.5份醇类物质(1,2-己二醇1份、丙二醇1.5份)置于20℃恒温水浴锅内浸泡15min；浸泡完成后再转移至超声波处理器中，在20℃下超声1h；静置分层，离心或过滤得到上清液；使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱，用水洗涤以除去杂质，收集的洗脱液即忍冬花植物提取液。
实施例4
将25份忍冬花清洗干净，剪成小片，使用榨汁机破碎；再加入50份水、13份复合酶制剂(纤维素酶4份、果胶酶3份、木聚糖酶0.5份、葡糖氧化酶2份、溶菌酶3.5份)和2.5份醇类物质(丙二醇1.5份、辛甘醇1份)置于25℃恒温水浴锅内浸泡30min；浸泡完成后再转移至超声波处理器中，在25℃下超声1h；静置分层，离心或过滤得到上清液；使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱，用水洗涤以除去杂质，收集的洗脱液即忍冬花植物提取液。
实施例5
将25份忍冬花清洗干净，剪成小片，使用榨汁机破碎；再加入50份水、15份复合酶制剂(纤维素酶3份、果胶酶2.5份、木聚糖酶2.5份、葡糖氧化酶3.5份、溶菌酶3.5份)和2.5份丙二醇置于25℃恒温水浴锅内浸泡30min；浸泡完成后再转移至超声波处理器中，在20℃下超声1.5静置分层，离心或过滤得到上清液；使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱，用水洗涤以除去杂质，收集的洗脱液即忍冬花植物提取液。
实施例6
将25份忍冬花清洗干净，剪成小片，使用榨汁机破碎；再加入100份水、15份复合酶制剂(纤维素酶3.5份、果胶酶3.5份、木聚糖酶2.5份、葡糖氧化酶2份、溶菌酶3.5份)和5份丙二醇置于25℃恒温水浴锅内浸泡30min；浸泡完成后再转移至超声波处理器中，在20℃下超声1.5h，静置分层，离心或过滤得到上清液；使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱，用水洗涤以除去杂质，收集的洗脱液即忍冬花植物提取液。
实施例7
将50份忍冬花清洗干净，剪成小片，使用榨汁机破碎；再加入100份水、25份复合酶制剂(纤维素酶6份、果胶酶7份、溶菌酶6.5份、辅酶Q10 5.5份)和5份醇类物质(丙二醇2.5份、辛甘醇2.5份)置于45℃恒温水浴锅内浸泡30min；浸泡完成后再转移至超声波处理器中，在45℃下超声2h，静置分层，离心或过滤得到上清液；使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱，用水洗涤以除去杂质，收集的洗脱液即忍冬花植物提取液。
实施例8
将50份忍冬花清洗干净，剪成小片，使用榨汁机破碎；再加入100份水、25份的复合酶制剂(纤维素酶6.5份、葡糖氧化酶6.5份、溶菌酶7份、辅酶Q10 5份)和5份丁二醇置于40℃恒温水浴锅内浸泡30min；浸泡完成后再转移至超声波处理器中，在40℃下超声2h，静置分层，离心或过滤得到上清液；使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱，用水洗涤以除去杂质，收集的洗脱液即忍冬花植物提取液。
实施例9
将30份忍冬花清洗干净，剪成小片，使用榨汁机破碎；再加入60份水、15份的复合酶制剂(纤维素酶4份、果胶酶2份、葡糖氧化酶4份、辅酶Q10 5份)和3份1,2-己二醇置于40℃恒温水浴锅内浸泡25min；浸泡完成后再转移至超声波处理器中，在40℃下超声1h，静置分层，离心或过滤得到上清液；使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱，用水洗涤以除去杂质，收集的洗脱液即忍冬花植物提取液。
实施例10
将30份忍冬花清洗干净，剪成小片，使用榨汁机破碎；再加入60份水、15份的复合酶制剂(果胶酶3.5份、木聚糖酶2.5份、溶菌酶4.5份、辅酶Q10 4.5份)和3份醇类物质(1,2-己二醇1.5份、辛甘醇1.5份)置于25℃恒温水浴锅内浸泡25min；浸泡完成后再转移至超声波处理器中，在25℃下超声1h，静置分层，离心或过滤得到上清液；使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱，用水洗涤以除去杂质，收集的洗脱液即忍冬花植物提取液。
二、为了进一步说明本发明实施例提供的忍冬花植物提取液的安全性及功效性，以下通过试验例进一步说明本发明实施例提供的忍冬花植物提取液的有益效果：
试验五至试验九提供的对照品均为市售的忍冬花提取液，具体如下：
对照品1对应的忍冬花提取液，供应商为：广州美懿生物科技有限公司；
对照品2对应的忍冬花提取液，供应商为：赣州佰珍堂生物科技有限公司；
对照品3对应的忍冬花提取液，供应商为：广州雅顿化工科技有限公司；
对照品4对应的忍冬花提取液，供应商为：广州宇泰化工科技有限公司。
试验一：提取率测定(黄酮测定方法)
忍冬花中含有丰富的绿源酸、异绿原酸、木犀草酸等黄酮类物质，通过测定实施例1～10中制得的忍冬花提取物的黄酮类物质含量，从而求出提取率。
反应原理：黄酮类物质在氧化剂亚硝酸盐存在的情况下，与硝酸铝生成黄色的黄酮铝络合物，在碱性环境下显红色。采用络合-分光光度法，以芦丁为对照品测定忍冬花(或忍冬花提取液)中黄酮类物质含量，加入铝离子试剂使黄酮类化合物与铝盐形成络合物。利用紫外可见分光光度计在波长510nm处测定吸光度值，对照芦丁标准曲线，测得黄酮类含量。
1、芦丁标准曲线的绘制
精确吸取浓度为0.1mg/mL的芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6支比色管中，分别加入60％乙醇溶液定容至5.0mL，加入5％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，静置6min；加入10％硝酸铝溶液0.3mL，静置6min；加入1.0mol/L NaOH溶液4.0mL与去离子水0.4mL，静置15min，用分光光度计于510nm波长下测定吸光度值A，以吸光度值对芦丁标准溶液(mg/mL)作图。
2、提取液中黄酮的测定
取3支25mL比色管，分别作为空白、样品和样品校正。依次精确吸取0、2.0mL、2.0mL样液于三支试管中，各加60％乙醇溶液定容至5.0mL，加入5％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，静置6min；加入10％硝酸铝溶液0.3mL，静置6min；加入1.0mol/L NaOH溶液4.0mL与去离子水0.4mL，静置15min，用分光光度计于510nm波长下测定吸光度值A，从工作曲线中算出提取液中总黄酮的含量。
实验得芦丁标准曲线回归方程为：Y＝6.225X+0.0019，相关系数为R＝0.9995；其中X为芦丁标准品浓度(mg/mL)，Y为吸光度值。
忍冬花提取率＝100％×提取液中黄酮含量/所用忍冬花重量
表1
将酶法能够应用于忍冬花提取，利用纤维素酶、木聚糖酶及果胶酶的催化作用，强烈破坏植物细胞的纤维素、细胞壁等致密结构，使有效成分溶出，再加上醇类物质的共同溶解作用，极大提高提取率。本发明的实施例1～10的忍冬花提取率均在85％以上。
试验二：防腐效果测试
1、试验样品：本发明实施例1～10提供的忍冬花植物提取液样品；实验菌为大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、铜绿假单胞菌ATCC 9027、白色念珠菌ATCC10231。
2、试验方法：微生物挑战性实验方法。
3、试验结果评定：采用《欧洲药典》的结果评定标准对本次试验结果进行评定，具体详见下表2。
表2
从表2的测试结果可知，4种实验菌于第7天时(1周)菌落总数均下降100％，至第28天时无增长，判定通过挑战性实验，防腐效能良好，即本发明实施例提供的忍冬花植物提取液采用溶菌酶、葡糖氧化酶及多元醇复配构建的防腐体系的防腐效果良好。
试验三：眼部刺激性/腐蚀性测试
1、试验样品：本发明实施例1～10提供的忍冬花植物提取液。
2、试验方法：SN/T 2329-2009化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验。
3、试验结果评价标准：刺激评分标准分为以下等级：IS＜1为无刺激性；1≤IS＜5为轻刺激性；5≤IS＜9为中度刺激性；IS≥10为强刺激性/腐蚀性。
4、试验结果：经过试验，本发明实施例1～10提供的忍冬花植物提取液的刺激评分均为IS＜1，即本发明实施例提供的忍冬花植物提取液对眼部温和无刺激性。
试验四：皮肤刺激性试验
(一)皮肤封闭型斑贴试验
1、试验样品：本发明实施例提供1～10的忍冬花植物提取液。
2、试验方法：从某一区域选择22名志愿者，志愿者的年龄在20～45岁之间，身体健康，近期未服用药物，非哺乳妇女或妊娠妇女，非体质敏感者。随机将志愿者平均分成11组，每组两个人。其中，组1为空白对照组，斑试器小室内不放置任何物质，将斑试器用低致敏胶带贴敷于志愿者的背部或者前臂屈侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷在皮肤上；组2～组11与组1的处理方法相同，不同的是：分别将加有0.025mL本发明实施例1～10提供的忍冬花植物提取液放入斑试器小室内；即组2对应的是本发明实施例1提供的忍冬花植物提取液，组3对应的是本发明实施例2提供的忍冬花植物提取液，组4对应的是本发明实施例3提供的忍冬花植物提取液……以此类推，组11对应的是本发明实施例10提供的忍冬花植物提取液。各组试验持续24小时、48小时后，去除斑试器后30min，待压痕消失后，观察贴敷处皮肤的反应情况并记录。
其中，皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准见下表3。
表3
在整个试验过程中，组1～组11的受试者的受势部位皮肤反应均呈阴性反应。由此可以看出，本发明实施例提供的忍冬花植物提取液不会引起皮肤的过敏和刺激反应，安全性好。
(二)重复性开放型涂抹试验
1、试验样品：本发明实施例提供的忍冬花植物提取液。
2、从某一区域中选择22名志愿者，志愿者的年龄在20-45岁之间，身体健康，近期未服用药物，非哺乳妇女或妊娠妇女，非体质敏感者。随机将志愿者平均分成11组，每组两个人。其中，组1为空白对照组，以前臂屈作为受试部位，面积3×3cm2，受试部位保持干燥，受试前和受势期间避免接触其他外用制剂，用超纯水0.05±0.005g/次，均匀地涂抹受试部位；组2～组11分别为试验组，与组1不同的是：采用本发明实施例1～10提供的忍冬花植物提取液0.05±0.005g/次均匀地涂抹受试部位；其中，组2对应本发明实施例1提供的忍冬花植物提取液，组3对应本发明实施例2提供的忍冬花植物提取液，组4对应本发明实施例3提供的忍冬花植物提取液……以此类推，组11对应本发明实施例10提供的忍冬花植物提取液。各组每天进行2次均匀地涂抹受试部位，连续试验7天后完成试验，每天观察受试者的受试部位的皮肤反应情况并记录。在试验的过程中，如果出现如下表8中的3分以上的皮肤反应情况时，可停止继续试验并记录结果。
其中，表4为皮肤重复性开放型涂抹试验皮肤反应评判标准表。
表4
在整个试验过程中，组1～组11的受试者的受势部位的皮肤反应均呈阴性反应。由此可以看出，本发明实施例提供的忍冬花植物提取液不会引起皮肤的过敏和刺激反应，安全性好。
试验五：抑菌性实验
1、试验样品：选取市售的对照品1～4及本发明实施例1～10提供的忍冬花植物提取液进行测试。
2、试验方法：参考卫生部《消毒技术规范》2008版。试验菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌。
在试验过程中，将本发明实施例1～10提供的忍冬花植物提取液样品分别配制成浓度为1％的试样，并放置于编号1～10的容量瓶或锥形瓶中，备用。并配制实验用菌悬液，平均分装到编号1a～10a的锥形瓶中，然后，分别取等量的各试样液添加到1a～10a的锥形瓶中，将待试样液与实验用菌悬液中的试验菌种充分混合均匀并相互作用20min后，开始测试并记录每个锥形瓶中的试验菌种的杀灭率。
3、试验结果：试验结果详见下表5，其中，杀灭率＝(试验后存活的菌种数量/初始菌种的数量)×100％。
表5
从表5的试验结果中可以看出，本发明中的实施例1～10提供的对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的杀灭率均在90％以上，明显优于对照品1～4的杀菌率。在溶菌酶与葡萄氧化酶的复合作用下，能抑制菌斑形成，能够有效去除菌落种群。在第二酶制剂(溶菌酶和/或葡萄氧化酶)与忍冬花的共同作用下，使得发明的忍冬花植物提取液有效强化抑菌功能。
试验六：抗氧化性实验
1、试验样品：选取市售的对照品1～4及本发明实施例1～10提供的忍冬花植物提取液进行测试。
2、试验方法：高锰酸钾溶液滴定法：配制5mmol/L的高锰酸钾溶液。
取2mL实施例1～10的忍冬花植物提取液于干净的锥形瓶中，加入50mL的蒸馏水，然后用5mmol/L的高锰酸钾溶液进行标定，当锥形瓶中的溶液由浅茶色变为淡紫色，且30s内不褪色，即为滴定终点，记录消耗高锰酸钾的体积V。
表6
实施例 消耗高锰酸钾的体积V/mL 实施例 消耗高锰酸钾的体积V/mL
实施例1 28.95 实施例8 28.85
实施例2 28.16 实施例9 28.19
实施例3 29.44 实施例10 29.40
实施例4 29.81 对照品1 16.54
实施例5 29.18 对照品2 10.35
实施例6 30.11 对照品3 12.37
实施例7 29.31 对照品4 11.12
忍冬花植物提取液能够与高锰酸钾溶液发生氧化还原反应，消耗的高锰酸钾的体积越多，说明提取液中含有较多的还原性物质，代表着该提取液的抗氧化性越强。如表6可知，本发明的实施例1～10中忍冬花植物提取液的抗氧化性能力强于市售对照品1～4，抗氧化能力强。
试验七：过敏性实验(透明质酸酶体外抑制试验)
实验样品：选取市售的对照品1～4以及本发明实施例1～10提供的忍冬花提取物进行测试。
取0.1mL 0.25mmol/L CaCl2溶液和0.5mL透明质酸酶液于37℃恒温水浴锅内培养20min；随后加入样品液0.5mL，恒温培养20min；再加入0.5mL透明质酸钠液37℃恒温30min。随后置于常温放置5min后，加入0.1mL 0.4mol/L NaOH溶液和0.5mL乙酰丙酮溶液，置沸水浴中加热15min后，立即用冰水冷却5min；最后加入埃尔利希试剂1.0mL并用3.0mL无水乙醇进行稀释，放置20min显色，用分光光度计测定其吸光度(A)。
透明质酸酶抑制率＝[(A-B)-(C-D)]×100％/(A-B)；A为对照溶液吸光度(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)，B为对照空白溶液吸光度(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)，C为试样溶液吸光度值，D为试样空白溶液吸光度(用醋酸缓冲溶液代替酶液)
表7
透明质酸酶是过敏反应参与者，其与过敏有强相关性，许多抗过敏药物有强抑制透明质酸酶活性的作用。本实验采用透明质酸酶体外抑制试验对本发明中的实施例1～10进行过敏性功效测试，实验发现本发明的忍冬花提取物对于透明质酸酶抑制率均在90％以上，具有较好的抗过敏效果，抗敏性明显高于市售对照品1～4，结果见表7。
试验八：美白功效性实验(抑制酪氨酸酶活性试验)
实验样品：选取市售的对照品1～4以及本发明实施例1～10提供的忍冬花提取物进行测试。
实验方法：将L-酪氨酸、实验样品、PBS缓冲液依次加到编号为A1、A2、B1、B2组各管中混匀；将试管架放入37℃恒温水浴锅中水浴10～15min；将酪氨酸酶依次加入A1和B1组各管中、摇匀，准确计时，反应15min停止；依次在96孔板上点板，用酶标仪测定其吸光度并计算抑制率。
抑制率＝[(A1-A2)-(B1-B2)]×100％/(A1-A2)：A1为空白样板有酶体系吸光度；A2为空白样板无酶体系吸光度；B1为样品组有酶体系吸光度；
B2为样品组无酶体系吸光度。
表8
酪氨酸酶在黑色素生物合成过程中起关键作用，它控制着黑素形成过程，其活性程度对色素形成的数量与沉积起主要作用。美白类物质就是通过抑制酪氨酸酶活性或阻断从酪氨酸生成黑色素的氧化反应减少黑色素的生成达到美白皮肤的效果。如表8所示，本发明的实施例1～10对酪氨酸酶具有明显的抑制作用，抑制率率高达85％以上，且为对照品1～4的两倍多。说明本发明的忍冬花提取物较市售对照品而言，具有很好的美白功效。
实验九：保湿效果
实验样品：选取市售的对照品1～4以及本发明实施例1～10提供的忍冬花提取物进行测试。
实验方法：用皮肤测试仪测量固定手臂的初始参数指标初始值(水份、油份、弹性、胶原纤维等)，涂抹等量的忍冬花植物提取液，涂抹均匀，等待1分钟至皮肤完全吸收，测试涂抹后固定手臂处的各参数指标值。
表9
通过表9可知，相比较对照品1～4，本发明的忍冬花提取物能够明显增加皮肤的水分，增加肌肤的水润度，保持肌肤的柔滑水嫩；吸收1h后，肌肤的水分增加值基本上保持不变，能够长效保湿。
实验十：防紫外线实验
1、试验样品：本发明实施例6提供的忍冬花植物提取液及对照品1～4中的忍冬提取液。
2、取健康成年雌雄兔各18只，且大小体重相同。随机将雌兔(雄兔)平均分成6组，每组3只。其中，组1为空白对照组，选用兔背3处(上、左、右)作为固定受试部位，面积3×3cm2，受试部位保持干燥，受试前和受势期间避免接触其他外用制剂，用超纯水0.05±0.005g/次，均匀地涂抹受试部位；组2～组5分别为试验组，与组1不同的是：采用本发明实施例6提供的忍冬花植物提取液及对照品1～4中的忍冬花植物提取液0.05±0.005g/次均匀地涂抹受试部位；其中，组2对应本发明实施例6提供的忍冬花植物提取液，组3对应对照品1提供的忍冬花植物提取液，组4对应对照品2提供的忍冬花植物提取液，组5对应对照品3提供的忍冬花植物提取液，组6对应对照品4提供的忍冬花植物提取液。各组每天进行早晚2次均匀地涂抹受试部位，将雌兔(雄兔)在炎热夏季12点至14点期间，暴露于阳光下照射，照射2h，连续试验7天后完成试验，7天后观察雌兔(雄兔)的受试部位的皮肤反应情况并记录。皮肤明显变化指较初始肌肤出现晒黑、脱皮、红肿等皮肤问题。
记录结果其中防紫外线效果＝100％×区域(雌兔或雄兔背部无明显变化的区域)/总测试区域(雌兔或雄兔的总测试区域)
表10
炎热夏季12-14点间，太阳紫外光线最为强烈。涂抹本发明的实施例6中的忍冬花植物提取液后，将雌雄兔放置强烈的紫外线条件下每天照射2h，连续一周后发现雌兔与雄兔的防紫外线效果高达100％，明显优于对照品1～4，说明本发明的忍冬花植物提取液有效抵御紫外线辐射危害，结果详见表10。
本发明提供的用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液及其制备方法具有以下有益效果：
一、本发明提供的忍冬花植物提取液利用复合生物酶特有技术，一方面避免了使用有毒性的有机溶剂，提高了忍冬花植物提取液的安全性，另一方面，采用酶法制备忍冬花植物提取液，忍冬花提取率高达85％～95％，活性成份黄酮的含量介于21～24mg之间，浓度介于0.42～0.48mg/mL，活性成份含量高，经测试，该忍冬花植物提取液温和无刺激，抗过敏能力强，能保持肌肤的柔滑水嫩，具有美白和有效抵御紫外线辐射危害的功效，可广泛应用于化妆品工业。
二、在第一酶制剂和醇类物质的共同作用下，全面破解植物细胞壁及细胞间质的密闭结构，忍冬花提取率高(85％～95％)；第二酶制剂能抑制菌斑形成，能够有效去除菌落种群，使提取的忍冬花植物提取液自身具防腐性能，延长了产品的使用寿命。
三、本发明的忍冬花植物提取液为可溶性液体，克服了粉末状忍冬花提取物在各类产品体系中的兼容应用的局限性。
以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以忍冬花为原料，经预处理后得到长度小于预设值的忍冬花片；
(2)将步骤(1)制得的20～50份忍冬花片置于20～45℃的浸泡液中浸泡15～30分钟，所述浸泡液包括10～25份的复合酶制剂、1～5份醇类物质及40～100份水；
(3)将浸泡液和浸泡后的忍冬花片转移至超声波处理器中，在预设温度下超声处理1～2小时，静止分层后分离得到上清液；
(4)上清液采用装填有树脂填料的色谱层析柱纯水洗脱，去除杂质，获得的洗脱液即忍冬花植物提取液。
2.根据权利要求1所述的用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液的制备方法，其特征在于，所述复合酶制剂包括按重量比为1：(0.5～1.5)混合的第一酶制剂和第二酶制剂，所述第一酶制剂为纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶中的一种或两种以上的混合物，所述第二酶制剂为葡糖氧化酶和/或溶菌酶。
3.根据权利要求2所述的用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液的制备方法，其特征在于，所述第一酶制剂为所述纤维素酶、所述果胶酶和所述木聚糖酶的混合物，且所述木聚糖酶、所述纤维素酶和所述果胶酶和的重量比组成为1：(2～8)：(1～6)。
4.根据权利要求2所述的用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液的制备方法，其特征在于，所述醇类物质和所述第一酶制剂的重量比为1：(1～6)。
5.根据权利要求2所述的用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液的制备方法，其特征在于，所述第二酶制剂为所述葡糖氧化酶和所述溶菌酶的混合物，且所述葡糖氧化酶和所述溶菌酶的重量比为1：(0.5～2)。
6.根据权利要求2至5任一项所述的用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液的制备方法，其特征在于，所述复合酶制剂还包括辅酶Q10。
7.根据权利要求1所述的用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液的制备方法，其特征在于，所述醇类物质为1,2-己二醇、丁二醇、丙二醇、辛甘醇中的一种或两种以上的混合物。
8.根据权利要求1所述的用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的预设温度为20～45℃。
9.一种用生物酶加工和防腐的忍冬花植物提取液，其特征在于，所述忍冬花植物提取液采用权利要求1至8任一项所述的忍冬花植物提取液的制备方法制备。
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CN114948819A (zh) * 2022-06-28 2022-08-30 中国农业科学院麻类研究所 一种具有修复功效的忍冬花发酵物及其制备方法
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CN116370386A (zh) * 2023-05-31 2023-07-04 广州巴宝莉化妆品有限公司 一种鲜花活性原液的提取方法及化妆品
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