CN108524349A - 一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液及其制备方法 - Google Patents

一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明适用于植物提取领域，提供了一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：往20～50份洋甘菊中加入40～100份水、10～25份复合酶制剂和1～5份醇类物质，于20～45℃浸泡15～30min后，于20～45℃超声处理1～2h后静置分层，离心或过滤，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液。本发明利用复合生物酶制备洋甘菊植物提取液，在纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、溶菌酶、葡糖氧化酶和多元醇的共同作用下，全面破解植物细胞壁及细胞间质的致密结构，洋甘菊提取率高。得到的洋甘菊植物提取液温和无刺激，抗敏能力强，具有美白功效和天然防腐性能。

Description

一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液及其制备方法
技术领域
本发明属于植物提取领域，尤其涉及一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液及其制备方法。
背景技术
洋甘菊(Matricaria chamomillaL.)又称母菊，为菊科母菊属(Matricaria)的一年生或多年生草本，全草香气，含有挥发性芳香油，具有抗过敏、杀菌、保湿美白等功能，是一种极具开发价值的香料植物。
常用的洋甘菊的提取方法主要分为水提法与有机溶剂提取法。水提法是用水溶液提取洋甘菊粉末，该提取方法的优点是成本低、安全性高，适于工业生产，缺点是提取率低。
有机溶剂提取法是利用一些极性溶剂如甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿或混合溶液提取洋甘菊中的有效成分。虽然有机溶剂能够提高洋甘菊的提取率，但是大多数有机溶剂都易燃易爆、有毒或具有强刺激性，会危害人体和污染环境，同时提取成本也比较高。
中药材的有效成分往往需要破除中药材细胞壁的阻碍才能被分离出来，但中药材的细胞壁以及细胞间质中的半纤维素、果胶质、纤维素等会形成较为致密的组织，使得在常规情况下药材的有效成分很难快速的被溶出，提取困难。采用酶法，可以加大生物反应的速度，使得中药材致密的组织能够通过快速酶反应而失去阻碍的效能，这样有效成分就可以从药材里溶出来。
酶是一种专一性强、催化效率高的生物催化剂，能够应用于中药材的提取。将酶应用于中药材提取，可以利用其较强的催化作用破坏药材细胞的纤维素、细胞壁等致密结构，使有效成分溶出来。
目前，利用酶提取洋甘菊有效成分的研究较多，洋甘菊提取原料绝大多数为粉末状，其提取率较低，在各类产品体系中的兼容应用具有局限性。也有不乏洋甘菊植物提取液的研究报道，但由于洋甘菊植物提取液中含有丰富的有机酸、糖分、蛋白质和黄酮类等物质，仅通过纤维素酶或果胶酶作用制得的洋甘菊提取物容易滋生细菌，即使提取率高、不刺激皮肤，但洋甘菊提取物不易保存，严重降低其功效。因此，众多生产厂家会在洋甘菊提取物中添加防腐剂，以延长其使用寿命，如此一来，由于防腐剂的“负面”作用，反而使得洋甘菊提取物的抗敏效果大打折扣。
发明内容
本发明实施例提供一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，旨在解决现有技术中洋甘菊的提取率不高、存在过敏等反应的防腐及有机溶剂成分、缺乏安全性及功效性等的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，包括如下步骤：
往20～50份洋甘菊中加入40～100份水、10～25份复合酶制剂和1～5份醇类物质，于20～45℃浸泡15～30min后，于20～45℃超声处理1～2h后静置分层，离心或过滤，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述份数为重量份数。
优选的，所述的洋甘菊采用如下方法进行预处理：将新鲜采摘的洋甘菊除去杂质及梗，清洗干净，使用榨汁机破碎。
优选的，所述的洋甘菊为罗马洋甘菊(CHAMAEMELUM NOBILE)、德国洋甘菊(MATRICARIA RECUTICA)和摩洛哥洋甘菊(ORMENIS MULTICAULIS)中的一种或两种混合物。
更优选的，所述的洋甘菊为罗马洋甘菊(CHAMAEMELUM NOBILE)。
所述的水为纯净水。
优选的，所述的复合酶制剂为纤维素酶、果胶酶、葡糖氧化酶、溶菌酶和辅酶Q10中的一种或至少两种的混合物。
更优选的，所述的复合酶制剂为纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、葡糖氧化酶和溶菌酶的混合物。
优选地，所述的醇类物质为1,2-己二醇、丁二醇、丙二醇和辛甘醇中的一种或至少两种的混合物。
更优选地，所述的醇类物质为1,2-己二醇。
1,2-己二醇、丁二醇、丙二醇和辛甘醇均能够溶解一定的植物体成分，同时安全性好，具有各自的优良特性。如1,2-己二醇，能够高效长久保湿，还有着防腐杀菌的功效；丁二醇触感滑爽，性质稳定，可以获得更柔软的肤感；丙二醇的粘性和吸湿性好，无毒；辛甘醇具有一定的保湿与抗菌活性。
所述的浸泡在恒温水浴锅内进行。
所述的超声的频率为30～50HZ，优选为35HZ。
所述的色谱柱层析分离采用如下方法进行：使所述上清液通过树脂色谱层析柱，用水洗涤至洗脱液澄清无颗粒性不溶物时(以除去杂质)，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述的树脂色谱层析柱长457mm，直径40mm。
本发明实施例还提供由上述制备方法得到的洋甘菊植物提取液。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明利用复合生物酶制备洋甘菊植物提取液，在纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、溶菌酶、葡糖氧化酶和多元醇的共同作用下，全面破解植物细胞壁及细胞间质的致密结构，洋甘菊提取率高。
(2)本发明制备得到的洋甘菊植物提取液为可溶性液体，克服粉末状洋甘菊提取物在各类产品体系中兼容应用的局限性。制备得到的洋甘菊植物提取液温和无刺激，抗敏能力强，具有美白功效。
(3)通过复合生物酶与多元醇的方法提取洋甘菊，利用复合酶葡萄糖氧化酶与溶菌酶的特有复配技术，使得本发明的洋甘菊植物提取液能够依靠自身特有的防腐性能，延长产品的使用寿命，同时有效避免了有毒性的有机溶剂，提高洋甘菊植物提取液的安全性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本申请中，纤维素酶与果胶酶能够使细胞壁或细胞间质中的纤维素、果胶等物质降解，破坏细胞壁的致密结构，引起细胞壁及细胞间质结构产生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从传质角度促使有效成分提取率提高。
木聚糖是植物半纤维素的重要组分，木聚糖结构复杂，完全降解需要多种酶的参与，而木聚糖酶是参与降解酶系中最重要的一种。木聚糖是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，木聚糖酶可以破碎植物细胞壁，提高养分的木聚糖降解为聚合度较低的小分子片段，破坏细胞壁的结构，将细胞壁束缚的营养物质释放出来。
葡糖氧化酶能有效快速分解葡聚糖，溶解菌斑，抑制菌斑形成，能够有效去除菌落种群。
溶菌酶是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，性质很稳定。
辅酶Q10是一种脂溶性抗氧化剂，能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能。同时能深入细胞，强化细胞新成代谢功能，活络细胞间紧实结合能力，另一方面在表皮层形成弹性的网状结构，确实修补因失水性造成的皱纹，并进而达到真正的保湿功效。
本发明利用复合生物酶制备洋甘菊植物提取液，在纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和多元醇的共同作用下，全面破解植物细胞壁及细胞间质的致密结构，洋甘菊提取率高。
实施例1
一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，包括如下步骤：
将20份洋甘菊除去杂质及梗，用清水清洗干净后采用榨汁机破碎，得到破碎的洋甘菊；往上述破碎的洋甘菊中加入40份水(纯净水)、10份复合酶制剂(纤维素酶3份、果胶酶2份、葡糖氧化酶2份、木聚糖酶1份和溶菌酶2份)和1份醇类物质(1,2-己二醇)，于20℃恒温水浴锅内浸泡15min后，于20℃超声处理(超声的频率为35HZ)1h后静置分层，离心，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述份数为重量份数。
所述的色谱柱层析分离采用如下方法进行：使所述上清液通过树脂色谱层析柱(树脂色谱层析柱：长457mm，直径40mm。)，用水洗涤至洗脱液澄清无颗粒性不溶物时(以除去杂质)，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液。
实施例2
一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，包括如下步骤：
将25份洋甘菊除去杂质及梗，用清水清洗干净后采用榨汁机破碎，得到破碎的洋甘菊；往上述破碎的洋甘菊中加入50份水(纯净水)、14份复合酶制剂(纤维素酶4份、果胶酶3份、葡糖氧化酶3份、木聚糖酶1.5份和溶菌酶2.5份)和2.5份醇类物质(1,2-己二醇)，于20℃恒温水浴锅内浸泡15min后，于20℃超声处理(超声的频率为40HZ)1h后静置分层，过滤，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述份数为重量份数。
所述的色谱柱层析分离采用如下方法进行：使所述上清液通过树脂色谱层析柱(树脂色谱层析柱：长457mm，直径40mm。)，用水洗涤至洗脱液澄清无颗粒性不溶物时(以除去杂质)，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液。
实施例3
一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，包括如下步骤：
将25份洋甘菊除去杂质及梗，用清水清洗干净后采用榨汁机破碎，得到破碎的洋甘菊；往上述破碎的洋甘菊中加入50份水(纯净水)、14份复合酶制剂(纤维素酶2份、果胶酶4.5份、葡糖氧化酶3.5份、木聚糖酶1.5份、溶菌酶2.5份)和2.5份醇类物质(1,2-己二醇1份和丁二醇1.5份)，于20℃恒温水浴锅内浸泡15min后，于20℃超声处理(超声的频率为35HZ)1h后静置分层，过滤，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述份数为重量份数。
所述的色谱柱层析分离采用如下方法进行：使所述上清液通过树脂色谱层析柱(树脂色谱层析柱：长457mm，直径40mm。)，用水洗涤至洗脱液澄清无颗粒性不溶物时(以除去杂质)，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液。
实施例4
一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，包括如下步骤：
将25份洋甘菊除去杂质及梗，用清水清洗干净后采用榨汁机破碎，得到破碎的洋甘菊；往上述破碎的洋甘菊中加入50份水(纯净水)、15份复合酶制剂(纤维素酶4份、果胶酶3份、木聚糖酶2.5份、葡糖氧化酶2份、溶菌酶3.5份)和2.5份醇类物质(1,2-己二醇1份和丙二醇1.5份)，于25℃恒温水浴锅内浸泡30min后，于25℃超声处理(超声的频率为35HZ)1h后静置分层，过滤，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述份数为重量份数。
所述的色谱柱层析分离采用如下方法进行：使所述上清液通过树脂色谱层析柱(树脂色谱层析柱：长457mm，直径40mm。)，用水洗涤至洗脱液澄清无颗粒性不溶物(以除去杂质)时，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液。
实施例5
一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，包括如下步骤：
将25份洋甘菊除去杂质及梗，用清水清洗干净后采用榨汁机破碎，得到破碎的洋甘菊；往上述破碎的洋甘菊中加入50份水(纯净水)、12.5份复合酶制剂(纤维素酶3份、果胶酶2.5份、葡糖氧化酶3.5份和溶菌酶3.5份)和2.5份醇类物质(1,2-己二醇)，于25℃恒温水浴锅内浸泡30min后，于20℃超声处理(超声的频率为35HZ)1.5h后静置分层，离心，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述份数为重量份数。
所述的色谱柱层析分离采用如下方法进行：使所述上清液通过树脂色谱层析柱(树脂色谱层析柱：长457mm，直径40mm。)，用水洗涤至洗脱液澄清无颗粒性不溶物时(以除去杂质)，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液。
实施例6
一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，包括如下步骤：
将25份洋甘菊除去杂质及梗，用清水清洗干净后采用榨汁机破碎，得到破碎的洋甘菊；往上述破碎的洋甘菊中加入100份水(纯净水)、15份复合酶制剂(纤维素酶3.5份、果胶酶3.5份、木聚糖酶2.5、葡糖氧化酶2份和溶菌酶3.5份)和5份醇类物质(1,2-己二醇)，于25℃恒温水浴锅内浸泡30min后，于20℃超声处理(超声的频率为35HZ)1.5h后静置分层，离心，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述份数为重量份数。
所述的色谱柱层析分离采用如下方法进行：使所述上清液通过树脂色谱层析柱(树脂色谱层析柱：长457mm，直径40mm。)，用水洗涤至洗脱液澄清无颗粒性不溶物时(以除去杂质)，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液。
实施例7
一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，包括如下步骤：
将50份洋甘菊除去杂质及梗，用清水清洗干净后采用榨汁机破碎，得到破碎的洋甘菊；往上述破碎的洋甘菊中加入100份水(纯净水)、25份复合酶制剂(纤维素酶6份、果胶酶7份、溶菌酶6.5份和辅酶Q10 5.5份)和5份醇类物质(1,2-己二醇2.5份和辛甘醇2.5份)，于45℃恒温水浴锅内浸泡30min后，于45℃超声处理(超声的频率为40HZ)2h后静置分层，离心，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述份数为重量份数。
所述的色谱柱层析分离采用如下方法进行：使所述上清液通过树脂色谱层析柱(树脂色谱层析柱：长457mm，直径40mm。)，用水洗涤至洗脱液澄清无颗粒性不溶物时(以除去杂质)，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液。
实施例8
一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，包括如下步骤：
将50份洋甘菊除去杂质及梗，用清水清洗干净后采用榨汁机破碎，得到破碎的洋甘菊；往上述破碎的洋甘菊中加入100份水(纯净水)、25份复合酶制剂(纤维素酶6.5份、葡糖氧化酶6.5份、溶菌酶7份和辅酶Q10 5份)和5份醇类物质(1,2-己二醇)，于40℃恒温水浴锅内浸泡30min后，于40℃超声处理(超声的频率为50HZ)2h后静置分层，离心，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述份数为重量份数。
所述的色谱柱层析分离采用如下方法进行：使所述上清液通过树脂色谱层析柱(树脂色谱层析柱：长457mm，直径40mm。)，用水洗涤至洗脱液澄清无颗粒性不溶物时(以除去杂质)，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液。
实施例9
一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，包括如下步骤：
将30份洋甘菊除去杂质及梗，用清水清洗干净后采用榨汁机破碎，得到破碎的洋甘菊；往上述破碎的洋甘菊中加入60份水(纯净水)、15份复合酶制剂(果胶酶2份、葡糖氧化酶4份、木聚糖酶4份和辅酶Q10 5份)和3份醇类物质(1,2-己二醇)，于40℃恒温水浴锅内浸泡25min后，于40℃超声处理(超声的频率为30HZ)1h后静置分层，离心，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述份数为重量份数。
所述的色谱柱层析分离采用如下方法进行：使所述上清液通过树脂色谱层析柱(树脂色谱层析柱：长457mm，直径40mm。)，用水洗涤至洗脱液澄清无颗粒性不溶物时(以除去杂质)，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液。
实施例10
一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，包括如下步骤：
将30份洋甘菊除去杂质及梗，用清水清洗干净后采用榨汁机破碎，得到破碎的洋甘菊；往上述破碎的洋甘菊中加入60份水(纯净水)、15份复合酶制剂(纤维素酶2.5份、果胶酶3.5份、溶菌酶4.5份和辅酶Q10 4.5份)和3份醇类物质(1,2-己二醇1.5份和丁二醇1.5份)，于25℃恒温水浴锅内浸泡25min后，于25℃超声处理(超声的频率为30HZ)1h后静置分层，离心，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述份数为重量份数。
所述的色谱柱层析分离采用如下方法进行：使所述上清液通过树脂色谱层析柱(树脂色谱层析柱：长457mm，直径40mm。)，用水洗涤至洗脱液澄清无颗粒性不溶物时(以除去杂质)，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液。
为了进一步说明本发明实施例提供的洋甘菊植物提取液的安全性及功效性，以下通过试验例进一步说明本发明实施例提供的洋甘菊植物提取液的有益效果：
试验一：提取率测定(黄酮测定方法)
洋甘菊中含有丰富的黄酮类物质，通过测定实施例1～10中制得的洋甘菊植物提取液的黄酮类物质含量，从而求出提取率。
反应原理：黄酮类物质在氧化剂亚硝酸盐存在的情况下，与硝酸铝生成黄色的黄酮铝络合物，在碱性环境下显红色。采用络合-分光光度法，以芦丁为对照品测定洋甘菊(或洋甘菊植物提取液)中黄酮类物质含量，加入铝离子试剂使黄酮类化合物与铝盐形成络合物。利用紫外可见分光光度计在波长510nm处测定吸光度值，对照芦丁标准曲线，测得黄酮类含量。
1、芦丁标准曲线的绘制
精确吸取浓度为0.1mg/mL的芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6支比色管中，分别加入60％乙醇溶液定容至5.0mL，加入5％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，静置6min；加入10％硝酸铝溶液0.3mL，静置6min；加入1.0mol/L NaOH溶液4.0mL与去离子水0.4mL，静置15min，用分光光度计于510nm波长下测定吸光度值A，以吸光度值对芦丁标准溶液(mg/mL)作图。
2、提取液中黄酮的测定
取3支25mL比色管，分别作为空白、样品和样品校正。依次精确吸取0、2.0mL、2.0mL样液于三支试管中，各加60％乙醇溶液定容至5.0mL，加入5％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，静置6min；加入10％硝酸铝溶液0.3mL，静置6min；加入1.0mol/L NaOH溶液4.0mL与去离子水0.4mL，静置15min，用分光光度计于510nm波长下测定吸光度值A，从工作曲线中算出提取液中总黄酮的含量。
实验得芦丁标准曲线回归方程为：Y＝6.225X+0.0019，相关系数为R＝0.9995；其中X为芦丁标准品浓度(mg/mL)，Y为吸光度值。
洋甘菊提取率＝100％×提取液中黄酮含量/所用洋甘菊重量
表1实施例1-10的洋甘菊植物提取液的黄酮含量的测试结果
将酶法应用于洋甘菊药材的提取，即利用纤维素酶、木聚糖酶及果胶酶的催化作用，强烈破坏植物细胞的纤维素、细胞壁等致密结构，使有效成分溶出，再加上醇类物质的共同溶解作用，极大提高提取率。以黄酮含量作为测试指标，本发明的实施例1～10的洋甘菊的提取率均在85％以上。
试验二：过敏性实验(透明质酸酶体外抑制试验)
实验样品：选取市售的竞品1-洋甘菊提取液(供应商为：广州市博榈化工有限公司)：竞品2-洋甘菊提取液(供应商为：广州毅锦生物科技有限公司)、竞品3-洋甘菊提取液(供应商为：广州文玲贸易有限公司)、竞品4-洋甘菊提取液(供应商为：广州姿汇化妆品有限公司)以及本发明实施例提供的洋甘菊植物提取液进行测试。
取0.1mL 0.25mmol/L CaCl2溶液和0.5mL透明质酸酶液于37℃恒温水浴锅内培养20min；随后加入样品液0.5mL，恒温培养20min；再加入0.5mL透明质酸钠液37℃恒温30min。随后置于常温放置5min后，加入0.1mL 0.4mol/L NaOH溶液和0.5mL乙酰丙酮溶液，置沸水浴中加热15min后，立即用冰水冷却5min；最后加入埃尔利希试剂1.0mL并用3.0mL无水乙醇进行稀释，放置20min显色，用分光光度计测定其吸光度(A)。
透明质酸酶抑制率＝[(A-B)-(C-D)]×100％/(A-B)；A为对照溶液吸光度(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)，B为对照空白溶液吸光度(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)，C为试样溶液吸光度值，D为试样空白溶液吸光度(用醋酸缓冲溶液代替酶液)。
表2实施例1-10的洋甘菊植物提取液及竞品1-4的洋甘菊提取液的透明质酸酶抑制率的测试结果
透明质酸酶是过敏反应参与者，其与过敏有强相关性，许多抗过敏药物有强抑制透明质酸酶活性的作用。本实验采用透明质酸酶体外抑制试验对本发明中的实施例1～10的洋甘菊植物提取液进行过敏性功效测试，实验发现本发明的洋甘菊植物提取液对于透明质酸酶抑制率均在95％以上，具有较好的抗过敏效果，抗敏性明显高于市售竞品1～4，结果见表2。
试验三：美白功效性实验(抑制酪氨酸酶活性试验)
将L-酪氨酸、样品液、PBS缓冲液依次加到编号为A1、A2、B1、B2组各管中混匀；将试管架放入37℃恒温水浴锅中水浴10～15min；将酪氨酸酶依次加入A1和B1组各管中、摇匀，准确计时，反应15min停止；依次在96孔板上点板，用酶标仪测定其吸光度并计算抑制率。
抑制率＝[(A1-A2)-(B1-B2)]×100％/(A1-A2)：A1为空白样板有酶体系吸光度；A2为空白样板无酶体系吸光度；B1为样品组有酶体系吸光度；B2为样品组无酶体系吸光度。
表3实施例1-10的洋甘菊植物提取液及竞品1-4洋甘菊提取液的酪氨酸酶活性抑制率的测试结果
酪氨酸酶在黑色素生物合成过程中起关键作用，它控制着黑素形成过程，其活性程度对色素形成的数量与沉积起主要作用。美白类物质就是通过抑制酪氨酸酶活性或阻断从酪氨酸生成黑色素的氧化反应减少黑色素的生成达到美白皮肤的效果。如表3所示，本发明的实施例1～10的洋甘菊植物提取液对酪氨酸酶具有明显的抑制作用，抑制率率高达85％以上，且为竞品1～4的洋甘菊提取液的两倍多。说明本发明制备的洋甘菊植物提取液较市售竞品而言，具有很好的美白功效。
试验四：抑菌性实验
1、试验样品：本发明实施例提供的洋甘菊植物提取液。
2、试验方法：参考卫生部《消毒技术规范》2008版。试验菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌。
在试验过程中，将本发明实施例1～10提供的洋甘菊植物提取液样品分别配制成浓度为1％的试样，并放置于编号1～10的容量瓶或锥形瓶中，备用。并配制实验用菌悬液，平均分装到编号1a～10a的锥形瓶中，然后，分别取等量的各试样液添加到1a～10a的锥形瓶中，将待试样液与实验用菌悬液中的试验菌种充分混合均匀并相互作用20min后，开始测试并记录每个锥形瓶中的试验菌种的杀灭率。
3、试验结果：试验结果详见下表4，其中，杀灭率＝(试验后存活的菌种数量/初始菌种的数量)×100％。
表4实施例1-10的洋甘菊植物提取液及竞品1-4的洋甘菊提取液的抑菌性试验结果
从上表4的试验结果中可以看出，本发明中的实施例1～10提供的洋甘菊植物提取液对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的杀灭率均在90％以上，明显优于竞品1～4的杀菌率。在溶菌酶与葡萄氧化酶的复合作用下，能抑制菌斑形成，能够有效去除菌落种群。复合酶制剂(溶菌酶与葡萄氧化酶)与洋甘菊的共同作用下，有效强化了本发明的洋甘菊植物提取液的抑菌功能。
试验五：抗氧化性实验
高锰酸钾溶液滴定法：配制5mmol/L的高锰酸钾溶液。
取2mL实施例1～10的洋甘菊植物提取液于干净的锥形瓶中，加入50mL的蒸馏水，然后用5mmol/L的高锰酸钾溶液进行标定，当锥形瓶中的溶液由浅茶色变为淡紫色，且30s内不褪色，即为滴定终点，记录消耗高锰酸钾的体积V。
表5实施例1-10的洋甘菊植物提取液及竞品1-4的洋甘菊提取液的抗氧化性试验结果
洋甘菊植物提取液能够与高锰酸钾溶液发生氧化还原反应，消耗的高锰酸钾的体积越多，说明洋甘菊植物提取液中含有较多的还原性物质，代表着该提取液的抗氧化性越强。如表5可知，本发明的实施例1～10中的洋甘菊植物提取液的抗氧化性能力强于市售竞品1～4，抗氧化能力强。
试验六：防腐效果测试
1、试验样品：本发明实施例提供的洋甘菊植物提取液样品；实验菌为大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、铜绿假单胞菌ATCC 9027、白色念珠菌ATCC10231。
2、试验方法：微生物挑战性实验方法。
3、试验结果评定：采用《欧洲药典》的结果评定标准对本次试验结果进行评定，具体详见下表6。
表6实施例1-10的洋甘菊植物提取液及竞品1-4的洋甘菊提取液的防腐测试结果
从上表6的测试结果可知，4种实验菌于第7天时(1周)菌落总数均下降100％，至第28天时无增长，判定通过挑战性实验，防腐效能良好，即本发明实施例提供的洋甘菊植物提取液采用溶菌酶和葡萄氧化酶复配构建的防腐体系的防腐效果良好。
试验七：眼部刺激性/腐蚀性测试
1、试验样品：本发明实施例提供的洋甘菊植物提取液。
2、试验方法：SN/T 2329-2009化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验。
3、试验结果评价标准：刺激评分标准分为以下等级：IS＜1为无刺激性；1≤IS＜5为轻刺激性；5≤IS＜9为中度刺激性；IS≥10为强刺激性/腐蚀性。
4、试验结果：经过试验，本发明实施例1-10提供的洋甘菊植物提取液的刺激评分均为IS＜1，即本发明实施例提供的洋甘菊植物提取液对眼部温和无刺激性。
试验八：皮肤刺激性试验
(一)皮肤封闭型斑贴试验
1、试验样品：本发明实施例提供的洋甘菊植物提取液。
2、试验方法：从某一区域选择22名志愿者，志愿者的年龄在20～45岁之间，身体健康，近期未服用药物，非哺乳妇女或妊娠妇女，非体质敏感者。随机将志愿者平均分成11组，每组两个人。其中，组1为空白对照组，斑试器小室内不放置任何物质，将斑试器用低致敏胶带贴敷于志愿者的背部或者前臂屈侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷在皮肤上；组2～组11与组1的处理方法相同，不同的是：分别将加有0.025mL本发明实施例1～10提供的洋甘菊植物提取液放入斑试器小室内；即组2对应的是本发明实施例1提供的洋甘菊植物提取液，组3对应的是本发明实施例2提供的洋甘菊植物提取液，组4对应的是本发明实施例3提供的洋甘菊植物提取液……以此类推，组11对应的是本发明实施例10提供的洋甘菊植物提取液。各组试验持续24小时、48小时后，去除斑试器后30min，待压痕消失后，观察贴敷处皮肤的反应情况并记录。
其中，皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准见下表7。
表7皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
在整个试验过程中，组1-组11的受试者的受势部位皮肤反应均呈阴性反应。由此可以看出，本发明实施例提供的洋甘菊植物提取液不会引起皮肤的过敏和刺激反应，安全性好。
(二)重复性开放型涂抹试验
1、试验样品：本发明实施例提供的洋甘菊植物提取液。
2、从某一区域中选择22名志愿者，志愿者的年龄在20-45岁之间，身体健康，近期未服用药物，非哺乳妇女或妊娠妇女，非体质敏感者。随机将志愿者平均分成11组，每组两个人。其中，组1为空白对照组，以前臂屈作为受试部位，面积3×3cm2，受试部位保持干燥，受试前和受势期间避免接触其他外用制剂，用超纯水0.05±0.005g/次，均匀地涂抹受试部位；组2～组11分别为试验组，与组1不同的是：采用本发明实施例1～10提供的洋甘菊植物提取液0.05±0.005g/次均匀地涂抹受试部位；其中，组2对应本发明实施例1提供的洋甘菊植物提取液，组3对应本发明实施例2提供的洋甘菊植物提取液，组4对应本发明实施例3提供的洋甘菊植物提取液……以此类推，组11对应本发明实施例10提供的洋甘菊植物提取液。各组每天进行2次均匀地涂抹受试部位，连续试验7天后完成试验，每天观察受试者的受试部位的皮肤反应情况并记录。在试验的过程中，如果出现如下表8中的3分以上的皮肤反应情况时，可停止继续试验并记录结果。
其中，表8为皮肤重复性开放型涂抹试验皮肤反应评判标准表。
表8皮肤重复性开放型涂抹试验皮肤反应评判标准表
在整个试验过程中，组1～组11的受试者的受势部位的皮肤反应均呈阴性反应。由此可以看出，本发明实施例提供的洋甘菊植物提取液不会引起皮肤的过敏和刺激反应，安全性好。
本发明采用复合生物酶制备洋甘菊植物提取液，在纤维素酶、果胶酶和多元醇的共同作用下，全面破碎植物细胞壁及细胞间质的致密结构，洋甘菊提取率高；制备得到的洋甘菊植物提取液防腐性能好，使用寿命较长，同时不含有毒性或刺激性的有机溶剂，安全性好，温和无刺激，抗敏能力强，具有很好的美白功效和天然防腐性能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
往20～50份洋甘菊中加入40～100份水、10～25份复合酶制剂和1～5份醇类物质，于20～45℃浸泡15～30min后，于20～45℃超声处理1～2h后静置分层，离心或过滤，得到上清液；将所述上清液通过色谱柱层析分离，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述份数为重量份数。
2.如权利要求1所述的用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，其特征在于，所述的洋甘菊为罗马洋甘菊、德国洋甘菊和摩洛哥洋甘菊中的一种或两种混合物。
3.如权利要求2所述的用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，其特征在于，所述的洋甘菊为罗马洋甘菊。
4.如权利要求1所述的用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，其特征在于，所述的复合酶制剂为纤维素酶、果胶酶、葡糖氧化酶、溶菌酶和辅酶Q10中的一种或至少两种的混合物。
5.如权利要求1所述的用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，其特征在于，所述的复合酶制剂为纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、葡糖氧化酶和溶菌酶的混合物。
6.如权利要求1所述的用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，其特征在于，所述的醇类物质为1,2-己二醇、丁二醇、丙二醇和辛甘醇中的一种或至少两种的混合物。
7.如权利要求1所述的用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，其特征在于，所述的醇类物质为1,2-己二醇。
8.如权利要求1所述的用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，其特征在于，所述的超声的频率为30～50HZ。
9.如权利要求1所述的用生物酶加工和防腐的洋甘菊植物提取液的制备方法，其特征在于，所述的色谱柱层析分离采用如下方法进行：使所述上清液通过树脂色谱层析柱，用水洗涤至洗脱液澄清无颗粒性不溶物时，收集洗脱液，得到洋甘菊植物提取液；所述树脂色谱层析柱长457mm，直径40mm。
10.一种由权利要求1-9任一项所述的制备方法得到的洋甘菊植物提取液。
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