CN106434787B - 一种玉米种皮多糖复合物及制备方法和医疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种多功能多糖复合物的制备方法及其医疗用途，利用生物酶解法提取的玉米种皮多糖复合物，含有多糖、多肽及多酚成分，具有抗氧化、抗衰老活性功能，分子量在500Da‑21 kDa之间，平均分子量为17.9kDa，它具有抗氧化、降血脂及延缓衰老的功能，可用于制备抗氧化、抗衰老药物、保健食品及化妆品等领域，提高了粮食作物的附加值，制备工艺无污染、零排放。

Description

一种玉米种皮多糖复合物及制备方法和医疗用途
技术领域
本发明公开了一种玉米种皮多糖复合物，具有多重活性成分；同时还提供了该玉米种皮多糖复合物的制备方法，本发明进一步公开了玉米种皮多糖复合物的医疗用途，属于食品、医药、保健品制备技术领域。
背景技术
植物种皮是种子的保护组织，其含有纤维素、半纤维素、肽聚糖及酚酸等物质；多糖是一种聚合程度不同的糖链组成的混合物，不足10个单糖，并多于3个单糖所组成的短糖链称为寡糖，如果蛋白质、脂类等大分子物质结合在寡糖链上，整体形成新的高分子化合物，称为复合多糖；另外，多酚化合物是植物的次生代谢产物，在植物中的含量较为丰富，其中包括连接有糖苷基的多酚化合物。这些物质在同一体系内存在，统称为多糖复合物，其兼有多糖、多酚及多肽的功能活性。
秀丽隐杆线虫（C.elegans）是一种无毒无害、可以独立生存的线虫。自1965年起，科学家Sydney Brenner利用线虫作为分子生物学和发育生物学研究领域的模式生物，并于2002年获得诺贝尔生理医学奖。近年来秀丽隐杆线虫被广泛应用于抗衰老药物的筛选及抗衰老分子机制的研究中，主要用于抗衰老药物生理指标的评价及反映抗衰老机制的生化指标测定，包括寿命、生存率、生存时间、ROS含量以及daf-16，sod-3等基因调控情况研究。
复合多糖主要承担细胞信息功能，在激素、病毒等识别中发挥重要作用，同时也能作为表面抗原响应免疫应答等,是细胞间信号传递的分子基础，具有一定的生物活性。谷物中的多酚类化合物，均具有良好的清除自由基能力，是一类来源十分广泛，低毒无毒，危险性很小的天然抗氧化剂，具有抗衰老作用。
目前，在玉米生产加工过程中，玉米种皮多作为饲料喂养牲畜之用，甚至废弃物而丢弃，玉米种皮含有大量的多糖复合物，其潜在的价值没有被充分利用，造成极大浪费。
发明内容
本发明公开了一种玉米种皮多糖复合物，具有抗氧化、抗衰老活性，用于食品、医疗及保健品领域。
本发明提供了一种玉米种皮多糖复合物的制备方法，制备含有多糖、多肽及多酚成分的生物活性物质复合物。
本发明还公开了一种玉米种皮多糖复合物的医疗用途，用于抗氧化、抗衰老领域。
本发明所述的一种玉米种皮多糖复合物，其特征在于主要含有以下成分：
多糖60-80%，多酚5-7.8%，蛋白10-20%，分子量500Da-21 kDa，平均分子量为17-18kDa。
本发明所述的提供了一种玉米种皮多糖复合物的制备方法，包括步骤如下:
1）将玉米种皮粉碎80-100目，按1：(6-8）(W/V)的比例加水混合均匀，NaOH调pH值为7制成混合液；
2）取步骤1）混合液50-500L，升温至40℃-45℃，NaOH或柠檬酸调pH值为6.8-7.2，加入脂肪酶40g-400g、蛋白酶38g-380g、淀粉酶30 mL-300mL及果胶酶0.5g-5g，反应30-60分钟；
3）将步骤2）反应体系升温至48℃-52℃，柠檬酸调pH值为6-6.5，加入食品级纤维素酶15 mL-150 mL，反应60-90 分钟；
4）将步骤3）反应体系按1：(7-10）(W/V)的比例加水混合均匀，121℃, 0.105PKa ,灭菌 30-50分钟；
5）待温度降到90℃以下，进行固液分离，1000-2000转/分钟，离心10-20分钟；
6）上清液超滤膜截留0.001-0.005um以下分子量；
7）截留的液体利用DEAE52或XAD进行柱层析，保留含有酚羟基层析液；
8）对层析液进行分离除盐；
9）除盐后的液体喷雾干燥或冷冻干燥，得到多糖复合物。
对所得的本发明多糖复合物进行了体外抗氧化活性测定，表明其有明显的体外抗氧化能力；
1）当多糖复合物浓度为1 2μM时，自由基清（DPPH方法）除率达92-95%；多糖复合物的清除活性是抗坏血酸的8-10倍，阿魏酸的17-19倍。结果证明多糖复合物具有显著的抗氧化活性，并且在低浓度时即具有良好效果；
2）利用FRAP法检测了多糖复合物的总抗氧化能力，多糖复合物有着良好的还原Fe3+离子的能力，实验表明，在低浓度 (0.15uM) 时，多糖复合物还原能力约为Trolox的2000倍左右（0.25 mM -0.30 mM），在高浓度(2.4uM)时为200倍左右（0.50 mM -0.55mM）；
本发明对所得的多糖复合物进行了动物体内抗氧化活性测定，实验证明MAD、SOD及GSH均为阳性，说明多糖复合物具有抗氧化功能。
本发明对所得的多糖复合物进行了以秀丽隐杆线虫（C.elegans）为模型，研究其抗衰老能力；
实验结果表明，多糖复合物浓度为1.5mg/mL时，其清除线虫体内的ROS为50%，在热激条件和自然条件下分别延长线虫寿命22-26%和15-18%；
本发明的积极效果在于：利用生物酶解法提取的玉米种皮多糖复合物，含有多糖、多肽及多酚成分，具有抗氧化、抗衰老活性功能，可用于制备抗氧化、抗衰老药物、保健食品及化妆品等领域，提高了粮食作物的附加值，制备工艺无污染、零排放。
附图说明：
图1为本发明实例1制备的多糖复合物FT-IR红外光谱检测结果；
图2为本发明实例2制备的多糖复合物FT-IR红外光谱检测结果；
图3为本发明实例3制备的多糖复合物FT-IR红外光谱检测结果。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所做的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
玉米多糖复合物的制备：
1）将玉米种皮粉碎80目，按1：6(W/V)的比例加水混合均匀，NaOH调pH值为7制成混合液；
2）取步骤1）混合液50L，升温至40℃-45℃，NaOH调pH值为6.8-7.2，加入脂肪酶40g,蛋白酶38g,淀粉酶30mL,果胶酶0.5g，反应30分钟；
3）将步骤2）反应体系升温至48℃，柠檬酸调pH值为6，加入食品级纤维素酶15 mL，反应60分钟；
4）将步骤3）反应体系按1：7 (W/V)的比例加水混合均匀，121℃, 0.105PKa ,灭菌30分钟；
5）待温度降到90℃以下，进行固液分离，2000转/分钟，离心10分钟；
6）上清液超滤膜截留0.001-0.005um以下分子量；
7）截留的液体利用DEAE52或XAD进行柱层析，保留含有酚羟基层析液；
8）对层析液500分子量透析除盐；
9）截留除盐后的液体冷冻干燥，得到多糖复合物；
10）利用DNS比色定糖法测定多糖复合物中糖含量；利用Folin-Ciocalteu 法测定多糖复合物中多酚含量；采用德国Elementar公司的Vario Micro cube型元素分析仪测定多糖复合物中C、H、N、S元素的含量，多糖复合物含有多糖73%，多酚7.6%，多肽15.7%；
11）多糖复合物FT-IR红外检测，取适量多糖复合物样品置于玛瑙研钵中，与等量的KBr研磨混合均匀。压片后，置于Nicolet 5700傅立叶红外光谱仪（ThermoFisher .USA）上进行检测。扫描范围4000-500；ATR池；窗口材料为锡锌。结果见图1。
实施例2
1）将玉米种皮粉碎90目，按1：7(W/V)的比例加水混合均匀，NaOH调pH值为7制成混合液；
2）取步骤1）混合液100L，升温至45℃，柠檬酸调pH值为7.0，加入脂肪酶100g、蛋白酶180g、淀粉酶100mL及果胶酶3g，反应40 分钟；
3）将步骤2）反应体系升温至50℃，柠檬酸调pH值为6.5，加入食品级纤维素酶100mL，反应80 分钟；
4）将步骤3）反应体系按1：8(W/V)的比例加水混合均匀，121℃, 0.105PKa ,灭菌50分钟；
5）待温度降到90℃以下，进行固液分离，2000转/分钟，离心10分钟；
6）上清液超滤膜截留0.001-0.005um以下分子量；
7）截留的液体利用DEAE52或XAD进行柱层析，保留含有酚羟基层析液；
8）对层析液进行500分子量透析除盐；
9）截留除盐后的液体冷冻干燥，得到多糖复合物；
10）利用DNS比色定糖法测定多糖复合物中糖含量；利用Folin-Ciocalteu 法测定多糖复合物中多酚含量；采用德国Elementar公司的Vario Micro cube型元素分析仪测定多糖复合物中C、H、N、S元素的含量，多糖复合物含有多糖74.1%，多酚7.5%，多肽15.8%；
11）多糖复合物FT-IR红外检测，取适量多糖复合物样品置于玛瑙研钵中，与等量的KBr研磨混合均匀。压片后，置于Nicolet 5700傅立叶红外光谱仪（ThermoFisher .USA）上进行检测。扫描范围4000-500；ATR池；窗口材料为锡锌，结果见图2。
实施例3
1）将玉米种皮粉碎100目，按1：8(W/V)的比例加水混合均匀，NaOH调pH值为7制成混合液；
2）取步骤1）混合液500L，升温至45℃，柠檬酸调pH值为7.2，加入脂肪酶400g、蛋白酶380g、淀粉酶300mL及果胶酶5g，反应60 分钟；
3）将步骤2）反应体系升温至52℃，柠檬酸调pH值为6.5，加入食品级纤维素酶150mL，反应90 分钟；
4）将步骤3）反应体系按1：10(W/V)的比例加水混合均匀，121℃, 0.105PKa ,灭菌50分钟；
5）待温度降到90℃以下，进行固液分离， 2000转/分钟，离心20分钟；
6）上清液超滤膜截留0.001um以下分子量；
7）截留的液体利用DEAE52或XAD进行柱层析，保留含有酚羟基层析液；
8）对层析液进行500分子量透析除盐；
9）除盐后的液体喷雾干燥或冷冻干燥，即得；
10）利用DNS比色定糖法测定多糖复合物中糖含量；利用Folin-Ciocalteu 法测定多糖复合物中多酚含量；采用德国Elementar公司的Vario Micro cube型元素分析仪测定多糖复合物中C、H、N、S元素的含量，多糖复合物含有多糖75%，多酚7.8%，多肽15.5%；
11）多糖复合物FT-IR红外检测，取适量多糖复合物样品置于玛瑙研钵中，与等量的KBr研磨混合均匀。压片后，置于Nicolet 5700傅立叶红外光谱仪（ThermoFisher .USA）上进行检测。扫描范围4000-500；ATR池；窗口材料为锡锌,结果见图3。
实验例1 玉米多糖复合物的清除DPPH自由基能力实验
实验方法：分别量取2、4、6、8、10、12μM的多糖复合物样品溶液500μL，加入等体积的DPPH溶液，在室温下避光反应1h；对照组：分别量取浓度为16、32、62.5、125、250、500μM的抗坏血酸（Vc）和阿魏酸（Fa）溶液作为阳性对照；参比组：500uL去离子水与500uL DPPH溶液的混合溶液，并以500μL 无水乙醇与500μL去离子水的混合溶液调节吸光度零点，在波长517nm处测量吸光度值。清除率按照如下公式计算：
清除率 (%) = 1-（A实验/A参比）×100%
实验结果如下：利用实例1、实例2、实例3制备的多糖复合物浓度为12μM时，测定其清除能力如表1所示，实验结果表明三批样品在相同浓度下，其清除自由基的能力都达到92%以上；多糖复合物、抗坏血酸和阿魏酸清除DPPH自由基的EC50值分别为2.84μM 、27.53μM和52.36μM，即多糖复合物的清除活性是抗坏血酸的9倍以上，阿魏酸的18倍以上，具有良好的应用前景，相关研究国内外未见报道。
表1 不同批次玉米多糖复合物的清除DPPH自由基能力测试结果
样品 抗坏血酸 阿魏酸 实例1 实例2 实例3
清除率（%） 100 90 94.3 94.9 95
EC<sub>50</sub>值（μM） 27.53 52.36 2.84 2.82 2.86
实验例2 玉米多糖复合物总抗氧化能力测定实验
实验方法：分别量取0.15、0.3、0.6、1.2、2.4μM的多糖复合物溶液5μL作为底物，加入180μL的FRAP工作液，37℃孵育5min后，在波长593nm处测定其吸光度值，依据标准曲线计算出多糖复合物总抗氧化能力。
实验结果如表2所示，不同批次玉米多糖复合物有着良好的还原Fe3+离子的能力，利用Trolox为阳性对照，玉米多糖复合物总抗氧化能力以Trolox当量浓度表示；当不同批次玉米多糖复合物浓度都为0.15μM时，其还原能力相当于0.28 mM -0.30mM Trolox，并且随着浓度增长呈现出较好的浓度依赖性，当浓度为2.4μM时相当于0.52-0.55mM Trolox，实验证明，玉米多糖复合物具有体外抗氧化作用，相关研究国内外未见报道。
表2 不同批次玉米多糖复合物的总抗氧化能力测试结果
实验例3玉米多糖复合物动物体内抗氧化能力检测
实验方法
（1）抗氧化模型建立方法
选取25－30g健康成年小鼠，随机分为5个组，1个空白对照组，1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组给予不同浓度（高剂量800ug/g；中剂量400ug/g；低剂量200ug/g）受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续灌胃40天，末次灌胃后，空白对照组和模型组对照组以及3个剂量组禁食16小时（过夜），然后1次性灌胃给予50%乙醇12mL/kgBW，6小时后取材（空白对照组不作处理），测血清中脂质氧化产物含量还原性谷胱甘肽(GSH)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力。
（2）MDA 含量测定
机体产生的氧自由基能攻击细胞生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应而生成脂质过氧化物，其中有丙二醛（MDA）。采用硫代巴比妥酸显色法进行检测。丙二醛（MDA）能与硫代巴比妥酸（TBA）发生缩合反应，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰。因底物为硫代巴比妥酸（TBA），故称为TBA法。MDA的测定常常与SOD的测定相配合，SOD活力的大小间接反应了细胞清除氧自由基的能力大小，而MDA含量的多少间接反应了细胞受自由基攻击的严重程度。
（3）SOD 活性测定
采用黄嘌呤氧化酶法进行检测。通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应产生超氧化物（O2•−），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，可用可见光分光光度计检测其吸光度。当被测样品含SOD时，则对O2•−有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度，通过公式计算可求出被测样品中SOD的活力。
（4）GSH 活性测定
还原型谷胱甘肽（GSH），它能与二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成一种黄色化合物，在405nm处测其吸光度即可计算出GSH的量法进行检测。GSH具有良好的解毒、自由基清除、维持红细胞膜的完整性以及加快铁质的吸收等多重重要生理功能。另外，它还是一种低分子清除剂，能够很好的对O2-、H2O2以及LOOH进行清除，因此GSH量的高低是衡量机体或细胞抗氧化能力高低的重要因素。目前，利用试剂盒可以直接对GSH进行检测，通过测定OD值，依照公式计算可求出被测样品中GSH的活力。
以上MDA,SOD,GSH三个指标均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。
实验结果：
分别利用实例1、实例2、实例3制备的多糖复合物，按照低剂量（200ug/g）、中剂量（400ug/g）、高剂量（800ug/g）三种浓度灌胃小鼠40天后，按照保健食品功能检测方法建立抗氧化模型，50%乙醇灌胃模型小鼠及多糖复合物灌胃小鼠，其模型组与空白对照组（没有利用乙醇损伤）相比，MDA值的增加了4.9倍；灌胃三种不同浓度的多糖复合物小鼠，其MDA值增加分别是3.9倍、2.4倍及1.5倍，实验证明多糖复合物具有一定减少MDA生成的作用；其SOD 活性下降25.4%；灌胃三种不同浓度的多糖复合物小鼠，其SOD活性下降分别是19.3%、10.4%及5.8%，实验证明多糖复合物具有一定减少SOD活性降低的作用；其GSH活性下降33.7%；灌胃三种不同浓度的多糖复合物小鼠，其GSH活性下降分别是14.5%、13.6%及3.6%，实验证明多糖复合物具有一定减少GSH活性降低的作用，具体见表3所示，所有数据均有统计学意义。实验证明玉米多糖复合物在动物体内MDA、SOD及GSH值，均为阳性，其具有抗氧化活性，相关研究国内外未见报道。
表3 不同批次玉米多糖复合物在动物体内抗氧化能力测试结果
实验例4玉米多糖复合物的抗衰老活性研究
实验方法：多糖复合物对线虫寿命的影响
1.热激实验
分别取同期化完成的成虫35只（虫龄4 days）置于给多糖复合物与空白NGM(称取3g NaCl、17g琼脂、2.5g蛋白胨、加入975mL去离子水，高压蒸汽灭菌，待溶液冷却至55℃后，加入无菌1mL 1M CaCl2、1mL 1M MgSO4、25mL磷酸钾缓冲液，最后加入1mL 5mg/mL 胆固醇，摇匀)培养基上。培养两天，每天更换新板。两天后，将平板放入35℃培养箱中，每小时计数线虫的死亡量。线虫的死亡以触碰线虫后30s内体式显微镜下观察不到虫体的应激动作或咽部收缩消失为准。
2.自然条件寿命实验
分别取35只同期化后的线虫，置于给药与空白的NGM平板上。每天将线虫转移至对应的新鲜NGM平板上并统计存活线虫数目，直至线虫全部死亡。线虫的死亡以触碰线虫后30s内体式显微镜下观察不到虫体的应激动作或咽部收缩消失为准。
实验结果：
分别利用实例1、实例2、实例3制备的多糖复合物，热激条件下多糖复合物对线虫寿命的影响机体在受到外界刺激（如热刺激）时，会迅速产生大量的ROS。在35℃热应激条件下，野生型线虫仅能存活8小时左右。给多糖复合物2天后，在热激条件下，可以延长线虫寿命分别为22%，23%及25%，效果显著。
分别利用实例1、实例2、实例3制备的多糖复合物，自然条件下多糖复合物对线虫寿命的影响，当线虫处于自然生长的条件时（20℃，食物充足），从线虫龄4天开始给多糖复合物，到虫龄6天即出现明显差异，多糖复合物亦能够显著延长线虫寿命分别为16.2%、16.8%、16.9% 效果显著。

Claims (3)

1.一种玉米种皮多糖复合物，其特征在于是通过以下步骤制成的：
1）将玉米种皮粉碎80-100目，按1：(6-8）(W/V)的比例加水混合均匀，NaOH调pH值为7制成混合液；
2）取步骤1）混合液50-500L，升温至40℃-45℃，NaOH或柠檬酸调pH值为6.8-7.2，加入脂肪酶40g-400g、蛋白酶38g-380g、淀粉酶30 mL-300mL及果胶酶0.5g-5g，反应30-60 分钟；
3）将步骤2）反应体系升温至48℃-52℃，柠檬酸调pH值为6-6.5，加入食品级纤维素酶15 mL-150 mL，反应60-90 分钟；
4）将步骤3）反应体系按1：(7-10）(W/V)的比例加水混合均匀，121℃，105KPa，灭菌 30-50分钟；
5）待温度降到90℃以下，进行固液分离，1000-2000转/分钟，离心10-20分钟；
6）上清液超滤膜截留0.001-0.005um以下分子量；
7）截留的液体利用DEAE52或XAD进行柱层析，保留含有酚羟基的层析液；
8）对层析液进行分离除盐；
9）除盐后的液体喷雾干燥或冷冻干燥，即得多糖复合物；
多糖复合物主要含有以下成分：
多糖60-80%，多酚5-7.8%，多肽10-20%，分子量500Da-21 kDa，平均分子量为17-18kDa。
2.权利要求1所述的提供了一种玉米种皮多糖复合物的制备方法，包括步骤如下:
1）将玉米种皮粉碎80-100目，按1：(6-8）(W/V)的比例加水混合均匀，NaOH调pH值为7制成混合液；
2）取步骤1）混合液50-500L，升温至40℃-45℃，NaOH或柠檬酸调pH值为6.8-7.2，加入脂肪酶40g-400g、蛋白酶38g-380g、淀粉酶30 mL-300mL及果胶酶0.5g-5g，反应30-60 分钟；
3）将步骤2）反应体系升温至48℃-52℃，柠檬酸调pH值为6-6.5，加入食品级纤维素酶15 mL-150 mL，反应60-90 分钟；
4）将步骤3）反应体系按1：(7-10）(W/V)的比例加水混合均匀，121℃，105KPa，灭菌 30-50分钟；
5）待温度降到90℃以下，进行固液分离，1000-2000转/分钟，离心10-20分钟；
6）上清液超滤膜截留0.001-0.005um以下分子量；
7）截留的液体利用DEAE52或XAD进行柱层析，保留含有酚羟基层析液；
8）对层析液进行分离除盐；
9）除盐后的液体喷雾干燥或冷冻干燥，得到多糖复合物。
3.如权利要求1的所述的玉米种皮多糖复合物在制备抗氧化、抗衰老药物中的医疗用途。
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