CN105496842B - 一种肉苁蓉鳞茎提取物的制备方法及抗氧化作用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物的制备方法，该方法包括：a)沸水提取；b)浓缩，然后脱蛋白，然后碱中和；c)透析，浓缩，离心去沉淀，上清液用有机溶剂沉淀；d)收集沉淀，干燥后得到干燥的肉苁蓉鳞茎水提多糖；e)步骤d)所得肉苁蓉鳞茎水提多糖在强酸、70‑200℃温度条件下降解；f)去除酸性成分，离心后取上清液得到包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物。本发明还涉及本发明方法制备得到的肉苁蓉鳞茎提取物及其纯化富集寡糖后的产物在具有抗氧化作用的化妆品中的应用。

Description

一种肉苁蓉鳞茎提取物的制备方法及抗氧化作用

技术领域

本发明涉及天然药物化学领域和化妆品领域，更具体地说，涉及一种从中草药肉苁蓉的鳞茎提取得到的主要成分之一多糖经降解后获得的寡糖混合物。此外，本发明还涉及所述方法提取得到的肉苁蓉鳞茎提取物的抗氧化作用。具体涉及该肉苁蓉鳞茎提取物在制备具有抗氧化作用的化妆品中的应用。

背景技术

日常生活中，各种各样的环境压力都会对皮肤造成损伤，例如紫外线、 PM2.5等。研究表明，氧化损伤是环境压力对皮肤造成伤害主要途径之一。

活性氧自由基(ROS)为正常细胞代谢产物，也可作为细胞信号传导分子。随着人体的衰老，人体自身抗氧化系统下降以及外界因素的干扰，如UV照射，导致体内ROS水平的升高。过量ROS对细胞造成损伤，如引起DNA损伤，蛋白氧化，非酶糖基化，基质金属蛋白酶表达的升高，炎症等等。这些都称为ROS所造成的氧化损伤。自由基学说是由英国分子生物学家Harman于1956年提出的，它的中心内容包括：自由基是机体氧化反应中产生的有害物质，具有极强的氧化性；在正常生理条件下，机体内自由基的产生与消除处于动态平衡；一旦这种平衡被破坏则会导致过量自由基的产生；过量的自由基对染色体、线粒体、细胞膜和结缔组织等生物组织的毒害性攻击会引起机体的氧化损伤。自由基引起机体氧化损伤的机制可以概括为以下三个方面：一是使生物大分子发生交联聚合和脂褐素堆积；二是使器官组织细胞破坏和减少；三是使免疫功能降低。皮肤中自由基的过度产生容易导致皮肤干燥、粗糙、松弛、弹性下降，因此具有清除自由基能力或者提高细胞自身抗氧能力的原料成为护肤品中的一类重要添加剂。

当暴露于亲电子试剂或活性氧刺激时，机体自身能诱导出一系列的保护性蛋白，以缓解细胞所受的损害。这一协调反应是由保护性蛋白DNA上游调节区的抗氧化反应元件(ARE)来调控的。目前已有成熟方法，将表达luciferase荧光酶的一段报告基因转染到293T细胞的ARE序列之后，通过检测luciferase的表达量来反映ARE的激活状态，从而让我们了解ARE 调控的抗氧蛋白的表达情况。也就是说，使用luciferase的底物与细胞裂解液反映，所测得的荧光值强弱，就能对应细胞表达的抗氧蛋白的多少，体现其自身的抗氧化能力。

我国中医药资源丰富，为我们寻找优越的抗氧化添加剂提供了基础。肉苁蓉(Herba Cistanche)Cistanche deserticolaY.C.Ma(c.dor)为列当科 (Orobanchaeceae)肉苁蓉属(Cistanche)多年生高等寄生植物，其味甘咸微辛酸、微温，在《神农百草经》中列为上品，具有补肾益精、润肠通便和延缓衰老等功效，被誉为“沙漠人参”。别名大芸、寸芸、苁蓉、纵蓉、肉松蓉、精笋、地精、查干告亚(蒙语)。长期的药学实践和大量近代药理学研究表明，它具有提高机体的免疫功能，促进DNA合成，增强体力，提高智能，还有抗衰老等方面的作用。同时，肉苁蓉多糖作为肉苁蓉药材的主要功效成分之一，也有许多报道称其有抗衰老、抗氧化等方面的作用。

例如，中国专利申请CN201110039116.2公开了一种肉苁蓉提取物提取方法及其应用。具体说，该申请公开了属于药用植物应用研究技术领域的一种肉苁蓉提取物提取方法及其应用。该提取物来源于列当科肉苁蓉属的荒漠肉苁蓉或管花肉苁蓉。将肉苁蓉的干燥肉质茎磨成粉末，通过回流提取、过滤、药渣再回流提取、冰冻干燥仪干燥得到棕色粉末，即为肉苁蓉提取物。本发明的肉苁蓉提取物可激活免疫系统，增加免疫器官脾脏的重量，治疗肠癌，减少肠道增生的发生，保护正常的肠道表皮细胞，减少肠道幽门杆菌感染。

例如，中国专利申请CN201210064589.2公开了一种含管花肉苁蓉提取物的美白抗衰老化妆品及其制备方法。具体说，该申请提供了一种管花肉苁蓉提取物的制备方法及美白抗衰老化妆品，所述管花肉苁蓉提取物的制备方法包括粉碎、粗提取、将粗提取物进行离心收集、并经过静置后洗脱、烘干，得管花肉苁蓉提取物。该制备方法简单并无污染，所述提取物的松果菊苷的含量≥25％，毛蕊花糖苷的含量≥55％，总苷含量≥80％；将此方法制得的管花肉苁蓉提取物经过抗氧化性活性等的测试后，证明管花肉苁蓉提取物具有抗氧化，美白、抗衰老的作用。将其添加到化妆品制得美白抗衰老化妆品，并对化妆品进行细胞毒性及安全性等测试，验证了化妆品的安全无刺激、且具有很好的美白效果。

但是，现有技术均未公开由肉苁蓉提取得到的多糖降解形成寡糖混合物的方法。也就是说，迄今为止还没有对肉苁蓉鳞茎提取得到的多糖进行降解，形成寡糖混合物的研究报道，更没有关于这种寡糖混合物具有抗氧化功效的报道。本发明首次研究得出此寡糖混合物能通过增加细胞自身抗氧蛋白的表达量蛋白(通过报告基因表达量反映)来达成抗氧化的功效，且寡糖混合物的抗氧化能力强于原多糖。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有增强肌肤对抗环境压力能力的肉苁蓉鳞茎提取物。本发明的肉苁蓉鳞茎提取物按提供的方法制成，其成分主要为寡糖混合物，包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物可直接用于提高细胞自身抗氧能力，且纯化除去单糖和多糖成分后得到的寡糖混合物抗氧效果更佳。

因此，本发明的一个目的是提供一种包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物的制备方法及其可能的分离纯化方法，所述方法包括以下步骤：

a)沸水提取；

b)浓缩，然后脱蛋白，然后碱中和；

c)透析，浓缩，离心去沉淀，上清液用有机溶剂沉淀；

d)收集沉淀，干燥后得到干燥的肉苁蓉鳞茎水提多糖；

e)步骤d)所得肉苁蓉鳞茎水提多糖在强酸、70-200℃温度条件下降解；

f)去除酸性成分，离心后取上清液，得到包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物。

在本发明的一个实施方式中，所述方法还包括在步骤a)之前进行脱脂的步骤。

在本发明的一个实施方式中，所述方法还包括在步骤f)之后采用活性炭硅藻土层析柱进行分离纯化的步骤。

在本发明的一个实施方式中，所述步骤e)中使用的强酸选自：三氟乙酸、盐酸、高锰酸、硫酸、硝酸、高氯酸、硒酸、氢溴酸、氢碘酸、氯酸。

在本发明的一个实施方式中，所述步骤a)包括取肉苁蓉鳞茎中草药，原药材用沸水提取，硫酸-苯酚法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显。在本发明的一个实施方式中，所述步骤b)包括合并提取液，浓缩，用流动水透析，透析内液浓缩后加入30％(w/v)的三氟乙酸水溶液脱蛋白，然后碱中和至pH 值7.0-8.0。在本发明的一个实施方式中，所述步骤c)包括用流动水透析，透析内液浓缩后，加入2-5倍体积的95％有机溶剂进行沉淀。在一个优选的实施方式中，所述步骤c)中使用的有机溶剂是乙醇。在本发明的一个实施方式中，所述步骤d)包括收集沉淀，用无水乙醇和丙酮洗涤，干燥后得到干燥的肉苁蓉鳞茎水提多糖。在本发明的一个实施方式中，所述步骤e)包括在0.1～4M的强酸溶液中，70～200℃的温度下加热降解反应1～4小时，获得包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物。在一个优选的实施方式中，所述步骤e)中的强酸为三氟乙酸或盐酸。在本发明的一个实施方式中，所述步骤f)包括用透析或蒸馏手段去除酸性成分，离心后取上清液，通过活性炭硅藻土混合柱(w/w＝1:1)进行分离，用0-100％乙醇洗脱。装柱方法：以适量水混合椰壳活性炭(承德兴华活性炭有限责任公司)和硅藻土(国药)，成泥浆状后均匀轻缓地倒入玻璃柱中，静置沉降后用去离子水平衡至柱体积不变，便可用于样品分离。在本发明的一个实施方式中，采用苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并洗脱液，蒸馏去乙醇后用蒸馏水溶解获得浅黄色澄清溶液。

在本发明一个优选的实施方式中，所述步骤b)中的脱蛋白的操作采用 30％(w/v)的三氟乙酸水溶液。

在本发明一个优选的实施方式中，所述步骤c)中使用的有机溶剂选自：乙醇，丙酮，氯仿。

在本发明一个优选的实施方式中，所述步骤e)中使用的强酸选自：三氟乙酸、盐酸。

在本发明一个优选的实施方式中，所述步骤f)中使用的活性炭硅藻土层析柱是通过将活性炭与硅藻土按照1：1的重量比在水中混合形成泥浆状，然后将所得泥浆状混合物均匀倒入层析柱制备得到。

在本发明一个优选的实施方式中，所述步骤f)中采用0-100％的乙醇洗脱。

在本发明的另一方面，提供了通过本发明方法制备得到的包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物。

在本发明的另一方面，提供了通过本发明方法制备得到的包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物可以使用的除去多糖的提纯方法。

在本发明的另一方面，提供了按照本发明方法制备得到的肉苁蓉鳞茎提取物在具有抗氧化作用的化妆品中的应用。

在本发明的另一方面，提供了一种具有抗氧化作用的化妆品，所述化妆品包含按照本发明方法制备得到的肉苁蓉鳞茎提取物以及化妆品领域可接受的赋形剂。在一个实施方式中，所述化妆品选自：洁面乳、化妆水、乳液、膏霜、啫喱、面膜。在一个优选的实施方式中，所述肉苁蓉鳞茎提取物的使用量为0.0001％-80％(w/w)。优选的浓度范围为0.001％-10 ％(w/w)。更优选的浓度范围为0.005％-5％(w/w)。最优选的是肉苁蓉鳞茎提取物在0.1％-1％(w/w)的浓度范围。

附图说明

图1是本发明肉苁蓉鳞茎提取物的提取工艺流程图。

图2为抗氧化反应元件ARE激活水平的检测结果。图中纵坐标为样品的相对光强(RLU)平均值除以对照组RLU值所得的百分比，此数值体现的是以对照组为基准，各种处理条件下293T细胞裂解液中luciferase转化的底物多少，也即体现了细胞中luciferase的表达量。横坐标显示的是不同的实验条件，从左到右使用的依次是，普通培养基，含0.5mg/ml及0.1mg/ml 肉苁蓉鳞茎提取多糖的培养基，含0.5mg/ml及0.1mg/ml肉苁蓉鳞茎制备寡糖的培养基，含0.5mg/ml及0.1mg/ml纯化后的肉苁蓉鳞茎制备寡糖的培养基。星号代表的是该条件下的实验值与对照组有显著性差异。

图3为UVA照射后细胞内ROS生成量检测结果。图中纵坐标为样品的荧光读数平均值除以对照组荧光读数平均值所得的百分比，此数值体现的是以对照组为基准，各种处理条件下，紫外照射后成纤维细胞内ROS的生成量。横坐标显示的是不同的实验条件，从左到右使用的依次是，普通培养基培养72h后照射，含5μM姜黄素的培养基培养72h后照射，含0.3mg/ml肉苁蓉鳞茎提取多糖的培养基培养72h后照射，含0.05mg/ml肉苁蓉鳞茎制备寡糖的培养基培养72h后照射。星号代表的是该条件下的实验值与对照组有显著性差异。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。

本发明实施例中使用的仪器设备如下：

SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸易有限公司。

85-2型恒温磁力搅拌器：上海思乐仪器有限公司。

DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司。

N-1100D-WD真空旋转蒸发仪：日本EYELA公司。

UV260可见分光光度计：日本Shimadzu。

GL-21M低温高速离心机：上海离心机研究所有限公司。

Labconco大型冷冻干燥机：美国Labconco公司。

Edwards小型冷冻干燥机：英国Edwards公司。

全波长双板多功能仪(酶标仪)：美国BMG Labtech公司Novostar

细胞培养箱：美国Thermo serial II

以下实施例1-5例举本发明涉及的肉苁蓉鳞茎提取物制备方法及可能的纯化方法，所述肉苁蓉产自甘肃或新疆。

实施例1

取肉苁蓉鳞茎2kg，乙醇浸泡脱脂，室温自然干燥，干燥后的肉苁蓉鳞茎原药材用30L沸水提取，直至水提液中糖含量值较低，低温浓缩至5L，加入6L 30％(w/v)三氯乙酸溶液，脱蛋白之后用碱中和至pH为7.0，对流动水透析三天，内液浓缩，离心去沉淀，上清液加入3倍乙醇沉淀，静置，离心保留沉淀，分别用无水乙醇，丙酮洗涤，真空干燥后得到干燥肉苁蓉鳞茎水提多糖200g，为棕褐色粉末。

水提粗多糖10g以适量水溶解，离心除去不溶物。在终浓度为0.2M三氟乙酸溶液中，以及70℃加热4小时获得寡糖混合物。蒸馏除去三氟乙酸，离心后取上清液。获得深棕色水溶液，包含寡糖的肉苁蓉鳞茎提取物，固含量77mg/ml。

50g椰壳活性炭混合50g硅藻土于500ml去离子水中，搅拌均匀后缓慢倒入直径6cm高80cm的玻璃柱中，装柱后用蠕动泵压纯水平衡2天至柱体积不变，吸出上层清水，加入降解除酸后的寡糖混合物溶液。以纯水洗脱，苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并洗脱液，蒸馏去乙醇后用蒸馏水溶解获得浅黄色澄清溶液，固体含量15mg/ml。

实施例2

取肉苁蓉鳞茎2kg，丙酮浸泡脱脂，通风橱内室温自然干燥，干燥后的肉苁蓉鳞茎原药材用40L沸水提取，直至水提液中糖含量值较低，低温浓缩至6L，加入7L 30％(w/v)三氯乙酸溶液，脱蛋白之后用碱中和至pH 为7.3，对流动水透析三天，内液浓缩，离心去沉淀，上清液加入2倍丙酮沉淀，静置，离心保留沉淀，分别用无水乙醇，丙酮洗涤，烘箱干燥后得到干燥肉苁蓉鳞茎水提多糖275g，为棕褐色粉末。

水提粗多糖10g以适量水溶解，离心除去不溶物。在终浓度为0.4M盐酸溶液中，以及160℃加热1小时获得寡糖混合物。用孔径为100Da的透析袋透析除去盐酸，离心后取上清液。获得深棕色水溶液，包含寡糖的肉苁蓉鳞茎提取物，固含量84mg/ml。

50g椰壳活性炭混合50g硅藻土于600ml去离子水中，搅拌均匀后缓慢倒入直径6cm高80cm的玻璃柱中，装柱后用蠕动泵压纯水平衡3天至柱体积不变，吸出上层清水，加入降解除酸后的寡糖混合物溶液。以5％乙醇洗脱，苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并洗脱液，蒸馏去乙醇后用蒸馏水溶解获得浅黄色澄清溶液，固体含量11.3mg/ml。

实施例3

取肉苁蓉鳞茎2kg，氯仿浸泡脱脂，通风橱内室温自然干燥，干燥后的肉苁蓉鳞茎原药材用60L沸水提取，直至水提液中糖含量值较低，低温浓缩至8L，加入8L 30％(w/v)三氯乙酸溶液，脱蛋白之后用碱中和至pH 为7.1，对流动水透析三天，内液浓缩，离心去沉淀，上清液加入3倍乙醇沉淀，静置，离心保留沉淀，分别用无水乙醇，丙酮洗涤，真空干燥后得到干燥肉苁蓉鳞茎水提多糖310g，为棕褐色粉末。

水提粗多糖10g以适量水溶解，离心除去不溶物。在终浓度为0.4M三氟乙酸溶液中，以及100℃加热4小时获得寡糖混合物。蒸馏除去三氟乙酸，离心后取上清液。获得深棕色水溶液，包含寡糖的肉苁蓉鳞茎提取物，固含量50mg/ml。

60g椰壳活性炭混合60g硅藻土于450ml去离子水中，搅拌均匀后缓慢倒入直径6cm高80cm的玻璃柱中，装柱后用蠕动泵压纯水平衡2天至柱体积不变，吸出上层清水，加入降解除酸后的寡糖混合物溶液。以50％乙醇洗脱，苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并洗脱液，蒸馏去乙醇后用蒸馏水溶解获得浅黄色澄清溶液，固体含量5mg/ml。

实施例4

取肉苁蓉鳞茎2kg，乙醇浸泡脱脂，室温自然干燥，干燥后的肉苁蓉鳞茎原药材用50L沸水提取，直至水提液中糖含量值较低，低温浓缩至8L，加入8L 30％(w/v)三氯乙酸溶液，脱蛋白之后用碱中和至pH为7.6，对流动水透析三天，内液浓缩，离心去沉淀，上清液加入2倍丙酮沉淀，静置，离心保留沉淀，分别用无水乙醇，丙酮洗涤，烘箱干燥后得到干燥肉苁蓉鳞茎水提多糖298g，为棕褐色粉末。

水提粗多糖10g以适量水溶解，离心。在终浓度为3M三氟乙酸溶液中，以及120℃加热1小时获得寡糖混合物。蒸馏除去三氟乙酸，离心后取上清液。获得深棕色水溶液，包含寡糖的肉苁蓉鳞茎提取物，固含量 32mg/ml。

40g椰壳活性炭混合40g硅藻土于700ml去离子水中，搅拌均匀后缓慢倒入直径6cm高80cm的玻璃柱中，装柱后用蠕动泵压纯水平衡3天至柱体积不变，吸出上层清水，加入降解除酸后的寡糖混合物溶液。以65％乙醇洗脱，苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并洗脱液，蒸馏去乙醇后用蒸馏水溶解获得浅黄色澄清溶液，固体含量5.6mg/ml。

实施例5

取肉苁蓉鳞茎2kg，丙酮浸泡脱脂，通风橱内室温自然干燥，干燥后的肉苁蓉鳞茎原药材用70L沸水提取，直至水提液中糖含量值较低，低温浓缩至5L，加入9L 30％(w/v)三氯乙酸溶液，脱蛋白之后用碱中和至pH 为7.8，对流动水透析三天，内液浓缩，离心去沉淀，上清液加入5倍氯仿沉淀，静置，离心保留沉淀，分别用无水乙醇，丙酮洗涤，真空干燥后得到干燥肉苁蓉鳞茎水提多糖322g，为棕褐色粉末。

水提粗多糖10g以适量水溶解，离心。在终浓度为2M盐酸溶液中，以及90℃加热2小时获得寡糖混合物。用孔径为100Da的透析袋透析除去盐酸，离心后取上清液。获得深棕色水溶液，包含寡糖的肉苁蓉鳞茎提取物，固含量128mg/ml。

60g椰壳活性炭混合60g硅藻土于800ml去离子水中，搅拌均匀后缓慢倒入直径6cm高80cm的玻璃柱中，装柱后用蠕动泵压纯水平衡2天至柱体积不变，吸出上层清水，加入降解除酸后的寡糖混合物溶液。以95％乙醇洗脱，苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并洗脱液，蒸馏去乙醇后用蒸馏水溶解获得浅黄色澄清溶液，固体含量3.5mg/ml。

以下实施例6-12 中所使用的肉苁蓉鳞茎提取物均为实施例3得到的肉苁蓉鳞茎提取物(未经分纯)，其生药浓度为50mg/ml(即5％w/w)；实施例中各组分的单位均为重量百分比。

实施例6：面霜的制备

实施例7：乳液的制备

实施例8：精华液的制备

实施例9：眼霜的制备

实施例10：喷雾的制备

实施例11：沐浴露的制备

实施例12：洗面奶的制备

以上6-12实施例中所述的组合物均经过①稳定性测试，将料体分别在 -20℃、4℃、室温、48℃、循环(连续变换四个温度条件)放置12周，各料体的颜色和形态都保持稳定；②皮肤安全性测试，证实对皮肤无刺激，不会引发红斑、脱屑、刺痛及灼热等不良反应，可安心使用；③使用感觉测试，请20位中国女性志愿者在面部连续使用实施例6所述的面霜8周，评估结果表明，肉苁蓉鳞茎提取物能够增强肌肤对抗环境压力的能力、舒缓肌肤、减少损伤。

实施例13：肉苁蓉鳞茎提取物提高细胞抗氧化能力效果的评价

(一)抗氧化反应元件ARE激活水平

1)实验原理

正如背景中所说，抗氧化反应元件(ARE)在生物体内分布广泛，是抗氧化酶基因的顺式作用元件，对维持细胞氧化还原状态和防御氧化损伤有重要作用。受其调控的因子包括第2阶段酶，如还原型辅酶I(Ⅱ)醌氧化还原酶(NQ01)；抗氧化的蛋白质，如血红素氧化酶1(HO-1)。

本发明使用的ARE表达水平检测方法，使用的是一种经过人工改造的含有报告基因的293T细胞。方法是将编码luciferase荧光酶的一段报告基因转染到293T细胞的ARE序列之后，当ARE激活时，其下游的报告基因就会表达luciferase荧光酶。通过裂解细胞，再加入此荧光酶的底物，检测底物转化后所发出的的自然光的强度(RLU值)就能体现细胞中luciferase 的表达量，从而反映出细胞内ARE的激活水平。也就是说，通过底物转化后发出的自然光强，我们就可以了解到ARE调控的抗氧蛋白的表达情况，体现其自身的抗氧化能力。

2)实验方法

在96孔板每孔加入150μL含10％血清的细胞培养液，再用排枪加入 50μL转染过luciferase荧光酶报告基因的293T细胞悬液。细胞接种量为 3×10⁴个/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。再继续加入含有肉苁蓉鳞茎提取多糖(对应图中多糖)、肉苁蓉鳞茎制备寡糖(对应图中混合寡糖)、纯化后的肉苁蓉鳞茎制备寡糖(对应图中寡糖)的培养基各100μl/ 孔，使其终浓度分别为0.5mg/ml、0.1mg/ml。所有药物浓度均已做过细胞毒性检测，对该细胞密度下的293T细胞无毒害作用。37℃5％CO₂培养箱培养16小时。每孔各加入100μL裂解液彻底裂解细胞膜，使用luciferase 荧光酶检测试剂盒(promega)测量其中luciferase荧光酶所催化转化的荧光物质的相对光强RLU。

3)实验结果

抗氧化反应元件ARE激活水平的检测结果如图2所示。实验表明，使用肉苁蓉鳞茎制备的寡糖混合物培养的细胞在紫外照射后，胞内ARE的激活水平明显高于对照组，即此细胞内抗氧蛋白的表达量多于对照组。并且其效果优于未经降解的多糖，而分纯后的寡糖效果更佳。

(二)UVA照射后细胞内ROS生成量测定

1)实验原理

正如背景中提到的，活性氧自由基(ROS)过多的积累，会对皮肤造成氧化损伤，因此，清除皮肤中的ROS能有有效帮助皮肤抵御环境压力造成的损伤。本实验用UVA照射成纤维细胞，模拟环境压力对皮肤造成的损伤。借助 DCFH-DA检测试剂盒，能够有效测量在UVA照射后，成纤维细胞内产生的 ROS的量。

DCFH-DA是一种探针，它本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

2)实验方法

在96孔板每孔加入150μL含10％血清的细胞培养液，再用排枪加入 50μL成纤维细胞悬液。细胞接种量为3000个/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。吸出150μL培养基，再加入含有姜黄素、肉苁蓉鳞茎提取多糖(对应图中多糖)、纯化后的肉苁蓉鳞茎制备寡糖(对应图中寡糖) 的培养基各150μl/孔，使其终浓度分别为5μM、0.25mg/ml、0.1mg/ml。所有药物浓度均已做过细胞毒性检测，对该细胞密度下的成纤维细胞无毒害作用。继续培养48h后重新按之前所述方法更换一次培养基，24h后吸出培养基，用PBS清洗后，加载DCFH-DA探针，37℃，5％CO₂培养箱中孵育 40分钟。洗去多余探针，UVA以15J的剂量照射后，使用荧光酶标仪在485 nm激发波长，538nm发射波长下读数，其值对应的即为孔内细胞生成的 ROS量。

3)实施结果

实验结果如图3所示。可以看出，使用纯化后的肉苁蓉鳞茎制备的寡糖混合物培养的细胞在紫外照射后，胞内生成的ROS量明显低于对照水平，也即此细胞与对照相比，抵御UVA的能力更强，照射后细胞的损伤更小。其并且效果优于未经降解的多糖。

综合以上两个实验的结果，证明本发明能够明显提高细胞抵御环境压力和刺激的能力，从而减少损伤、保护肌肤。

Claims (8)

1.一种包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a)沸水提取；

b)浓缩，然后脱蛋白，然后碱中和；

c)透析，浓缩，离心去沉淀，上清液用有机溶剂沉淀；

d)收集沉淀，干燥后得到干燥的肉苁蓉鳞茎水提多糖；

e)步骤d)所得肉苁蓉鳞茎水提多糖在0.1～4M的强酸溶液中、70-200℃温度下加热降解反应1～4小时；

f)去除酸性成分，离心后取上清液，得到包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤a)之前进行脱脂的步骤。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤f)之后采用活性炭硅藻土层析柱进行分离纯化的步骤。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤e)中使用的强酸选自：三氟乙酸、盐酸、高锰酸、硫酸、硝酸、高氯酸、硒酸、氢溴酸、氢碘酸、氯酸。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分离纯化步骤中使用的活性炭硅藻土层析柱是通过将活性炭与硅藻土按照1：1的重量比在水中混合形成泥浆状，然后将所得泥浆状混合物均匀倒入层析柱制备得到。

6.如权利要求1所述的方法制备得到的包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物。

7.如权利要求6所述的肉苁蓉鳞茎提取物在制备具有抗氧化作用的化妆品中的应用。

8.一种具有抗氧化作用的化妆品，所述化妆品包含0.0001％-80％(w/w)的如权利要求6所述的肉苁蓉鳞茎提取物以及化妆品领域可接受的赋形剂。