CN112779305A - 一种肉苁蓉酶解寡糖浓缩液的制备方法及所得产品和应用 - Google Patents

一种肉苁蓉酶解寡糖浓缩液的制备方法及所得产品和应用 Download PDF

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Abstract

一种肉苁蓉酶解寡糖浓缩液的制备方法及所得产品和应用，所述肉苁蓉酶解寡糖浓缩液是将肉苁蓉鳞茎多糖用降解酶进行降解得到；所述酶为葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶和木聚糖酶中的一种或多种。本发明肉苁蓉酶解寡糖浓缩液采用酶解的方法制得，条件温和、无非糖副产物产生、寡糖收率高且不含有糠醛等有毒、刺激性副产物，更适于在化妆品中应用。酶解法对反应设备要求较低、设备损耗少、能耗及生产用水少、经济效益及环境效益更高。所得寡糖浓缩液应用于化妆品中具有美白、保湿、抗氧化、防晒、晒后修复等功能，可作为保湿、美白、防晒及晒后修复及抗氧化成分应用于化妆品中。

Description

一种肉苁蓉酶解寡糖浓缩液的制备方法及所得产品和应用
技术领域
本发明涉及一种以中草药肉苁蓉为原料制得的肉苁蓉酶解寡糖新产品，以及该产品的制备方法和应用，更涉及一种具有保湿、美白、防晒及晒后修复和抗氧化多重作用、尤其是具有美白作用的肉苁蓉寡糖浓缩液的制备方法及其产品和应用，属于天然药物化学领域和化妆品领域。
背景技术
皮肤是人体最大的一个器官，由表皮、真皮和皮下组织所构成，并含有附属器官。皮肤作为机体对外界环境的首道屏障，不断受到各种微生物、化学和物理因素的影响。光照以及现代社会的环境污染、电子产品的辐射等均会造成皮肤的老化，导致皮肤产生干燥、粗糙、皱纹、变黑、斑等问题，因此具有保湿、抗氧化、美白等功效的化妆品原料成为目前的主要研究热点之一。
现代化妆品原料在追求功效的同时，也越来越多的考虑到安全方面的问题，因而天然植物提取物尤其是药食同源的植物提取物受到越来越多的关注。肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉的带鳞叶肉质茎，是我国长期使用的中药材，在内蒙古自治区有作为食品原料使用的历史，其性味甘酸咸温，功能主治为：补肾，益精，润燥，滑肠等，于《本经》、《别录》、《本草正》、《玉楸药解》、《本草经疏》、《本草经解》等都有广泛记载。
目前，对于肉苁蓉功效及功效成分的研究主要集中于多糖、总苷、总寡糖等肉苁蓉提取物，对肉苁蓉多糖降解产生寡糖混合物的制备方法和相应寡糖混合物的功效研究较少。专利CN201410502922.2、CN201410502895.9、CN201410505010.0、CN201711404814.1、CN201711406825.3、CN201510297211.0等公开了一种肉苁蓉鳞茎多糖在强酸、70-200℃温度条件下降解产生寡糖混合物的方法，并提出所制备肉苁蓉鳞茎提取物及其纯化富集寡糖后的产物具有保湿、抗氧化、延缓皮肤衰老、加速受损皮肤屏障的修复、改善透皮吸收效率等作用及化妆品中应用。这些专利的寡糖均通过强酸高温水解后纯化富集得到，这种方法对天然多糖及降解产生的寡糖糖链基团及结构破坏较大，制备的寡糖分子量分布也较宽；同时，酸降解对反应设备要求较高，而且生产过程中能耗及用水量较高，会对环境造成一定的压力。酶解法可特异性、选择性切断糖苷键，与酸解法相比，反应条件温和、不需加入大量反应试剂、对环境污染小、产品安全性高、所得寡糖立体结构不易被破坏，生物活性可能会更高。
现有技术尚未公开由肉苁蓉提取得到的多糖经酶法降解制备肉苁蓉寡糖混合物的方法，更没有关于这种肉苁蓉寡糖混合物功效的研究报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种肉苁蓉酶解寡糖浓缩液的制备方法及所得的寡糖浓缩液，该方法通过酶法降解肉苁蓉鳞茎提取物中的多糖并获得相应寡糖浓缩液，该方法条件温和、安全性高、环境污染小，所得产品具有保湿、美白、防晒及晒后修复和抗氧化等多重功效。
本发明首次通过酶法降解肉苁蓉多糖得到寡糖浓缩液，该寡糖浓缩液经验证具有保湿、美白、防晒及晒后修复和抗氧化等多重功效，尤其是具有酸解法所得寡糖混合物所不具有的美白功效，由此可以看出本发明方法得到的寡糖浓缩液与酸解法所得产物相比具有不同的结构。
本发明肉苁蓉寡糖浓缩液中含有多种肉苁蓉寡糖，是多种肉苁蓉寡糖的混合物，其制备方法包括将肉苁蓉鳞茎多糖用降解酶进行降解的步骤；所述酶为葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶和木聚糖酶中的一种或多种。
进一步的，所述降解酶可以为一种，也可以为多种。当为多种时，各降解酶可以一起使用，也可以逐一单独使用。
进一步的，各降解酶的用量根据不同的降解酶的情况选择最佳用量。各降解酶的pH和温度也根据其自身性质选择最佳的酶解pH和温度。
在本发明的一个实施方式中，所述肉苁蓉鳞茎多糖降解酶为甘露聚糖酶和半乳糖苷酶的组合。优选的使用方式是：将肉苁蓉鳞茎多糖先用甘露聚糖酶充分酶解，然后再加入半乳糖苷酶进行酶解。
在本发明的一个实施方式中，将肉苁蓉鳞茎多糖配成水溶液进行酶解，肉苁蓉鳞茎多糖与水的质量比为1:5-50。
进一步的，本发明制备方法还包括对酶解液进行后处理的步骤，酶解液的后处理具体包括以下步骤:
a.将酶解所得的酶解液进行酶灭活、脱色；
b.将脱色后的酶解液除去不溶性杂质以及分子量高的物质；
c.将步骤b后的酶解液进行减压蒸发浓缩，得肉苁蓉酶解寡糖浓缩液。
进一步的，对酶解液的后处理步骤中，所述酶灭活、脱色、去除不溶性杂质、去除分子量高的物质、蒸发浓缩的方法可以采用现有技术中公开的各种可行的方法进行，对本领域技术人员来说不具有操作难度。
在本发明的一个实施方式中，将酶解液在70℃～90℃下进行酶灭活，时间为20min～60min。
在本发明的一个实施方式中，以活性炭或者活性炭和硅藻土的混合物为脱色剂对酶解液进行脱色。脱色剂的用量为酶解液质量的0.5％～2％。脱色温度为50℃～60℃，脱色时间为20min～60min。
在本发明的一个实施方式中，采用过滤、离心、微滤中的至少一种方式除去酶解液中的不溶性杂质。
在本发明的一个实施方式中，先采用离心或过滤对酶解液进行处理，然后将滤液或上清液进一步进行微滤，以充分去除酶解液中的不溶性杂质。优选的，微滤所用的微滤膜的孔径为0.22微米。
在本发明的一个实施方式中，采用透析或超滤的方式除去酶解液中的分子量高的物质。所述分子量高的物质是高分子的多糖或杂蛋白。透析所用的透析袋的截留分子量小于等于5000Da。透析可以进行一次，也可以进行多次。
进一步的，本发明最终经减压蒸发浓缩得到的肉苁蓉寡糖浓缩液为肉苁蓉寡糖混合物的浓缩液，其中含有肉苁蓉寡糖混合物和水。该肉苁蓉寡糖浓缩液的固含量大于1wt％。
进一步的，本发明制备方法中，所述肉苁蓉鳞茎多糖可以采用现有技术中公开的方法进行提取制备，例如可以采用背景技术中所涉及的专利中公开的方法进行提取，对本领域技术人员来说，不具有技术难度。
在本发明的一个实施方式中，所述肉苁蓉鳞茎多糖采用以下方法得到：
(1)将肉苁蓉鳞茎切片、干燥、粉碎、过筛，得肉苁蓉鳞茎粉末；
(2)将肉苁蓉鳞茎粉末溶于水中，进行超声处理；
(3)将超声处理后的肉苁蓉鳞茎水溶液进行水提，所得水提液浓缩、去沉淀；
(4)将去沉淀后的水提液用有机溶剂沉淀，收集沉淀、干燥，即为肉苁蓉鳞茎多糖。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，将肉苁蓉原药材鲜鳞茎切片后晒干、阴干或40℃及以下温度下烘干后粉碎，过10～30目筛。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，将肉苁蓉鳞茎粉末进行超声处理，以初步破坏肉苁蓉粉末的木质化结构。超声使用普通的超声实验装置即可。肉苁蓉鳞茎粉末与水的质量比为1:5-40，超声温度为20℃～45℃，超声功率为100W～600W，超声时间为20min～60min。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，水提温度为80℃～100℃，水提时间为1h-2h。所述水提可以一次，也可以多次，优选为2次。随着水提次数的增加，每次水提所需的水量可以适当减少。
在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，水提进行两次，第一次肉苁蓉鳞茎粉末与水的质量比为1:5-40，第二次肉苁蓉鳞茎粉末与水的质量比为1:5-10。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，水提后的水提液合并，采用浓缩、离心，或者浓缩、离心、再过滤的方法去除不溶性沉淀，获得上清液。
在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，将去沉淀后的水提液用有机溶剂沉淀，所述有机溶剂为乙醇、氯仿或丙酮，优选为乙醇。乙醇可以是无水乙醇，也可以是高浓度的乙醇水溶液。有机溶剂与水提液的体积比为2-5:1。
进一步的，上述肉苁蓉鳞茎多糖获取方法中，在步骤(2)和(3)之间还包括酶解的步骤，即在超声处理后先进行酶处理再进行水提，所述酶为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、漆酶、脂肪酶和中性蛋白酶中的一种或多种。酶解条件分别采用各酶最适的作用条件即可。
按照本发明上述方法制得的肉苁蓉酶解寡糖浓缩液是多种寡糖的混合物，经试验验证，该产品具有保湿、美白、防晒、晒后修复、抗氧化等多种功效。并且，本发明方法制得的产品具有了目前报道的肉苁蓉酸解寡糖混合物所不具有的美白功效。由于酸解寡糖受到强酸的随机降解，寡糖结构会有一定破坏，而酶解寡糖是利用酶的特异性降解得到的寡糖，因此本发明肉苁蓉酶解寡糖浓缩液产品与现有技术中制得的寡糖混合物具有不同的结构，是一种新的产品，也在保护范围之内。
此外，本发明对于上述制备的肉苁蓉酶解寡糖浓缩液在皮肤保湿、美白、防晒、晒后修复或抗氧化中的应用也进行保护。
进一步的，本发明还提供了一种肉苁蓉酶解寡糖溶液，该肉苁蓉酶解寡糖溶液由上述肉苁蓉酶解寡糖浓缩液稀释而得。
进一步的，上述肉苁蓉酶解寡糖溶液可以采用水对肉苁蓉酶解寡糖浓缩液进行稀释而得。
进一步的，上述肉苁蓉酶解寡糖溶液的固含量为0.7～1wt％。
本发明还提供了上述肉苁蓉酶解寡糖溶液在皮肤保湿、美白、防晒、晒后修复或抗氧化中的应用。
进一步的，本发明还提供了一种化妆品，特别是一种美白化妆品，该化妆品含有上述肉苁蓉酶解寡糖浓缩液或肉苁蓉酶解寡糖溶液。除了该肉苁蓉酶解寡糖浓缩液或肉苁蓉酶解寡糖溶液外，还可以包含其他功效成分以及制成化妆品所必须的各种辅助成分。
在本发明的一个实施方式中提供了一种化妆品，含有上述肉苁蓉酶解寡糖溶液，所述肉苁蓉酶解寡糖溶液在化妆品中的添加量为0.01～8wt％。
进一步的，所述化妆品可以是各种不同的类型，包括但不限于香皂、洗面奶、沐浴露、化妆水、护肤乳液、护肤膏霜、精华液、眼霜、面膜、气雾剂、喷雾剂等。
本发明寡糖浓缩液采用酶解的方法制得，条件温和、无非糖副产物产生、寡糖收率高且不含有糠醛等有毒、刺激性副产物，更适于在化妆品中应用。酶解法对反应设备要求较低、设备损耗少、能耗及生产用水少、经济效益及环境效益更高。所得寡糖浓缩液应用于化妆品中具有减少游离自由基形成、抗氧化功能；抑制黑色素形成、美白功能；减少UV辐射造成的皮肤细胞损伤、防晒及晒后修复功能；还兼具有保湿作用。因此，所述肉苁蓉酶解寡糖浓缩液可作为保湿、美白、防晒及晒后修复和抗氧化成分应用于化妆品中。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
下述实施例中，所用酶均为市购产品。
如无特别说明，下述浓度均为质量百分浓度。
实施例1肉苁蓉鳞茎多糖的提取
取新鲜肉苁蓉鳞茎，切片后40℃烘干至含水量<4wt％后粉碎，过30目筛，收集肉苁蓉鳞茎粉末。称取肉苁蓉鳞茎粉末1000g，按照固液比为1：5加入纯化水定容，配成溶液。在40℃下采用400W的超声对溶液处理40min，初步破坏肉苁蓉粉末的木质化结构。向超声处理后的肉苁蓉粉末溶液中加入1g纤维素酶、0.4g半纤维素酶及1ml漆酶，在45℃处理40min。酶处理后的溶液升温至80℃水提1h，将所得水提液过滤，滤渣再按照1:5的固液比加入纯化水提取一次，所得水提液过滤。合并两次的水提液，在搅拌状态下，向其中缓慢流加10L 93％的工业乙醇，静置沉降，上清棕黑色，沉淀色黑、质地细腻。倒掉上清，沉淀中加入93％的工业乙醇洗涤三次，得松散呈棕色的沉淀，将沉淀真空干燥，获得棕色肉苁蓉鳞茎多糖。
实施例2肉苁蓉酶解寡糖浓缩液的制备
取实施例1制得的肉苁蓉鳞茎多糖20g，按照1:5的固液比配成溶液，向溶液中分别加入不同的降解酶，分别在各降解酶合适的温度、pH和用量下进行酶解处理，酶解后所得的酶解液在70℃酶灭活40min，然后加入酶解液1wt％的活性炭，在55℃下脱色40min，脱色后的酶解液离心，取上清液，上清液再过0.22微米滤膜，除去不溶性杂质。然后将酶解液用截留分子量5000Da的透析袋透析过夜，进一步将分子量过高的多糖除去，收集透过液，得肉苁蓉酶解寡糖溶液。将所得透过液减压蒸发浓缩至0.1L，得肉苁蓉酶解寡糖浓缩液，所得寡糖分子量在5000Da以下。
各降解酶的酶解条件以及所得寡糖产量如表1所示。
表1不同酶降解肉苁蓉鳞茎多糖的酶解条件及所得寡糖产量
Figure BDA0002266241570000061
Figure BDA0002266241570000071
注:上表中，各酶的酶解条件均为其最佳酶解条件。寡糖产量是将0.1L肉苁蓉寡糖浓缩液在60℃下烘干至恒重所得的质量。
由表1不同降解酶降解肉苁蓉多糖后的寡糖产量可见，以壳聚糖酶、木瓜蛋白酶、葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、木聚糖酶、琼胶酶、透明质酸酶、阿拉伯糖苷酶、果胶酶等具有多糖降解作用的酶处理等量肉苁蓉鳞茎多糖，其中壳聚糖酶、木瓜蛋白酶、琼胶酶、透明质酸酶对肉苁蓉鳞茎多糖降解能力弱，所得分子量<5000Da的肉苁蓉酶解寡糖为2.39g～8.30g；而葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、果胶酶及其组合酶体系等对肉苁蓉鳞茎多糖降解能力较强，所得分子量<5000Da的肉苁蓉酶解寡糖均>14g，最高达17.69g，从酶解产率上看，所用降解酶从葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、果胶酶以及它们之间的组合中筛选。
实施例3
取新鲜肉苁蓉鳞茎，切片后40℃烘干至含水量<4wt％后粉碎，过10目筛，收集肉苁蓉鳞茎粉末。称取肉苁蓉鳞茎粉末适量，加入纯化水定容，按照设定的固液比配制5L溶液。将溶液进行超声处理，初步破坏肉苁蓉粉末的木质化结构。超声处理后可以再进行酶处理，然后将超声或酶处理后的溶液进行水提，将所得水提液过滤，在搅拌状态下，向其中缓慢流加水提液体积5倍的93％的工业乙醇，静置沉降，上清棕黑色，沉淀色黑、质地细腻。倒掉上清，沉淀中加入93％的工业乙醇洗涤三次，得松散呈棕色的沉淀，将沉淀真空干燥，获得棕色肉苁蓉鳞茎多糖。
各反应条件及所得肉苁蓉鳞茎多糖的产量如表2所示。
表2肉苁蓉鳞茎多糖的不同提取条件及相应多糖产量
Figure BDA0002266241570000072
Figure BDA0002266241570000081
实施例4
取实施例1制得的肉苁蓉鳞茎多糖适量，按照设定的固液比配成0.1L溶液，向溶液中分别加入不同的降解酶，分别在各降解酶合适的温度、pH和用量下进行酶解处理，酶解后所得的酶解液加热使酶失活，然后加入活性炭脱色，脱色后的酶解液离心，取上清液，上清液再过0.22微米滤膜，除去不溶性杂质。然后将酶解液用截留分子量5000Da的透析袋透析过夜，进一步将分子量过高的多糖除去，收集透过液。将所得透过液减压蒸发浓缩至0.1L，得肉苁蓉酶解寡糖浓缩液，所得寡糖分子量在5000Da以下。
各反应条件及所得寡糖的产量如表3所示。
表3肉苁蓉酶解寡糖的不同制备条件及相应的寡糖产量
Figure BDA0002266241570000082
Figure BDA0002266241570000091
注:上表中，寡糖产量是将0.1L肉苁蓉寡糖浓缩液在60℃下烘干至恒重所得的质量。
对比例
取实施例1制得的肉苁蓉鳞茎多糖20g，按照1:5的固液比配成溶液。向溶液中加入盐酸至终浓度为2mol/L，在90℃下处理2h，使肉苁蓉鳞茎多糖降解。然后用4mol/L氢氧化钠溶液将上述酸解液的pH值调至6.0，再加入1wt％的活性炭，在55℃下脱色40min，脱色后的酸解液离心，取上清液，上清液再过0.22微米滤膜，除去不溶性杂质。然后将酸解液用截留分子量5000Da的透析袋透析过夜，进一步将分子量过高的多糖除去，收集透过液。将所得透过液减压蒸发浓缩至0.1L，得肉苁蓉酸解寡糖混合物，所得寡糖分子量在5000Da以下。将所得肉苁蓉酸解寡糖混合物干燥，经测定，寡糖产量为16.49g。
下面，对实施例2的肉苁蓉酶解寡糖(实施例2的寡糖3、4、7-13)以及对比例的肉苁蓉酸解寡糖进行细胞毒性及功效分析。
测试例1肉苁蓉酶解寡糖细胞毒性评价
细胞毒性评价实验参照：GB/T16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验(ISO 10993-5:2009,IDT)及《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》SNT2328-2009化妆品急性毒性的角质细胞试验，评价肉苁蓉寡糖的细胞毒性。检测指标为细胞增殖率，检测方法为WST-1法。
1.实验材料
a.肉苁蓉酶解寡糖溶液1(实施例2寡糖3的1wt％水溶液)；b.肉苁蓉酶解寡糖溶液2(实施例2寡糖4的1wt％水溶液)；c.肉苁蓉酶解寡糖溶液3(实施例2寡糖7的1wt％水溶液)；d.肉苁蓉酶解寡糖溶液4(实施例2寡糖8的1wt％水溶液)；e.肉苁蓉酶解寡糖溶液5(实施例2寡糖9的1wt％水溶液)；f.肉苁蓉酶解寡糖溶液6(实施例2寡糖10的1wt％水溶液)；g.肉苁蓉酶解寡糖溶液7(实施例2寡糖11的1wt％水溶液)；h.肉苁蓉酶解寡糖溶液8(实施例2寡糖12的1wt％水溶液)；i.肉苁蓉酶解寡糖溶液9(实施例2寡糖13的1wt％水溶液)；j.肉苁蓉酸解寡糖溶液(对比例酸解寡糖的1wt％水溶液)。
2.仪器设备
倒置显微镜(OLYMPUS，CKX41)，超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司，SCB-1520)，二氧化碳培养箱(SANYO)，数显恒温水浴锅(金坛市中大仪器厂)，恒温微孔板快速振荡器(海门市麒麟医用仪器厂)，酶标仪(BIO-RAD)等。
3.实验过程及评价标准
取对数生长期小鼠胚胎成纤维细胞BALB/3T3，以5×104个/mL密度接种于96孔板，每孔100uL，培养体系是DMEM高糖培养液，添加10％胎牛血清，样品以含血清培养液配制成肉苁蓉酶解寡糖溶液添加量(wt％)0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、4％、8％的溶液，并用0.22μm滤膜过滤除菌。接种的细胞置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2常规培养24h后，弃去培养液，换成100μL含寡糖的样品，未加寡糖的含血清培养液作为正常对照(control)。每个样品7个浓度水平，每个水平6个平行孔，继续培养48h后，采用WST-1法检测细胞相对增殖率。相对增殖率(RGR)为样品组吸光度与正常对照组吸光度的比值。按照GB/T16886.5-2017的要求，RGR低于70％时，认为样品具有细胞毒性。
4、实验结果
表4不同浓度肉苁蓉寡糖的细胞毒性(RGR％)
Figure BDA0002266241570000101
Figure BDA0002266241570000111
如表4所示，上述9种肉苁蓉酶解寡糖溶液以及肉苁蓉酸解寡糖溶液在0.01％-8％的添加量范围内相对增殖率(RGR)均高于70％，均无明显细胞毒性，但肉苁蓉酸解寡糖溶液的安全性次于肉苁蓉酶解寡糖溶液的安全性。本发明所制备肉苁蓉酶解寡糖溶液安全健康，可添加于化妆品中。
测试例2肉苁蓉酶解寡糖美白性能评价
美白性能通过对B16小鼠黑色素瘤细胞黑色素生成量的影响进行评价。
1.实验材料
a.肉苁蓉酶解寡糖溶液1(实施例2寡糖3的1wt％水溶液)；b.肉苁蓉酶解寡糖溶液2(实施例2寡糖4的1wt％水溶液)；c.肉苁蓉酶解寡糖溶液3(实施例2寡糖7的1wt％水溶液)；d.肉苁蓉酶解寡糖溶液4(实施例2寡糖8的1wt％水溶液)；e.肉苁蓉酶解寡糖溶液5(实施例2寡糖9的1wt％水溶液)；f.肉苁蓉酶解寡糖溶液6(实施例2寡糖10的1wt％水溶液)；g.肉苁蓉酶解寡糖溶液7(实施例2寡糖11的1wt％水溶液)；h.肉苁蓉酶解寡糖溶液8(实施例2寡糖12的1wt％水溶液)；i.肉苁蓉酶解寡糖溶液9(实施例2寡糖13的1wt％水溶液)；j.肉苁蓉酸解寡糖溶液(对比例酸解寡糖的1wt％水溶液)；k.肉苁蓉鳞茎多糖溶液1(实施例3多糖2，浓度1wt％)；l.肉苁蓉鳞茎多糖溶液2(实施例3多糖5，浓度1wt％)；m.肉苁蓉鳞茎多糖溶液3(实施例3多糖6，浓度1wt％)。
2.仪器设备
倒置显微镜(OLYMPUS，CKX41)，超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司，SCB-1520)，二氧化碳培养箱(SANYO)，数显恒温水浴锅(金坛市中大仪器厂)，恒温微孔板快速振荡器(海门市麒麟医用仪器厂)，酶标仪(BIO-RAD)。
3.实验方法
3.1.细胞培养及加样品处理
将B16小鼠黑色素瘤细胞株接种于96孔板，37℃、5％CO2条件下进行培养24h。加入样品接触培养72h后，用NaOH裂解液裂解细胞，80℃加热30min，酶标仪450nm检测吸光度。同时在96孔板内接种相同体积密度的细胞作为增殖对照。
3.2.数据处理
实验组黑色素生成总量增加率与相应增殖对照的增殖率之比，即为单位细胞黑色素生成率。单位细胞黑色素抑制率(％)＝100％-单位细胞黑色素生成率。
相对增殖率(RGR)为样品组吸光度与正常对照组吸光度的比值。
4.实验结果
表5肉苁蓉酶解寡糖溶液对黑色素生成的影响
Figure BDA0002266241570000121
由表5可知，肉苁蓉酶解寡糖溶液1-6(实验组1-13)都具有一定的黑色素抑制能力，实验条件下B16小鼠黑色素瘤细胞中单位细胞黑色素抑制率为17.43％～39.54％，说明此类肉苁蓉酶解寡糖溶液具有良好美白效果。而从实验组6-13看，肉苁蓉酶解寡糖溶液0.01-8％浓度范围内均具有黑色素抑制能力，优选为1-8％。从实验组18-20看，肉苁蓉鳞茎多糖溶液添加量为1％时，单位细胞黑色素抑制率为-5.21％～7.37％，与空白对照比无明显差异，说明肉苁蓉酶解寡糖溶液1-6的黑色素抑制能力为酶解寡糖自身所具有，而非鳞茎多糖自身或其中含有的其他成分所致。
从实验组14-16看，肉苁蓉酶解寡糖溶液7-9的单位细胞黑色素抑制率为1.45％～8.62％，从实验组17看，肉苁蓉酸解寡糖溶液的单位细胞黑色素抑制率仅为5.56％，故肉苁蓉酶解寡糖溶液7-9和肉苁蓉酸解寡糖溶液的美白效果均较差，与空白对照相比无明显差异，无美白效果。由此可以看出，并非所有的降解酶得到的寡糖溶液都具有美白效果，不同方式得到的寡糖溶液的结构不同。因而，优选降解酶为葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、木聚糖酶或其组合酶，而从实验组1-5、9看，在相同浓度下，肉苁蓉酶解寡糖溶液6的单位细胞黑色素抑制率最高，美白功效最为显著，为最优的肉苁蓉酶解寡糖溶液，制备该寡糖溶液的降解酶是甘露聚糖酶和半乳糖苷酶的组合酶，因此选择该组合酶为最优的降解酶。
从细胞相对增殖率看，添加肉苁蓉酶解寡糖溶液后，细胞相对增殖率与空白对照组相比无明显区别，说明肉苁蓉酶解寡糖溶液无明显细胞毒性，健康安全，适用于有美白功效要求的化妆品。
测试例3肉苁蓉酶解寡糖保湿性能评价
对优选的降解酶得到的寡糖溶液进行保湿性评价。短期保湿功效评价采用皮肤水分测定仪和皮肤水分散失测定仪，通过检测使用前及使用后30min，1h，3h及6h的皮肤水分含量及皮肤水分散失量变化评价保湿性能。
1.实验材料
取基础保湿乳液，向其中分别加入肉苁蓉酶解寡糖溶液1(实施例2寡糖3的1wt％水溶液)、肉苁蓉酶解寡糖溶液2(实施例2寡糖4的1wt％水溶液)、肉苁蓉酶解寡糖溶液3(实施例2寡糖7的1wt％水溶液)、肉苁蓉酶解寡糖溶液4(实施例2寡糖8的1wt％水溶液)、肉苁蓉酶解寡糖溶液5(实施例2寡糖9的1wt％水溶液)、肉苁蓉酶解寡糖溶液6(实施例2寡糖10的1wt％水溶液)、肉苁蓉鳞茎多糖溶液1(实施例3多糖2，浓度1wt％)、肉苁蓉鳞茎多糖溶液2(实施例3多糖5，浓度1wt％)、肉苁蓉鳞茎多糖溶液3(实施例3多糖6，浓度1wt％)9种溶液，作为试验样品，其中肉苁蓉酶解寡糖溶液及肉苁蓉鳞茎多糖溶液的添加量如表6、表7所示，同时以基础保湿乳液作为对照。基础保湿乳液成分为：
A相(wt％)：GTCC 5.0％；2EHP 4.0％；矿油1.0％；PEG-100硬脂酸酯/甘油硬脂酸酯2.0％。
B相(wt％)：甘油5.0％；卡波姆0.2％；TEA 0.1％；杰马plus 0.6％；水至100％。
2、仪器设备
皮肤水分测试仪Corneometer CM 825(Courage+Khazaka公司，德国)，皮肤水分散失测定仪Corneometer TM300(Courage+Khazaka公司，德国)。
3、保湿性的测定
在受试者左右前臂屈侧标记6个4cm×4cm的试验区域，每个试验区域分别使用各样品，涂抹量为每个实验区域0.05±0.01g样品，轻轻按摩至样品吸收，分两次进行试验，使所有样品都进行试验。使用皮肤水分测定仪和皮肤水分散失测定仪测定使用前(初始值)及使用后30min，1h，3h及6h时各区域内的皮肤水分含量及皮肤水分散失量的变化情况。
其中：
Figure BDA0002266241570000141
Figure BDA0002266241570000142
4、实验结果
表6经不同样品处理后皮肤含水量随时间的变化率(％)
Figure BDA0002266241570000143
Figure BDA0002266241570000151
表7经不同样品处理后经皮水分散失量随时间的变化率(％)
Figure BDA0002266241570000152
由表6和表7数据可见，从实验组1-13与实验组17的数据对比可见，在0.5～6h内，本发明肉苁蓉酶解寡糖溶液都可以有效提升皮肤含水量并降低经皮水分散失量，说明肉苁蓉酶解寡糖溶液有优异的保湿性能。从实验组6-13的数据对比可见，当添加不同浓度的同种肉苁蓉酶解寡糖溶液时，随肉苁蓉酶解寡糖溶液添加量的提高，皮肤含水量呈上升趋势、经皮水分散失量呈下降趋势，说明0.01％～8％浓度范围内肉苁蓉酶解寡糖溶液的保湿性能与浓度正相关。添加肉苁蓉鳞茎多糖溶液的保湿乳液(实验组14-16)能少量提升皮肤含水量和降低经皮水分散失量，但效果低于相同添加量下肉苁蓉酶解寡糖溶液，说明肉苁蓉酶解寡糖溶液的保湿性能是由酶解后形成的特殊肉苁蓉寡糖所赋予的，而非鳞茎多糖或者鳞茎多糖溶液中的其他成分。
从实验组1-5、9的对比可以见，相同添加量(1％)的肉苁蓉酶解寡糖溶液，肉苁蓉酶解寡糖溶液6在数据采集时间(0.5～6h)内皮肤含水量最高，同时经皮水分散失量最低，为优选的肉苁蓉酶解寡糖溶液。
测试例4肉苁蓉酶解寡糖防晒及晒后修复性能评价
对优选的降解酶得到的寡糖溶液进行防晒及晒后修复评价。防晒及晒后修复功效采用以一定剂量的紫外线照射细胞，并通过分别照射前后添加样品处理细胞，从细胞增殖水平角度考察肉苁蓉酶解寡糖溶液对细胞紫外线损伤的防护与修复作用。
1.实验材料
a.肉苁蓉酶解寡糖溶液1(实施例2寡糖3的1wt％水溶液)；b.肉苁蓉酶解寡糖溶液2(实施例2寡糖4的1wt％水溶液)；c.肉苁蓉酶解寡糖溶液3(实施例2寡糖7的1wt％水溶液)；d.肉苁蓉酶解寡糖溶液4(实施例2寡糖8的1wt％水溶液)；e.肉苁蓉酶解寡糖溶液5(实施例2寡糖9的1wt％水溶液)；f.肉苁蓉酶解寡糖溶液6(实施例2寡糖10的1wt％水溶液)；g.肉苁蓉鳞茎多糖溶液1(实施例3多糖2，浓度1wt％)；h.肉苁蓉鳞茎多糖溶液2(实施例3多糖5，浓度1wt％)；i.肉苁蓉鳞茎多糖溶液3(实施例3多糖6，浓度1wt％)。
2.仪器设备
倒置显微镜(OLYMPUS，CKX41)、超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司，SCB-1520)、二氧化碳培养箱(SANYO，MCO-18AIC(UV))、数显恒温水浴锅(金坛市中大仪器厂)、酶标仪(Bio-Rad，iMark)、UV-8型紫外线灯箱(北京电光源研究所)、ST-513型紫外线测量仪(台湾先驰)。
3.实验方法
3.1.样品溶液的配制
样品溶液：肉苁蓉酶解寡糖溶液1-6和肉苁蓉鳞茎多糖溶液1-3分别添加至无血清培养基，配制添加量为10％的样品溶液，0.22μm滤膜过滤除菌，使用前用无血清培养基稀释到指定浓度。
MTT溶液：用PBS配制浓度为5mg/mL的MTT作用液，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冰箱保存备用。
3.2.对UV照射损伤的防护作用
铺板：取处于对数生长期HaCaT细胞，胰酶消化后，调细胞密度5×104/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL细胞悬液，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2常规培养过夜。
样品处理：常规培养过夜后，弃去培养液，每孔分别加入100μL目标浓度样品溶液，对照组加入等量的新鲜培养液，放入细胞培养箱中孵育16h。实验分组如下：
表8对UV照射损伤的防护实验分组
分组 处理方法
对照组 不照射，只换新鲜培养液
模型组 换新鲜培养液后，UV照射
实验组 加入样品溶液后，UV照射
照射：采用7.2J/cm2 UVA加126mJ/cm2 UVB对模型组及实验组HaCaT细胞进行联合照射。照射后，换为无血清培养基培养过夜，然后每孔加入15μL MTT，放入细胞培养箱中继续孵育4h。弃去培养液，每孔加入100μL DMSO，避光震荡10min，于490nm波长处用酶标仪测定吸光度，检测细胞相对增殖率。相对增殖率(RGR)为模型组或实验组吸光度与对照组吸光度的比值。
3.3.对UV照射损伤的修复作用
铺板：取处于对数生长期HaCaT细胞，胰酶消化后，调细胞密度5×104/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL细胞悬液，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2常规培养过夜。
样品处理：实验组和模型组先进行照射，照射结束后，弃去培养液，实验组每孔加入100μL目标浓度样品溶液，模型组加入等量的新鲜培养液，然后放入培养箱中继续培养。对照组不进行照射，仅更换新鲜培养液。培养24h后，每孔加入15μL MTT，放入细胞培养箱中继续孵育4h。弃去培养液，每孔加入100μL DMSO，避光震荡10min，于490nm波长处用酶标仪测定吸光度，检测细胞相对增殖率。相对增殖率(RGR)为模型组或实验组吸光度与对照组吸光度的比值。
照射：采用7.2J/cm2 UVA加126mJ/cm2 UVB对模型组及实验组HaCaT细胞进行联合照射。
实验分组如下：
表9对UV照射后损伤的修复实验分组
Figure BDA0002266241570000171
Figure BDA0002266241570000181
4.实验结果
表10不同样品对HaCaT细胞UV照射损伤的防护作用及UV照射损伤后的修复作用
Figure BDA0002266241570000182
由表10数据可知，肉苁蓉酶解寡糖溶液能够增强细胞的UV耐受性并修复UV造成的皮肤损伤，具有一定的防晒及晒后修复能力。而肉苁蓉鳞茎多糖溶液UV照射前后添加对细胞增殖率都没有明显影响，说明肉苁蓉鳞茎多糖溶液并不具有增强细胞的UV耐受性并修复UV造成的皮肤损伤的功效，同时也说明肉苁蓉鳞茎多糖经酶解后所形成的寡糖具有防晒及晒后修复功能，可用于有防晒和晒后修复要求的化妆品。
实验组6～13的数据对比表明，在0.1％～8％的添加量范围内，随着添加量的提高，防晒及晒后修复功能有增强的趋势。
测试例5肉苁蓉酶解寡糖抗氧化性能评价
对优选的降解酶得到的寡糖溶液进行抗氧化性评价。抗氧化性能通过考察是否具有抑制ROS产生或者清除ROS的能力评价，采用UVA+UVB照射损伤细胞，刺激活性氧自由基(ROS)的产生，并通过照射前后细胞与样品接触，考察肉苁蓉酶解寡糖是否具有抑制ROS产生或者清除ROS的能力。
1.实验材料
a.肉苁蓉酶解寡糖溶液1(实施例2寡糖3的1wt％水溶液)；b.肉苁蓉酶解寡糖溶液2(实施例2寡糖4的1wt％水溶液)；c.肉苁蓉酶解寡糖溶液3(实施例2寡糖7的1wt％水溶液)；d.肉苁蓉酶解寡糖溶液4(实施例2寡糖8的1wt％水溶液)；e.肉苁蓉酶解寡糖溶液5(实施例2寡糖9的1wt％水溶液)；f.肉苁蓉酶解寡糖溶液6(实施例2寡糖10的1wt％水溶液)；g.肉苁蓉鳞茎多糖溶液1(实施例3多糖2，浓度1wt％)；h.肉苁蓉鳞茎多糖溶液2(实施例3多糖5，浓度1wt％)；i.肉苁蓉鳞茎多糖溶液3(实施例3多糖6，浓度1wt％)。
2.仪器设备
倒置相差显微镜(OLYMPUS，CKX41)，超净工作台(东联哈尔，SCB-1520)，二氧化碳培养箱(SANYO)，微孔板恒温振荡器(其林贝尔，BE-9008)，酶标仪(BIO-RAD，iMark)，UV-8型紫外线灯箱(北京电光源研究所)，ST-513型紫外线测量仪(台湾先驰)，流式细胞仪(BD，Accuri C6 PLUS)。
3.实验方法
3.1.样品溶液的配制
样品溶液：肉苁蓉酶解寡糖溶液1-6和肉苁蓉鳞茎多糖溶液1-3分别添加至无血清培养基，配制浓度为10％的样品溶液，0.22μm滤膜过滤除菌，使用前用无血清培养基稀释到指定浓度。
二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针溶液的配制：按0.375uL DCFH-DA:1mL PBS比例稀释。
3.2.紫外损伤后与样品接触(修复)
取处于对数生长期的HaCaT细胞，以5×104个/mL密度接种于12孔培养板，每孔2mL细胞悬液，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2常规培养24h。
模型组和实验组弃去1mL培养液，盖保鲜膜，UVA用2000μW/cm2的强度照射2h-3h，UVB用700μW/cm2的强度照射7min，对照组常规培养。
照射后弃去旧培养液，实验组加入样品溶液，对照组和模型组加入无血清培养液，每孔均为2mL，继续培养16h后，弃去全部培养液，用PBS洗两遍。每孔加入1.5mL DCFH-DA溶液，放入细胞培养箱中继续孵育30min，每隔5min混匀一次使探针充分结合。弃去探针，用预热的无血清培养基洗两遍，每孔加入1ml无血清培养基37℃孵育10min。PBS洗一遍后，胰酶消化细胞，PBS洗两遍，300μL PBS重悬，用流式细胞仪双通道检测(上机前细胞需要过滤)，FL1-H通道，每个样品收集10000个细胞。
3.3紫外损伤前与样品接触(防护)
取处于对数生长期的HaCaT细胞，以4×104个/mL密度接种于12孔培养板，每孔2mL细胞悬液，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2常规培养24h。
弃去旧培养液，实验组加入样品溶液，对照组和模型组加入无血清培养液，每孔均为2mL，继续培养24h后模型组和实验组照射，对照组常规培养不照射。
模型组和实验组弃去1mL培养基，盖保鲜膜，UVA用2000μW/cm2的强度照射2h-3h，UVB用700μW/cm2的强度照射7min，对照组不照射。弃去培养基，用PBS洗两遍。每孔加入1.5mL DCFH-DA，放入细胞培养箱中继续孵育30min，每隔5min混匀一次使探针充分结合。弃去探针，用预热的无血清培养基洗两遍，每孔加入1ml无血清培养基37℃孵育10min。PBS洗一遍后，胰酶消化细胞，PBS洗两遍，300μL PBS重悬，用流式细胞仪双通道检测(上机前细胞需要过滤)，FL1-H通道，每个样品收集10000个细胞。
3.4数据处理与统计学分析
根据1通道(FL1-H)获取的信号数据，即DCF产生的荧光强度或荧光总量计算ROS产生率。
用平均荧光强度(GMEAN)计算ROS生成率：
Figure BDA0002266241570000201
ROS抑制率＝1-ROS生成率。
统计学分析采用SPSS 19.0软件。
4.实验结果
表11不同样品对活性氧自由基(ROS)生成的影响
Figure BDA0002266241570000202
Figure BDA0002266241570000211
Figure BDA0002266241570000221
由表11数据可知，相对于模型组(100％)，HaCaT细胞在紫外损伤前后与肉苁蓉酶解寡糖溶液接触，肉苁蓉酶解寡糖溶液1-6均具有抑制ROS产生和清除ROS的能力，即肉苁蓉酶解寡糖溶液具有一定的抗氧化能力。而肉苁蓉鳞茎多糖溶液在紫外损伤后与细胞接触不具有ROS清除能力，在紫外损伤前与细胞接触不具有ROS抑制能力，可以推断，未酶解前，肉苁蓉鳞茎多糖中多糖及其他成分不具有抗氧化性，肉苁蓉酶解寡糖溶液的抗氧能力为多糖酶解后产生的寡糖所具有。
与正常培养的对照组相比，经过UVA+UVB照射损伤后，细胞内的ROS水平都增加了一个数量级以上。从表11可以看出，肉苁蓉酶解寡糖溶液在0.01％～8％的添加量下，均具有ROS清除和抑制能力，其中添加量为0.05-8％时效果更好，添加量为1-8％时效果更好。
从上述实验结果看，肉苁蓉鳞茎寡糖溶液6的各种功效作用最佳，是最优寡糖，肉苁蓉鳞茎寡糖溶液6是采用甘露聚糖酶和半乳糖苷酶降解得到的，因此优选的降解酶为甘露聚糖酶和半乳糖苷酶的组合。

Claims (10)

1.一种肉苁蓉酶解寡糖浓缩液的制备方法，其特征是：包括将肉苁蓉鳞茎多糖用降解酶进行降解的步骤；所述酶为葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶和木聚糖酶中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：优选的，所述降解酶为多种时，各降解酶一起使用或者逐一单独使用；优选的，将肉苁蓉鳞茎多糖配成水溶液进行酶解，肉苁蓉鳞茎多糖与水的质量比为1:5-50。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述降解酶为甘露聚糖酶和半乳糖苷酶的组合；优选的，将肉苁蓉鳞茎多糖先用甘露聚糖酶充分酶解，然后再加入半乳糖苷酶进行酶解。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：还包括对酶解液进行后处理的步骤，具体包括以下步骤:
a.将酶解所得的酶解液进行酶灭活、脱色；
b.将脱色后的酶解液除去不溶性杂质以及分子量高的物质；
c.将步骤b后的酶解液进行减压蒸发浓缩，得肉苁蓉酶解寡糖浓缩液；优选的，肉苁蓉酶解寡糖浓缩液的固含量大于1wt%。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：优选的，将酶解液在70℃～90℃下进行酶灭活，时间为20min～60min；
优选的，脱色在50℃～60℃下进行，脱色时间为20min～60min；
优选的，脱色所用脱色剂为活性炭或者活性炭和硅藻土的混合物，脱色剂的用量为酶解液质量的0.5～2%；
优选的，采用过滤、离心、微滤中的至少一种方式除去酶解液中的不溶性杂质；
优选的，采用透析或超滤的方式除去酶解液中的分子量高的物质；
优选的，透析所用的透析袋的截留分子量小于等于5000 Da。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述肉苁蓉鳞茎多糖采用以下方法得到：
（1）将肉苁蓉鳞茎切片、干燥、粉碎、过筛，得肉苁蓉鳞茎粉末；
（2）将肉苁蓉鳞茎粉末溶于水中，进行超声处理；
（3）将超声处理后的肉苁蓉鳞茎水溶液进行水提，所得水提液浓缩、去沉淀；
（4）将去沉淀后的水提液用有机溶剂沉淀，收集沉淀、干燥，即为肉苁蓉鳞茎多糖。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是：优选的，在超声处理后先进行酶处理再进行水提，所述酶为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、漆酶、脂肪酶和中性蛋白酶中的一种或多种；
优选的，步骤（2）中，肉苁蓉鳞茎粉末与水的质量比为1:5-40，超声温度为20～45℃，超声功率为100W～600W，超声时间为20min～60min；
优选的，步骤（3）中，水提温度为80～100℃，水提时间为1-2h；
优选的，步骤（4）中，有机溶剂为乙醇、氯仿或丙酮，优选为乙醇；有机溶剂与水提液的体积比为2-5:1。
8.按照权利要求1-7中任一项所述的肉苁蓉酶解寡糖浓缩液的制备方法制得的肉苁蓉酶解寡糖浓缩液及其在皮肤保湿、美白、防晒、晒后修复或抗氧化中的应用。
9.一种肉苁蓉酶解寡糖溶液及其在皮肤保湿、美白、防晒、晒后修复或抗氧化中的应用，其特征是：所述肉苁蓉酶解寡糖溶液由权利要求8所述的肉苁蓉酶解寡糖浓缩液稀释而得；优选的，所述肉苁蓉酶解寡糖溶液的固含量为0.7～1wt%。
10.一种化妆品，其特征是：含有权利要求8所述的肉苁蓉酶解寡糖浓缩液或含有权利要求9所述的肉苁蓉酶解寡糖溶液；
优选的，所述肉苁蓉酶解寡糖溶液在化妆品中的添加量为0.01～8wt％；
优选的，所述化妆品的类型包括香皂、洗面奶、沐浴露、化妆水、护肤乳液、护肤膏霜、精华液、眼霜、面膜、气雾剂或喷雾剂。
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